JPH0157959B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、グアノシン二燐酸−フコースの生化
学的製造法に関するもので、その目的とするとこ
ろは、生体の代謝中間体として重要な役割をも
ち、医薬、生化学試薬として重要視されているグ
アノシン二燐酸−フコースを工業的に有利に製造
するにある。

グアノシン二燐酸−フコースは、血液型活性糖
リピドの合成を触媒するフコース転移酵素の基質
として知られ、近年血液型物質の型特異性を決定
する糖転移酵素の研究が行なわれるようになつた
が、従来、グアノシン二燐酸−フコースの調製が
困難であつて容易に入手できないことにより、医
学、生化学の研究の発展を著しく妨げていた。

本発明者らは、上記グアノシン二燐酸−フコー
スの安価かつ大量の製造法について種々研究を行
なつた結果、グアニル酸もしくはグアノシン二燐
酸−マンノースから微生物の酵素により、グアノ
シン二燐酸−フコースを効率よく生成させること
に成功した。

グアノシン二燐酸−マンノースからグアノシン
二燐酸−フコースへ転換する酵素の存在は、ウサ
ギの肺、高等植物に見出され、微生物ではクレブ
シエラ・ニユーモニエ、エシエリチア・コリー、
サルモネラ等に見出されているが、本発明者ら
は、強力な転換酵素活性を有する微生物を広く検
索し、クレブシエラ・ニユーモニエ、エシエリチ
ア・コリーの他に、強い酵素活性を有するアグロ
バクテリウム・ラジオバクター、アグロバクテリ
ウム・リゾゲネス等の微生物を発見した。かかる
微生物を利用し、グアノシン二燐酸−マンノース
からグアノシン二燐酸−フコースを高濃度に、か
つ収率よく生産した例はなく、本発明が最初であ
る。

本発明において、グアノシン二燐酸−マンノー
スからグアノシン二燐酸−フコースの生成に使用
される微生物としては、アグロバクテリウム属、
エシエリチア属に属する菌株およびクレブシエ
ラ・ニユーモニエ（Klebsiella pneumoniae）
IFO3319であり、かかる微生物についてその菌体
内酵素の通常の利用形態がすべて適用できる。例
えば、菌体磨砕物、菌体抽出物、溶媒処理物、界
面活性剤処理物、凍結乾燥処理物等を使用するこ
とができる。

微生物の培養は、通常用いられる培養基、例え
ば、ブドウ糖、シヨ糖、麦芽糖、グリセリン、廃
糖密、澱粉、有機酸などの炭素源、カザミノ酸、
酵母エキス、ペプトン、肉エキス、大豆粉、コー
ン・スチープ・リカー、尿素、アンモニウム塩な
どの窒素源、その他微生物の生育に必要な燐酸カ
リウム、燐酸マグネシウム、微量金属などからな
る培地が使用される。

上記菌体酵素源を接触させるべき反応基質とし
ては、グアノシン二燐酸−マンノースが使用され
る。また、既知の酵母、例えばパン酵母の菌体を
用いて、無機燐酸の存在下にグアニル酸とグルコ
ースとからグアノシン二燐酸−マンノースを生成
せしめて得られる反応液をそのまゝ使用すること
ができる。

グアノシン二燐酸−フコースの生成に際して
は、補酵素としてNADPH（還元型ニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチドフオスフエート）また
はNADPが添加され、さらに必要に応じてグル
コース−６−燐酸が添加される。これらの化合物
の作用は、酵素源に含まれるグルコース−６−燐
酸脱水素酵素により、NADPHが再生されるた
めに転換反応が促進される。

本発明の反応条件は、菌株の種類、酵素活性の
強弱、基質濃度、性状に応じて酵素反応が円滑に
進む範囲で適宜選択されるが、一般にPH4.5〜10、
反応温度20〜40℃が適当である。

反応液中に生成されたグアノシン二燐酸−フコ
ースは、公知のイオン交換樹脂法、活性炭吸着
法、セルロース吸着法、溶剤抽出沈殿法などを併
用して分離することができる。

次に、実施例をもつて本発明をさらに具体的に
説明する。

実施例 １ アグロバクテリウム・ラジオバクター
（Agrobacterium radiobacter）IAM1527をグル
コース0.5％、カザミノ酸1.0％、酵母エキス0.5
％、燐酸第１カリウム0.1％、燐酸第２カリウム
0.3％、PH6.5の培地で28℃にて振盪培養して、得
られた菌体を超音背破砕処理し、抽出液を得た。
この抽出液より、硫安35％〜80％の添加範囲で生
ずる沈殿を酵素源とした。

この酵素源500mg（蛋白質として）を、グアノ
シン二燐酸−マンノース50μモル、NADPH48μ
モル、グルコース−６−燐酸120μモル、トリス
−燐酸緩衝液（PH8.0）1200μモルを含む反応液
100mlに添加して、30℃で５時間反応させた。反
応液中にグアノシン二燐酸−フコースが45.5μモ
ル生成した。

反応液を活性炭に通液し、水洗後アンモニア性
エタノール水溶液にて溶出し、溶出液をほゞ中性
近くまで濃縮した。次に、Cl型に調製したダウエ
ツクス１×２樹脂に上記濃縮液を吸着せしめ、次
いで水洗した後、塩酸−食塩の溶媒系で段階的に
溶出を行なつて、グアノシン二燐酸−フコース画
分を集めた。この画分には未反応基質がまだ含ま
れているため、セルロースカラムクロマトグラフ
を行なつて、グアノシン二燐酸−フコースを精製
し、単離した。収量は反応液100mlから約31μモ
ルであつた。なお、グアノシン二燐酸−フコース
の測定は、公知のペーパークロマトグラフイーな
らびに血液に含まれるグアノシン二燐酸−フコシ
ルトランスフエラーゼを用いて確認した。

