JPS6022683B2 - 赤血球の酸素放出特性を改良する方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、小さなアロステリック因子、例えばィノシッ
トヘキサリン酸を含有する脂質胞と融合した、優れた０
２放出特性を有する赤血球、及び該赤血球並びに該赤血
球を含有する血嬢を調製する方法に関する。

赤血球の王なる機能の１つは分子状酸素を肺から末梢組
織へ輸送することにある。

赤血球には、０２と可逆的な付加物を形成するヘモグロ
ビン（Ｈｂ）が高濃度で含まれている（細胞当たり３の
ｇ、即ち、３５．５夕／細胞１００ｍ‘）。Ｑ分圧は、
肺では約１０Ｗ舷Ｈｇであり、酸化されたヘモグロビン
から０２が解離されなければならない毛細管では約７仇
廠Ｈｇである。生理的条件下では、酸化されたヘモグロ
ビンの僅か約２５％が酸素を放出し、約７５％が静脈血
と共に肺にもどる。この様にＨｂ−０２付加物の大部分
がＱ輸送のために利用されていない。Ｈｂとアロステリ
ツク因子の相互作用によって、毛細管系において出来る
限り高い０２分圧を総持つつ、Ｈｂ−０２付加物からの
、生理的に要求される最大０２一放出を達成することが
できる。

Ｈｂのァロステリック特性は、Ｓ字状の酸素結合曲線に
あらわれる。その半飽和圧（Ｐｏ２（１／２））は０２
親和性の指標である。４０ないし６０％飽和範囲におけ
るＳ字状曲線の煩斜度は、Ｈｂ中の４個の０２結合部位
の共鰯性の程度を示す（ヒル係数〔Ｈｉｌｌｃ礎ｆｆｉ
ｃｉｅｎｔ〕：ｎ＝２．８−３．２）。

ヒル係数が増大すると、即ち、Ｓ字状結合曲線が急こう
配になると、あるいは、この結合曲線全体が０２分圧の
高い方へシフト（移動）すると（いわゆる右シフト）、
毛細管系での０２放出が促進され、周囲の組織への酸素
の供Ｖ給が改善されることになる。赤血球中の２・３−
ピスホスホグリセレートレベルを高め、そのヘモグロビ
ンとの結合を高めることによって、右シフトは実際に達
成される。２・３−ビスホスホグリセレートがＨｂ結合
すると０２親和性が減少し、０２半飽和圧が増大する。

赤血球中の鱗糖バイパス（副行路）で合成される２・３
−ビスホスホグリセレートは、０２欠乏する緩慢な適応
のための因子である。２・３−ビスホスホグリセレート
は、ＰＨ７．４において、分離したヘモグロビン（ｓｔ
ｒｉｐｅｄｈａｅｍｏｇｏｂｉｎ）の半飽和圧を、３７
０の場合にはＰｏ２（１／２）＝９．、肋日鰍）ら２３
７肋Ｈｇに、２５二０の場合にはＰｏ２（１′２）＝４
．３凧Ｈｇから１２．０豚Ｈｇに、それぞれ上昇される
（ｌｍ風、Ｋ．ａＭＹｏ船ｔａｎｉ、Ｔ．（１９７５）
、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５０ １０＄一１０斑）
。

植物組織から単欧されたイノシットヘキサリン酸（フィ
チン酸；ＩＨＰ）を分離したヘモグロビンに結合させる
と、０２親和性が非常に減少し、０２半飽和圧が高くな
る（Ｒｕｃｋｐａ山、Ｋ．ｅｔａｌ．（１９７１）Ｂｉ
比ｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈ＄．Ａｃｔａ ２３０ ２１１−
２２１）。ＩＨＰをヘモグロビンに結合させると、０２
半飽和圧は３７００でＰ。２（１／２）＝９６．４凧Ｈ
ｇ、２５００でＰ。

２（１／２）＝４８．４肌Ｈｇに、それぞれ上昇する。

ＩＨＰは、２・３−ビスホスホグリセレートおよびその
他のポリホスフェートの様に、赤血球膜を浸透すること
ができない。脂質胞は細胞膜の性質の一部を表わす。

脂質砲は、細胞原形質膜との融合あるいはエンドシトシ
ス（ｅｎｄＭｙｔｏｓｉｓ）により細胞内へ浸入するこ
とができる（ＰａｒａｈａｄＰｐｏｕｌｏｓ、Ｄ．ｅｔ
．ａｌ．（１９７６）Ｎａｔｍｅ ２５２、１６３一１
６５）。この融合は、例えばシナプス伝導、排他、原形
質膜集合、被膜ビールスによる感染などの多くの膜過程
において重要な意味を持っている。

血球と脂質胞との融合は、細胞培養において、幻影赤血
球を用いて達成された。ＭＬセル（細胞系−ネズミリン
パ腫）を、コクサッキウィルスＡ−なに対し高い中和価
を有する１ｇＧを含有している小胞で処理すると、この
細胞は、このウイルスによるその後の感染から保護され
る。

グレゴリアジス（Ｏｒｅ数ｒｉａｄｉｓ）およびバック
ランド（ＢＭｋｌａｎｄ）はインベルターゼ（転化酵素
）を、ィンベルタ−ゼ欠損マウスマクロフアージ（大食
球）に入れるために脂質胞を使用している（Ｎａｔｍｅ
（１９７３）２３５ ２５２−２５３）。しかし、ィン
ビボ実験では、この脂質胞は無差別に全ての細胞に入っ
たり、肝臓で素早く分解されるので、明白な成果を得る
には至らなかった。現在までに、アロステリック因子ま
たはその他の物質を赤血球に混入させるために脂質砲を
使用したという報告はない。脂質胞は、危険を伴うこと
なく動物に注射し得ることが多くの実験の結果わかつて
いる。分離したＨｂの構造や機能に及ぼすＩＨＰの影響
については詳細に研究されているが、これまで、無損傷
の（完全な）赤血球中にＩＨＰを混入させることは不可
能であったので、無損傷の赤血球中のヘモグロビンとｍ
Ｐとの相互作用に関するデータはない。

驚くべきことに、赤血球膜と融合し得る流動性を負荷し
た脂質砲を用いて、赤血球中に川Ｐの如きアロステリツ
ク因子を混入することができることが見し、出された。

ここでは、その高い結合定数の故に、それは、ヘモグロ
ビン中のその結合部位において、２・３ービスホスホグ
リセレートに取って代わる。この条件下において、赤血
球中のＨｂは、０２親和性が非常に低いアロステリック
構造に変わる。０２親和性が低くなると、即ち、赤血球
中のヘモグロビンの０２半飽和圧が高くなると、かなり
０２分圧が高くても結合０２を解離する赤血球の能力が
増大し、従って組織に対する０２供給が改善される。

