JPS6059213B2 - 改良された酸素放出特性を有する無損傷赤血球を含有する血液 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、小さなアロステリック因子、例えばイノシツ
トヘキサリン酸を含有する脂質胞と融合した、優れたα
放出特性を有する赤血球を含有・する血液およびその使
用に関する。

赤血球の主たる機能の１つは分子状酸素を肺から末梢組
織へ輸送することにある。

赤血球には、０２と可逆的な付加物を形成するヘモグロ
ビン（Ｈｂ）が高濃度で含まれている（細胞当たり３０
Ｐｇ１即ち３５．５ｆ／細胞１００ｍ１）。α分圧は、
肺では約１００７７１７７！Ｈｇであり、酸化されたコ
レステロールから０２解離されなければならない毛細管
系では約７０ｗｎＨｇである。生理的条件下では、酸化
されたヘモグロビンの僅か約２５％が酸素を放出し、約
７５％が静脈血と共に肺にもどる。この様にＨｂ−０２
付加物の大部分が０２輸送のために利用されていない。
Ｈｂとアロステリック因子の相互作用によつて、毛細管
系において出来る限り高い０２分圧を維持しつつ、励−
０２付加物からの、生理的に要求される最大０２一放出
を達成することができる。

耶のアロステリック特性は、Ｓ字状の酸素結合曲線にあ
られれる。

その半飽和圧（ＰＯ２（１１２））は０２親和性の指標
である。４０ないし６０％飽和範囲におけるＳ字状曲線
の傾斜度はＨｂ中の４個の０２結合部位の共働性の程度
を示す（ビル係ｊ数〔ＨｌｌｌｃＯｅｆｆｉｃｉｅｎＯ
：ｎ＝２．８−３．２）。

ビル係数が増大すると、即ち、Ｓ字状結合曲線が急こう
配になる、あるいは、この結合曲線全体が０２分圧の高
い方へシフト（移動）すると（いわゆる右シフト）、毛
細管系での０２放出が促進され、周囲の組織への酸素の
供給が改善されることになる、赤血球中の２、３−ビス
ホスホグリセレートレベルを高め、そのヘモグロビンと
の結合を高めることによつて、右シフトは実際に達成さ
れる。２、３−ビスホスホグリセレートがＩ］ｂに結合
すると０２親和性が減少し、０２半飽和圧が増大する。

赤血球中の解糖バイパス（副行路）で合成される２、３
−ビスホスホグリセレートは、α欠乏に対する緩慢な適
応のための因子である。２、３−ビスホスホグリセレー
トは、ＰＨ７．４において、分離したヘモグロビン（Ｓ
ｔｒｉｐｐｅｄｈａｅｍＯ−ＧｉＯｂｉｎ）の半飽和圧
を、３７℃の場合にはＰＯ２（１１２）＝９．３ｍＨｇ
から２３．７ＴＩｎＨｇに、２５℃の場合にはＰＯ２（
１１２）＝４．３ＴｆｎＨｇから１２．０ｗｍＨｇに、
それぞれ上昇させる（Ｉｍａｉ，Ｋ，ａｎｄＹＯｒｌｅ
ｔａｎｉ，Ｔ．（１９７５），Ｊ．ＢｌＯｌ．Ｃｈｅｍ
．２５ＯｌＯ９３−１０９８０植物組織から単離された
イノシツトヘキサリン酸（フイチン酸：ＩＨＰ）を分離
したヘモグロビンに結合させると、０２親和性が非常に
減少一し、０２半飽和圧が高くなる（ＲｕｃｋｐａｕＩ
，Ｋ．ｅｔＡｌ．（１９７１）ＢｌＯｃｈｉｍ．ＢｌＯ
ｐｈｙｓ．Ａｃｔａ２３６，２ｌｌ−２２１）。

ＩＨＰをヘモグロビンに結合させると、０。半飽和圧は
３７℃でＰ。２（１１２）＝９６．４ｗｍＨｇ１２５℃
でＰＯ２（１ノ２）＝４８．４７０７７！Ｈｇに、それ
ぞれ上昇する。

ＩＨＰは、２、３−ビスホスホスグリセレートおよびそ
の他のポリスフエートの様に、赤血球膜を浸透すること
ができない。脂質胞は細胞膜の一部を表わす。

脂質胞は、細胞原形質膜との融合あるいはエンドシトシ
ス（ＥｎｄＯｃｙｔＯｓｉｓ）により細胞内へ浸入する
ことができる（ＰａｒａｈａｊＯｐＯｕｌＯｓ，Ｄ．ｅ
ｔ．ａｌ．（１９７６）Ｎａｔｕｒｅ２５２，ｌ６３−
１６５）。この融合は、例えばシナプス伝導、排泄、原
形質膜集合、エンベロープビールスによる感染などの多
くの膜過程において重要な意味を持つている。血球と脂
質胞との融合は、細胞培養において、幻影赤血球を用い
て達成された。ＭＬセル（細胞系一ネズミリンパ腫）を
、コクサツキウイルスＡ−？に対し高い中和価を有する
ＩｇＧを含有している小胞で処理すると、この細胞は、
このウィルスによるその後の感染から保護一される。グ
レゴリアジス（ＧｒｅｇＯｒｉａｄｉｓ）およびバック
ランド（ＢｕｃｋＩａｎｄ）はインベルターゼ（転化酵
素）を、インベルターゼ欠損マウスマクロファージ（大
食球）に入れるために脂質胞を使用している（Ｎａｔｕ
ｒｅ（１９７３）２３５２５２−２５３）。しかし、イ
ンビボ実験では、この脂質胞は無差別に全ての細胞に入
つたり、肝臓で素早く分解されるので、明白な成果を得
るには至らなかつた。現在までに、アロステリック因子
またはその他の物質を赤血球に混入させるために脂質胞
を使用したという報告はない。脂質胞は、危険を伴うこ
となく動物に注射し得ることが多くの実験の結果わかつ
ている。分離したＨｂの構造や機能に及ぼすＩＨＰの影
響については詳細に研究されているが、これまで、無損
傷の（完全な）赤血球中にＩＦＩＰを混入させることは
不可能であつたので、無損傷の赤血球中のヘモグロビン
とＩＨＰとの相互作用に関するデータはない。

驚くべきことに、赤血球膜と融合し得る流動性を負荷し
た脂質胞を用いて、赤血球中に■Ｐの如きアロステリッ
ク因子を混入することができることが見い出された。

ここでは、その高に結合定数の故に、それは、ヘモグロ
ビン中のその結合部位において、２、３−ビスホスホグ
リセレートに取つて代わる。この条件下において、赤血
球中の怖は、０２親和性が非常に低いアロステリック構
造に変わる。０２親和性が低くなると、即ち、赤血球中
のヘモグロビンの０２半飽和圧が高くなると、かなりα
分圧が高くても結合０２を解離する赤血球の能力が増大
し、従つて組織に対する０２供給が改善される。

