JPS6024183A - 細胞培養方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、例えば組織培養のようなインビトロにおける
細胞増殖に用いられる方法および装置に関する。

過去１０年間に、薬物学的又は診断用に有用な生産物を
得るために動物、植物又は人工細胞（例えばハイプリド
ーマ）をどのようにしたら最４良く利用できるかについ
ての知識と理解が劇的に増加した。

例えばインターフェロンは動物細胞から放出され、ウイ
ールス感染を阻害する。しかしながらその効果は、主と
して、それを生産する細胞を大量に増殖させることがむ
づかしかったため、まだ十分には確立されていない。モ
ノクローナル抗体はハイプリドーマによって生産される
。ヒトハイプリドーマによって生産されるヒト・モノク
ローナル抗体は、ヒトハイプリドーマを培養で増殖させ
ることによって製造するのが最も良い。ゾラスミノーグ
ンを賦活化して血餅溶解酵素プラスミン−な生成する酵
素、ウロキナーゼは、好ましくは培養で増殖した腎細胞
から得られる。シラスミノ−ダンを賦活化してヒトプラ
スミンを生成する酵素であるヒトウ四キナーゼは、ヒト
腎細胞から得ることができるが、−この細胞を大規模に
増殖させることはむづかしい。

上述のような生産物の起源としてその種の細胞は明らか
に有望でおるため、能率的な大規模細胞培養システムを
開発する努力が促進された（例えば、Ｆ＠ｄ＠ｒ　＆　
Ｔｏｌｂｅｒｔ　［ＴｈｅＬａｒｇｅ　５ｃａｌｓ　ｅ
ｔ＋１ｔｌｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＭａｍｍａｌｉａｎＣ
ｅｌｌ＠ｓ　Ｊ　＋　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍ＠ｒ
ｉｃａｎ　ｓ　２　４　８；３６−４３（１９８３年１
月）を参照せよ）。

一般に、非細菌性細胞は脆弱で複雑である。

それらは血ｇＸ膜によって取シ囲まれ、細胞壁がない。

動物および植物細胞の栄養的要求条件は厳しい。外せな
らば、細菌のような自由生活微生物とは違って、動物又
は植物の細胞は有機体組織の一部として、特殊化された
生活に適応しているのが普通だからである。それらの生
活力は、多くの他の細胞の特殊外機能およびそれぞれの
細胞のために正確に調節された安定な環境を保障すると
ころの循環系に依存する。大部分の細胞は、動物性でお
れ植物性であれ、懸濁状態では増殖しないだろう。それ
らは成る表面に付着した場合にのみ増殖する。永年に互
って、実験室で小規模に細胞を増殖させる技術が開発さ
れてきた。インビトロにおける細胞培養のための多数の
装置が提案された。例えばＫＩ１１＆ｚｅｋ等による米
国特許第４，１８４，９２２号又は米国特許第４．２２
０，７２５号に記載の装置、Ｊｏｈｎｓｏｎ等による米
国特許第４，３１７，８８６号に記載の装置、Ｋａｔｉ
ｎｇｓｒ　尋による米国特許第４，２５９，４４９号に
、又はＢａｋｅｒ等による米国特許第４，３２１，３３
０号に記載の装置を参照され度い。

種々の起源に由来する細胞をインビトロで増殖させるた
めの、改良された能率的な装置および方法の必要性は絶
えず続いている。

本発明は、動物、植物又は人工の細胞の増殖および培養
のための装置並びにその装置の使用法を提供する。

ことに用いる装置は、Ｂ＠ａｋ等の米国特許第４，２５
２，６５３号に記載の免疫血液潅流装置の改良である。

Ｂｅ　＠に等の装置それ自体がＤａｖｌｓ等により記載
された装置の変形である（　Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ
　ｏｆ　ｔｈｓ　Ａｎｖｒｉｃａｎ　５ｏ−ｃｉｅｔｙ
ｆｏｒ　Ａｒｔｉｆｌｅｌａｒ　Ｉｎｆｅｒｎａｌ　Ｏ
ｒｇａｎｓ＋　２０　：３５３）。Ｄ＆マ１謬等は秩序
立って展開される重合体繊維内に封じ込められた炭素粒
子をもつ血液潅流カートリッジについて記載している。