ｍＰを混入された、従って組織に対して優れた０２供給
能を有する赤血球は、次の様な場合に使用することがで
きる。

１ 吸入する空気の０２分圧が低い場合、即ち、標高の
高い山での登山家および０２の希薄な大気中での宇宙航
行家。

２ ０２交換表面が減少した場合、即ち、腕気腫におけ
る腕胞の数の減少。

３ 肺において０２拡散に対する抵抗が増大した場合、
即ち、肺炎または端息など。

４ ０２輸送能の低下、即ち赤血球減少、あらゆるタイ
プの貧血状態、動静脈短絡。

５ 血液循環障害、即ち動脈硬化、血栓寒栓症、器管硬
塞、虚血状態。

６ ヘモグロビンの高い０２親和性、即ち、ヘモグロビ
ン突然変異、ヘモグロビン鎖におけるＮ末端アミノ酸の
化学変化、例えば真性糖尿病、赤血球中の酵素欠損。

７ 改善された酸素供給による解毒過程の促進。

８ 保存血液の０２親和性を減少させるために、即ち、
輸液、ショック状態。

９ 癌の放射線治療の改善。

赤血球に混入するァロステリック因子としては、既知の
生理的因子、２・３−ビスホスホグリセレートおよびア
デノシン三燐酸よりもヘモグロビンに対する親和性の高
いものが使用される。

特にィノシツトヘキサリン酸がアロステリツク因子とし
て好ましい。その他の楯ホスフェート類、例えばィノシ
ツトベンタリン酸、ィノシットテトラリン酸、ィノシツ
トトリリン酸、ィノシツトジリン酸およびジホスフアチ
ジルイノシツトジリン酸などもアロステリック因子とし
て使用することができる。その他のアロステリツク因子
としては、ポリホスフェート糖、例えばヌクレオチドト
リリン酸、ヌクレオチドジリン酸、ヌクレオチドモノリ
ン酸、およびアルコールホスフェートェステル類などが
好適である。

ある種のヘモグロビン突然変異の場合、例えばチューリ
ッヒ（Ｚｕｒｉｃｈ）ヘモグロビンの場合、ポリカルボ
ン酸類の如き有機ァニオンをアロステリツク因子として
使用することができる。

最後に、ヘキサシアノ鉄酸塩、ホスフェートまたはクロ
ラィドの如き無機ァニオン類をアロステリック因子とし
て使用することもできる。

脂質胞はホスフアチジルコリン／ホスフアチジルセリン
／コレステロールの混合物であって、これらは１０〜５
：４〜１：１０〜３のモル比で使用される。

特に好適なモル比は８：２：７であるが、９：１：８の
モル比のもの、および８：４：７のモル比のものも好ま
しい。流動恒体としては、通常の流動損体、特に、例え
ば等張ビスートリス緩衝液の如き既知の緩衝化した生理
的担体が使用される。

脂質胞は、赤血球膜と融合できなければならない。

完全な赤血球にアロステリック因子を混入させることに
より、赤血球のヘモグロビンを、容易に酸素を放出する
アロステリツクコンホメーションの赤血球に変換するこ
とができる。本発明方法により、血液酸素の効率の良い
利用を約束する改良赤血球を調節することができる。

この改良赤血球は、アロステリツク因子を不可逆的に混
入させることによって得られる。即ち、脂質砲を赤血球
膜と融合させ、この様にして、導入されたアロステリツ
ク因子を赤血球中のヘモグロビンと結合させるのである
。例えばＩＨＰをアロステリツク因子として使用する場
合には、まず脂質胞に阻Ｐを付加し、この脂質胞が赤血
球と融合し、その後ＩＨＰがヘモグロビンと結合する。

これによってヘモグロビンのアロステリツクコンホメー
ションがおこり、その酸素に対する親和性が変化する。
アロステリック因子と脂質胞の結合物を赤血球へ混入さ
せる操作は体外で行なう。

この操作中は、赤血球は採取血液から分離し、アロステ
リツク因子を伴った脂質胞を混入させてこれを改良し、
この改良された赤血球を血数にもどす。

従って、改良赤血球を含有する血液を保存することがで
きる。改良赤血球は、生理的担体に含ませ、血液循環に
おける輪注や注射に使用することもできる。

本発明に係る改良赤血球の特に好ましい調製法を以下に
記載する。【ａ１ ィノシツトヘキサリン酸を等張緩衝
液に、溶液が飽和するまで溶解する。

｛ｂ）ホスフアチジルコリン、ホスフアチジルセリンお
よびコレステロールのモル比が１０〜５：４〜１：１０
〜３である脂質胞混合物を（ａ｝の溶液に懸濁する。

【ｃ｝ 全調製懸濁液を超音波処理または注射法で崩壊
させる。

‘ｄ｝ この混合物を遠心分離し、上層の懸濁液を分離
する。

この上層懸濁液はィノシットヘキサリン酸に富んだ小さ
な脂質胞と遊離のィノシットヘキサリン酸を含有する。
｛ｅー 遠心分離によって血酸から分離したヒト赤血球
を【ｄーの上層懸濁液に懸濁する。

Ｍ インキュベーションによりこの脂質胞（小胞）は赤
血球と融合する。

亀）改良された完全な赤血球を等張ＮａＣＩ溶液または
等眼緩衝液で洗浄する。

こうして遊離のィノシツトヘキサリン酸を定量的に除去
する。次いでこの調製済赤血球を血数または代用血液に
懸濁する。以下に添付の図面について説明する。

第１図 ４℃で保存した赤血球内ヘモグロビンの時間経
過による０２親和性の増大。

０２半飽和圧Ｐｏ２（１／２）を、Ｃ０２の非存在下、
２ｙｏで測定した。

実線はＡＣＤ中で貯蔵した赤血球（ＲＢＣ）、破線は０
．１払モルのＮａＣＩを含有するｐＨ７．４の等張０．
皿Ｍビスートリス緩衝液で貯蔵した赤血球である。第２
図 ４℃における、貯蔵時間による赤血球内ヘモグロビ
ンの０２結合曲線の左シフト。

ＲＢＣは４℃で、０．１私モルＮａＣＩを含有する班７
．４の等張０．１０Ｍビスートリス緩衝液中で貯蔵した
。結合等温線はＣ０２の非存在下、２５０で測定した。
実線はポリホスフェートを完全に油渇させたＲＢＣ。破
線はポリホスフェート潤滑の半減期のＲ８Ｃ（７１／２
＝虹）、一点破線は新鮮なＲ８Ｃ。矢印はＱ分圧３仇舷
Ｈｇにおおるヘモグロビンの不飽和度を示す。第３図
Ｃ０２非存在下での、２５ｏｏにおける０２結合曲線の
ｐＨ依存性。

ＲＢＣは０．１５４モルＮａＣＩを含有するｐＨ７．４
の等張０．１■Ｍピスートリス緩衝液中、４００で１７
日間貯蔵した。破線はｐＨ７．７２、実線は−７．４２
、一点破線はｐＨ７．０＆ 矢印は０２分圧３０肋Ｈｇ
におけるヘモグロビンの不飽和を示す。第４図 Ｃ０２
の非存在下での、２５ｏｏにおける赤血球内ヘモグロビ
ンのボーア効果。