旧Ｐを混入された、従つて組織に対して優れた０２供給
能を有する赤血球は、次の様な場合に使用することがで
きる。

１吸入する空気の０２が分圧が低い場合、即ち、標高の
高い山での登山家および０２の希薄な大気中での宇宙航
行家。

２０２交換表面が減少した場合、即ち、肺気腫における
肺胞の数の減少。

３肺において０２拡散に対する抵抗が増大した場合、即
ち、肺炎または喘息など。

４０２輸送能の低下、即ち赤血球減少、あるゆるタイプ
の貧血状態、動静脈短絡。

５血液循環障害、即ち動脈硬化、血栓塞栓症、器管硬塞
、虚血状態。

６ヘモグロビンの高い０２親和性、即ち、ヘモグロピン
ロビン突然変異、ヘモグロビン鎖におけるＮ末端アミノ
酸の化学変化、例えば真性糖尿病、赤血球中の酵素欠損
。

７改善された酸素供給による解毒過程の促進。

８保存血液の０２親和性を減少させるために、即ち、輸
液、ショック状態。

９癌の放射線治療の改善。

赤血球に混入するアロステリック因子としては、既知の
生理的因子、２、３−ビスホスホグリセレートおよびア
デノシン三燐酸よりもヘモグ七ピンに対する親和性の高
いものが使用される。

特にイノシツトヘキサリン酸がアロステリック因子とし
て好ましい。その他の糖ホスフェート類、例えばイノシ
ツトペンタリン酸、イノシツトテトラリン酸、イノシツ
トトリリン酸、イノシツトジリン酸およびジホスフアチ
ジルイノシツトジリン酸などもアロステリック因子とし
て使用することができる。その他のアロステリック因子
としては、ポリホスフェート類、例えばヌクレオチドト
リリン酸、ヌクレオチドジリン酸、ヌクレオチドモノリ
ン酸、およびアルコールホスフェートエステル類などが
好適である。

ある種のヘモグロビン突然変異の場合、例えばチューリ
ッヒ（Ｚｕｒｉｃｈ）ヘモグロビンの場合、ポリカルボ
ン酸類の如き有機アニオンをアロステリック因子として
使用することができる。

最後に、ヘキサシアノ鉄酸塩、ホスフェートまたはクロ
ライドの如き無機アニオン類をアロステリック因子とし
て使用することもできる。

脂質胞はホスファチジルコリン／ホスファチジルセリン
／コレステロールの混合物であつて、これらは１０〜５
：４〜１：１０〜３のモル比で使用される。

特に好適なモル比は８：２：７であるが、９：１：８の
モル比のもの、および８：４：７のモル比のものも好ま
しい。流動担体としては、通常の流動担体、特に、例え
ば等張ビス−トリス緩衝液の如き既知の緩衝化した生理
的担体が使用される。

脂質胞は、赤血球膜と融合できなければならない。

完全な赤血球にアロステリック因子を混入させることに
より、赤血球のヘモグロビンを、容易に酸素を放出する
アロステリツクコンホメーシヨンの赤血球に変換するこ
とができる。本発明方法により、血液酸素の効率の良い
利用を約束する改良赤血球を調節することができる。

この改良赤血球は、アロステリック因子を不可逆的に混
入させることによつて得られる。即ち、脂質胞を赤血球
膜と融合させ、この様にして、導入されたアロステリッ
ク因子を赤血球中のヘモグロビンと結合させるのである
。例えばＩＨＰをアロステリック因子として使用する場
合には、まず脂質胞にＩＨＰを付加し、この脂質胞が赤
血球と融合し、゛その後１ＨＰがヘモグロビンを結合す
る。

これによつてヘモグロビンのアロ．ステリツクコンホメ
ーシヨンがおこり、その酸素に対する親和性が変化する
。アロステリック因子と脂質胞の結合物を赤血球へ混入
させる操作は体外で行なう。

この操作中は、赤血球は採取血液から分離し、アロステ
リック因子を伴つた脂質胞を混入させてこれを改良し、
この改良された赤血球を血漿にもどす。

従つて、改良赤血球を含有する血液を保存することがで
きる。改良赤血球は、生理的担体に含ませ、血液循環に
おける輸注や注射に使用することもできるぃ本発明に係
る改良赤血球の特に好ましい調製法を以下に記載する。

ａ イノシツトヘキサリン酸を等張緩衝液に、溶液が飽
和するまで溶解する。

ｂ ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリンおよ
びコレステロールのモル比が１０〜５：４〜１：１０〜
３である脂質胞混合物をａの溶液にノ 懸濁する。

ｃ全調製懸濁液を超音波処理または注射法で崩壊させる
。

ｄ この混合物を遠心分離し、上層の懸濁液を分離する
。

この上層懸濁液はイノシツトヘキサリン酸に富んだ小さ
な脂質胞ど遊離のイノシツトヘキサリン酸を含有する。
ｅ遠心分離によつて血漿から分離したヒト赤血球をｄの
上層懸濁液に懸濁する。

ｆ インキユベーシヨンによりこの脂質胞（小胞）は赤
血球と融合する。

ｇ改良された完全な赤血球を等張ＮａＣｌ溶液または等
張緩衝液で洗浄する。

こうして遊離のイノシツトヘキサリン酸を定量的に除去
する。次いでこの調製済赤血球を血漿または代用血液に
懸濁する。以下に添付の図面について説明する。

第１図４℃で保存した赤血球内ヘモグロビンの、時間経
過による０２親和性の増大。

０。

半飽和圧ＰＯ２（１′２）を、ＣＯ２の非存在下、２５
℃で測定した。実線はＡＣＤ中で貯蔵した赤血球（ＲＢ
Ｃ）、破線は０．１５４モルのＮａＣｌを含有するＰ７
．４の等張０．１Ａ１ビス−トリス緩衝液て貯蔵した赤
血球である。第２図４℃における、貯蔵時間による赤血
球内ヘモグロビンの０２結合曲線の左シフト。

ＲＢＣは４℃で、０．１５４ＮａＣ１を含有するＰＨ７
．４の等張０．１０ｒ！４ビス−トリス緩衝液中で貯蔵
した。結合等温線はＣＯ２の非存在下、２５℃で測定し
た。実線はポリホスフェートを完全に個濁させたＲＢＣ
。破線はポリホスフェート個濁の半減期のＲＢＣ（τ１
１２＝９ｄ）、一点破線は新鮮なｍ℃。矢印は０２分圧
３０顛Ｈｇにおけるヘモグロビンの不飽和度を示す。第
３図ＣＯ２非存在下での２５℃における０２結合曲線の
ＰＨ依存性。ＲＢＣは０．１５４モルＮａＣｌを含有す
るＰＨ７．４の等張０．１０Ｍビス−トリス緩衝液中、
４℃で１７日間貯蔵した。破線はＰＨ７．７２、実線は
ＰＨ７．４２、一点破線はＰＨ７．Ｏ８Ｏ矢印は０２分
圧３０ｗｔＨｇにおけるヘモグロビンの不飽和を示す。
第４図ＣＯ２の非存在下での、２５℃における赤血球内
ヘモグロビンのボーア効果。

