JPS6041480A - 雑種細胞の単離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は、２つの生きた細胞、好ましくは悪性細胞と
正常細胞の間で形成される生きた、単離可能な雑種細胞
の製造方法に関する。さらに詳細にｄ゛うと、この発明
は、細胞融合の技術を用いた弔−クローン抗体の製造方
法に関する。

最近、細胞融合として知られる技術が開発された。この
技術では、いわゆる雑種細胞が、それ゛ぞれの親細胞の
所望の性質を示すように２つの類似した又は非類似の親
細胞から形成される。典型的には、親細胞の１つとして
、継続的に生育し、分裂することができる、悪性細胞（
例えばミエローマ細胞）が週ばれる。これは、雑種細胞
自体が、継続的に分裂できるという望ましい性質を示し
、それによって、均一な雑種細胞集団（「ハイブリドー
マ」と呼ばれる）を生育できるようにすることを意図し
て行なわれる。

雑種細胞の他方の親細胞は、何らかの所望の性質を示す
が継続的に分裂することができない、いわゆる「正常」
細胞である。正常細胞の所望の性質は、典型的には、抗
体のような生産物を生産することである。継続的に分裂
する細胞と、この１［′畠な抗体産生細胞との間の雑種
細胞は、理想的には、親正常細胞の抗体産生能力と、他
方の親の継続的分裂性を示し、このため、所望の抗体を
大量に生Ｊｒする潜在的能力を有する。以下の議論にお
いては、簡Ｑｊ、のため、継続的分裂細胞を、例示的に
、悪性のミエローマ細胞であるとして議論を進める。

悪性（ミエローマ）細胞と抗体産生細胞との融合は、い
わゆる「単一クローン」抗体の製造に゛　用いられてお
り、実際、このような抗体を製造しようという要望は、
細胞融合技術の発展に負うところが大きい。ミエローマ
細胞と抗体産生細胞との雑種細胞は、単一の（単一クロ
ーン性の）生産物を産生ずる。なぜなら、雑種細胞を形
成するのに、抗体産生細胞としては１つの細胞のみが用
いられており、この１つの抗体産生細胞はそれ自身、１
つの型の生産物のみをつくることができるからである。

従って、ミエローマ細胞集団を融合条ヂ１下で抗体産生
細胞（全体としては多くの異なった生産物又は抗体を産
生じてＱ＼る）と混合すると、１つのミエローマ細胞と
１つの抗体産生細胞とからなる雑種細胞が複数形成され
る。それぞれの雑種細胞は、次に、それぞれの特定の１
つの生産物を生産するのに十分な程度にまで増殖させら
れ、この生産物は、それが例えば特定の抗原に対する抗
体であるか否か調べられる。

イＩ用な雑種細胞（例えば抗体を生産する）を形成する
だめの融合技術の効率は、混合細胞東回から、ミエロー
マ細胞と正常細胞との雑種細胞を単離する能力、及び、
その後の第２段階において、これらの雑種細胞から特定
の所望の抗体を産生ずる細胞を単離する能力に大きく依
存している。従って、例えば、融合条件下でミエローマ
細胞集団を正常細胞集団（抗体を産生じている）と混合
すると、得られた細胞集団は、以下の細胞を含んでいる
。

（ａ）　ミエローマ細胞と正常細胞との雑種細胞（ｂ）
２つのミエローマ細胞同志の雑種細胞（Ｃ）２つの正常
細胞同志の雑種細胞 （ｄ）融合しなかった正常細胞 （ｅ）融合しなかったミエローマ細胞 第１の’ｌ’　ｌ！１：においては、（ａ）の＠Ｅａに
入るもののみがめられている。範ｌｌ３（ａ）、（ｂ）
、及び（ｅ）に属する細胞は、範ＩＬｉ（ｃ）及び（ｄ
）に属する細胞から「単離」することができる。なぜな
ら、正常細胞は、継続的分裂ができないので、最終的に
は死滅するからである。しかしながら、範＠（ｂ）及び
（Ｃ）の細胞から１Ｒ（ａ）の細胞を単離すること８士
困難である。なぜなら、これらの細胞は全て継続的分裂
が可能だからである。この単離を行なうために、融合操
作において、ミエローマ細胞集ｉ用として、いわゆる「
突然変異」ミエローマ細胞を用いることが開発された。

すなわち、特定の培地中において、生存に必要な物質を
遺伝的に欠く突然変異ミエローマ細胞が、融合操作に用
いられる。

これらの細胞とｉＥ常細胞を混合して融合を行なった後
、イ１）られた細胞を上述の培地に懸濁する。融合しな
かった突然変異ミエローマ細胞及び２つの突然変異ミエ
ローマ細胞から形成された雑種細胞は最終的にこの培地
中で死滅し、一方、突然変異ミエローマ細胞と正常細胞
とから形成された所望の雑種細胞は生存することができ
る。なぜなら、突然変異ミエローマ細胞の遺伝的欠陥は
、雑種細胞を構成する正常細胞によって補われるからで
ある。

この単離方法の１例として、ヒボキサンチン。

フォスフォリポシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）欠
損の突然変異ミエローマ細胞を用いることを挙げること
ができる。このような細胞の増殖は、選択ヒボキサンチ
ン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）培地によって
ｊＨ害される。従って、全ての細胞をこの培地中に懸濁
すると、突然変異ミエローマ細胞と正常細胞とから形成
された雑種細胞のみが選択的に増殖する。