０．１私モルのＮａＣＩを含有する。

ｐＨ７．４の等張０．１０モルビスートリス緩衝液中、
４００で１７日間貯蔵したＲＢＣ。第５図 赤血球への
不可逆性のＩＨＰ混入。ＰＨ７．６でＶ２（後記参照）
仲介したＩＨＰの混入前後において、Ｃ０２の非存在下
、２５午○で赤血球の０２半飽和圧を測定した。ＲＢＣ
は０．１５４モルＮａＣＩを含有するｐＨ７．４の等張
０．１０ビスートリス緩衝液中、４℃で貯蔵した。実線
（一〇−○−○−）はＲＢＣのポリホスフェート潤潟曲
線。口←→口はＰＨ７．６でＩＨＰ混入、ＩＨＰ付加し
たＲ８Ｃを４℃で貯蔵。△←→△はｐＨ７．６でＩＨＰ
混入、ＩＨＰ付加ＲＢＣを３７０で貯蔵。ＩＨＰ混入は
標準条件下で行なった。図中、線１はその左側がポリホ
スフェート洞潟、右側がＩＨＰ混入を示す。第６図 Ｃ
０２非存在下での、２５℃における。

ＩＨＰ付加赤血球のボーア効果。点線はｐＨ７．６にか
けるＶ２−仲介によるＩＨＰ混入。実線はｐＨ７．８に
おけるＶ２一仲介によるＩＨＰ混入。ＲＢＣは０．１私
モルのＮａＣＩを含有するｐＨ７．４の等張０．皿Ｍビ
スートリス緩衝液中、４℃で貯蔵。ｍＰ混入は標準条件
下で行なった。第７図 ０２結合等温線の右シフトに及
ぼす小胞組成の影響をＣ０２の非存在下、２５ｏｏ、ｐ
Ｈ７．６で測定した。

ｐＨ７．６におけるｍＰの混入は標準条件下で行ない、
細胞をｐＨ７．６の等張緩衝液に懸濁した。一点破線は
０．１弦モルのＮａＣＩを含有するｐＨ７．４の等張０
．１のＭビスートリス緩衝液中１９日間貯蔵したＲＢＣ
。破線はＶＩ仲介ＩＨＰ混入後のＲＢＣ。二点破線は新
鮮なＲ的。実線はＶ２仲介１冊混入後のＲＢＣ。矢印は
３０肋Ｈｇの０２分圧下におけるヘモグロビンの不飽和
を示す。第８図 ３７℃におけるｍＰ付加小胞の安定性
。

破線はＶ幻・胞。実線はＶ乳・胞。小胞で仲介されたＩ
ＨＰは、ｐＨ７．４で、標準条件下でＲ８Ｃに混入され
た。ｍＰ付加赤血球のＰｏ２（１／２）はＣ０２の非存
在下、２ｙＣで測定した。第９図１４Ｃコレステロール
の、小胞から完全赤血球への混入の動力学。

インキュベーションは、０．１鼠モルのＮａＣＩを含有
するｐＨ７．４の等眼０．１Ｍビスートリス緩衝液中、
３？○で行なった。−×一×−×一は１４Ｃ−コレステ
ロールで・ラベルしたＶ２小胞。一△−△一△一は１℃
ーコレステロールでラベルしたＶ乳・砲。−○−○−○
一は１℃ーコレステロールでラベルしたＶ１小胞。図中
、１はｔｌ／２＝４５を表わす。第１０図１４Ｃーコレ
ステロールの、Ｖ２４、胞から完全赤血球への混入の動
力学。

放射活性は、Ｆｏｌｃｈ抽出赤血球脂質中で測定した。
インキュベーション条件は第９図の場合と同じである。
第１１図 脂質胞からの、ヘラ細胞（Ｈｅｌａｃｅｌｌ
）による１４Ｃ−コレステロール取り込みの動力学。ｐ
Ｈ７．４の燐酸緩衝食塩水中、３７ｑ０でインキュベー
ト。−×−×一は小胞Ｖ２、一○−○一は小胞Ｖん第１
２図 小砲からのへラ細胞による１４Ｃーコレステロー
ル取り込みのｐＨ依存性。

条件は第１１図の場合と同じ。−○−○一は１℃−コレ
ステロールでラベルしたＶ３小胞。−×−×一は同Ｖ２
小胞。第１３図 ｍＰ付加赤血球の０２半飽和圧に及ぼ
すインキュベーション煤質のｐＨの影響。

Ｐｏ２（１′２）はＣ０２の非存在下２５ｑ０で測定し
た。第１４図 外部煤質中のｍＰの存在下での、ｐＨ７
．斑における、赤血球へのＶ２仲介ＩＨＰ浸入の動力学
。５７日間経過（５７日年令）のＲＢＣのインキューベ
ーションは、標準条件下で行なった。

Ｐｏ２（１／２）はＣ０２の非存在下、２５ｑｏで測定
した。第１５図 Ｖ２仲介ＩＨＰ混入の半減期に及ぼす
インキュベーション煤質のＰＨの影響。ＲＢＣは外部煤
質中のｍＰと共に標準条件下でインキュベートした。Ｐ
ｏ２（１／２）はＣ０２の非存在下２５℃で測定した。
第１ ６図 外部煤質中のＩＨＰの在存下における、ｐ
Ｈ７．４での、赤血球によるＶ２−仲介ＩＨＰ取り込み
の動力学。

インキュベーションは標準条件下で行なった。Ｐｏ２（
１／２）はＣＱの非存在下、２５℃で測定した。第１７
図 ｐＨ７．４において、Ｖ２−仲介ＩＨＰの赤血球に
よる取り込み前後の０２結合曲線。

インキュベーションは、ＰＨ７．６において、標準条件
下で行なった。脳の臨界０２分圧３仇舷Ｈｇに対する赤
血球による０２放出を矢印で示した。２５ｑｏにおいて
：実線は４１年令の赤血球（５％０２放出）；破線ｍＰ
−付加赤血球（４７％０２放出）；３７０において：一
点破線は４１年令の赤血球（２１％０２放出）；三点破
線はＩＨＰ付加赤血球（８０％○２放・出）。

毛管における赤血球内ヘモグロビンの酸素不飽和の程度
は、静脈の０２分圧に依存するばかりではなく、特に赤
血球内のヘモグロビンの酸素親和性に依存する。

０２親和性をコントロールする赤血球内アロステリツク
因子はボーアプロトン、ＣＱおよび有機リン酸化合物、
特に、ＤＰＧ（２・３−ビスホスホグリセレート−天然
アロステリック因子）およびＡＴＰ（アデノシン三機酸
）などである。

貯蔵赤血球中のＤＰＧおよびＡＴＰが洞渇すると、次第
に酸素親和性が増大する（母ＩｃｅｒＺａｋ、Ｓ．ｅｔ
ａｌ．（１９７２）Ａｄｖ．Ｅｘｐ．ＭｅｄＢｉｏｌ
．２８ ４３３−４４７）。

これは、貯蔵時間（赤血球を４℃で貯蔵）に対して、半
飽和における０２分圧（２５ｑ０で測定）をプロットし
た第１図に示されている。Ｑ結合等温線は、Ｃ０２の非
存在下、一定のｐＨ（７．４）において測定した。これ
は、半飽和圧に及ぼすこれらアロステリック因子の影響
を除外するためである。漸進性のポリホスフェート油潟
の終点はＰ。２（１／２）＝４．２凧Ｈｇによって決定
され、これは完全にリン酸塩のない（はだかの）ヘモグ
ロビンの半飽和圧である。