０．１５４モルのＮａＣｌを含有するＰＨ７．４の等張
０．１０モルビスートリス緩衝液中、４℃で１７日間貯
蔵したｍ℃。

第５図 赤血球への不可逆性のＩＨＰ混入。ＰＨ７．６
でＶ２（後記参照）仲介したＩＨＰの混入前後において
、ＣＯ２の非存在下、２５℃で赤血球の０２半飽和圧を
測定した。ｍ℃は０．１５４モルＮａＣＩを含有するＰ
Ｈ７．４の等張０．１０ビス−トリス緩衝液中、４℃で
貯蔵した。実線（−０−０−０−）はＲＢＣのポリホス
フェート個濁曲線。口←→口はＰＨ７．６でＩＨＰ混入
、ＩＨＰ付加したＲＢＣを４℃で貯蔵。Δ←→ΔはＰＨ
７．６でＩＨＰ混入、ＩＨＰ付加ＲＢＣを３ｒＣで貯蔵
。ＩＨＰ混入は標準条件下で行なつた。図中、線１はそ
の左側がポリホスフェート個濁、右側がＩＨＰ混入を示
す。第６図ＣＯ２非存在下での２５℃におけるＩＨＰ付
加赤血球のボーア効果。

点線はＰＨ７．６における■２一仲介によるＩＨＰ混入
。実線はＰＨ７．８におけるＶ２−仲介によるＩＨＰ混
入。ｍ℃は０．１５４モルのＮａＣｌを含有するＰＨ７
．４の等張０．１０Ｍビス−トリス緩衝液中、４℃て貯
蔵。ＩＨＰ混入は標準条件下で行なつた。第７図０２結
合等温線の右シフトに及ぼす小胞組成の影響をＣＯ２の
非存在下、２５℃、ＰＨ７．６で測定した。

ＰＨ７．６におけるＩＨＰの混入は標準条件下て行ない
、細胞をＰＨ７．６の等張緩衝液に懸濁した。一点破線
は０．１５４モルのＮａＣｌを含有するＰＨ７．４の等
張０．１０Ｍビス−トリス緩衝液中１９日間貯蔵したＲ
ＢＣＯ破線はＶｌ仲介１１（Ｐ混入後のＲＢＣＯ二点破
線は新鮮な円℃。実線はＶ２仲介１ＦＩＰ混入後の■℃
。矢印は３０ＴｍｍＨｇの０２分圧下におけるヘモグロ
ビンの不飽和を示す。第８図３ｒＣにおけるＩＨＰ付加
小胞の安定性。

破線はＶ２小胞。実線はＶ（３／Ｉ）胞。小胞で仲介さ
れたＩＨＰは、ＰＨ７．４で、標準条件下でＲＢＣに混
入された。ＩＨＰ付加赤血球のＰＯ２（１１２）はＣＯ
２の非存在下、２５゜Ｃで測定した。第９図１４Ｃ−コ
レステロールの、小胞から完全赤血球への混入の動力学
。

インキユベーシヨンは、０．１５４モルのＮａＣｌを含
有するＰＨ７．４の等張０．１Ｍビス−トリス緩衝液中
、３ｒＣで行なつた。一×−×−×−は１４Ｃ−コレス
テロールでラベルしたＶ２／Ｊ）胞。−Δ一Δ一Δ−は
１４Ｃ−コレステロールでラベルしたＶ．３／ｌ）胞。
−０−０−０−は１４Ｃ−コレステロールでラベルした
Ｖ１小胞。図中１はＴｌｌ２＝４５″を表わす。第１０
図１４Ｃ−コレステロールの、Ｖ２小胞から完全赤血球
への動力学。

放射活性は、ＦＯｌｃｈ抽出赤血球脂質中で測定した。
インキユベーシヨン条件下は第９図の場合と同じである
。第１１図 脂質胞からの、ヘラ細胞（ＨｅＩａｃｅｌ
ｌ）による１４Ｃ−コレステロール取り込みの動力学。

ＰＨ７．４の燐酸緩衝食塩水中、３ｒＣでイワキユベー
ト。−×−×−は小胞Ｖ２、−０−０−は小胞■３。第
１２図 小胞からのヘラ細胞による１４Ｃ−コレステロ
ール取り込みのＰＨ依存性。

条件は第１１図の場合と同じ。−０−０−は１４Ｃ−コ
レステロールでラベルした■３小胞。−×−×−は同Ｖ
２小胞。第１３図１ＨＰ付加赤血球の０２半飽和圧に及
ぼすインキユベーシヨン媒質のＰＨ影響。

ＰＯ２（１１２）はＣＯ２の非存在下２５℃で測定した
。第１４図 外部媒質中のＩＨＰの存在下での、ＰＨ７
．３８における、赤血球へのＶ２仲介１ＨＰ混入の動力
学。

５７目間経過（５７日年令）のＲＢＣのインキユベーシ
ヨン５は、標準条件下で行なつた。

ＰＯ２（１１２）はＣＯ２の非存在下、２５℃で測定し
た。１第１５図Ｖ２仲介１ＨＰ混入の半減期に及ぼすイ
ンキユベーシヨン媒質のＰＨの影響。

ｍ℃は外部媒質中のＩＨＰと共に標準条件下でインキユ
ベーシヨンした。ＰＯ２（１１２）はＣＯ２の非存在下
２５℃で測定した。・第１６図 外部媒質中の１ＨＰの
存在下における、ＰＨ７．４での、赤血球によるＶ２一
仲介１ＨＰ取り込みの動力学。

インキユベーシヨンは標準条件下で行なつた。ＰＯ２（
１１２）はＣＯ２の非存在下、２５℃で測定した。）第
１７図ＰＨ７．４において、Ｖ２一仲介■Ｐの赤血球に
よる取り込み前後の０２の結合曲線。

インキユベーシヨンは、ＰＨ７．６において、標準条件
下で行なつた。脳の臨界０２分圧３０Ｔｆ０ｎＨｇに対
する赤血球による０２放出を矢印で示した。２５℃にお
いて：実験は４１年令の赤血球（５％α放出）；破線は
ＩＨＰ一付加赤血球（４７％０２放出）；３ＴＣにおい
て：ー点破線は４１年令の赤血球（２１％０２放出）；
三点破線はＩＨＰ付加赤血球（８０％０２放出）。

毛管における赤血球内ヘモグロビンの酸素不飽和の程度
は、静脈の０２分圧に依存するばかりではなく、特に赤
血球内のヘモグロビンの酸素親和性に依存する。

０２親和性をコントロールする赤血球内アロステリック
因子はボーアプロトン、ＣＯ２および有機リン酸化合物
、特にＤＰＧ（２，３ービスホスホグリセレートー天然
アロステリック因子）およびＡＴＰ（アデノシン三燐酸
）などである。

貯蔵赤血球中のＤＰＧおよびＡＴＰが個濁すると、次第
に酸素親和性が増大する（Ｂａｌｃｅｒｚａｋ，Ｓ．ｅ
ｔａｌ．（１９７２）Ａｄｙ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．ＢｌＯ
ｌ．２８４３３−４７７７）。