ミエローマ細胞と正常細胞との雑種細胞を他の全ての細
胞から雑種化後に単離する別の方法が、本出願人が１９
８３年４月５日に出願した米国持前出願第４８２，２４
０号に開示されている。この方法では、突然変異ミエロ
ーマ細胞の代わりに、特定の培地中での生存に必要な成
分を不活性化するように化学的に処理したミエローマ細
胞集団を用いる。

この第１の単離後、生存している細胞だけがミエローマ
細胞と正常細胞との雑種細胞である。

第１の単離に要する時間（すなわち、ミエローマ細胞／
市常細胞雑種以外の全ての細胞を死滅させるのに要する
時間）中に、生存する全ての雑種細胞は分署しはじめて
いるやもし、雑種化技術によって１つのミエローマ細胞
と１つの正常細胞とのＣｊｉ−の雑種細胞のみが必ず形
成されるのであれば、行なうべきことは、既に始まった
分裂を継続させ、増殖させ続ける（その結果均一なハイ
ブリト−ママスが形成される）ことだけであり、その中
でこのマスが増殖している培地を試験し、そのハイブリ
！・−マが、所望の特定の抗体を産生しているか否かを
知ることができる。もしそうであるなら、生産される生
産物は真実「単一クローン性」である。なぜなら、それ
を生産しているハイブリドーママスは、１つの生産物の
みを生産することかできる単一の雑種細胞から誘導され
たものであるからである。−に記試験時に、形成された
雑種細胞の分裂によって多数の細胞が存在するという事
実は問題とはならない。なぜなら、最初に単一の雑種の
みが形成されるという仮定に基づいているので、このよ
うな細胞は全て必然的に同一のものであるからである。

しかしながら、実際には、現在行なわれている雑種化技
術においては、１つのミエローマ細胞と１つの正常細胞
とから１つの雑種細胞Δｈが形成されることは確保され
ない。統３１学的には、ミエローマ細胞／正常細Ｉ抱Ｉ
「種は、１０５個のミエローマ細胞と１Ｆ常細胞ごとに
１個ないし１０個形成される。従って、わずか１０１個
のミエローマ細胞が適当な容器中で正常細胞と混合され
たとしても、１つの雑種細胞のみが形成されるという保
証はない。例えばこのような雑種細胞が３つ形成された
場合、上述した単離技術により、もちろん、これらの３
つの雑種を他の全ての細胞から分離することができる。

しかしながら、これらの３つの雑種細胞は、それぞれ３
つの異なる正常細胞から誘導されたものであろうから、
それぞれ異なる生ノ４″、物を生産している。これらの
３つの雑種細胞を継続的に増殖させて得られる混合ハイ
ブリドーマは、所ｑ１の生産物を生産するけれども、そ
の所ｑノの生産物は、例えば他の２つの生産物と混じっ
ている。従って、純粋な単一クローン性生産物は生産さ
れない。従って、所望の生産物のみを生産する均一な細
胞集団が形成されるまで、ト記混合物からの個々の細胞
をそれぞれ増殖させなければならない。この仕４蓼は、
上述したように、第１王程において、３つの雑種細胞が
他の全ての細胞から”ｌ’−幽されるまでに、それらの
雑種細胞が既に分裂を始めているので非常にやっかいな
ものになる。

ずな矛）ら、所望の生産物を生産している雑種のみを見
つける際に存在する細胞の数は、３つよりもはるかに多
く、単一の雑種細胞から誘導され所望のｒｊｌ　−抗体
性生産物を生産しているハイブリドーマを見出すために
これらの細胞のそれぞれを別々に増殖させ、検査しなけ
ればならない。このような検査の多くは無駄骨であるこ
とは明らかである。なぜなら、はとんどの場合、増殖さ
せられ。

検査される特定の細胞は、検査される他の細胞の単なる
分裂によってできたものであるからである。それにもか
かわらず、全ての細胞を試験することが必要である。

これら全ての細胞をクローニングしなければ。

ならないということにより、雑種化技術がやっかいで時
１？ｊｌと経費のかかるものとなる。

この発明の目的は、所望の特定の生産物を生産する、生
きた容易に単離できる雑種細胞を製造することが可能な
、雑種化方法を提供することである。

この目的及び他の目的は、細胞の雑種化を、多数の個々
の分離した容器、穴、又は室内で行ない、継続分裂細胞
と正常細胞との雑種細胞は、１つの室内において２個以
上形成されないようにした方法によって達成される。

この発明のさらなる特徴は、種々の容器の集団から、所
望の特定の生産物を生産している増殖中の雑種細胞集団
を含む容器を分離することができるということである。

この発明の最も好ましい態様では、それぞれの室内にお
いて２個未満の雑種細胞が形成されるという条件は、全
ての室において、雑種化の前に、１個の継続分裂細胞と
１個のＩＦ常細胞との対が２対未満存在するようにする
ことによって達成される。従って、例えば、ある１個の
室内に、正常細胞が１個だけ存在するのならば、継続分
裂細胞はいくつ存在してもよい。なぜなら、１つの継続
分裂細胞と１つの正常細胞とから成る１つの雑種細胞の
みが形成されるからである。あるいは、ある［つの室は
、１つの継続分裂細胞を含むのであれば多数の正常細胞
を含んでいてもよい。やはり、１つの継続分裂細胞と１
つの正常細胞とから成る１つの雑種細胞のみが形成され
るからである。操作に用いられる材料を節約するという
観点から、↑えば、もちろん、個々の室がそれぞれ１個
の継続分裂細胞と１個の正常細胞のみを含むことが好ま
しい。