出発点、即ち新鮮な血液のＰ。２（１′２）は懸濁煤質
の組成に依存する。

これらのポリホスフェート酒潟カーブから、貯蔵赤血球
の新しい機能パラメーター、いわゆる赤血球内ポリホス
フェートの半減期を求めることができる。それは、斑７
．４の等張０．１Ｍビスートリス緩衝液中では９日であ
り、ＡＣＤ（酸−クエン酸塩ーデキストロース：保存溶
液）安定イＱ客液中では１２日である。赤血球中のポリ
ホスフェートの綱渇は０２結合等温線の左シフトをもた
らし、従って、酸素放出能の減少となる。

４℃で貯蔵した赤血球の０２結合曲線の左シフトおよび
酸素放出能の減少を２５０で測定した結果を第２図に示
す。

０２分圧３０脚Ｈｇにおいては、新鮮な赤血球の不飽和
度は１１％であるが、ポリホスフェートを半分欄潟した
赤血球の不飽和度は僅かに１％である。

ポリホスフェート洞湯赤血球の０２結合曲線の左シフト
は組織への酸素輸送を損なうこととなる。

したがって、貯蔵血液（ＤＰＧ欠乏）を大量に輸液する
と、筋肉のｐＨが低下し、皿糠中の乳酸レベルが増大し
、輪液症候群として知られている。血圧低下をきたす（
Ｋｅｙｙ、Ｓ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．（１９７２）Ａｄｖ．
Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２＆ ５１１一５１６）。
このｐＨ低下は、第３図に示す様に、部分的にのみこの
左シフトに反作用的に働く。０２分圧３仇岬Ｈｇにおい
てＰＨ７．４２から７．０８にかわると、赤血球（ｐＨ
７．４の等張０．１Ｍビスートリス緩衝液中、４℃で１
７日間貯蔵）の酸素不飽和度は１％から５％に増える。

しかし、ｐＨ７．４６において、新鮮な赤血球において
観察される１１％の不飽和度はボーア効果によってのみ
達成されるのではない（第２図）。等張０．１Ｍビスー
トリスおよびトリス緩衝液にそれぞれ懸濁した貯蔵赤血
球の０２親和性に及ぼす州の影響（ポーア効果）は、ｐ
Ｈ７．０ないし７．８の範囲に関して第４図に示してあ
る。４℃で１７日間貯蔵した赤血球を用いて、Ｃ０２の
非存在下、２５ｏｏで、０２結合曲線を測定した。

これらの古い赤血球は、ヘモグロビンの０２親和性にお
けるポリホスフェ−ト効果の半分以上を失っている（第
１図参照）。ボーア効果、一△Ｐｏ２（１／２）／△ｐ
Ｈは０２１モル当たり０．球プロトンになる。結合酸素
と共に放出されるボーアプロトンの数は、既に７５％の
ポリホスフェート効果が失われている場合は少くともＲ
８Ｇ年令が３４日までは一定である。従って、貯蔵、即
ちポリホスフェ−トの酒潟は赤血球のボーア効果に影響
を及ぼさない。実施例 人血の採集及び貯蔵 若い健康な志願者から１００のとの血液をとり、ＡＣＤ
安定化剤５０机上を含む２５０机【容量のバイオフラス
コ（ＢｉｏｔｅＳｔ一Ｓｅｍｍ−ｌｍ山川ｅ、Ｆｒａｎ
ｋｆｕｎａ．Ｎねｊｎ）に入れる。

この試料を４００で保存する。ヒト赤血球の採集及び貯
蔵若い発端者から採集した３００の‘の血液を、凝血を
妨ぐためにへパリンまたはクエン酸ナトリウムを入れた
プラスチック袋に集める。

この血液を氷俗で冷却し、その後の操作を４℃で行なう
。２３５０瓜ｇで２０分間遠心分離し、赤血球を血※か
ら分離する（Ｓｏｗａｌｌ、Ｔｙｐｅ ＲＣ−波；Ｒｏ
ｔｏｒＳＳ３４；１２００比ｐｍ）。

集めた赤血球をｐＨ７．４の等張食塩ビスートリス緩衝
液（０．１０モルビスートリス、０．１５４モルＮａＣ
Ｉ）中に懸濁し、遠心分離する。この洗浄操作を３回く
り返す。最後に、集めた赤血球をｐＨ７．４の等眼食塩
ビスートリス緩衝液３００羽に懸濁し４℃で貯蔵する。
赤血球懸濁液のｐＨ測定及び調整 ｐＨ７．４の等張０．１Ｍ緩衝液およびＡＣＤ中で貯蔵
した赤血球を、それぞれ、８００舷ｇで２分間、室温で
遠心分離する（Ｅｐｐｅ肘ｏげ Ｃｅｎｔｒｉｆｕ鞍、
Ｔｙｐｅ３２００；１２００仇ｐｍ）。

赤血球懸濁液の所望のｐＨは、緩衝煤質をくり返し交換
することによって調節する。血球を所望の緩衝液に懸濁
し、再び遠心分離する。この操作を一定のＰＨになるま
でくり返す。ｐＨは、ガラス電極を用いて、２５００で
測定する。（ｌｎ籾ｌｄ、Ｆｒａｎｋｆ山ｔ ａ．ＮＰ
ｉｎ、Ｔｙｐ．４０６−Ｍ入 ａ＝３５柵）。ｐＨ側定
の正確度は±０．０２単位である。ＩＨＰ付加脂質胞の
調製 ＩＨＰをｐＨ７．４の等張ビスートリス緩衝液（０．皿
Ｍビスートリス、０．１５４モルＮａＣＩ）に、例えば
室温ないし５０ｏｏで、飽和するまで溶解させる。

ホスフアチジルコリン（ＰＣ）、ホスフアチジルセリン
（Ｒ）、コレステロール（ＣＨ）からなる脂質混合物（
モル比：ＰＣ：的：ＣＨ＝８：２：７、表１参照）をこ
の溶液に懸濁し、約５ぴ○で、窒素気流下で４５分間超
音波処理する。小胞調製における温度は、緩衝液の氷点
およびポリホスフェートの熱安定性によってのみ制限さ
れる。この超音波処理は、チタン侵入探触子（ｔ舷ｎ
ｄｉｐｐｒｏｂｅ、ｌｏｋ比）を有する超音波粉砕機（
Ｓｃｈ６１１ｅｒ、Ｔｙｐｅ１２５、Ｒａｎｋ机ｎ ａ
．Ｍａｉｎ）を用いて行なう。超音波処理は、好ましく
は１００Ｗ′地以上のエネルギーで効果的に行なうこと
ができる。超音波処理の後、小胞懸濁液を、２−Ｃで、
超遠心分離器（Ｂｅｃｋｍａｎｎ、ＴｙｐＬ５一６５
Ｒｏｂｒ６０）を用いて１００００瓜ｇで１時間遠心分
離する。上燈液は、直径が５００Ａあるいはそれ以下で
ある小胞質胞を含有している。この小胞が形成される時
、その小胞は脂質が懸濁しているその溶液を包含する。
表１脂質砲の組成キ 実施可能をモル比範囲（ＶＩ−Ｖ
３）二ＰＯ：ＰＳ：ＯＨ＝１０〜５：４〜１：１０〜３
ホスフアチジルセリンは牛の脳から（Ｋｏｃｈ−Ｌｉｇ
ｈｔ、ＧＢ）、ホスフアチジルコリンは卵黄から（Ｌｉ
ｐｉｄＳｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ、靴ｓｔｏｎ、ＵＳＡ）
のものである。

