JPS60248191A

JPS60248191A - フオスフイノスリシンの製造方法

Info

Publication number: JPS60248191A
Application number: JP10239084A
Authority: JP
Inventors: Satoshi Omura; 智大村; Haruo Tanaka; 晴雄田中; Katatsune Murata; 村田　容常; Yuzuru Iwai; 譲岩井; Ruiko Oiwa; 大岩　留意子
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1984-05-21
Filing date: 1984-05-21
Publication date: 1985-12-07

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明はフォスフイノスリシン（Ｌ−２−アミノ−４−
メチルフォスフイノ酪酸）の製造方法に関する。

本発明によって提供されるフォスフイノスリシンは、下
記のような２−アミノ−４−メチルフォスフイノ酪酸の
構造を有する化合物であシ、その物理化学的性状はＨｅ
１ｖ、　Ｃｈｌｍ、　Ａｃｔａ、、　５５巻、２２４頁
、１９７２年に開示されている。

フォスフイノスリシンは、除草活性を有するフォスフイ
ノスリジルアラニルアラニン（ｐｈｏｓ−ｐｈｌｎｏｔ
ｈｒｉｃｙｌａｌａｎｙｌａｌａｎｌｎｏ　）の活性本
体であわ、グルタミン合成酵素の強力な阻害剤である（
　）（ｅｌｖ、　Ｃｈｉｎ、　Ａｅｔａ、、５５巻、２
２４頁、１９７２年）。そして、フォスフイノスリシン
も強い除草活性を有することが知られている（４？開昭
５４−９２６２８　）。

フォスフイノスリシンの製造法としては、すでに化学合
成による方法が知られているが（Ｈｓｌｖ。

Ｃｈｉｍ、　Ａｅｔａ、、　５５巻、２２４頁、１９７
２年および明治製菓研究年報１３号、４９頁、１９７３
年）、化学合成では、ラセミ体が得られ活性は半減する
。

本発明は、バチルス、ブレビバクテリウム、エシェリヒ
ア、グルコノバクタ−、プロテウス首たはエルビニャ屑
に貫くするある種の微生物が、フォスアラジンを分解し
てフォスフイノスリシンを生産する能力を有するという
知見に基いている。

本発明の目的はフォスフイノスリシンの新しい製造方法
を提供することである。

本発明によシ、ノチルス、ブレビバクテリウム、エシェ
リヒア、グルコノバクタ−、フロテラスまたはエルピニ
ャ属に属し、７オスアラシンをフォスフイノスリシンに
変換する能力を有菌する微生物の培養物または！もしくはこれらの処理物と
フォスアラジンを接触せしめることを特徴とするフォス
フイノスリシンの製造方法が提供される。

本発明により、下記の式％式％で示されるアミＰ結合氷解反応をノ鷹チルス属、プレピ
ノ考りテリウム属、エシェリヒア属、グルコツノでフタ
−属、ゾロテラス属、エルビニャ属尋の細菌　・ ′　の培養物またはこれらの生菌体あるいは有機溶剤処理した菌体水性懸濁液等
を用いて行ない、反応液よりＬ−７オスフイノスリシン
を製造する。

本発明の方法によると、活性型（Ｌ型）のフォスフイノ
スリシンのみが直接培地中に蓄積されるので、ＤＬ分割
の必要はなく、活性型の７オスフイノスリシン製造のた
めの優れた方法である。

本発明を次に詳しく説明する。

抗生物質フォスアラジンの構造は次式の通シである。

― けＩ、　Ｇ）Ｉ３フォスアラジンは、さきに本発明者らが放線菌ＫＡ−３
３８株（微工研条寄第３５８号）の培養物から採取し、
その構造が開示されている（＃願昭５８−１４１４０１
号）。

フォスアラジンは分子Ｊ１３６５、融点〉２２５℃（分
解）の両性物質で、常温において安定であり、水によく
とけ、メタノールにはかなりよくとけるが、他の有機溶
媒には難溶である。フォスアラジンの理化学的性状および製法は前記特願△ 昭５８−１４１４０１号に開示されている。