これは、貯蔵時間（赤血球を４℃で貯蔵）に対して、半
飽和における０２分圧（２５℃て測定）をプロットした
第１図に示されている。０２結合等温線は、ＣＯ２の非
存在下、一定のＰＨ（７．４）において測定した。

これは、半飽和圧に及ぼすこれらアロステリック因子の
影響を除外するためてある。漸進性のポリホスフェート
個濁の終点はＰＯ２（１１２）＝４．２ｍ１ｔＨｇによ
つて決定され、これは完全にリン酸塩のない（はだかの
）ヘモグロビンの半飽和圧である。出発点、即ち新鮮な
血液のＰ。２（１１２）は懸濁媒質の組成に依存する。

これらのポリホスフェート個濁カーブから、貯蔵赤血球
の新しい機能パラメーター、いわゆる赤血球内ポリホス
フェートの半減期を求める．ことができる。それは、Ｐ
Ｈ７．４の等張０．１Ｍビス−トリス緩衝液中では９日
であり、ＡＣＤ（酸−クエン酸塩−デキストロースニ保
存溶液）安定化溶液中ては１２日である。赤血球中のポ
リホスフェートの個濁は０２結合．等温線の左シフトを
もたらし、従つて、酸素放出能の減少となる。

４℃で貯蔵した赤血球の０２結合曲線の左シフトおよび
酸素放出能の減少を２５℃で測定した結果を第２図に示
す。

０２分圧３０ｍＨｇにおいては、新一鮮な赤血球の不飽
和度は１１％であるが、ポリホスフェートを半分個濁し
た赤血球の不飽和度は僅かに１％である。

ポリホスフェート個濁赤血球の０２結合曲線の左シフト
は組織への酸素輸送を損なうこととなる。

したがつて、貯蔵血液（ＤＰＧ欠乏）を大量に輸液する
と、筋肉のＰＨが低下し、血漿中の乳酸レベルが増大し
、輸液症候群として知られている血圧低下をきたす（Ｋ
ｅｖｙ，Ｓ．Ｖ．ｅｔａｌ．（１９７２）Ａｄｖ．Ｅｘ
ｐ．Ｍｅｄ．ＢｌＯｌ．２＆５１１−５１６）。このＰ
Ｈ低下は、第３図に示す様に、部分的にのみこの左シフ
トに反作用的に働く。０２分圧３０ｗｎＨｇにおいてＰ
Ｈが７．４２から７．０８にかわると、赤血球（ＰＨ７
．４の等張・０．１Ｍビス−トリス緩衝液中、４℃で１
７日間貯蔵）の酸素不飽和度は１％から５％に増える。

しかし、ＰＨ７．４６において、新鮮な赤血球において
観察される１１％の不飽和度はボーア効果によつてのみ
達成されるのではない（第２図）。等張０．１Ｍビス−
トリスおよびトリス緩衝液にそれぞれ懸濁した貯蔵赤血
球の０２親和性に及ぼすＰＨの影響（ボーア効果）は、
ＰＨ７．Ｏないし７．８の範囲に関して第４図に示して
ある。４℃で１７日間貯蔵した赤血球を用いて、ＣＯ２
の非存在下、２５℃で、０２結合曲線を測定した。

これらの古い赤血球は、ヘモグロビンの０２親和性にお
けるポリホスフェート効果の半分以上を失つている（第
１図参照）。ボーア効果、−ΔＰＯ２（１１２）／ΔＰ
Ｈは０２１モル当たり０．５３プロトンになる。結合酸
素と共に放出されるボーアプロトンの数は、既に７５％
のポリホスフェート効果が失われている場合は少くとも
ＲＢＣ年令が３４日までは一定である。従つて、貯蔵、
即ちポリホスフェートの個濁は赤血球のボーア効果に影
響を及ぼさない。実施例 人血の採集及び貯蔵 若い健康な志願者から１００ｍ１の血液をとり、ＡＣＤ
安定化剤５０ｍｔを含む２５０ｍＬ容量のバイオフラス
コ（ＢｉＯｔｅｓｔ−Ｓｅｒｕｍ−■Ｎｓｔｉｔｕｃｅ
，Ｆｒｎｌｎｋｆｕｒｔａ．Ｍａｉｎ）に入れる。

この試料を４℃で保存する。ヒト赤血球の採集及び貯蔵 若い発端者から採集した３００ｍｔの血液を、凝血を防
ぐためにへバリンまたはクエン酸ナトリウムを入れたプ
ラスチック袋に集める。

この血液を氷浴で冷却し、その後の操作を４℃で行なう
。２３５００Ｘｇで２紛間遠心分離し、赤血球を血漿か
ら分離する（ＳＯｒｖａＩｌ，ＴｙｐｅＲＣ−？；ＲＯ
ｔＯｒＳＳ３４；１２０００ｒ′Ｐｍ）。

集めた赤血球をＰＨ７．４の等張食塩ビス−トリス緩衝
液（０．１０モルビスートリス、０．１５モルＮａＣｌ
）中に懸濁し、遠心分離する。この洗浄操作を３回くり
返す。最後に、集めた赤血球をＰＨ７．４の等張食塩ビ
ス−トリス緩衝液３００ｍｔに懸濁し４℃で貯蔵する。
赤血球懸濁液のＰＨ測定及び調整 ＰＨ７．４の等張０．１Ｍ緩衝液およびＡＣＤ中で貯蔵
した赤血球を、それぞれ、８０００Ｘｇで２分間、室温
で遠心分離する（ＥｐｐｅｎｄＯｒｆＣｅｎｔｒｉｆｕ
ｇｅ，Ｈｙｐｅ３２ＯＯ：１２０００ｒ′Ｐｍ）。

赤血球懸濁液の所望のＰＨは、緩衝媒質をくり返し交換
することによつて調節する。血液を所望の緩衝液に懸濁
し、再び遠心分離する。この操作を一定のＰＨになるま
でくり返す。ＰＨは、ガラス電極を用いで、２５℃で測
定する（ＩｎｇＯｌｄ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔａ，Ｍａｉ
ｎ，Ｔｙｐ．４Ｏ６−Ｍ３，ａ＝３５Ｔｆｎ）。ＰＨ測
定の正確度は±０．０２単位である。ＩＨＰ付加脂質胞
の調製 ＩＨＰをＰＨ７．４の等張ビス−トリス緩衝液（４）．
１０Ｍビス−トリス、０．１５モルＮａＣりに、例えば
室温−ないし５０℃で、飽和するまで溶解させる。

ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルセリン
（ＰＳ）、コレステロール（ＣＨ）からなる脂質混合物
（モル比；ＰＣ：ＰＳ：ＣＨ＝８：２：７、表１参照）
をこの溶液に懸濁し、約５０℃で、窒素気流下で４紛間
超音波処理する。小胞調製における温度は、緩衝液の氷
点およびポリホスフェートの熱安定性によつてのみ制限
される。この超音波処理は、テタン侵入探触子（Ｔｉｔ
ａｎｄｉｐｐｒＯｂｅｌｌＯＫＨｚ）を有する超音粉砕
機（ＳｃｈＯｌｌｅｒ，Ｔｙｐｅｌ２５，Ｆｒａｎｋｆ
ｕｒｔａ，Ｍａｉｎ）を用いで行なう。超音波処理は、
好ましくは１００Ｗ／ｃｌ以上のエネルギーで効果的に
行なうことができる。超音波処理の後、小胞懸濁液を、
２５℃で、超遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎｎ，ＴｙｐＬ
５−６５，Ｒ０ｔ０ｒ６０）を用いて１０００００×ｖ
で１時間遠心分離する。上澄液は、直径が５００Ａある
いはそれ以下である小脂質胞を含有している。この小胞
が形成される時、その小胞は脂質が懸濁しているその溶
液を包含する。ホスファチジルセリンは牛の脳から（Ｋ
Ｏｃｈ上Ｉｇｈｔ，ＧＢ）、ホスファチジルコリンは卵
横から（ＬｉｐｉｄＳｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ，ＢＯｓ；
０ｎ，ＵＳＡ）のものである。コレステロールおよびイ
ノシツトヘキサリン酸のナトリウム塩はそれぞれＭｅｒ
ｃｋ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）およびＳｉｇｍａ（Ｍｕｒ
ｌｃｈｅｎ）製のものである。全ての脂質はカラムクロ
マトグラフィーによつて精製し、その純度を薄層クロマ
トグラフィーによつて検査した。１ｎｍ０１／ｅの脂質
から二重層（Ｂｉｌａｙｅｒ）の脂質胞（小胞、ｄ≦５
００Ａ）が２×１０１１得られる。

２×１０１１の脂質胞と１Ｃｆの赤血球をインキュベー
トするが、後記する様にそれ以外の比率でもよい。

ヒト赤血球へのイノシツトヘキサリン酸の混入インビト
ロ実験用として、２００μｅの赤血球懸濁液を室温で、
８０００Ｘｙで２分間遠心分離する（ＥｐｐｅｎｄＯｒ
ｆＣｅｎｔｒ′Ｉｆｕｇｅ，Ｔｙｐｅ３２ＯＯ，ｌ２Ｏ
ＯＯｒｐｍ）。

要すれば、集めた血球を洗浄し、上記した如く所望のＰ
Ｈに調節し、次いで所望のＰＨの“等張０．１Ｍ緩衝液
２００μｅに懸濁する。これに同量の所望のＰＨの脂質
胞懸濁液を加える。この赤血球を１時間、３７℃でイン
キュベートする。赤血球は、一定のＰＨになるまで、等
張０．１Ｍ緩衝液でくり返し洗浄する。上澄液につき、
もはや遊離のＩＨＰが検出されなくなるまでＣａ２＋に
よつて沈降テストを行なう。ＰＨ範囲７ないし８で効力
があり、赤血球の構造的、形態学的および機能的統合性
に影響を与えない緩衝液であれば、いかなるものであつ
ても使用することができる。７０２結合曲線の測定 ０２結合曲線は、迅速分散技術により、２５℃で測定し
た（Ｓｉｃｋ，Ｈ．ａｎｄＧｅｒｓＯｎｄｅ，Ｋ．（１
９６９），Ａｒｌａｌｙｔ．ＢｌＯｃｈｅｍ．３２３６
２−３７６；′Ｓｉｃｋ，Ｈ．ａｎｄＧｅｒｓＯｎｄｅ
，Ｋ．（１９７２），４７，４６−５６）。

結果小胞と融合した後の貯蔵したヒト赤血球のボーア効
果ＰＨ７．４の等張緩衝媒質中、４℃で４０日間貯蔵さ
れた、そして部分的にポリホスフェートが個濁したヒト
赤血球の０２半飽和圧、それと共に（ｎ＝２．８）ボー
ア効果は、３７℃で１時間、ＰＨ７．６の等張緩衝液中
で小胞Ｖ２とインキユベーシヨンした後は、顕著な変化
をしなかつた。

さらに、赤血球を他の脂質組成を有する小胞（Ｖ１およ
びＶ３）と共にインキュベートした場合も、赤血球内へ
ヘモグロビンの０２結合パラメーターに影響を与えなか
つた。小胞で仲介されて（Ｖ２）イノシツトヘキサリン
酸を混入された後の、貯蔵されたヒト赤血球のボーア効
実現在までに知られている最も強力なヘモグロビンのア
ロステリック因子であるＩＨＰは、０２結合曲線の右シ
フトで示される様に、ヘモグロビンの０２曲線親和性を
減少する。

１８を合成することができないヒト赤血球は、この因子
を含有している脂質胞と融合する間に、このポリホスフ
ェートを付加され得る。

本発明において、例示的に記載されているＩＨＰの混入
についての実験は、基本的には、全てのアロステリック
因子、例えば糖ポリホスフェート、例えばイノシツトペ
ンタリン酸、イノシツトテトラリン酸、イノシツトトリ
リン酸、イノシツトジリン酸、およびジホスフアテジル
イノシツトジリン酸、さらにポリホスフェート、例えば
ヌクレオチドトＩ八ジ、およびモノホスフェート、アル
コールポリホスフェートエステル類などについても同じ
様に適用し得る。赤血球膜を通過し得る、因子としての
特性をもつた無機アニオン類（ヘキサシアノ鉄酸塩（■
）、ポリホスフェートおよびクロリド）も使用すること
ができる。．突然変異を示すヘモグロビンの特殊な場合
には、ポリカルボン酸の如き有機アニオンがアロステリ
ック因子として使用し得る。ポリカルボン酸の例として
は、マレイン酸がチューリッヒヘモグロビンの場合に使
用し得る。ＰＨ７．４の等張緩衝媒質中、４℃で２５日
間貯蔵したヒト赤血球（ＰＯ２（１１２）＝６．０Ｔ１
０！ＴＨｙ）を、ＰＨ７．６に調節し（ＰＯ２（１１２
）＝４．５薗Ｈｆ）、次いて、１ＨＰ付加Ｖ２小胞と共
に、０．１９モルのＩＨＰを含有しているＰＨ７．６の
等張０．１モルトリス緩衝液中、３ｒＣで１時間インキ
ュベートする。

赤血球にＩＨＰが混入した後、０拌飽和圧は急激に上昇
して３．２倍となり（ＰＯ２（１１２）＝１４．３？Ｈ
ｙ）、新鮮な赤血球の価を超える（ＰＯ２（１１２）＝
１０．５５ＴｆＩＩｔＨｆであつて、これの１．４倍）
。次いでこの■Ｐ付加した赤血球をＰＨ７．６の等張緩
衝媒質中、４℃で６日間蔵する。この場合、半飽和圧は
一定であつた。４℃でさらに４日間貯蔵した後、ＩＨＰ
付加赤血球を７ＰＨ７．２８に変えると、ＰＯ２（１１
２）は再び３２．１ｍＨｙに増加した。