コレステロールおよびイノシツトヘキサリン酸のナトリ
ウム塩はそれぞれＭｅｒＣｋ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）お
よびＳｉｇｍａ（ＭＵｎｃｈｅｎ）製のものである。

全ての脂質はカラムクロマトグラフイーによって精製し
、その純度を薄層クロマトグラフィーによって検査した
ｌｎｍｏｌ／その脂質から二重層（ｂｉｌａｙｅｒ）の
脂質砲（小胞、ｄ≦５００Ａ）が２×１ぴ１得られる。
２×１び１の脂質範と１ぴの赤血球をインキュベートす
るが、後記する様にそれ以外の比率でもよい。

ヒト赤血球へのィノシットヘキサリン酸の混入ィンビト
ロ実験用として、２０叫どの赤血球懸濁液を室温で、８
００瓜ｇで２分間遠心分離する（Ｅｐｐｅ風ｏＭ Ｃ
ｅｎｔｒｊｆｕ袋 、 Ｔｙｐｅ３２００ 、１２００
仇ｐｍ）。

要すれば、集めた血球を洗浄し、上記した如く所望の柵
に調節し、次いで所望のｐＨの等張０．１Ｍ緩衝液２０
叫そに懸濁する。これに同量の所望のｐＨの脂質胞懸濁
液を加える。この赤血球を１時間、３７０でインキュベ
ートする。赤血球は、一定のｐＨになるまで、等張０．
１Ｍ緩衝液でくり返し洗浄する。上澄液につき、もはや
遊離の田Ｐが検出されなくなるまでＣａ２十による沈降
テストを行なう。ｐＨ範囲７ないし８で効力があり、赤
血球の構造的、形態学的および機能的統合性に影響を与
えない緩衝液あれば、いかなるものであっても使用する
ことができる。Ｑ結合曲線の測定 ０２結合曲線は、迅速分散技術により、２５℃で測定し
た（Ｓｉｃｋ、日．ａｎｄ ＱｒｓｏＭｅ、Ｋ．（１９
６９）、Ａｍａｌｙｔ，Ｂｉ比ｈｅｍ，３２ ３６２−
３７６；Ｓｉｃｋ、日．ａＭ蛇岱ｏｎｄｅ、Ｋ，（１９
７２）、４７、４６‐５６）。

結果小胞と融合した後の貯蔵したヒト赤血球のボーア効
果．ｐＨ７．４の等張緩衝媒質中、４℃で４０日間貯蔵
された、そして部分的にポリホスフェートが個渇したヒ
ト赤血球の０２半飽和圧、それと共に（ｎ＝２．８）ボ
ーア効果は、３７℃で１時間、舟７．６の等張緩衝液中
で小胞Ｖ２とインキュベーションした後は、顕著な変化
をしなかった。

まらに、赤血球を他の脂質組成を有する小胞（Ｖ，およ
びＶ３）と共にインキュベートした場合も、赤血球内の
ヘモグロビンの０２結合パラメーターに影響を与えなか
った。小胞で仲介されて（Ｖ２）ィノシットヘキサリン
酸を混入された後の、貯蔵されたヒト赤血球のポーア効
果現在までに知られている最も強力なへモグ。

ビンのァロステリック因子であるＩＨＰは、０２結合曲
線の右シフトで示される様に、ヘモグロビンの０２親和
性を減少する。ＩＨＰを合成することができないヒト赤
血球は、この因子を含有している脂質胞と融合する間に
、このポリホスフェートを付加され得る。本発明におい
て、例示的に記載されているＩＨＰの混入についての実
験は、基本的には、全てのアロステリック因子、例えば
糟ホスフェ−ト、例えばイノシットベンタリン酸、イノ
シツトテトラリン酸、ィノシツトトリリン酸、ィノシツ
トジリン酸、およびジホスフアチジルイノシツトジリン
酸、さらにポリホスフェート、例えばヌクレオチドトリ
、ジ、およびモノホスフエート、アルコールホスフェー
トェステル類などについても同じ様に適用し得る。赤血
球膜を通過し得る、因子としての特性を持った無機アニ
オン類（ヘキサシアノ鉄酸塩（Ｄ）、ホスフェートおよ
びクロリド）も使用することができる。突然変異を示す
ヘモグロビンの特殊な場合には、ポリカルポン酸の如き
有機アニオンがアロステリツク因子として使用し得る。
ポリカルボン酸の例としては、マレィン酸がチューリッ
ヒヘモグロビンの場合に使用し得る。班７．４の等張緩
衝嬢質中、４℃で２５日間貯蔵したヒト赤血球（Ｐｏ２
（１／２）＝６．０肋Ｈｇ）を、ｐＨ７．６に調節しく
Ｐｏ２（１／２）＝４．５肋Ｈｇ）、次いで、也Ｐ付加
Ｖ幻・胞と共に、０．１９モルのｍＰを含有しているｐ
Ｈ７．６の等張０．１モルトリス緩衝液中、３７℃で１
時間インキュべ−トする。

赤血球にｍＰが混入した後、０２半飽和圧は急激に上昇
して３．２倍となり（Ｐ。２（１／２）＝１４．３肋Ｈ
ｇ）、新鮮な赤血球の価を超える（Ｐｏ２（１′２）＝
１０．５５肋Ｈｇであって、これの１．４倍）。

次いでこのＩＨＰ付加した赤血球をｐＨ７．６の等張緩
衝煤質中、４℃で６日間貯蔵する。この場合、半飽和圧
は一定であった。４℃でさらに４日間貯蔵した後、ｍＰ
付加赤血球をｐＨ７．２８に変えると、Ｐｏ２（１／２
）は再び３２．１肋Ｈｇに増加した。

他の実験では、４℃で３６日間貯蔵した洗浄赤血球をｐ
Ｈ７．６に調節し、上記と同様にしてＩＨＰを混入させ
た。Ｐｏ２（１／２）は１４．０肋Ｈｇに増大した。Ｉ
ＨＰ付加細胞を３７０で２日間貯蔵した。これらのｍＰ
付加血球を３７０で２日間貯蔵した後も０２親和性の変
化は観察されなかった。４℃で貯蔵する間に生理的ポリ
ホスフェートが半分油渇する正常の赤血球とは異なり、
ＩＨＰ付加赤血球は、一定のＰｏ２（１′２）値を示す
（第５図参照）ことからもわかる様に、少くとも９日間
はＩＨＰを加水分解しないと思われる。