雑種化条件にさらすと、１つの室内に存するｉ＃続分裂
細胞と正常細胞は融合し１Ｍ種細胞を形成する。全ての
室を適当な培地（例えばＨＡＴ選択培地）にさらすと、
継続分裂細胞と正常細胞との機能的な雑種細胞以外の全
ての細胞は時間がたつにつれて死滅する（継続分裂細胞
は、そのもともと有する何らかの遺伝的欠陥の故に、正
常１１１１胞は継続的に分裂できないため死滅する）。

この処理後、どの室中で増殖したマスも、必然的に１個
の継続分裂細胞と１個の正常細胞とからなる１個の雑種
細胞から誘導されたものである。さらに重要なことには
、それぞれの室内においては、１個の継続分裂細胞と１
個の正常細胞との２対未満の対からｔＩｂまったので、
単離されたマスは必然的に１個の雑種細胞０力から誘導
されたものであり、１つの単一抗体性生産物のみを生産
することができる。従って、必要なことは、特定のハイ
ブリドーマがその中で増殖している培地を、そのハイブ
リドーマが所望の生産物を生産しているか否か調べるだ
けである。もしそうであるなら、さらに？ｌｉ　Ｉｌｌ
したり、クローニングしたりする操作は不要である。

それぞれの室において継続分裂細胞と正常細胞との間で
１個以下５の雑種細胞が形成されるとｌ、％う黄ヂ１は
、それぞれの室内に１個の継続分裂細胞と１個の正常細
胞との対を１対以下含ませることによっ′−Ｃ最も確実
に確保されるが、実際上は、この黄ヂ１−は、それぞれ
の室内に例えば２万個の細胞がイｆイ１する場合（すな
わち、継続分裂細胞と正常細胞との対が１万対も存在し
得る）であっても、達成されることが見出された。なぜ
なら、雑種形成の頻度は極めて低いからである。明らか
なように、この発明の方法のこの態様によると、多数の
細胞を処理するのに必要な室の数が大幅に減少する。

理論的には、あらゆる適当な容器又は室を、この発明の
実施に用いることができる。しかしながら、雑種形成の
頻度が極めて低く、また、石川物質の５５！造能力を経
済的にするために、１個の継続分裂細胞と１個の正常細
胞との雑種化の機会が１０ｒのオーダー必要であり、そ
れによって所望の生産物を生産する正常細胞から誘導さ
れる雑種細胞が少なくとも１つ形成される。この発明の
好ましい態様において、各室に１個の継続分裂細胞と１
個の正常細胞との対を１対以下含ませることによって１
個の室あたりｌ　（ｎのＩＡ種細胞のみが形成するよう
にした場合には、従って、個々の室がｌび必要になる。

個々の室が１万対の細胞を含んでいる場合であっても、
このような室の数は相当なものになる。この困難さを解
決するために、この発明の方法はさらに、その中で雑種
化を行なうことができる、多数の小さな分離した個々の
「室」を提供する実際的方法にも関する。この方法のさ
らなる利点は、増殖中の雑Ｓ！細胞を含む室を、他の全
ての室から容易に分離することができるということであ
る。

この発明のこの特徴においては、その中で雑種化が起き
得る個々の分離した室として、半透膜性のマイクロカプ
セル（以下、「ビーズ」という）を採用する。以下にさ
らに詳細に説明する方法では、多数の継続分裂細胞（以
下例示的説明のため悪性（ミエローマ）細胞という）と
正常細胞との７１ｄ合物を、ビーズ形成培地に懸濁する
。このビーズ形成媒体の酢は（上述したこの発明の好ま
しいＥ；様の場合）、形成されたそれぞれのビーズ中に
２個以下の細胞が存在することになる敏である。こめ２
個の細胞は、２個のミエローマ細胞、２個のｉ■Ｅ常細
脳細胞は１個のミエローマ細胞と１個の市畠細胞である
。これらのビーズ集団を雑種化条件にさらすと、１個の
ミエローマ細胞と１個の正常細胞とを含むビーズ内にお
いて単一の雑種細胞が形成される。次に、全てのビーズ
を適当な培地（例えばＨＡＴ選択Ｊ８地）に懸濁するこ
とにより、ミエローマ細胞／正常細胞雑種を含むビーズ
以外の全てのビーズが最終的に死滅する。生きたＩＩ＋
胞（例えばミエローマ細胞／正常細胞雑種細胞）がなお
存在するビーズは賀Ｍ、（密度）が増加し続けるので、
それによってこれらのビーズは他の全てのビーズから「
分離」される。なぜなら。