Ｂｅｓ＋に等はこの装置に変更を加え、生物学的液組成
の著しく特殊な変化にも用い得るようにした。Ｂ＠ａｋ
等の米国特許第４，２５４６３５号における繊維カー）
　ＩＪツゾは、固定された、ランダムでない、三次元的
配列の繊維を含み、その繊維の化学的組成は、又別の化
学的種属がその表面に移植可能となるか又は繊維母体内
にとシ込まれ得るというようなもの：あった。その付加
的種属はカートリッジを潅流する生物学的液（例えば血
液）に高度に特異的な変化を能率的に与え得るような方
法で固定された。

本発明は、Ｄ＠Ｙｌ＠４１　＠およびＢｅａｋ等による
装置の、細胞培養への適用を開示するものでおる。本発
明はそのようなカートリッジ装置が作成される一般的公
式および過程をも開示し、インビトロ細胞培養に適した
方法および材料を記載する。

本発明は一般に、ハウシングの中に含まれる固定した三
次元の繊維配列から成シ、そのハウシングは、栄養液が
液と繊維間との最大接触を保ちながらハウシング中を連
続的に流れるように作られる。繊維には共有又は非共有
吸収性付着物でコーティングされ、所望の細胞が培養増
殖できるようになっている。従って繊維は、所望の細胞
がそこに付着し、栄養液中で栄養組成と接触し、毒性老
廃物をその中へ放出し、しかもその生活能力又は代謝効
率は失わないことが可能であるように選択される。

装置 第１図に示した装置は本発明の下に考え得られる１例に
過ぎず、決して本発明を限定するものではない。

組み立てられたカートリッジ紘、一端に円形ガラス又は
プラスチック円盤２を、他端に同様な円盤２＆をかぶせ
た、ガラス製又はゾ、ラスナック製ジャケット１から成
る。円盤２はその中心に円筒状の出口３をもつ。ジャケ
ットおよびキャップには、栄養液がジャケットおよびキ
ャップの表面に沿ってよどみ匁い軸流をおこし出口から
外に流れ出るように、リプ４の形にもシ上った要素があ
る。ジャケットの中にはガラス製又はプラスチック製心
棒６の周シにらせん状に巻きつけられた、繊維のスゾー
ル５がある。リプ間の隙間を除いてジャケットの全空間
を心棒と繊維が埋めている。

別の屋の心棒を用いることもできる。その心棒は長さに
沿っていくつかの孔のあいた単純な中空のチューブであ
る。培養液はそのチューブに送り込まれ、その長さのい
づれの点からも出ることができる。孔の大きさは、流れ
のノｑターンが最適になるように、チューブの長さ′に
沿って種々変化させることができる。

第２因は心棒６を示す、これはガラス製又はプラスチッ
ク製棒で、基部７が円錐形になっておシ、長さに沿って
８のような溝がほつである。棒のてっぺんは、構造物２
ａのような円形のスピンドルキャップにとシつけられた
円錐状の口１０の中にはめ込まれる。キャップの直径は
、キャップがジャケットとびつ７ＩＣシ合うように、そ
して心棒をジャケット中に挿入した時密封容器が形成さ
れるように選ばれる。スピンドルキャップの外側表面に
は、円筒形の入口部分１１がとシつけられている、それ
は円錐状の口１０に相対し、その内径は、液がそこを通
過して心棒６の溝８に入シ得るような大きさでおる。更
に、心棒の円錐形基部の大きさは、心棒基部を出口には
め込んだ時その心棒がジャケットキャップのリプ４との
み接触するような大きさである。このおかげで、リプ間
に蓄積する栄養液は、心棒６の円錐形基部７と、出口３
この間の細隙を通って流れ出る。こうして、心棒に繊維
を巻きつけた時この装置に流入する液の流れは、第１図
の矢によって示される。

繊維の配列およびハウシング 繊維の広がシおよびカートリッジ内の繊維の特殊な三次
元的配列が、流れの性質、使用し得る重合体表面面積訃
よびこの装置の示す注入容量を決める。この最後の二条
性が最適となるのは繊維の直径が、十分な強度を示しな
がら最小の数値をとる時、および繊維の配列が、最も緻
密な床（ｂ＠ｄ　）を作るように選ばれた時である。流
れの性質は、使用し得る表面面積および注入容量とは反
対の方向に影響を受ける。そこで、培養細胞に対する損
傷を最小にし、全体的効率を最大にするよりにこれらの
条件を調節しなければならない。