従って、この様に処理された赤血球は、実質的に長期間
貯蔵することができる。このほか、ｍＰ付加赤血球は、
非処理血球より大きなボーア効果を示す（第６図）。

遊離ＩＨＰの存在下、ｐＨ７．６でｍＰ付加Ｖ２４・胞
とインキュベートし、それぞれの等張０・ＩＭ緩衝液で
洗浄することによって所望のｐＨに調節した赤血球の、
Ｃ０２非存在下におけるボーア効果は、０２１モル当た
り、一△Ｐｏ２（１／２）／△ｐＨを＝１．２０プ。

トンとなる。ＩＨＰ付加赤血球のボーアプロトン放出は
正常の新鮮な赤血球の３倍大きい。従って、ｍＰ付加血
球は組織においてより効果的に酸素を放出し、肺に於い
てより効果的に酸素を摂取する。斑７．８においては、
遊離ｍＰの存在下でのｍＰ付加Ｖ幻・胞によるＩＨＰ混
入はもっと効果的である。ｍＰ付加血球のＰＨを７．４
に変えると、理論的に期待されるＰｏ２（１′２）＝３
５肌Ｈｇへの増大が観察される（第６図参照）。一方、
ｐＨ７．８では、露入後、ボーア効果は小さくなる様に
思われる（０２１モル当たり、一△Ｐｏ２（１／２）／
△ｐＨ＝０．９プロトン）。ヒト赤血球によるィノシッ
トヘキサリン酸摂取に及ぼす小胞組成の影響ヒト赤血球
により摂取されたｍＰの量は、０２結合曲線の右シフト
の大きさとして測定される。

即ち、標準条件下で測定された０２半飽和圧は、混入効
率の１つの指標である。このＩＨ球受取効率は、小胞の
脂質組成に著しく依存している。第７図には、ＶＩおよ
びＶ２をｐＨ７．６でインキュベートした後の、０２結
合曲線の右シフトが例示されている。Ｖ２４・砲は最も
大きな右シフトを示し、３物舷Ｈｇにおける不飽和度は
１４％である。１９日年令の赤血球はこの０２圧では不
飽和度は零であり、新鮮な赤血球では不飽和度は５％で
ある。Ｖ２小胞によりＩＨＰを混入したものは、３０仇
舷Ｈｇにおける、正常な赤血球の０２放出にくらべ約３
倍改善されている。Ｖ２とＶの・胞は、同じだけの赤血
球によるＩＨＰ摂取を促すので、０２結合曲線の右シフ
トは同じである。ＩＨＰを含有するＶ１、Ｖ２およびＶ
３小胞の外部煤質中にＩＨＰが存在しなくても、その混
入の半減期（７１／２）に関してはかわりはなく、３０
分である。

ＶＩおよびＶ３は、透析したＩＨＰ付加ＶＭ・胞につい
て測定したＩＨＰ効果の半分以下である。これは、ＶＩ
およびＶ３の安定性が低いことを示している。第８図に
は、Ｖ２とＶ３の安定性の違いが示してある。Ｖ２の安
定性の半減期は３日であり、Ｖ３のそれは、１．５日で
ある。小胞の血球への混入１４Ｃ−コレステロールまた
は１４Ｃ一ホスフアチジルコリンでラベルした小胞Ｖ１
、Ｖ２およびＶ３を用いて、脂質胞の完全赤血球への混
入を行なった。

これを、培養へラ細胞への同じ小胞の混入と比較した。
放射活性を、完全赤血球（可溶化とルマック（Ｌｕｍａ
ｃ）試薬一式を用いた漂白による）及び全脂質ホルヒ（
Ｆｏｌｃｈ）抽出物について測定した。混入は４時間を
要して行なった。結果を第９図及び第１０図に示す。第
９図は完全赤血球を用いた場合の小胞Ｖ１、Ｖ２および
Ｖ３についての結果を示す。インキュベーション嬢質は
、餌７．４の等叢０．１Ｍビス−トリス緩衝液中１０Ｍ
のｍＰ付加小胞と１０の‘のＲＢＣを含有している。１
０、２０、４０、６以９０、１２０、１８０および２４
０分後に試料を採取し、カウントした。

混入の半減期は、Ｖ２小胞（これはまたＲＢＣにおいて
も最高の放射活性レベルを示す）については４９分、Ｖ
ＩおよびＶ２については３５分であった。ＲＢＣ中に見
し、出される放射活性が必ずしも小胞の混入を意味する
ものではないことに注意しなければならない。何故なら
、４・胞と赤血球の間でコレステロールが交換すること
はよく知られているからである（Ｂ１ｏｉ、Ｂ．ａｎｄ
Ｚｉｌｖｅ岱ｍｉｔ、Ｄ．（１９７７）Ｂｉｏｅｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ ｌ０ ３班３−３９４８）。ＲＢＣ脂質抽
出物において、Ｖ幻・砲を用いた場合↑１／２は３ぴ分
であることがわかった（第１０図参照）。Ｖ２およびＶ
乳、胞をへラ細胞に混入する場合も同じパターンが得ら
れる（第１１図）。へラ細胞と小胞とのインキュベーシ
ョンは前記と同じ条件下で行なった。別の実験では、ヘ
ラ細胞を、７ないし８の種々のｐＨ値において、等張緩
衝液中１４Ｃ−コレステロール含有小胞と共にインキュ
ベートした。第１２図は、血球による、ラベルした脂質
の取り込みは、ＰＨを７なし、し８の間で変化させても
ほとんど影響されないことを示している。放射性物質で
ラベルした４・胞とインキュベートした時の赤血球によ
る放射活性の取り込みの半減期は、透析したＩＨＰ付加
小胞とインキュベーートした赤血球によるＩＨＰ摂取の
半減期と同じである（第１６図）。

これは、本発明者らが血球と小胞との間の脂質交換ばか
りではなく小胞と血球との融合を測定したというもう１
つの証拠である。赤血球脂質抽出物の薄層クロマトグラ
フから、ＲＢＣ膜脂質が４・胞脂質に富んでいることが
わかつた。貯蔵ヒト赤血球によるＶ２仲介ＩＨＰ摂取の
見かけの技簿ｐＨ洗浄された赤血球によるｍＰ摂取はイ
ンキュベーション煤質の母に依存する。

ＩＨＰ付加赤血球のＰｏ２（１／２）をインキュベーシ
ョン嬢費の風に対してプロットすると、ＩＨ８良入の見
かけの最適風は餌７．４なし、し７．５の範囲にあるこ
とがわかる（第１３図）。ｐＨ７．５以上でのＰｏ２（
１／２）の減少は、第６図におけるボーァ効果曲線に相
当し、ヘモグロビンに対する旧Ｐ一親和性の減少と関連
している。ＰＨ７．４以下でのＰｏ２（１／２）の著し
い減少はｍＰ混入が制限されることを示しており、従つ
て、結合ｍＰにより完全に改質されたヘモグロビンに期
待された理論的Ｐｏ２（１／２）は観察されない。第６
図に示す様に、ｐＨ７．８でインキュベートした後、緩
衝嬢質の−を７．４にかえると、赤血球内のヘモグロビ
ンのＰ。