他の実験では、４℃で３６日間貯蔵した洗浄赤血球をＰ
Ｈ７．６に調節し、上記と同様にして１ＨＰを混入させ
た。ＰＯ２（１１２）は１４．『Ｈｙに増大した。ＩＨ
Ｐ付加細胞を３７℃で２日間貯蔵し・た。これらのＩＨ
Ｐ付加血球を３γＣで２日貯蔵した後も０２親和性の変
化は観察されなかつた。４℃で貯蔵する間に生理的なポ
リホスフェートが半分個濁する正常の赤血球とは異なり
、ＩＨＰ付加赤血球は、一定のＰＯ２（１１２）値を示
す（第５図参ｂ照）ことからもわかる様に、少くとも９
日間はＩＨＰを加水分解しないと思われる。

従つて、この様に処理された赤血球は、実質的に長期間
貯蔵することができる。このほか、ＩＨＰ付加赤血球は
、非処理血球より大きなボーア効果を示す（第６図）。

遊離１ＨＰの存在下、ＰＨ７．６でＩＨＰ付加Ｖ２小胞
とインキュベートし、それぞれの等張０．１Ｍ緩衝液て
洗浄することによつて所望のＰＨに調節した赤血球の、
ＣＯ２非存在下におけるボーア効果は、０２１モル当た
り、−ΔＰＯ２（１１２）／ΔＰＨ＝１．２０プロトン
となる。

ＩＨＰ付加赤血球のボーアプロトン放出は正常の新鮮な
赤血球の３倍大きい。従つて、ＩＨＰ付加血球は組織に
おいてより効果的に酸素を放出し、肺に於いてより効果
的に酸素を摂取する。ＰＨ７．８においては、遊離１Ｈ
Ｐの存在下でのＩＨＰ付加Ｖ２小胞によるＩＨｌ）混入
はもつと効果的である。ＩＨＰ付加血球のＰＨを７．４
に変えると、理論的に期待されるＰＯ２（１１２）＝３
５Ｔｆｒ！ＮＨ′への増大が観察される（第６図参照）
。一方、ＰＨ７．８ては、混入後、ボーア効果は小さく
なる様に思われる（０２１モル当たり、−ΔＰＯ２（１
１２）／ΔＰＨ＝０．９プロトン）。ヒト赤血球による
イノシツトヘキサリン酸摂取に及ぼす小胞組成の影響ヒ
ト赤血球により摂取されたＩＨＰの量は、０２結合曲線
の右シフトの大きさとして測定される。

即ち、標準条件下で測定された０２半飽和圧は、混入効
率の１つの指標である。このＩＨＰ摂取効率は、小胞の
脂質組成に著しく依存している。第７図には、Ｖ１およ
びＶ２をＰＨ７．６でインキュベートした後の、０２結
合曲線の右シフトが例示されている。■２小胞は最も大
きな右シフトを示し、３−Ｈｙにおおける不飽和度は１
４％である。１９日年令の赤血球はこの０２圧では不飽
和度は零，であり、新鮮な赤血球では不飽和度は５％で
ある。Ｖ２小胞によりＩＨＰを混入したものは、３０ｗ
ｒ１ｎＨｙにおける、正常な赤血球の０２放出にくらべ
約３倍改善されている。Ｖ２とＶ３／Ｊ）胞は、同じだ
けの赤血球によるＩＨＰ摂取を促すので、０２結合曲線
の右シフトは同じである。ＩＨＰを含有するＶ１、Ｖ２
およびＶ３小胞の外部媒質中にＬＨＰが存在しなくても
、その混入の半減期（Ｔｌｌ２）に関してはかわりはな
く、３紛である。

Ｖ１およびＶ３は、透析したＩＨＰ付加Ｖ２小胞に一つ
いて測定したＩＨＰ効果の半分以下である。これは、Ｖ
ＩおよびＶ３の安定性が低いことを示している。第８図
には、■２と■３の安定性の違いが示してある。■２の
安定性の半減期は３日であり、Ｖ３のそれは、１．５日
である。小胞の血球への混入１４Ｃ−コレステロールま
たは１４Ｃ−ホスファチジルコリンでラベルした小胞Ｖ
１、Ｖ２および■３を用いて、脂質胞の完全赤血球への
混入を行なつた。

これを、培養ヘラ細胞への同じ小胞の混入と比較した。
放射活性を、完全赤血球（可溶化とルマツク（Ｌｕｍａ
ｃ）試薬一式を用いた漂白による）及び全脂質ホルヒ（
ＦＯＩｃｈ）抽出物について測定した。混入は４時間を
要して行なつた。結果を第９図及び第１０図に示す。第
９図は完全赤血球を用いた場合の小胞Ｖ１、Ｖ２および
■３についての結果を示す。インキユベーシヨン媒質は
、ＰＨ７．４の等張０．１Ｍビス−トリス緩衝液中１０
ｍ１のＩｌＩＰ付加小胞と１０ｍ１（７）ＲＢＣを含有
している。１０１２へ４０、６０、９０１１２０、１８
０および２４紛後に試料を採取し、カウントした。混入
の半減期は、Ｖ２小胞（これはまたＲＢＣにおいても最
高の放射活性レベルを示す）については４紛、Ｖｌおよ
び■２については３５分であつた。ＲＢＣ中に見い出さ
れる放射活性が必ずしも小胞の混入を意味するものでは
ないことに注意しなければならない。何故なら、小胞と
赤血球の間でコレステロールが交換することはよく知ら
れているからである。（ＢｌＯｊ，Ｂ，ａｎｐＺｌｌｖ
ｅｒｓｍｉｔ，Ｄ．（１９７７）ＢｉＯｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙｌ６，３９４３−３９４８）。ｍ℃脂質抽出物にお
いて、Ｖ２小胞を用いた場合Ｒｌｌ２は３紛であること
がわかつた（第１０図参照）。■２およびＶ別）胞をヘ
ラ細胞に混入する場合も同じパターンが得られる（第１
１図）。ヘラ細胞と小胞とのインキユベーシヨンは前記
と同じ条件下で行なつた。別の実験では、ヘラ細胞を、
７ないし８の種々のＰＨ値において、等張緩衝液中１４
Ｃ−コレステロール含有小胞と共にインキュベートした
。第１２図は、血球による、ラベルした脂質の取り込み
は、ＰＨを７ないし８の間で変化させてもほとんど影響
されないことを示している。放射性物質でラベルした小
胞とインキュベートした時の赤血球による放射活性の取
り込みの半減期は、．透析したＩＨＰ付加小胞とインキ
ュベートした赤血球によるＩＨＰ摂取の半減期と同じで
である（第１６図）。

これは、本発明者らが血球と小胞との間の脂質交換ばか
りではなく小胞と血球との融合を測定したというもう１
つの証拠である。赤血球脂質抽出物の薄層クロマトグラ
フから、ｍ℃膜脂質が小胞脂質に富んでいることがわか
つた。貯蔵ヒト赤血球による■２仲介１ＨＰ摂取の見か
けの最適ＰＨ洗浄された赤血球によるＩＨＰ摂取はイン
キユベーシヨン媒質のＰＨに依存する。