実施例 ２ クレブシエラ・ニユーモニエ（Klebsiella
pneumoniae）IFO3319を用い、実施例１と同様
に培養して酵素源を調製した。この酵素源500mg
（蛋白質として）をグアノシン二燐酸−マンノー
ス50μモル、NADPH50μモル、グルコース−６
−燐酸120μモル、トリス−塩酸緩衝液（PH8.0）
1200μモルを含有する100mlの反応液を添加し、
30℃で６時間反応せしめた。反応液中にグアノシ
ン二燐酸−フコースが38.5μモル生成した。

実施例 ３ エシエリチア・コリー（Echerichia coli）
IFO3806を用い、実施例１と同様に培養して得た
生菌体を凍結乾燥処理した。この酵素源2.5ｇを、
グアノシン二燐酸−マンノース20μモル、
NADPH20μモル、グルコース−６−燐酸60μモ
ル、トルエン1.5ml、トリス−塩酸緩衝液（PH
8.0）600μモル含有する50mlの反応液に添加して、
30℃で５時間反応させた。反応液中にグアノシン
二燐酸−フコースが12.5μモル生成した。

実施例 ４ アグロバクテリウム・リゾゲネス
（Agrobacterium rhizogenes）IFO13257を用い、
実施例１と同様に培養して得られた菌体を超音波
処理してを抽出した。得られた酵素液（蛋白質
420mg含む）50mlを、グアノシン二燐酸−マンノ
ース50μモル、NADPH50μモル、グルコース−
６−燐酸120μモル、トリス−塩酸緩衝液（PH8.0）
1200μモル含む50mlに混合し、30℃で８時間反応
させた。反応液中にグアノシン二燐酸−フコース
が32μモル生成した。

実施例 ５ エシエリチア・インターメデイア（Echerichia
intermedia）IFO13544を用い、実施例１と同様
に培養して、得られた菌体の超音波処理を行なつ
て酵素を抽出した。この抽出液に硫安を80％以下
の添加で生ずる沈殿を粗酵素とした。この粗酵素
500mg（蛋白質として）を、グアノシン二燐酸−
マンノース40μモル、NADPH40μモル、グルコ
ース−６−燐酸120μモル、トリス−塩酸緩衝液
（PH8.0）1200μモル含まれる100mlの反応液に添加
し、30℃で８時間反応させた。反応液中にグアノ
シン二燐酸−フコースが28μモル生成した。

実施例 ６ 乾燥パン酵母５ｇをグアニル酸ソーダ１ｍモ
ル、グルコース40ｍモル、硫酸マグネシウム１ｍ
モル、燐酸緩衝液（PH7.0）18ｍモルの組成液に
加え、全容100mlとして28℃にて振盪反応を行な
つたところ、反応９時間でグアノシン二燐酸−マ
ンノースが0.42ｍモル生成した。

この反応液に、実施例１と同様にして調製した
アグロバクテリウム・ラジオバクター
（Agrobacterium radiobacter）IAM1527の酵素
標品２ｇとNADP0.4ｍモル、グルコース−６−
燐酸１ｍモルを各添加して、30℃にて静置反応を
行なつた。その結果、反応７時間でグアノシン二
燐酸−フコースは0.22ｍモル生成した。

実施例 ７ 乾燥パン酵母10ｇをグアニル酸ソーダ２ｍモ
ル、グルコース80ｍモル、硫酸マグネシウム２ｍ
モル、燐酸緩衝液（PH7.0）36ｍモルの組成液に
加え全容200mlとして30℃にて７時間振盪反応を
行なつたところ、グアノシン二燐酸−マンノース
が1.2ｍモル生成していた。

この反応液に、実施例２と同様にして調製した
アエロバクター・アエロゲネス（Aerobacter
aerogenes）IFO3319の酵素標品４ｇとNADP0.6
ｍモル、グルコース−６−燐酸２ｍモルを各添加
して、30℃にて静置反応させた。反応７時間でグ
アノシン二燐酸−フコースは0.46ｍモル生成し
た。

実施例 ８ 乾燥パン酵母５ｇをグアニル酸ソーダ１ｍモ
ル、グルコース40ｍモル、硫酸マグネシウム１ｍ
モル、燐酸緩衝液（PH7.0）18ｍモルの組成液に
加え全容100mlとして、28℃にて振盪反応を行な
つたところ、反応７時間でグアノシン二燐酸−マ
ンノースが0.32ｍモル生成した。

この反応液に、実施例５と同様にして調製した
エシエリチア・インターメデイア（Echerichia
intermedia）IFO13544の酵素標品２ｇと
NADP0.4ｍモル、グルコース−６−燐酸１ｍモ
ルを各添加して、30℃にて静置反応を行なつた。
その結果、反応９時間でグアノシン二燐酸−フコ
ースは0.18ｍモル生成した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ アグロバクテリウム属、エシエリチア属、ク
   レブシエラ・ニユーモニエIFO3319より選ばれる
   微生物の酵素により、グアノシン二燐酸−マンノ
   ースからグアノシン二燐酸−フコースを効率よく
   生成せしめることを特徴とする微生物によるグア
   ノシン二燐酸−フコースの製造法。 ２ 酵素反応液にNADPH（還元型ニコチンアミ
   ドアデニンジヌクレオチドフオスフエート）また
   はNADPと、グルコース−６−燐酸を添加する
   特許請求の範囲第１項記載の微生物によるグアノ
   シン二燐酸−フコースの製造法。 ３ グアノシン二燐酸−マンノースが、酵母によ
   りグルコース、無機燐酸およびグアニル酸とから
   生成せしめたものである特許請求の範囲第１項記
   載のグアノシン二燐酸−フコースの製造法。