ＨＡ　Ｔ　Ｊ’ｆ’ｒ地においても他の選ばれた培地に
おいても、これらのより密度の高いビーズは最終的に沈
み、一方、他のビーズは浮くか、懸濁液中に留まるから
である。このようにして分離された、雑種細胞を含むビ
ーズは、次に、所望の単一クローン性抗体が生産されて
いるか否かを調べられる。

この発明の１態様においては、さらに、このようにして
分離されたビーズを、同じ工程において処理して、所望
の特定の生産物を産生ずるハイブリドーマを含むビーズ
のみを単離することができる。この単離技術は、この発
明の雑種化方法の１１を構成しているので、以下におい
てさらに詳細に説明する。この単離方法自体は、所望の
細胞を産生ずるいずれの細胞の単離にも適用することが
できる。この方法は、本出願人が１９８１年１１月２５
日に出願した米国出願ｆｆ１３２５，０５１　号及び１
９８２年１１月２３日に出願した米国出願ｔｆＳ４４３
．１９１　号に記載されている。これらの発明の名称は
ともに「細胞の単離方法」である。

この発明のもう１つの特徴においては、個々の室として
ビーズを用いることにより、単一の、ｒｌ−−・クロー
ン性生産物を生産している／＼イブリドーマを容易に単
離することができる。この方法では、多殻の継続分裂細
胞（例えばミエローマ細胞）と正常細胞を単一の容器内
で混合し、既知の雑種化技術に従って、雑種化条件下に
置く。しかしながら、雑種化のために必要な十分な時間
が経過した後であって、いずれの雑種細胞も分裂を開始
する１１うに、全ての細胞集団を、該集団中のそれぞれ
の個々の細胞（すなわち、個々の雑種化しなかった１１
：常細胞又はミエローマ細胞、個々のミニロー−１細胞
／ミ工ローマ細胞雑種、個々の正常細胞／　＋ｌ−ｌ−
脳細胞雑種個々の正常細胞／ミエローマ細胞）が個々の
ビーズ中に封入されるビーズ形成工程に伺される。得ら
れたビーズは、次に、正１；へ細胞／ミエローマ細胞雑
種細胞以外の全ての細胞が死減し、１１三常細胞／ミ工
ローマ細胞雑種が他の全Ｃのビーズから特異的な重さく
上述したように、これらのビーズの重量は、正常細胞／
ミエローマ細胞雑種の分裂の故に増加している）によっ
て分離される培地に入れられる。このようにして中離さ
れた全てのハイブリドーマは、必然的に１つの正常細胞
／ミエローマ細胞雑種細胞から、Ａ導されたものである
。なぜなら、全ての細胞のビーズ化は、正常細胞／ミエ
ローマ細胞雑種細胞の分裂が始まる前に起きているから
である。従って、このようにして単離されたハイブリド
ーマによって生産されるあらゆる生産物は、必然的に弔
−りＵ−ン性生産物である。

この郭種化力法においては、「継続的に分裂する」細胞
の集団と、「正常な」細胞の集団とが提供される。後者
は、雑種細胞が有すべき望ま【７い性質を有している。

雑種細胞の継続的に分裂する親が右する継続分裂性の故
に、ｉＵ：常細胞の望ましい性質は潜在的に永久化され
る。

この発明に用いられるａ続分裂細胞は、全ての又は特定
のＪン３地ないしは環境内で継続的に増殖できる能力を
イ〕し、その継続的増殖能力を雑種細胞に与えることが
できるものであれば、どのような細胞でもよい。典型的
には、この継続的分裂細胞は、ミエローマ細胞のような
悪性細胞である。

しかしながら、あるいは、継続分裂細胞は、非悪性細胞
であって、特定の化合物又は培地の存在下で継続的に増
殖するものであってもよい。このようなものの例として
、Ｔ細胞増殖因子の存在ドにおりる１゛細胞を挙げるこ
とができる。この場合には、正常細胞とＴ細胞との雑種
細胞は、Ｔ細胞増殖因ｒ−め存在下において望ましく＃
統帥に分裂する。継続分裂細胞はまた。正常細胞と雑種
化された際にその分離を可能ならしめる性質を有してい
なければならない。」−述したように、これは、特定の
培地中で増殖することができない突然変異継続り）裂細
胞を用いることによって、あるいは、特定のＪｉζ地中
で増殖できないようにする前処理（例えば化学的処理）
を受けた継続分裂細胞を用いることによって達成するこ
とができる。

説明を簡単にするために、以下の説明では、継続的分裂
細胞を悪性ミエローマ細胞として話を進める。

また、例示のため、正常細胞は、少なくともそのうちの
あるものが、単離及び採集することがめられている特定
の所望の抗体を産生ずる細胞集団であるとして話を進め
る。正常細胞集団中の他の細胞は、生産物を全く生産し
ていないか、又は、４．′ｒ定の所望の抗体以外の他の
生産物（例えば抗体）を生産しているものであってよい
。