ＩＦ［Ｐ付加赤血球のＰＯ２（１１２）をインキユベー
シヨン媒質のＤＰＨに対してプロットすると、ＩＨＰ混
入の見かけの最適ＰＨはＰＨ７．４ないし７．５の範囲
にあることがわかる・（第１３図）。ＰＨ７．５以上で
のＰＯ２（１１２）の減少は、第６図におけるボーア効
果曲線に相当し、ヘモグロビンに対するＩＨＰ一親和性
の減少と関連している。ＰＨ７．似下でのＰＯ２（１１
２）の著しい減少はＩＨＰ混入が制限されることを示し
ており、従つて、結合１ＨＰにより完全に改質されたヘ
モグロビンに期待された理論的ＰＯ２（１１２）は観察
されない。第６図に示す様に、ＰＨ７．８でインキュベ
ートした後、緩衝媒質のＰＨを７．４にかえると、赤Ｉ
Ｒｌ球内ヘモグロビンのＰＯ２（１′２）は２５℃で３
０ないし４０ｗｎＨｙに増加する。

ＰＨ７．８でインキュベートし、別のＰＨ値に緩衝する
と、全ＰＨ領域に於いてＰ。２（１１２）の増大が見ら
れる。

この結果から、赤血球へのＩＨＰの混入は低ＰＨ値にお
いても有効であるが、７．４より高いＰＨ値の方がより
有効であると結論することができる。貯蔵ヒト赤血球に
よるＩＨＰ摂取の動力学第１４図は、ＰＨ７．３５にお
いて、０．１９Ｍｎ１ｐ溶液中でＩＨＰ付加Ｖ２小胞と
インキュベートした後の赤血球の０２親和性の、時間依
存性減少を示す。

ＰＯ２（１１２）の増大は４分後に半極大値に達する。
Ｐ。２（１１２）の増加として測定される。

ＩＨＰ混入速度はインキユベーシヨン媒質のＰＨに依存
する。第１５図には、ＩＨＰ混入の半減期がＰＨに対し
てプロットしてある。ＩＨＰ摂取は低ＰＨ（ＰＨ７．３
）では遅く、ＰＨが高い（ＰＨ７．７）と早い。高いＰ
Ｈにおける短い混入の半減期は赤血球へ混入したＩＨＰ
の量が多いことに相当する（第６図及び第１３図参照）
。１１１Ｐ混入の速度は外部媒質中の遊離■即の存在に
著しい影響を受ける。

小胞懸濁液を透析したり、ゲルｐ過することにより遊離
のＩＨＰを除去すると、ＩＨＰ混入の半減期はＰＨ７．
４において３０１ｉｊ′に増大６−る（第１６図）。Ｉ
ＨＰ付加赤血球におけるＡＴＰレベル 赤血球のアデノシントリホスフェート （ＡＴＰ）含量は、赤血球保存及び完全機能の観点から
非常に重要である。

既に記載した条件下で、空のＶ２小胞及びＩＨＰ付加Ｖ
２小胞を混入した赤血．球についてＡＴＰレベルを測定
した。測定は全て、ＰＨ７．４の等張０．１Ｍビス−ト
リス緩衝液中で行なつた。ＡＴＰ濃度はルシフエリンー
ルシフエラーゼ系を用いて測定した。１個のＡＴＰ分子
が使用されると１個のプロトンが生成するので、この反
応は非常に効率が良い。

空の小胞を混入してもＩＨＰ付加小胞を混入しても赤血
球中のＡＴＰレベルには影響がない。上記データは１週
間年令のｍ℃についてのものである。ＩＨＰを混入した
後もＲＢＣ中のＡＴＰレ）ベルが変化しなあいというこ
とは、ＲＢＣＣの生存能力、機能および形成性が変化し
ないことを示している。赤血球にＩＨＰ付加小胞を融合
することによる０２放出効果ＩＨＰ混入後の０２結合曲
線の右シフトを第１７図に示す。

４１ＥＩ年令の赤血球を、ＩＨＰ付加Ｖ２／ｌ）胞と共
にＰＨ７．４の等張ビス−トリス緩衝液に懸濁して融合
させると、０２半飽和圧は７顛Ｈｙから２８顛Ｈｇに増
大する。

これは、正常ではあるが年令の古い赤血球は、３０ｗ１
Ｈｆ１（：１）０２分圧下で、２５℃で９５％まで０２
付加されらるが、ＩＨＰ付加赤血球は同じ条件下で、僅
か５３％の酸化ヘモグ七ピンを含有する。ＩＨＰ付加小
胞と赤血球との融合の後、赤血球中の約６０％のヘモグ
ロビンがＩＨＰと結合した。ＰＨ７．４において、ＩＨ
Ｐ付加赤血球については、生理的条件（３ＴＣ）下にお
いて、０２半飽和圧は６０７１７７！Ｈｇと計算される
。脳における３０７ｍＨｙの臨界０２分圧において、小
胞処理した赤血球からは８０％のヘモグロビンが結合０
２を放出する。一方、正常の末処理赤血球は、同じ条件
下で僅か２０ないし２５％の酸素を放出する。赤血球の
実際的な親和性は、脂質胞■即濃度を変えたり、血中の
処理赤血球対末処理赤血球の比率を変えることにより、
これら２つの限界値内で変化させることができる。この
結果は、赤血球にＩＨＰを混入する為に提案された本発
明方法は、完全赤血球におけるヘモグロビンの０２親和
耐を永続的に、有意に、そして調節可能に低下させるこ
とを示している。

この様にＩＨＰ付加された赤血球は、既に記述した状況
下における組織への０２供給を調節するのに極めて好適
である。ラット及び犬の高所適用 血液量１４ｍ１（ＰＯ２（１１２）＝ＰＨ７．４および
２５℃におおいて１４．０ＴｓｎＨｙ）の体重２００ｙ
のラットを０２分圧を減少させた室内に入れた。

１３２００瓦の高度に相当する酸素分圧（１１２−Ｈｙ
）下では、四肢の筋肉における０２不足の為、ラットが
転倒した。

室内の０２圧を急いで正常値に戻すとラットは正常に振
舞つた。この動物から血液１ｍ１採取し、赤血球を分離
し、前記の方法でＩＨＰを付加した。ＩＨＰ付加した赤
血球を血漿に再懸濁し（ＰＯ２（１ノ２）＝ＰＨ７．４
、２５℃において２８．０ｗＩｎＨｙ）、このラットに
輸液した。この様にして０２分圧を下げた後は、このラ
ットは、１００ｗ！ＮＨＶ（約高度１４２００ｍに相当
する）て転倒する。従つて、この処理により、高度の最
高限度が８％増したことになる。この高所適用実験を、
同一ラットを用いて２４Ｖｉ１間後にもう一度行つた所
、同じ結果を得た。別の実験として、血液量６３０ｍ１
（ＰＯ２（１１２）＝ＰＨ７．４、２５℃に於いて１０
．８ｗｎＨｆ１）の、体重９ｋｇの犬をα分圧を減少さ
せた室内に入れた。