本発明者らは稚々の微生物について、フォスアラジンを
分解して７オスフイノスリシンを生成する能力について
調べた。その結果を第１表に要約して示す。試験方法は
後記実施例１記載の液体培地１０１ｄ　（１２０℃、１
５分間滅＠）に試験菌株を接種し、無菌−過したフォス
アラジン１０〜を添加後、２７℃もしくは３７℃で２４
時間振盪培養した。培養液を遠心分離して菌体な除き、
上澄中に残存する７オスアラシンを微生物検定により測
定して分解率を算出した。ついで、上澄液を強酸性陽イ
オン交換樹脂アンバーライトＩＲ−１２０（Ｈ＋）　（
米国、ローム・アンＰ・ハース社製）のカラムに通塔し
てフォスフイノスリシンを吸着させた後、２　Ｎ　ＮＨ
４ＯＨで溶出し、この溶出液をセルロース薄層プレート
にスポットして、ブタノール：酢酸：水（３：１：２）
全溶媒として展開し、フォスフイノスリシンの標品とＲ
ｆ　値を比較することによりフォスフイノスリシンの生
成を確認した後、デンシトメーターを用いて４８０ｎｍ
でフォスフイノスリシンを定量した。

供　試　菌　株　分解率（鉤　生成率−）ノでチルス・
ズブチリス　ＡＴＣＧ　６６３３　７２　６０．５エシ
エリヒア・コリ　ＮＩＨＪ　５９　１０．８プロテウス
・ブルガリス　ＩＦＯ３１６７４９１２，０エルビニヤ
・アロイデー　ＩＡＭ１０６８　５４，５　５１．４（
注）＊　フォスアラジンの分解率（鋤＊＊　フォスフイ
ノスリシンの生成率（ｐ本発明において用いられるフォ
スアラジン分解能を有する微生物は自然界に広く分布し
ている。代表的菌種としては、たとえば細菌として属す
る菌種、その他多くの菌種があげられる。

本発明において用いられるフォスアラジンから７オスフ
イノスリシンを生成する微生物が持っているフォスアラ
ジンのアミＰ結合分解能力は、その微生物が生産する酵
素に由来するものと推定される。しかし、本発明ではフ
ォスフイノスリシン生成能を有する微生物の処理剤とし
て用いる場合のみならず、無細胞抽出液においてもフォ
スフイノスリシン生成能が認められることから、本発明
で用いる微生物の細胞内または培養物中にフォスアラジ
ンから７オスフイノスリシンを生成する反応に関与する
酵素系が存在することが推定される。

本発明の方法を実施、するにあたっては、たとえば、ま
ず上記第１表の微生物のなかから選ばれた一つの菌種を
培養する。この場合の培地は状液体βものが適当で、静置、振盪、通気攪拌のいずれの
培養法によってもよい。また培地は、使用微生物が生育
しうる炭素源、窒素源を含むものを使用する。培養温度
は使用微生物の種類などによって異なるが、通常２５〜
３７℃で培養すればよい。原料として用いるフォスアラ
ジンは遊離酸または金属塩を微細粉末または水溶液の形
で培養液にそのまま添加することができる。

添加時期は微生物の培養前、培養中のいずれでもよい。

あるいは培養物から集菌、分離された生菌体な含む水性
懸濁液に、または菌体破壊液に加えてもよい。処理反応
ｐＨは６〜９の範囲で行なうことができるが、フォスフ
イノスリシンの生成率を高めるためにはｐＨ６，８〜８
．０が好ましい。反応温度は２５〜４０℃で処理するこ
とができる。

反応終了後、反応液中ｔｔまれるフォスフイノスリシン
は酸性アミノ酸であるので、その抽出、精製にあたって
は、アンバーライトＩＲ−１２０（米国、ローム・アン
ｒ・ハース社製）、ダウエックス５０Ｗ（米国、ダウ・
ケミカル社製）尋の陽イオン交換樹脂もしくは、アンバ
ーライ）　ＩＲＡ４００、ＩＲ−４５等の陰イオン交換
樹脂に吸着させ、これを適当な酸、アルカリもしくは塩
溶液を用いて溶出することができる。

実用的は分離精製法の一例を示すと次の通りである。

たとえば、培養ｆ液を強酸性陽イオン交換樹脂アンバー
ライトＩＲ−１２０（Ｈ土製）を充填したカラムを通過
させ、有効成分を吸着させ、これをアンモニア水で溶出
する方法はフォスフイノスリシンの精製法として有効な
手段である。

このような方法で得られたフォスフイノスリシンの粗物
質は、セルロース、シリカゲル、アルミナ、セファデッ
クス（スエーデン国、ファルマシア・ファイン・ケミカ
ルス社製）およびトヨパール（東洋曹達工業製）等を使
用する公知の方法により、さらに純度を高めることがで
きる。こうして得られたフォスフイノスリシンは、白色
の無定形粉末であり、その理化学的性質および構造式な
らびに生物学的性質は公知である（特開昭４８−８５５
３８）。