に述した正常細胞集団は、以下に述べるような種々の方
法によって得ることができる。

（ａ）生物を、所望の抗体に対して特異的な抗原で免疫
化し、その生物から細胞を分離する（例えば、免疫化し
た生物からリンパ球を集めることによって）。

（ｂ）所望の抗体に対して特異的な抗原の存在を示す疾
病状態にある生物によって生産された細胞を分離する。

例えば、潰瘍を有する、又は潰瘍が治癒した生物は、潰
瘍抗原に対する抗体を産生ずる細胞を有しているであろ
う。

（ｃ）生物のｉＥ常細胞を、生体外において、所望の抗
体に対して特異的な抗原で攻撃する。

（ｄ）生物の正常細胞を、生体外において、その生物が
遺伝的に生産する能力を有する全ての抗体（所望の抗体
をも含む）を当該細胞に生産せしめることができる化学
物質で処理する。このような化学物質の例として、リボ
多糖類及び種々の植物レクチンを挙げることができる。

この発明では、個々の室は、仮に正常細胞とミエローマ
細胞との間で雑種化が起きたとしても、１つの室内では
、このような雑種細胞が１つのみ含まれることとなるよ
うに、ミエローマ細胞とｉｌＥ　ｉ小細胞とを含む。上
述したように、これは、それぞれの室が、正常細胞とミ
エローマ細胞の１対以下の対を含むようにするか、ある
いは、このような対を複数含むが統計学的にそれらの対
から１個の雑種細胞しか形成されないような数の対を含
むことによって達成される。以下５発明を記載するため
に、これらの室は１個々の分離したマイクロカプセル又
はビーズであるとして話を進める。ビーズはその囲包材
料が半透膜性、すなわぢ１種々の剤及び培地を通過せし
めて細胞と接触させることができるのに十分に大きいが
細胞がビーズ内に保持されることを確保するのに十分に
小さな大きさの孔を右する。

雑種化は、ビーズ東回全体を、適当な濃度及び条件ドで
ポリエチレングリコール（Ｐ　Ｅ　Ｇ）や不活性化セン
タイウィルスのような「融合化剤」の作用にさらすこと
によって行なわれる。融合化剤はビーズ材才］を通過し
、２個の細胞を含むビーズ内では、細胞同志が（＝Ｊ着
され、融合細胞タブレントが形成される。これらのダブ
レットのある＋！！１合のものは雑種細胞を形成する。

雑種化が起きるのに十分な時間経過後、全てのビーズは
、用いたミエローマ細胞の性質の故に正畠細胞と雑種化
しなかったミエローマ細胞が生存することができない培
地中に懸濁される。同時に、ミエローマ細胞と雑種化し
なかった正常細胞は、本来的に分裂することができない
ので死滅する。その結果、最終的に生き残った細胞を含
むビーズはミエローマ細胞と正常細胞との機能的な雑種
細胞を含むビーズのみとなる。このようなビーズ中で増
殖する細胞は単一の雑種細胞から誘導されたちのであり
（なぜなら、全ての個々のビーズ中では、１個の２１１
種細胞のみが形成され得るから）、従って、？ｉ−のｒ
ｌｌ−・クローン性生産物（何らかの生産物が生産され
ているとした場合）を生産するであるう。

細胞を含むビーズを形成するのに種々の方法を採用する
ことができる。一般的に、封入される−５さ細１召集団
は、アルギン耐塩（これはカルシウバイ：１−ンの存在
下でゲルを形成する）やアガロース（これは一定の温度
以下においてゲルを形成する）又はこれらの混合物等の
適当なゲル形成相お１と均・に１１１合される。この細
胞とゲル形成材料との１１１合懸渇液の特定ｈ￥を釦や
ノズルを介して引き扶き、この引き抜いた材料を滴とし
てカルシウド溶１イ’ｔ　（ゲル形成材料がアルギン６
＃塩の場合）、又は例えば冷たい油（ゲル形成材料がア
ガロースの場合）中に置き、滴のゲル化を起こさせる。

細胞集団の細胞の数、細胞集団と混合されるケル形成材
料の濃度及び個々の滴の大きさを調整することにより、
個々の滴が一定の数似上の細胞を収容するようにするこ
とができる。すなわち、例えば、雑種化がビーズ自体の
中で起き、個々のビーズ中にはミエローマ細胞と正畠細
胞との対がｌ　ｔ＝Ｊ以下存在するようにすることが望
まれる場合には、−上述のパラメーターを、２個以下の
細胞を含むマイクロカプセルが形成されるように調整す
る。その結果、ゲル化した微小球は、全く細胞を含まな
いか、１つのミエローマ細胞、１つの１Ｆ常細胞、２つ
のミエローマ細胞、２つの正常細胞、又は１つのミエロ
ーマ細胞と１つの正常細胞とを含む。弔−のミエローマ
細胞／ｌＦ常細胞雑種のみが個々のビーズにおいて形成
されるという要件が、個々のビーズ中に、ミエローマ細
胞と正常細胞との対を例えば１万対含ませることによっ
て達成される場合には、」−述のパラメーターを、個々
のビーズが例えば２万個以下の細胞を含むこととなるよ
うに選ばれる。また、雑種化を従来技術と同様に行ない
（すなわち”、多数のミエローマ細胞と正常細胞とを雑
種北条ヂ１−下において１つの容器内で１１コ合する）
、■−述したように、得られた混合物中のそれぞれの細
胞（形成された全てのミエローマ細胞／　ｉＥ常細胞雑
種を含む）を、これらが分裂を開始する前にビーズ内に
封入する場合には、１−ポしたパラメーターは、好まし
くは１個々のビーズ内に１個以下の細胞が封入されるよ
うに黄ばれる。