カートリッジジャケットの入口と出口との間の固定繊維
配列の展開は、無数の配列から選ばれる。比較的便利な
配列の中には次のものがある。

（１）出口又は入口のまわシに巻きつけることによる繊
維の展開。このような配列は、チューブの長さに沿って
液を流入又は流出させる手段をもつチューブの一つの口
の周囲に、円筒状対称性を形成する。繊維を巻きつける
配列で考え得られるもう一つの型は、中心にある一個の
口のまわ）に球形対称性の形に繊維を巻きつけるもので
ある。

（２）　液が軸方向にカートリッジを通過するカートリ
ッジでは、繊維は流れの方向に平行に展開し、カートリ
ッジの両端にくっついている。

軸流カートリッジにおけるもう一つの配列は、繊維をカ
ートリッジの側方部分にくっつけることによって、液の
流れを横切るように繊維を展開するものでおる。平行配
列と横断配列との組み合わせを用いてもよい、この場合
繊維はカートリッジの両端および側方部分共にくっつけ
られ、織シ込み式に展開される。

繊維は単繊維として、又は多繊維のよ）糸として展開し
てもよい、そして装置は一本の連続する繊維か、多数の
繊維を含む。カートリッジハウジングおよび繊維展開の
配置が、装置に固定される成分の損傷を最小にする流体
力学に一致することは必要である。これらの制限は、熟
練せる当業者には周知のことである。

細胞 インビトロで培養が可能な細胞又は細胞の組み合わせは
すべて本発明に記載される装置中で培養することができ
る。特に興味があるのは、動物細胞（例えばヒト細胞）
、植物細胞、微生物細胞（例えば細菌、酵母類）又は人
工細胞（例えにハイプリドーマおよび発生学的に変化さ
せるかその他の変形を施した細胞）である。又、繊維に
結合したミクロカプセルに取シ込まれた細胞を用いるこ
ともできる。

例えば、先行技術の説Ｆ！ＡＫ記載された細胞は、いづ
れも本発明の装置に固定することができる。細胞は広い
意味では所望の分子又は分子の組み合わせ−例えば酵素
、芽胞細胞、薬物、抗体、ウィールス等−を丹念に作υ
、分泌する微小工場であると考えられる。

繊維 一般にはそのままで、又は処理を施してから、表面に生
きている細胞を吸着することのできる繊維生成材料は、
天然のものであれ人造性のものであれ、使用することが
できる。

その材料は、若干のクリテリヤによって規定されるべき
である。（１）その材料から生成する繊維は、処理して
三次元配列にできる位の強度をもたなければならない。

（２）その繊維は中性水溶液にほとんど不溶でなければ
ならない。

（３）その繊維は、非特異的吸着および捕促（＠ｎｔｒ
ａｐｍｅｎｔ　）を減らすために滑らかな無極性の表面
を有するか、表面積を増やすために多孔性表面を有する
かどちらかである。（４）その繊維はそれら繊維を通過
して流れる水性媒質中に毒性物質又は断片を放出しては
いけない。（５）繊維構造の生物適合性（ｂｉｏｃｏｍ
ｐａｔｉ　−ｂｌｌｌｔ７　）の程度は、意図する適用
のために満足すべきものでなければならない。長期適用
においてその繊維は吸着細胞の非可逆的蓄積的有害な変
化をおこしてはならない。（６）用いる繊維は、そこに
細胞を付着させる性質を呈さなければならない。こうし
て、繊維は次のカテゴリーの一つから選ばれる。（Ａｔ
生物学的起源の諸物質又娘それらから生ずる生産物、例
エバセルローズ、ペルフルオロエチルセルロース、トリ
アセチルセルロース、アセチルセルロース、ニトロセル
ロース、テキストラン、キチン、コラーゲン、フィブリ
ン、エラスチン、ケラチン、架橋溶性蛋白質、生物起源
の重合溶性有機物質（ぼす乳酸、？リリシン、核酸）、
絹、ゴム、澱粉およびヒドロキシエチル澱粉；（Ｂ）＆
リアミド、ポリエステル、？リエーテル、ポリウレタン
、ポリ炭酸およびシリコーンのような、ペテロ鎖、合成
重合体；（Ｃ）炭化水素重合体、例えば？リエチレン、
ボリゾμピレン、？リインゾレン、ポリスチレン、？リ
アクリルアミドのような？リアクリル樹脂、？リメタク
リル酸塩、酢酸ポリビニールのようなビニール重合体、
ＰＶｃのようなハロダン化炭化水素シラステックス、テ
フ。７■。よ、ヵ１，７．オ。カー、７．７いオロカー
ボン共重合体および？リクロロトリフルオロエテレン、
（Ｄ）ガラス繊維のようカ無機繊維、繊維は横断面が詰
まっていても中空であってもよい。