抗生物質フォスアラジンは、デービスの最小培地上でバ
チルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉ
ｓ）に対して強い抗菌活性を示すが、フォスフイノスリ
シンは、はとんど抗菌活性を示さないので、抗生物質フ
ォスアラジンはデービスの最小培地を用い、検定菌とし
て、１チルス・ズブチリスを用いるベーノ々−・ディス
ク法によって定量することができろ。フォスフイノスリ
シンは通常次の方法によって定量される。まず、試料溶
液をアンバーライ）　ＩＲ−１２０（Ｈ土製）などの強
酸性陽イオン交換樹脂のカラムに通塔して水洗した後、
吸着されたフォスフイノスリシンを２規定のアンモニア
水で溶出する。この溶出液を濃縮した後、展開溶媒とし
てブタノール、酢酸、水（３：１：２）を用いるセルロ
ース薄層クロマトグラフィーに供し、ニンヒｔ、Ｉ　Ｉ
Ｊン発色後、薄層クロマトスキャナーを用いて４８０ｎ
ｍで定量する。

本発明で製造されたフォスフイノスリシンの融点、比旋
光度、元素分析値、薄層クロマトグラフィーのＲ，ｆ　
値は下記の通りで、標品のフォスフイノスリシンと完全
に一致した。

融点：２１０〜２１５℃ 比旋光度：〔α）”Ｎ　＋３０°（２規定塩酸中）元素
分析値理論値（ＣｓＨ＋２Ｎ０４Ｐとして）：炭素３３．１５
係、水素６．６８％。

窒素７．７３％実測値：炭素３２．８５％、水素６．５０係。

窒素７．６３チセルロース薄層クロマトグラフィー（ブタノール：酢酸
：水＝３：１：２）のＲｆ　値：０．３７以下に実施例を示す。

実施例１斜面寒天に培養されたノでチルス・ズブチリスＡＴＣＣ
６６３３をペプトンｘ、ｏ％、肉エキス０．５チ、食塩
０．５チ、ｐＨ７，０の液体培地１０４（１２０℃、１
５分間滅′菌）に接種し、３７℃、１２時間振どう培養
した（前培養）。この前培養液を同じ組成の液体培地Ｉ
　ＪＪ（１２０℃、１５分間＃Ｃ＠）に移した後、無菌
濾過したフォスアラジン１００■（０，２１４モル）を
添加した。３７℃で２４時間振とり培養後Ｐ別し、Ｐ液
１ノを得た。この培養液中にフォスフイノスリシンが２
３．５■（０，１３１モル）存在した（変換率６０．５
チ）。Ｐ液を活性炭で脱色した後、イオン交換樹脂アン
バーライトＩＲ−１２０（Ｈ”）のカラムを通過させる
と、フォスフイノスリシンは樹脂に吸着された。樹脂を
水洗後、２規定アンモニア水で、３離させた。

溶離液を濃縮後、調製用セルロース薄層クロマトグラフ
ィー（メルク社製）を行なった。展開液は、ブタノール
：酢酸：水ｅ＝３：］：２を使用した。フォスフイノス
リシン部分をかき取シ、５０％メタノール水溶液で溶出
し、溶出液を減圧を行ない、フォスフイノスリシン１５
■ヲ得た。

実施例２１００ｍ１の栄賽培地〔肉エキス１％、ペプト１０．５
チ、食塩０．５チ（ｐＨ７，０））を入れた５００ＷＬ
ｌ容坂ロフラスコ（１２０℃、１５分間滅菌）に、バチ
ルス・ズブチリスＡＴＣＣ６６３３株の胞子懸濁液を２
．０チ植菌し、３７℃で１８時間振とう培養し種菌液を
得た。この種菌液をスビジゼ／（５ｐｉｚｉｚｅｎ）培
地〔硫安０．２チ、リン酸二カリウム１．４％、リン酸
−カリウム０．６％、クエン酸ナトリウム０．１％、硫
酸マグネシウム７水塩０．０２チ、グルコース０．５％
（ｐＨ７，０＞　、１２０１　（１２０℃、１５分間滅
菌）を入れた３０１ジャーファーメンタ−に２．０チ接
種し、３７℃で２４時間通気攪拌培養を行ない、５４Ｉ
の湿菌体を得た。