ン゛ル化した滴すなわち微小球か形成された後、個１（
の滴を、例えば東金化ポリリジンからなる゛１′、透膜
竹囲包材料で被覆する。アルキン酸塩系層の場合には、
ポリリジンコーティングは、ＩＩＭ　性に、ｌｉｄ　屯
したアルキン酸塩ケルと陰性に帯′准したポリリ・ノン
との静電的引力を利用して行なうことができる。ポリリ
ジンでコートされた滴は次に、カルシラ１、を含まない
溶液又はカルシウム月釦剤（例えばＥ　Ｄ　ＴＡ）を含
む溶液に入れられる。この溶１ｔｔｃがポリリジンコー
ティングを通過すると、これがアルキン酸塩ケルを溶か
し、液化されたゲルはポジリジンコーティングの外へ流
出する。そうすると残ったものは、もともとゲル化した
アルキン酸塩層中に存在した細胞を含むポリリジンマイ
クロカプセルないしはビーズである。次に雑種化及び／
又は単離操作に伺されるのは、これらのビーズである。

ゲル化した滴がアガロースのような材料から形成されて
いる場合には、半透膜性の囲包材料が個々の滴に提供さ
れ、このようにコートされた滴は、アガロースの液化を
引き起こすために適当な方法により加熱される。アガロ
ースが半透膜性の囲包材料から流出すると、残ったもの
は、もともとゲル化したアガロース層中に存在した細胞
を含むビーズである。

アガロースからなる滴の囲包材料としてポリリジンを用
いることは可能ではあるが、一般的に、これらの２つの
材料は静電的引力が小さいので、アガロース滴のまわり
にポリリジンを均一にコーティングすることが困難であ
ることが見出された。この困難さを克服する１つの方法
として、微小球ないしは滴をアガａ−スとアルギン酸塩
との程合物で形成することを挙げることができる。

用いられるアルギン酸塩の量は、ポリリジンが、滴中に
存在するアルギン酸塩との静電的引力の故に滴をコート
するこｔができるのに十分な量である。ポリリジンコー
ティングが形成されると、コートされた滴は、アルギン
酸塩と７カロースとを液化しイＩＩる、適当な温度の溶
ｌ＆に入れられる。

液化した材料がポリリジンコーティングを介して流出す
ると、残ったものは細胞含イ１ポリリジンビーズである
。

この光リノの一般的な工程に話を戻す。雑種化を行ない
、全てのビーズを適当なｊ９Ｊｌ！Ｊ（例えば選択ｆｌ
　Ａ　ＴＪ’：’ｒ　Ｊｌ　）中に懸濁すると、生きた
細胞を含有するビーズは、ミエローマ細胞と正常細胞と
の雑種４１１胞を含むもののみとなる。従って、このよ
うなビーズ内においてのみ増殖（ハイブリドーマの）が
起きる（なぜなら、もともとあったアルギン酸塩ヌはア
ガロースを除去したので、ビーズは多数の細胞を収容す
ることができ、このため、増殖し分裂する雑種細胞のマ
スを収容することができるからである）。ハイブリドー
マの連続的な増殖によって、一定体積のビーズの主星は
有意に増加し、その結果、比重の差に基づく適当な分離
方法によって、これらのビーズが他の全てのビーズから
分離され得る程度にまでビーズの密度が増加する。

このようにして分離されたビーズ（又はその中で増殖し
ているハイブリドーマ）のそれぞれについて、そのハイ
ブリト−マが所望の特定の生産物を産生しているか否か
を調べる。あらゆる陽性の測定のためには、上述した操
作以外のさらなるｊ’ｌｉ　１ｌｉｌ操作は不要である
。なぜなら、この発明の雑種化方法では、どのハイブリ
ドーマも、中−の生産物のみを生産する親正常細胞から
形成された単一の雑種細胞から誘導されたものであるこ
とが確保されているからである。

増殖するハイブリドーマを含むビーズの数が多く、それ
らが容易に他のビーズから分離され得るとはいえ、それ
ぞれのビーズについて、特定の生ｌｔ物を生産している
か否かを調べるのをこ手間と１１１ｒ間がかかることも
あろうにのため、及びビーズはｆｌＪΦ化操作自体に用
いられるものであるという事実に鑑み、この発明の好ま
しい態様は、木出頴人が１９８１年１１月２５１］、及
び１９８２年１１月２３０にそれぞれ出願した米国特許
出願第３２５．０５１’号及び第４４３，１９１、発明
の名称はともｔこ「細胞の単層方法」である）に記載さ
れた重厚技術を包含する。このジノ法によると、細胞に
よって生ノｌｅされる生Ｊｌｆ：物（ここではハイブリ
ドーマによって生産される生産物）とそれに対する親和
物質との相り：作用を用いて、このような細胞の直近傍
にのみ同定及び識別可能な物理的状態を生じさゼ、それ
によって単離すべき細胞を同定することができる。

この発明の雑種化方法に適用するにあたり、Ｊニ述した
？ｌｉ　ｊ１１方法は種々の態様により実施することが
できる。例えば請求められている生産物が１又は２以に
のハイブリドーマによって生産される中−クローン抗体
である場合には、以下のような単離方法が好ましい。