２（１／２）は２５午○で３０ないし４比吻Ｈｇに増加
する。

ｐＨ７．８でインキュベートし、別のｐＨ値に緩衝する
と、全ｐＨ領域に於いてＰｏ２（１／２）の増大が見ら
れている。この結果から、赤血球へのＩＨＰの混入は低
ｐＨ値においても有効であるが、７．４より高いｐＨ値
の方がより有効であると結論することができる。貯蔵ヒ
ト赤血球によるｍＰ摂取の動力学第１４図は、ｐＨ７．
３５において、０．仰けｍＰ溶液中でＩＨＰ付加Ｖ２４
・胞とインキュベートした後の赤血球の０２親和性の、
時間依存性減少を示す。

Ｐｏ２（１／２）の増大は４分後に半極大値に達する。
Ｐｏ２（１／２）の増加として測定されるＩＨＰ混入速
度はインキュベーション媒質のｐＨに依存する。第１５
図には、ＩＨＰ混入の半減期がｐＨに対してプロツトし
てある。ＩＨＰ摂取は低ｐＨ（ｐＨ７．３）では遅く、
ｐＨが高い（ｐＨ７．７）と早い。高いｐＨにおける短
い混入の半減期は赤血球へ混入した。ｍＰの量が多いこ
とに相当する。（第６図及び第１３図参照）。ＩＨＰ混
入の速度は外部媒質中の遊離ＩＨＰの存在に著しい影響
を受ける。

少胞懸濁液を透析したり、ゲル炉過することにより遊離
のＩＨＰを除去すると、ＩＨＰ混入の半減期はｐＨ７．
４において３０分に増大する（第１６図）。ｍＰ付加赤
血球におけるＡＴＲレベル 赤血球のアデノシントリホスフェート （ＡＴＰ）舎量は、赤血球保存及び完全機能の観点から
非常に重要である。

既に記載した条件下で、空のＶ２小胞及びＩＨＰ付加Ｖ
２小胞を混入した赤血球についてＡＴＰレベルを測定し
た、測定は全て、ｐＨ７．４の等張０．１Ｍビスートリ
ス緩衝液中で行なった。ＡＴＰ濃度はルシフェリンール
シフェラーゼ系を用いて測定した。酵素十ルシフェリン
＋ＡＴＰ伍） ６） こＥ−Ｓ−ＡＭＰ士ピロリン酸 ↓Ｑ Ｅ＋酸化された基質十ＡＭＰ＋Ｃ０２十ｈレ１個のＡＴ
Ｐ分子が使用されると１個のプロトンが生成するので、
この反応は非常に効率が良い。

空の小胞を混入してもｍＰ付加４・砲を混入しても赤血
球中のＡＴＰレベルには影響がない。表２ 赤血球のＡ
ＴＰ舎量上記データは１週間年令のＲＢＣについてのも
のである。

ＩＨＰを混入した後もＲＢＣ中のＡＴＰレベルが変化し
ないということは、ＲＢＣの生存能力、機能および形成
性が変化しないことを示している。赤血球にＩＨＰ付加
小胞を融合することによる０２放出効果ｍＰ混入後の０
２結合曲線の右シフトを第１７図に示す。

４１日年令の赤血球を、ＩＨＰ付加Ｖ幻・胞と共に、、
ｐＨ７．４の等張ビスートリス緩衝液に懸濁して融合さ
せると、０２半飽和圧は７肋Ｈｇから２８側Ｈｇに増大
する。

これは、正常ではあるが年令の古い赤血球は、３仇駁Ｈ
ｇの０２分圧下で、２８０で９５％まで０２付加される
が、ＩＨＰ付加赤血球は同じ条件下で、僅か５３％の酸
化ヘモグロビンを含有する。ＩＨＰ付加小胞と赤血球と
の融合の後、赤血球中の約６０％のヘモグロビンがＩＨ
Ｐと結合した。ＰＨ７．４において、ｍＰ付加赤血球に
ついては、生理的条件（３７０）下において、Ｑ半飽和
圧は６仇岬Ｈｇと計算される。脳における３仇収Ｈｇの
臨界Ｑ分圧において、小胞処理した赤血球からは８０％
のヘモグロビンが結合０２を放出する。一方、正常の未
処理赤血球は、同じ条件下で僅か２０ないし２５％の酸
素を放出する。赤血球の実際的な親和性は、脂質胞のｍ
８濃度を変えたり、血中の処理赤血球対未処理赤血球の
比率を変えることにより、これら２つの限界値内で変化
させることができる。この結果は、赤血球にＩＨＰを混
入する為に提案された本発明方法は、完全赤血球におけ
るヘモグロビンの０２親和性を永続的に、有意に、そし
て調整可能に低下させることを示している。

この様にＩＨＰ付加された赤血球は、既に記述した状況
下における組織への０２供給を調節するのに極めて好適
である。ラツト及び大の高所適用 血液量１４の‘（Ｐｏ２（１／２）＝ｐＨ７．４よび２
５午０において１４．比奴Ｈｇ）の体重２００夕のラッ
トを０２分圧を減少させた室内に入れた。

１３２００肌の高度に相当する酸素分圧（１２比奴Ｈｇ
）下では、四肢の筋肉における０２不足の為、ラットが
転倒した。

室内の○２圧を急いで正常値に戻すとラットは正常に振
舞つた。この動物から血液１の‘を採取し、赤血球を分
離し、前記の方法でＩＨＰを付加した。ｍＰ付加した赤
血球を血酸に再懸濁し（Ｐｏ２（１／２）＝ＰＨ７．４
２５００において２８．仇吻Ｈｇ）、このラットに輪
液した。この様にして０２分圧を下げた後は、このラッ
トは、１０物肋Ｈｇ（約高度１４２００肌に相当する）
で転倒する。従って、この処置により、高度の最高限度
が８％増したことになる。この高所適用実験を、同一ラ
ットを用いて２独時間後にもう一度行った所、同じ結果
を得た。別の実験として、血液量６３０の‘（Ｐｏ２（
１／２）＝ｐＨ７．４、２５℃に於いて１０．８肋Ｈｇ
）の、体重９ｋ９の犬を０２分圧を減少させた室内に入
れた。

０２分圧１４仇廠Ｈｇ（高度１２２００のに相当）にお
いて犬は転倒した。

次いで、急いで室内の０２圧を正常値に戻すと犬は正常
な行動を示した。この犬から血液１００の‘を採取し、
赤血球を分離し、前記の方法でＩＨＰを付加した。ｍＰ
付加した赤血球を血清（Ｐｏ２（１／２）＝を７．４
２５ｏｏで１５．１風Ｈｇ）に再懸濁し、この犬に輪液
した。０２分圧を減少させた後、この犬は１１０風Ｈｇ
（約１斑００肌の高度に相当）でした。

従って、この処置により、高度限度は十１３％増加した
。この高度限度は２日間変化しなかつた。上記実験に用
いた動物は、実験後４ヵ月（ラット）、１カ月（大）縫
った最後の確察時に於いて生存しており、元気であった
。

親和性の高い突然変異ヘモグロビンを有するヒト赤血球
未知の構造（ＨｂＮｂｉｎｚ）を有する、Ｑ親和性の高
い突然変異ヘモグロビンを持った１９才の女性から採血
した。