繊維はそのま＼用いてもよいし、細胞吸着性を増すため
に物理的又は化学的方法によって前処理を施してもよい
。化学的方法としては固定基（ａｎｃｈｏｒｉｍｇ　ｇ
ｒｏｕｐｓ　）による処理がある。例えば−リリシンの
存在下で繊維を生成すると、繊維はアミノ基でお＼われ
る。細胞、酵素の固定、固体相免疫検定法、酵素結合免
疫吸着剤検定法、細胞の標識化および分離、血液透析の
ために用いられるところの熟練せる当業者には周知のそ
の他の技術も用いることができる（参照例；米国特許第 ４．０３１，２０１号、３，６５２，７６１号、４，０
５９，６８５号、３．８６５．７２６号およびカナダ特
許第９５７，９２２号） 細胞の繊維への付着は、繊維をカートリッジに入れる直
前の、重合体製造中又は繊維紡績中に行われるか、又社
繊維をカートリッジ内で展開した後に行われる。その付
着は、先行技術の免疫血液潅流法において血液から細胞
を取シ除くために装置を用いる場合にみられるような単
に一時的な付着であるよシも、永久的であるべきである
。永久的とは、その付着が、所望の代謝産物を実収可能
なだけ十分長く、例えば１日かそれ以上、続くことを暗
に意味する。

繊維の表面を変化させる物理的処理法を用いることもで
きる。例えば、低圧不活性気体中又は反応性蒸気中にお
けるグロー放電は本発明における好ましい方法である。

なぜならばそれは細胞の吸着性を著しく増すからである
。同様にして大気圧下のコロナ放電も用いられる。細胞
付着を促進する物質（例えばコラーゲン、？リーム−９
２２等々）によるコーティングのような繊維の化学的処
理を用いることもできる。

本発明に訃いて用いられるカートリッジシステムおよび
装置は、現在用いられているフラスコ、ロール壜、又拡
ピーズの使用にまさる多くの利点を有する。

細胞が結合する表面面積は著しく増加する。

例えば長さ１５．２４ｃｌｎ（６インチ）、直径７．６
２α（３インチ）のカートリッジでは、破りプロピレン
繊維で約１０００平方米が得られ、これは培養フラスコ
およびロール壜のような装置に比べて顕著な増加である
。

ハイオヒーズ（ｂｌｏｂｅａｄ■）は同様の表面積を有
するとはいえ、本発明の装置はこれに比べて多くの利点
をもっている。栄養を、繊維床全体に付着している細胞
のすべてに一様に行きわたるように、カートリッジの中
に流し込むことができる。繊維がらせん状に分布するた
めに、繊維の充填量を調節することができる。こうして
カートリッジ内部に変動可能の空間を用意することがで
きる；この変動は、所望の栄養供給速度の大きさおよび
性質に依って調節することができる。カートリッジの流
れシステムは、生成物を簡単に集められる、という利点
をもっている。繊維は、トリジシン加水分解又はその他
の通常用いられる方法によって簡単に細胞を除去し、再
生することができる。栄養媒質紘再循猿させることが可
能で、出口でそれをチェックし、必要な塩類、成分又は
その他の培養に必要人ものな加えることができる。

システムは再利用できる。それは他の先行技術の培養装
置とはｙ同様に滅菌することができる。滅菌は、高温滅
菌、圧熱滅菌、エチレンオキシド処理、エタノール処理
等によって行われる。装置は、２〜３ミリリツトルから
数ガロンまでの広範囲の大きさで作られる。