増殖するハイブリドーマを含むビーズを他の全てのビー
ズから分離した後、個々のビーズを、ポリリジン、アガ
ロース又はアルギン酸塩のような半透膜性材料からなる
第２の外ビーズ内に封入する。外ビーズ（ビーズ全体の
いわゆる「外層」）自体の中は、所望の抗体に対して特
異的な抗原をその中に含むことができるようになってい
る。ハイブリドーマによって生産された抗体は、内ビー
ズ（その内側に増殖するハイブリドーマを含む）の半透
膜性材料を介してビーズ全体の外層の中に拡散する。も
しこの抗体が所望の抗体であるならば、それは外層の中
の特異的抗原を結合するであろう。もしその抗体が所望
の抗体でないのであれば、それは、外層中に存在する特
異的抗原に対しては親和性を示さないであろう。次に、
全てのビーズの外層中に拡散できるが、所望の抗体又は
所望の抗体とその特異的抗原との複合物にのみ結合する
物質を系全体に加える。この物質（例えば免疫グロブリ
ンのＦ。又はＦａ＆領域に結合する合されている。この
物質＋酵素は、所望の生産物を生産しているビーズにの
み存在するので、固定されていない物質を洗い流した後
、酵素は、所望の生産物を生産しているハイブリドーマ
を含むビーズ内においてのみ存在する。このようなビー
ズに酵′素が一旦結合されると、ビーズの全集団を、酵
素の存在下において同定可能な系を選択的につくり出す
種々の環境に置くことができる。例えば、酵素の存在下
において不溶性の有色物質となる無色の物質を系全体に
加えることができる。

＾す素は所望の抗体を産生するハイブリドーマを含むビ
ーズ内にのみ存在するので、このようなビーズのみが有
色となり、他の無色のビーズから容易に分離することが
できる。同様に、酵素の存在下（すなわち、所望の生産
物を生産するハイブリト−マヲ含むビーズ内のみ）にお
いて蛍光物質に転化される非蛍光物質を系全体に加える
こともできる。

所望の生産物を生産しているビーズにのみ結合される酵
素を用いた他の単離方法を採用することもできる。すな
わち、全てのビーズを適当に懸瀾し、これを、酵素の作
用によって無毒に変えられるか又は外ビーズ層に存在す
る酵素によって内ビーズには侵入できなくされる毒的環
境にさらす。その結果、所望の生産物を生産しているハ
イブリドーマを含むビーズのみが生き残る。所φのハイ
ブリドーマはビーズ中で継続的に増殖するので、所望の
ビーズは最終的には、増加した比重に基づいて他のビー
ズから分離される。

所望のハイブリドーマを含むビーズにのみ結合された酵
素を利用した他の方法では、可溶性の物質をビーズ集団
全体に加える。酵素の存在下では、この可溶性物質は不
溶性の沈殿に変えられ、それらのビーズの重量が増加す
る。その結果、比重の差に基づいて、それらのビーズを
他のビーズから分離することができる。さらにまたもう
１つの方法では、酵素の作用によって１又は２以上のガ
ス状物質に変えられる物質を全ピーズ集団懸渇液に加え
る。酵素を有するビーズの中でガスが発生し、それらの
所望のビーズは、他の不所望のヒースから浮揚する。

所望の生産物を生産しているｌ＼イブリドーマを含むビ
ーズのみを単離する非酵素的方法の１つでは、外ビーズ
層の中に、多数の赤血球が含まれている。これらの赤血
球の表面には所望の抗体に対して６異的な抗原が結合さ
れている。適当な時間インキュベ−１・すると、所望の
抗体を生産しているハイブリト−マを含むビーズでは、
その抗体は、外ビーズ層の中に含まれる赤血球に結合さ
れた抗原に結合する。他の全てのビーズでは、赤血球に
担持された抗原は、未結合のままになる。系全体に補体
のような物質を加えると、既知のとおり、抗原抗体複合
物を有する赤血球が溶解される。これらのビーズ中の溶
解された物質は半透膜性のビーズ表面を介して流出する
が、他の全てのビーズにおいては、赤血球は溶解されず
にそのまま残っている。その結果、所望のビーズ（その
中で赤血球が溶解された）は不所望のビーズよりも有意
に軽く、密度が小さくなり、そのため、適当な、比重の
差を用いた方法により分離することができる。

上述の説明により、この発明の好ましい実施態様による
と、増殖するいずれのハイブリドーマも弔−・の雑種細
胞から誘導されたものである（従って、単一の生産物の
みを生産することができる）ことが確保され、そのため
、所望の生産物を生産するハイブリドーマを実際に用い
るのに種／／のクローニング及びサブクローニング操作
が軍装になることかわかる。同時に、この発明の雑種化
を実施するのに選ばれた好ましい手段（例えば、分離し
た反応室として個々の分離したビーズを用いる）により
、所望の特定の生産物を生産している特定の細胞（ここ
では特定のハイブリドーマ）を？ｔＬ＃するための一］
二述した方法が容易に適用できる。その結果、雑種細胞
形成から、特定の単一・クローン性生産物をつくってい
るハイブリドーマを単離するまでの、雑種化方法全体が
、既知の雑種化／単離方法よりもはるかに効率的で経済
的なものとなる。