この新鮮な赤血球のＰｏ２（１′２）は、ＰＨ７．４
２５００において７．５柳Ｈｇであった。即ち組織への
酸素供聯合は５０％に減じている。組織での酸素不足の
ため、６週間毎に輸血を行なっている。前記の方法でこ
の赤血球にＩＨＰを付加した所、Ｐ。２（１／２）は１
８７側Ｈｇに増加した。

このことは、この患者の血液の高い０２親和性は、本発
明法により、新鮮な赤血球の正常値より高い値にまで、
減少させることができることを示しており、この値は全
血交換の酸素供給量の２３％増加に相当する。

【図面の簡単な説明】

第１図は赤血球内ヘモグロビンの、時間経過による０２
親和性の増大を示すグラフ、第２図は貯蔵時間経過によ
る赤血球内ヘモグロビンの０２結合曲線の左シフトを示
すグラフ、第３図はＱ結合曲線の−依存性を示すグラフ
、第４図は赤血球内ヘモグロビンのボーア効果を示すグ
ラフ、第５図はｍＰ混入前後の０２半飽和圧の変化を示
すグラフ、第６図はＩＨＰ付加赤血球のボーア効果を示
すグラフ、第７図は０２結合等温線の右シフトに及ぼす
小胞組成の影響を示すグラフ、第８図はＩＨＰ付加小胞
の安定性を示すグラフ、第９図は１４Ｃ−コレステロー
ルの、小胞から赤血球への混入の動力学を示すグラフ、
第１０図はＭ４Ｃーコレステロールの、Ｖ２小胞から赤
血球への混入の動力学を示すグラフ、第１１図は脂質胞
からの、ヘラ細胞による１４Ｃ−コレステロール取り込
みの動力学を示すグラフ、第１２図は小胞からの、ヘラ
細胞による１℃−コレステロール取り込みのｐＨ依存性
を示すグラフ、第１３図はｍＰ付加赤血球の○デモ飽和
圧に及ぼすインキュベーション媒質のｐＨの影響を示す
グラフ、第１４図は外部媒質中のｍＰの存在下での、赤
血球へのＶ２仲介ＩＨＰ混入の動力学を示すグラフ、第
１５図はＶ２仲介ＩＨＰ混入の半減期に及ぼすインキュ
ベーション煤質のｐＨの影響を示すグラフ、第１６図は
外部媒質中のＩＨＰの存在下にけけける、赤血球による
Ｖ２仲介ＩＨＰ取り込みの動力学を示すグラフ、第１７
図はＶ２仲介ＩＨＰの赤血球による取り込み前後の０２
結合曲線を示すグラフである。 第１図 第２図 第３図 第４図 第５図 第６図 第７図 第１５図 第８図 第９図 第１４図 第１０図 第１１図 第１３図 第１２図 第１６図 第１７図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ アロステリツク因子を付加した脂質胞を赤血球に融
   合させることにより該アロステリツク因子を赤血球中の
   ヘモグロビンに結合させることからなる改良された酸素
   放出特性を有する無損傷赤血球の調製法であつて、アロ
   ステリツク因子を等張緩衝溶液に飽和するまで溶解させ
   、この溶液に、ホスフアチジルコリン、ホスフアチジル
   セリンおよびコレステロールからなる脂質混合物を懸濁
   させ、この懸濁液を超音波処理し、次いで遠心分離して
   アロステリツク因子に富む脂質胞を含有する上澄み液に
   、血漿から分離した赤血球を懸濁し、この懸濁液をイン
   キユベートし、得られたた改良赤血球から遊離のアロス
   テリツク因子を除去することを特徴とする調製法。 ２ アロステリツク因子がイノシツトヘキサリン酸、イ
   ノシツトペンタリン酸またはイノシツトテトラリン酸で
   ある第１項に記載の調整法。 ３ 超音波処理を１００Ｗ／ｃｍ以上ののエネルギーで
   行なう第１項ないし第２項のいずれかに記載の調製法。 ４ 脂質混合物のモル比がホスフアチジルコリン：ホス
   フアチジルセリン：コレステロール＝１０〜５：４〜１
   ：１０〜３である第１項ないし第３項のいずれかに記載
   の調製法。５ 脂質混合物のモル比がホスフアチジルコ
   リン：ホスフアチジルセリン：コレステロール＝８：２
   ：７である第４項記載の調製法。 ６ 脂質混合物のモル比がホスフアチジルコリン：ホス
   フアチジルセリン：コレステロール＝９：１：８である
   第４項記載の調製法。 ７ 脂質混合物のモル比がホスフアチジルコリン：ホス
   フアチジルセリン：コレステロール＝８：４：７である
   第４項記載の調製法。 ８ 改良された赤血球から遊離のアロステリツク因子を
   等張ＭａＣｌ溶液または等張緩衝液を用いて定量的に除
   去する第１項ないし第７項のいずれかに記載の調製法。 ９ アロステリツク因子を等張緩衝溶液に飽和するまで
   溶解させ、この溶液に、ホスフアチジルコリン、ホスフ
   アチジルセリンおよびコレステロールからなる脂質混合
   物を懸濁させ、この懸濁液を超音波処理し、次いで遠心
   分離してアロステリツク因子に富む脂質胞を含有する上
   澄み液を分離し、この上澄み液に、血漿から分離した赤
   血球を懸濁し、この懸濁液をインキユベートし、得られ
   た改良赤血球から遊離のアロステリツク因子を除去する
   操作によつて得られる、アロステリツク因子が赤血球中
   のヘモグロビンと結合した改良された酸素放出特性を有
   する無損傷赤血球。１０ 該ホスフアチジルコリン、ホ
   スフアチジルセリン及びコレステロールのモル比が１０
   〜５：４〜１：１０〜３である第９項に記載の無損傷赤
   血球。 １１ ホスフアチジルコリン、ホスフアチジルセリン及
   びコレステロールのモル比が８：２：７である第１０項
   記載の無損傷赤血球。 １２ ホスフアチジルコリン、ホスフアチジルセリン及
   びコレステロールのモル比が９：１：８である第１０項
   記載の無損傷赤血球。 １３ ホスフアチジルコリン、ホスフアチジルセリン及
   びコレステロールのモル比が８：４：７である第１０項
   記載の無損傷赤血球。 １４ アロステリツク因子がイノシツトヘキサリン酸、
   イノシツトペンタリン酸、イノシツトテトラリン酸、イ
   ノシツトトリリン酸、イノシツトジリン酸またはジホス
   フアチジルジリン酸などからなる群から選ばれる糖ホス
   フエートである第９項記載の無損傷赤血球。 １５ アロステリツク因子がイノシツトヘキサリン酸で
   ある第１４項記載の無損傷赤血球。 １６ アロステリツク因子がヌクレオチドトリホスフエ
   ート、ヌクレオチドジホスフエート、ヌクレオチドモノ
   ホスフエートまたはアルコールホスフエートエステルな
   どからなる群から選ばれるポリフエートである第９項記
   載の無損傷赤血球。 １７ アロステリツク因子がポリカルボン酸の如き有機
   アニオンである第９項記載の無損傷赤血球。 １８ アロステリツク因子がヘキサシアノ鉄酸塩、ホス
   フエートまたはクロリドなどからなる群から選ばれる無
   機アニオンである第９項記載の無損傷赤血球。