カートリッジ−繊維の組み合わせは非摩耗性配置をとる
。ビーズを用いる時広い表面積が得られるとはいえ、こ
れに関してはいくつかの問題がある。先づ第一に、ビー
ズの流れ特性の問題である。もし圧のか＼ったシステム
においてビーズを用いるならば、速かに充填がおこシ、
流れが悪くなる。もしもビーズを用いた流動性ベッドシ
ステムを利用しようとする場合ビーズ同志の摩耗が見ら
れるのが普通であシ、このため細胞はその表面からはな
れて、材料のかなシの喪失がおこる。それに対して、本
発明のカートリッジ内の繊維はきつちυと巻きつけであ
る。もしも増殖が過剰になって、細胞がカートリッジの
成る部分を遮断し始めたような場合には、簡単に、装置
にか＼る圧力を高め、送風して再び穴な作シ、流れを維
持することができる。

本発明の装置を用いて別の配置で使用することができる
。装置の大きさを変えることもできるし、巻きつけるピ
ッチを変えることもでき、繊維の表面積の他にどの位の
空間が必要かに応じて多かれ少かれ空間をもった種々の
充填配列を得ることができる。

好ましい実施例において、本発明のカートリッジに第二
の繊維を設置することができる。

カートリッジが形成される巻きつけ過程の間第二の繊維
を、カートリッジの長さに沿って中心心棒と平行の方向
に向くように軸に沿って置き、残ルの繊維を心棒に巻き
つけて、平行繊維を包むようにすることもできる。

第二の繊維を用いる利点の一つは、これらが中空で１１
）得ることでおる。このため装置に、ループを描いて両
端に戻るか又はカートリッジ全体を通じて連続すること
ができ、栄養を添加した多特殊な物質を取υ出すのに用
いることのできる、中空繊維の流れシステムを埋め込む
ことができる。これはカートリッジの閉鎖後になされる
から、外部流はない。

今までこの発明について一般的に述べたが、更に説明の
目的で示され、別に特記しない限多請求を限定する意図
のないところの、二。

三の特殊な実施例を引用することによって、これはよシ
よく理解される。

実施例Ｉ ＳＣ−１細胞を用いる繊維実験材料および方法 ５種類の繊維を、細胞の付着および増殖のために適した
基質でおるかどうかを調べるために試験した。試験した
のは次の繊維である＝１　コーニング組織培養フラスコ
から引き伸ばしｆｃ都リすテレン繊維 ２　？リプローレフ６ｍ１１ ３　エ、オ、７■□８７９−□１−１□６．いシン８１
６　３４３−４） ４　、ＩＪ　：Ｃ，２ｆヤ（ｆｘ、ｙ　ＩＩ。７■。

１１００／１９２ ５　ナイロン６（ムｌｉｔ・ｄ　）　１００／３２繊維
は４０−５０’　ｍｍの長さに切断され、無水アルフー
ルに１時間没される。成る実験ではアルコールに浸さな
かった繊維もテストした。

アメリカン　タイプ　カルチャー　コレクションから入
手したマウス胚線維芽細胞、ＳＣ−１細胞の連続系列を
本研究に用いた。

細胞を６０　ｍｍシラスチック組織培養皿（Ｆａｌｅｏ
ｎ　）および未処理のプラスチックベトリ皿において増
殖させた。ＳＣ−１細胞は、５％加熱不活化ウつ胎仔血
清（５ｔｅｒｉｌｅＳｙ＠ｔｅｍＩＩ）、１００μｆ／
ｍ！ストレゾトマイシン（Ｌｉ１１７　）および１００
　ｕｎｉｔ＠／−ペニシリンを強化したイーグル最小必
須培地（１Ｍ　）　（ＧＩＢＣＯ）で増殖させた。

適当な培地５ｆＩｄ！、Ｖζ３．５Ｘ１０’細胞を接種
し、これを試験すべき繊維を含む培養皿に加えたｃ８Ｃ
−１細胞は、固体基質上に融合せる単層を形成した。試
駆繊維に付着した細胞の生活能を定めるためにトリノぐ
ンプルー％色素排除法を用いた。この色素は生きている
細胞からは排除されるが、死細胞にはとシ込まれる。

結果 どの繊維を細胞増殖の基質として用い得るかどうかを定
めるための最初の実験のために、組織培養皿のｓｃ　−
１を用いた。試験した５種類の繊維の中で、コーニング
組織培養フラスコからのポリスチレン繊維がその細胞に
対して最も大きい親和性をおられした。しかしながら細
胞は明らかに、その繊維表面よシも組織培養皿の表面に
増殖する傾向を示した。