最初の力で述べたように、既知のノ、（本市な雑種化技
術では、雑種細胞形成の第１１’程として心霊な細胞同
志の刺着をもたらすのに融合化剤（ＰＥＧ又は不活性化
センダイウィルス）を用いる。

雑種化方法自体の他の形態においては、最初の細胞伺箔
を達成するのに融合化剤を用いない。この方法はミ本出
願人が１９７９年１１月１１Ｊに出願した米国特許出願
第９０　、１３０号に記載されており。

その発明の名称は「単一クローン抗体の製造方法」であ
る。この米国出願に対応する欧州特許出願が１９８１年
５月２０目に明細書番号第００２８９０２すとし−Ｃ公
告された。この公吉明細古はこの明細、１：に組み入れ
られたものとする。

筒中に吉°えば、この方法は、ミエローマ細胞と１１′
、常細胞との全ての雑種細胞がうまく分離されたとして
も（突然変異ミエローマ細胞又はこの発明のように化学
的に処理されたミエローマ細胞を用いることによって）
、これらの雑種細胞の中からさらに、所望の特定の抗体
を産生じているもののみを！１１離する必要があるとい
う事実に注目して考え出された。最初の細胞刺着を達成
するために用いられる融合化剤はランダムで非特異的な
ものであり、従って、ミエローマ細胞と正゛畠細胞との
単離可能な雑種細胞は多数得られるが、これらのうちの
極めてわずかのもののみが所望の特定の抗体を産生して
いる正常細胞とミエローマ細胞との雑種細胞である。さ
らに、後者の雑種細胞であっても、何らかの理由により
、所望の特定の抗体を生産する能力をすでに有していな
いものもある。

この明細書の最初の方で述べたように、個々の単離され
たハイブリドーマが１′１１−のミエローマ細胞／−ｉ
Ｅ常細胞雑種細胞から誘導されるものであることを確保
し、さらに、本出願人の米国特誇出願第３２５，０５１
　号に記載した単離方法を採用して特定の？ｊｉ−の生
産物を生産するハイブリドーマを単離すると、雑種化方
法に融合化剤を用いる場合であっても、従来に比へて、
このような単離に要する手間が大きく減少される。本出
願人の米国特許出願第９０，１３０号に記載した方法を
用いてＨａ化自体を行なうと、特定の生産物を生ＪＩＬ
している特定のハイプリト−マを単離するのに要する手
間がさらに減少する。米国特許出願第９０，１３０号の
方法では、′４１１種化操種化用いられるミエローマ細
胞には、所１′１１の特定の抗体に対して特異的な抗原
がその表面に刺着され、又はその表面の１部を構成して
いる。゛従って、融合化剤の非存在下では、このような
ミエローマ細胞と正常細胞の混合物中では、ミエローマ
細胞と特定の（所望の）抗体を産生している正常細胞と
の伺、７′１（最終的には雑種化）のみが起きる。これ
らの正割細胞はその表面に抗体様のレセプターを有して
いる。このレセプターか、ミエローマ細胞りに設けられ
た抗原性レセプターに結合する。この方法によると、所
望の雑種細胞（すなわち、所望の特定の抗原を実際にＪ
ｒ生しているもの）の数が、形成される全ての雑種細胞
の数に対して極めて大きく、従って、このような所望の
雑種細胞の単離がはるかに容易になる。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）継続的に分裂する細胞と継続的に分裂できない正
   常細胞との１又は２以−ヒの雑種細胞が形成される条件
   下において、前記継続分裂可能細胞と前記正常細胞とを
   反応容器内で混合する工程を含む、前記継続分裂可能細
   胞と前記正常細胞との生きた単１１１　Ｏｆ能な雑種細
   胞を単離する方法において、前記混合及び雑種化を、そ
   れぞれの反応容器内において１つの前記継続分裂可能細
   胞と１つの前記正常細胞との雑種細胞が１つ形成される
   ことを確保し得る、一定の数以下の前記継続分裂可能細
   胞と前記正常細胞とを含む複数の分離した個々の反応容
   器内で行なうことを特徴とする方法。
2. （２）前記継続分裂可能細胞は、遺伝的欠陥又は化学的
   に誘導された不活性化の故に特定の培地内では生存し得
   ないものであり、雑種化後、前記反応容器を前記特定の
   培地にさらし、それによって、一定の時間経過後、生き
   た細胞を含む容器は、前記継続分裂可能細胞と前記正常
   細胞との生きた雑種細胞を含むもののみとする特許請求
   の範囲第１項記載の方法。
3. （３）一定の数以下の前記継続分裂可能細胞と前記１［
   常１ｑ１１胞とを含む前記反応容器は、雑種細胞を形成
   する七境に対して透過的な半透膜性の囲包層からなるビ
   ーズである特許請求の範囲第１項記戦の力ｌ去。
4. （４）前記継続分裂可能細胞と前記正常細胞とを、複数
   のゲル化微小球を形成する条件下において、ゲル形成剤
   の存在下で混合し、形成された個々の前記微小球を次に
   半透膜性の囲包層で囲包し、その後、該囲包層内のゲル
   状材料を液化して除去し、それによって、前記半透膜性
   の材おｌからなり、その中にそれぞれの前記微小球中に
   もともと存在していた細胞を含む複数のビーズを形成す
   る特許請求の範囲第３項記載の方法。