０２分圧１４０７０７７！Ｈｙ（高度１２２００ｍ１こ
相当）において犬は転倒した。次いで、急いで室内の０
２圧を正常値に戻すと犬は正常な行動を示した。この犬
から血液１００を採取し、赤血球を分離し、前記の方法
でＩＨＰを付加した。ＩＨＰ付加した赤血球を血清（（
ＰＯ２（１１２）＝ＰＨ７．４、２５℃で１５．０７１
７７！Ｈｇ）に再懸濁し、この犬に輸液した。０２分圧
を減少させた後は、この犬は１１０７０７７！Ｈｇ（約
１３８００ｍ．の高度に相当）で転倒した。

従つて、この処置により、高度限度は＋１３％増加した
。この高度限度は５日間変化しなかつた。上記実験に用
いた動物は、実験後４ヵ月（ラット）、１ヵ月（犬）経
つた最後の観察時に於いて生存しており、元気であつた
。

親和性の高い突然変異ヘモグロビンを有するヒト赤血球
未知の構造（ＨｂＭａｉｎｚ）を有する、０２親和性の
高い突然変異ヘモグロビンを持つた１吐の女性から採血
した。

この新鮮な赤血球のＰ。２（１１２）は、ＰＨ７．４、
２５℃において７．５ＴＷＬＨＶであつた。

即ち組織への酸素供給は５０％に減じている。組織での
酸素不足のため、６週間毎に輸血を行なつている。前記
の方法でこの赤血球にＩＨＰを付加した所、ＰＯ２（１
１２）は１８．７ＴＷ＆Ｈｆに増加した。このことは、
この患者の血液の高い０２親和性は、本発明方法により
、新鮮な赤血球の正常値より高い値にまで、減少させる
ことができることを示しており、この値は全血交換の酸
素供給量の２３％増加に相当する。図面の簡単な説明第
１図は赤血球内ヘモグロビンの、時間経過による０２親
和性の増大を示すグラフ、第２図は貯蔵時間経過による
赤血球内ヘモグロビンのα結合曲線の左シフトを示すグ
ラフ、第３図は０２結合曲線のＰＨ依存性を示すグラフ
、第４図は赤血球内ヘモグロビンのボーア効果を示すグ
ラフ、第５図はＩＨＰ混入前後の０２半飽和圧の変化を
示すグラフ、第６図はＩＨＰ付加赤血球のボーア効果を
示すグラフ、第７図は０２結合温線の右シフトに及ぼす
小胞組成の影響を示すグラフ、第８図はＩＨＰ付”加小
胞の安定性を示すグラフ、第９図は１４Ｃ−コレステロ
ールの、小胞から赤血球への混入の動力学を示すグラフ
、第１０図は１４Ｃ−コレステロールの、Ｖ２小胞から
赤血球への混入の動力学を示すグラフ、第１１図は脂質
胞からの、ヘラ細胞に，よる１４Ｃ−コレステロール取
り込みの動力学を示すグラフ、第１２図は小胞からの、
ヘラ細胞による１４Ｃ−ーコレステロール取り込みのＰ
Ｈ依存性を示すグラフ、第１３図はＩＨＰ付加赤血球の
Ｏ拌飽和圧に及ぼすインキユベーシヨン媒質のＰＨの影
響フを示すグラフ、第１４図は外部媒質中のＩＨＰの存
在下での、赤血球へのＶ２仲介１ＨＰ混入の動力学を示
すグラフ、第１５図は■２仲介１１（Ｐ混入の半減期に
及ぼすインキユベーシヨン媒質のＰＨの影響を示すグラ
フ、第１６図は外部媒質中のＩＨＰの存在下５における
、赤血球によるＶ２仲介１ＨＰ取り込みの動力学を示す
グラフ、第１７図はＶ２仲介１ＨＰの赤血球による取り
込み前後の０２結合曲線を示すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ アロステリック因子を等張緩衝溶液に飽和するまで
   溶解させ、この溶液に、ホスファチジルコリン、ホスフ
   ァチジルセリンおよびコレステロールからなり該ホスフ
   ァチジルコリン、ホスファチジルセリンおよびコレステ
   ロールのモル比が１０〜５：４〜１：１０〜３である脂
   質混合物を懸濁させ、この懸濁液を超音波処理し、次い
   で遠心分離してアロステリック因子に富む脂質胞を含有
   する上澄み液を分離し、この上澄み液に、血漿から分離
   した赤血球を懸濁し、この懸濁液をインキュベートし、
   得られた改良赤血球から遊離のアロステリック因子を除
   去した後、該赤血球を懸濁または代用血液に懸濁させる
   ことによつて得られるアロステリック因子が赤血球中の
   ヘモグロビンと結合した改良された酸素放出特性を有す
   る無損傷赤球を含有する血液。 ２ アロステリック因子がイノシツトヘキサリン酸であ
   る第１項記載の血液。 ３ ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及び
   コレステロールのモル比が８：２：７である第１項記載
   の血液。 ４ ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及び
   コレステロールのモル比が９：１：８である第１項記載
   の血液。 ５ ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及び
   コレステロールのモル比が８：４：７である第１項記載
   の血液。 ６ アロステリック因子を等張緩衝溶液に飽和するまで
   溶解させ、この溶液に、ホスファチジルコリン、、ホス
   ファチジルセリンおよびコレステロールからなり該ホス
   ファチジルコリン、ホスファチジルセリンおよびコレス
   テロールのモル比が１０〜５：４〜１：１０〜３である
   脂質混合物を懸濁させ、この懸濁液を超音波処理し、次
   いで遠心分離してアロステリック因子に富む脂質胞を含
   有する上澄み液を分離し、この上澄み液に、血漿から分
   離した赤血球を懸濁し、この懸濁液をインキユベートし
   、得られた改良赤血球から遊離のアロステリック因子を
   除去した後、該赤血球を血漿または代用血液に懸濁させ
   ることによつて得られるアロステリック因子が赤血球中
   のヘモグロビンと結合した改良された酸素放出特性を有
   する無損傷赤血球を含有する血液をヒト以外の温血動物
   に輸血することからなる、動物組織への酸素供給を改善
   する方法。 ７ ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及び
   コレステロールのモル比が８：２：７である第６項記載
   の方法。 ８ ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及び
   コレステロールのモル比が９：１：８である第６項記載
   の方法。 ９ ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及び
   コレステロールのモル比が８：４：７である第６項記載
   の方法。 １０ アロステリック因子がイノシツトヘキサリン酸、
   イノシツトペンタリン酸、イノシツトテナラリン酸、イ
   ノシツトトリリン酸、イノシツトジリン酸またはジホス
   ファチジルジリン酸などからなる群から選ばれる糖ホス
   エートである第６項記載の方法。 １１ アロステリック因子がイノシツトヘキサリン酸で
   ある第１０項記載の方法。 １２ アロステリック因子がヌクレオチドトリホスエー
   ト、ヌクレオチドジホスフェート、ヌクレオチドモノホ
   スフェートまたはアルコールホスフェートエステルなど
   からなる群から選ばれるポリホスフェートである第６項
   記載の方法。 １３ アロステリック因子がポリカルボン酸の如き有機
   アニオンである第６項記載の方法。 １４ アロステリック因子がヘキサシアノ鉄酸塩、ホス
   フェートまたはクロリドなどからなる群から選ばれる無
   機アニオンである第６項記載の方法。