繊維の長い部分に付着した細胞も少しはらったが、細胞
付着が最も強い部分は、金属製蛤で切った、繊維の端の
部分でめった。細胞は繊維上に好んで増殖する傾向を示
さなかった。。

とはいえ、トリノＱンプルー色素排除試験で調べたとζ
ろでは、繊維は細胞に対して有毒であるようには見えな
かった。この実験から得られた情報に基づいて、その後
の実験はすべて、−リステレン繊維を用いて、組織培養
皿およびペトリ皿両方で行った。

細胞の粘着性を高めることを試みて、ポリスチレン繊維
を組織培養皿に入れ、ぺ）　ＩＪ皿には処理繊維を置い
た。細胞は繊維表面と組織培養皿表面に増殖して融合単
層になった。

ペトリ皿表面には少しの細胞が付着しただけであったが
、ペトリ皿中の繊維表面上に細胞は増殖して融合単層を
生成した。細胞の大集団がペトリ皿の若干領域の繊維に
付着した。

４日目に各培地から一本の繊維をとシ出し、アセト−オ
ルセンで細胞を染色し、顕微写真をとった。アルコール
に浸した繊維と浸さない繊維とでは、細胞の付着および
増殖に伺らの差も認められなかった。

最初の実験によル、ポリスチレンにグロー放電処理を施
すとｓｃ　−１細胞の繊維に対する付着は増加すること
がわかった後、３種類の処理法を用いた。次の試料を調
製した。

１　ポリスチレン繊維に、１０鮎、２５０ｖの直流電気
量を酸素気流中で約５分間かける。

２　？リゾロビレン繊維にアンモニア気流中で１０ｍム
、２５０　Ｖの直流電気量を約５分間かける。

３　エラスタン繊維に、アルゴン気体中で１゜ｍム、２
５０Ｖ直流電気量を約１０分間がける。

ｓｃ　−１細胞はどの繊維上でもよく増殖したが、酸素
又はアンモニアの存在下で電気量をかけた繊維上におけ
る細胞増殖が、アルゴン存在下で電気量をかけた繊維上
における細胞増殖よシわずかに良かった。

未処理ポリスチレン繊維の若干に、脱イオン水中で０．
１％コラ−ダンでコーティングするか又は脱イオン水中
で０．５％ポリ−Ｌ−リシンコーティングを行った。繊
維を２時間溶液に浸し、１０分間脱イオン水で洗い、吸
収性紙タオル上にひろけて一晩乾かした。それからその
繊維を既述のように実験のために準備した。ペトリ皿に
おいてｓｃ　−１ｌＩａ胞はコラ−ダン−おｘびｚｖ−
Ｌ−リシン−コーティング繊維いづれの上でも増殖した
。組織培養皿ではアルコールで洗わなかった畝り−Ｌ＋
　ＩＪシン−コーティング繊維のみが細胞増殖を支えた
。これらコーティング繊維どちらでも、８Ｃ−１細胞の
増殖は、電気量をかけた繊維で観察された程しつかシと
付着し、且つ均一に分布するようにはみえなかった。

次には一すステレン繊維を％１−５−１５．３０秒およ
び１および５分間グロー放電にさらし７’Ｃ（アルゴン
気体中で１０ｍム、直流）。

それからこの電気量をかけた繊維および処理を施さ力い
対照繊維を入れた組織培養皿およびベトリ皿に５ｃ−１
細胞を加えた。２日間インキュベーションした後、対照
繊維では、繊維の切断端にわづかの細胞が付着している
だけであった。グー−放電に１，５又は１５秒間さらし
た繊維では、繊維上に大量の細胞増殖があった。グロー
放電に３０秒、１および５分間さらした繊維上への細胞
付着並びに増殖は非常に不均一でおった。１又は５分間
さらした繊維の若干部分は細胞に対して有毒であるよう
にみえた。

？リスチレン繊維を、次に一一タプル真空漏れ検出器か
らのコロナ放電にさらした。繊維なペトリ皿に入れ、コ
ロナ放電を皿の中の繊維にかけた。繊維をグロー放電に
さらすために用いた同じ皿に８Ｃ−１細胞を加えた。