２回水洗した後、２倍量の石英砂を加え、菌体な破砕後
、５０ミリモルの塩化イミダゾール、０．２ミリモルの
ＥＤＴＡおよび１．０ミリモルの２−メルカゾトエタノ
ールを含む緩衝液（ｐＨ７゜０）を菌体の７倍量加えた
。さらに、４℃、２７０００×１で３０分間遠心し、上
清（無細胞抽出液）を得た。この上清１００Ｍに７オス
アラシン１００■を添加し、３７℃で４８時間反応させ
た。この反応液中には、４１．６■のフォスフイノスリ
シンが存在した（変換率８５゜２％）。

実施例１と同様の方法によりフォスフイノスリシンを単
離し、３０ｒｎ９を得た。

参考例１放線菌ＫＡ−３３８株（微工研条寄第３５８号）をグル
コース０．１％、でん粉２．４　％　、ペプトン０．３
％、肉エキス０．３％、酵母エキス０．５％、ＣａＣ０
ａ　０．４　％、ｐＨ７の液体培地１１に接種し、２７
℃、４８時間通気攪拌培養し、これを種母とした。

トマトペースト４．０％、グルコース０．２％、オート
ミール１．５％、ＣｏＧノ２（工水塩）５０μＶ１、　
ｐＨ６，０の液体培地７０１に前記種母を接種し、２７
℃、７２時間通気攪拌培養した。培養液をｐＨ６，０に
調整後、シャープレス型遠心機で遠心分離し、培養上澄
を得た。この上澄液を弱塩基性陰イオン交換樹脂ダイヤ
イオンＷＡ−３０１：ＯＨ−）　（三菱化成工業製）を
充填したカラム（１，４１）に通過させ有効成分を吸着
させた。

引き続き水洗後０．５　Ｎ塩酸で溶出し、各５００１に
分画し、分画Ｎｏ、３〜１０を集めた。ついで活性炭を
充填したカラム（直径５　ｅＸ　３１．５０３　）を通
過させ有効成分を吸着させた。引き続きカラムを水洗後
、３０チアセトン水溶液で溶出させた。各２０１の分画
に分け、フラクションＮｏ、１５〜５５を集め、ついで
強酸性陽イオン交換樹脂アン／々−ライトＩＲ−１２０
Ｂ　（米国、ローム・アンＰ・ハース社製）を充填した
カラム（Ｆ＋ＱＢＸ２７い）に通過させ、有効成分を吸
着させた。引き続きカラムを水洗後、０．５Ｎアンモニ
ア水で溶出させた。・各２０−の分画に分け、７ラクシ
ヨンＮｏ、　９８〜１５２を集め、減圧下濃縮後、エタ
ノール（２００ｍｌ　）を加え沈殿を生じさせた。上澄
を集め、減圧濃縮後、アセトン２０倍量を加え、フォス
アラジン１．４４　ＩＩを得た。

このものを水に溶解させ、Ｉ　Ｎ　ＮａＯＨで中和させ
た。減圧乾固し、フォスアラジン（ナトリウム塩）　、
１．５　ｇを得た。

参考例２フォスアラジン３６５■（１ミリモル）？Ｊ＞Ｉｔの水
に溶解させ、Ｉ　Ｎ　ＮａＯＨ水溶液１　ｉＪ　（１ミ
リモル）を添加した後、減圧乾固し、フォスアラジンナ
トリウム塩３７９　＋１１９を得た。同様にフォスアラ
ジン３６５１ｎ９の水溶液に対し、Ｉ　Ｎ　ＮａＯＨ水
溶液２１１Ｌｌを添加し、減圧乾固し、フォスアラジン
ナトリウム塩４１１■を得た。また同様の方法によｌ）
　Ｉ　Ｎ　ＮａＯＨ水溶液にかえ、Ｉ　Ｎ　ＫＯ）（ハ ■を得た。また同様にＮＪＬＯＨにかえ、インゾロピル
アミン１ミリモル、およびｎ−ブチルアミン１ミリモル
を用いて、それぞれフォスアラジンモノイソゾロピルア
ミン塩および７オスアラシンモノーｎ−ブチルアミン塩
１ミリモルヲ得た。

Claims

【特許請求の範囲】バチルス、ブレビバクテリウム、エシェリヒア、グルコ
ツノセクター、プロテウスまたはエルビニャ属に属し、
フォスアラジンをフォスフイノスリシンに変換する能力
を有する微生物の培萌スアラシンを接触せしめることを特徴とするフォスフイ
ノスリシンの製造方法。