繊維を処理するプロセスで稿ペトリ皿の表ｍｌをも処理
し、その結果細胞は皿の表面にも繊維表面にも付着した
。この実験を、方法に次のよう力変化を加えてくシ返し
た：繊維をアルミニウム製秤量ノＱンに置き、グロー放
電にさらす。１群の繊維を約１秒間さらし、ビンセット
で裏返し、更に１秒間グロー放電にさらす。それから繊
維なベトリ皿に移した。この方法を別の群の繊維を用い
てアルミニウム製ノＱンの中で繰返して行った。この群
の繊維はよυ長時間（約５〜１０秒間）グロー放電にさ
らした。未処理の対照繊維にはわづかのｓｃ　−１細胞
しか付着しなかった。電気量をかけた繊維には多量或い
は軽度の細胞増殖部分があったが２日後、完全に融合し
た細胞単層をもった繊維は１本も見つからなかった。

実施例２ ＫＢ細胞培養による繊維の実験 この実験の目的は、培養基中のＫｎ細胞が合成繊維上で
発育し増殖するかどうかを調べることであった。

材料：ＫＢ培養細胞：　Ｄｒ、Ｈａｒｒｙ　Ｅａｇｌｓ
＋１９５４によって細胞培養が開始されたヒト鼻咽喉類
上皮癌（Ｅａｇｌｓｓ　ＨｏＰｒｏｅ、Ｓｅｅ、Ｅｘｐ
ｔｌ　。

Ｂｌｏｌ、Ｍａｄ、す：３６２．１９５５）。

増殖培地：１０％仔ウシ血清（ＦｌｏｗＬａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｓｓ＊Ｍａｌ＊ａｎ＋Ｖｉｒｇｉｎｉｍ　）を添
加したイーグル基礎培地（Ｅａｇｌｓ、ＨｏＪ、Ｅｘｐ
ｔｌ。

Ｍｅｄ、１０２：５９５−１９５５）。ｆ２ステック組
織培養皿、６０　Ｘ　１５　ｍｍ（ＦａｌｅｏｎＢｅｃ
ｔｏｎ　Ｄｉｃｋｌｎｓｏｎ　Ｌａｂｗａｒｅ＋０ｚｎ
ａｒｄ−カリフオルニア〕。

繊維：　（１）　＆リスチレン（コーニング組織培養フ
ラスコから） （２）　ｆ′リゾロビレンー６ｍ１ｌ （３）−ｒ−、ｘ）ｙ■Ａ８□９−１□−１−０□（４
）？ジエステル１１００／１９２デユー７５、。７■ （５）ナイロン６　１００７３２ 方法：繊維を約５０　ｍｍ長さに切断し、無水　（アル
コールに１時間浸した。繊維を６０Ｘ１５　ｍｍプラス
チック組織培養皿に無秩序に置いた（１つの皿に１種類
の繊維）。増殖培地に２００，０００細胞／−の割で懸
濁させｆｃＫＢ細胞を５１を容量づつ各試験器に加え７
’Ｃ（１つの皿にｌＸｌ０’細胞）。各試験毎に対照の
細胞皿（繊維を入れない）が１個含まれた。

皿を５％ＣＯ！および空気中で、３７℃で２４時間およ
び４８時間インキュベートした。それらの皿を倒立顕微
鏡下で調べ、細胞増殖および繊維への付着の状態を観察
した。

試験結果： （１）５種類の繊維をＢ細胞の存在下でインキュベート
しｆｃ＝細胞付着は認められなかった。

：２）電気的に負荷をかけた、アルコール処理−および
アルコール未処理の？リステレン繊維にＫＢ細胞を加え
る：繊維の端に少数の細胞が付着した・ （３）　Ｏｘ　％　−ＮＨ４およびアルゴン中で電気的
に負荷をかけた叡すステレン繊維十ＫＢ細胞：これら３
条件すべてにおいて細胞は繊維の端に付着した：アルゴ
ン中で電気的に負荷の繊維では細胞はまばらに付着した
。

（４）　−リリシンおよびプラーダン（別々に）でコー
ティングした、アルコール処理なしの？リステレン繊維
、十ＫＢ細胞：細胞はコラーゲンコーティングを行った
繊維に付着した。

？リリシンコーティング繊維には細胞付着は認められな
かった。

結論：と＼に用いた繊維について、細胞付着を促進する
能力は、繊維の種類、細胞の種類　４゜および付着前の
繊維処理の種類によって変るしかしながら細胞の増殖お
よび付着のための条件は、はんの小規模な実験によって
日常的に見出すことができ、無限の繊維および細胞にこ
の方法を応用することができる。本発明のカートリッジ
装置の中に、選択した繊維と細胞を入れれば、細胞の大
規模培養のだめの有効で安定なシステムができる。

今と＼にこの方法を十分に説明したが、この同じ方法が
、と＼に示した発明又は実施例の精神又は範囲を逸脱す
ることなく、相邑する広い範囲の組成、細胞、方法論、
繊維、巻きつけ、サイズ等において行われ得ることは、
熟練せる当業者には当然である。

【図面の簡単な説明】

第１図は組み立てた細胞培養装置の一部切シ取られた斜
視図でおる。 第２図はカートリッジの心棒の斜視図でおる。 １−ｍ−ジャケット　２．２＆−ｍ−末端プレート３−
−−山口　４−一一軸リプ ５−ｍ−繊維スプール　６一−−心棒 ７−−−円錐形突端　８−ｍ−溝 １０−一一円錐状口　１１−ｍ−人口 以上 ↓ ＦＩＧ、　ｊ ＦＩＧ、　２ 手続補正書（賦） 昭和５９年８月１６日 事件の表示 昭和５９年　特　許　願第６８９６３　号発明の名称 細胞培養方法及び装置 補正をする者 事件との関係　出願人 名称　ストル　リサーチアンド　デ（ロノメント　コニ
？レーション代表者　ラル７　ゾエー、ストル 代理人 ５゜ ６、補正の対象 明細書の「発明の名称」の欄 Ｌ　補正の内容 α）　明細書中、第１頁第３行 「細胞培養の方法及び装置」とあるを 「細胞培養方法及び装置」と訂正する。 ４４３−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　不浸透性物質の、長いハクシングから成る細胞培
   養装置であって、その両端は不浸透性の末端プレートに
   よって閉鎖され、当該ハウシングは内部に、ｔｌとんど
   その長さ全体に延びる複数の軸リプ、当該末端プレート
   の一つにある入口、当該末端プレートの他端にある出口
   をもち、当該リゾは当該末端プレートの他端において放
   射状に続き、一本の不浸透性の心棒が当該ハウシング中
   に軸方向に置かれ、その心棒の周囲には軸方向に溝がつ
   いておシ、円錐状の口が当該心棒の一端に、しつかシと
   とシつけられ、それは当該入口および当該溝と連絡して
   おシ、当該心棒の他端は、環状空間をもつ尚該出口に関
   して軸方向の円錐形突端となって＃！シ、繊維のスゾー
   ルが当該心棒にうづ巻き状に当該ハウシングの内部をほ
   とんど満たして当該リプにくい込む程巻きつけられ、そ
   の際当該入口から入ってくる液体は当該心棒のみそに沿
   って流れ、当該繊維スゾールを通過し、当該ハウシング
   を当該リブの間を流れ、その後は当該円錐形突端と当該
   出口との間を流れ、当該繊維上には、動物、植物、微生
   物又は人工由来の細胞が付着している細胞培養装置。 ２　細胞がウイールスを生産するものである特許請求の
   範囲第１項記載の装置。 ユ　細胞が動物性である特許請求の範囲第１項記載の装
   置。 ４゜　細胞が哺乳類由来のものである、特許請求の範囲
   第３項記載の装置。 工　細胞がハイプリドーマである特許請求の範囲第１項
   記載の装置。 ６、細胞が繊維上に直接固定されたものである　３゜特
   許請求の範囲第１項記載の装置。 ７、　細胞が、化学的固定化合物によって繊維上に固定
   されたものである特許請求の範囲第１項記載の装置。 ８、インビトロで細胞を培養する方法でおって。 特許請求の範囲第１〜７項のいづれかの装置で当該細胞
   を培養することを含む方法。 ９、　動物、植物、微生物又は人工由来の細胞に発生す
   る物質を得るための方法でおって、当該細胞なインビ）
   １−で培養し、一方当該細胞を固定して保持し、その後
   生産物を当該細胞から集める、当該細胞が特許請求の範
   囲第１〜７項のいづれかによる装置に固定されるという
   改善がなされた方法。