JPS60251882A - ペプチド合成用プロテア−ゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、ペプチド合成用プロテアーゼの製造法に関す
る。更に詳しくは、バチルス属菌由来のペプチド合成用
プロテアーゼ構造遺伝子を、宿主菌に導入して形質転換
を行い、得られたペプチド合成用プロテアーゼ高生産性
形質転換株を培養し、培養物中にペプチド合成用プロテ
アーゼを生産蓄積せしめた後、これを採取することを特
徴とするペプチド合成用プロテアーゼの製造法に関する
。

従来の技術 近年、酵素を用いるペプチド合成法は、化学的合成法に
比してラセミ化やその他の望ましくない副反応を避ける
ことができ、操作も簡単で、反応条件も常温、水性媒質
系であることなどの利点を有しているため、さかんに行
われるようになった。

例えば特開昭５１−１１００．９４号、特開昭５２−５
１０９２号、特開昭５２−１２８２９０号、特開昭５２
−！２８２９１号等に記載されている。

しかしながら、ペプチド合成に使用される酵素は、強力
なプロテアーゼ作用を有し、かつペプチド合酸反応を阻
害しないためのエステラーゼ作用及びアミダーゼ作用を
殆ど有しないことが必要である。

本発明者の一人が先に特公昭５’１−５３．０７４号公
報にて明らかにしたように、広く自然界からこの条件に
合うプロテアーゼ生産菌株をスクリーニングした結果、
バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ、　）　Ｎ
ｏ、３６　ＦＥＲＭ−Ｐ　Ｎｏ、４７３６を見い出した
。

発明が解決しようとする問題点 バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、　）　
Ｎ［１３６ＦＥＲＬ−Ｐ　Ｉｌｂ、　４７３６は、優れ
た性質を有し、ペプチド合成用として使用可能であるが
、しかしこのものをより工業的に利用し易くするために
は、更にプロテアーゼ力を高めることが望まれていた。

問題点を解決するための手段 そこで、該菌株を改良するために、従来より微生物によ
る酵素等の生産性増強方法として一般的に用いられてい
る紫外線或いは、ニトロソグアニジン等を用いる変異操
作を試みた。しかし、この試みは、エステラーゼ、アミ
ダーゼのような夾雑酵素の生産を抑制し、プロテアーゼ
力のみを増強させる点において非常に困難であり、かつ
又、これら変異操作により得られた菌株は、復帰変異を
起し易く、不安定であった。そこで本発明者らは、遺伝
子操作技術を用いて菌株を改良することを試みた。遺伝
子操作技術は、目的の酵素の遺伝子を適切なベクターに
連結し、主として異種微生物に導入し、遺伝子増幅効果
により生産性を高める方法である。しかしながら、酵素
がプロテアーゼである場合には、宿主微生物に阻害的な
影響を与える場合があり、これまで効率よく生産された
例は少なく、これを例示すれば、ニュクレイツク・アシ
ド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈ　）第１１巻第７９１１頁（１９８３年）、ジャ
ーナル・オブ・ハクテリオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏ
ｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　）第１５４巻第８３１
頁（１９８３年）及び特開昭５８−１６２２９１号等が
報告されているにすぎない。

本発明者らは、バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｐ、　）　Ｎｏ、３６　ＦＥＲＭ−Ｐ　Ｎ１４７３６
由来のペプチド合成用プロテアーゼ遺伝子を宿主に導入
して形質転換を行い、得られたペプチド合成用プロテア
ーゼ生産性形質転換株の産生ずるプロテアーゼが、宿主
微生物に阻害的影響を与えることなく、かつエステラー
ゼ及びアミダーゼ等をほとんど生産しないことを知り、
真に実用的なペプチド合成用プロテアーゼの製造法を確
立し、本発明を完成せしめたものである。

作用 まず、ペプチド合成用プロ”テアーゼ生産性菌株バチル
ス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、）　Ｎａ３６
　ＦＥＲＭ−ＰＩｔ　４７３６の染色体ＤＮＡを切断し
、得られたＤＮＡ断片をベクターｐＢＲ３２２に結合し
て、大腸菌Ｃ６００株に形質転換し、プロテアーゼ生産
株の選択を行った。次いでプロテアーゼ生産性大腸菌形
質転換株より、プロテアーゼ遺伝子を含むプラスミドを
凋製し、サブクローニングにより低分子化した後、プロ
テアーゼ遺伝子断片を取り出し、ベクターｐＵＢ１１０
に結合して、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
　５ｕｂｔｉｌｉｓ　）　ＲＭ１２５株に形質転換した
。

本形質転換株からカゼイン含有選択培地でプロテアーゼ
生産性菌株を選択した。このプロテアーゼ生産性形質転
換株を培養し、菌体を除去した培養ろ液は、そのもので
もペプチド合成用プロテアーゼとして使用することがで
きるのは勿論であるが、ろ液を加熱処理することによっ
てエステラーゼ、アミダーゼを全く含有しないより優れ
たペプチド合成用プロテアーゼとすることができる。夾
雑酵素であるエステラーゼ及びアミダーゼは、宿主に由
来して産生されるものであり、非耐熱性であるが、一方
、プロテアーゼの方は、耐熱性が大であるので、６５℃
程度の加熱処理によっても簡単に夾雑酵素を失活させる
ことができるからである。次に本発明を実施例にてより
具体的に説明するが、本実施例で用いた各種酵素活性測
定法は次の通りである。

（１）プロテアーゼ活性 １．５％ミルクカゼイン溶液１πｅを試験管にとり、３
７℃、５分間予熱後、希釈酵素液１　ｍｃを加え、６０
分間反応せしめた後、０．４Ｍ　）リフロール酢酸２ｍ
ｅを加え、反応を停止せしめ、次いでろ過して得られる
ろ液１−を別の試験管にとり　０．４Ｍ炭酸すトリウム
塩５　ｍｅ及び５倍希釈のフォリン試液１　ｍＥを加え
、３７℃で２０分間発色する。この液にっき６６０Ｍｍ
の波長における吸光度をめる。酵素液のかわりに水を用
いた場合をブランク値とする。力価は、上記条件下１　
ｍｌ！中に１００γのチロシンに相当するアミノ酸を生
成するときを１単位とする。

（２）エステラーゼ活性 シュウェルトＧ、Ｗ、　（Ｓｃｈｗｅｒｔ　Ｇ、Ｗ、　
ｅｔ　ａｌ）　ら、バイオキミカ・エト・バイオフィジ
カ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈ
ｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ　）第２６巻第５７０頁（１９５
５年）に準じて測定する。即ち、基質としてＮ−ヘンヅ
イルーし一アルギニンエチルエステルを酢酸カルシウム
０．００２Ｍを含む０．１Ｍ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８
，０）に溶解（最終濃度２５０μＭ）したちの３　ｍｆ
！と酵素液０．２ｍＦを混合し、３７℃、６０分間反応
後、００２５３Ｍｍを測定し、反応直後のｏＤ２５３ｎ
ｍとの吸光度差が１．０のときの酵素力価を１単位とす
る。

（３）アミダーゼ活性 （２）のエステラーゼ活性測定法中のＮ−ベンゾイル−
Ｌ−アルギニンエチルエステルにかえてＮ−ベンゾイル
−し−アルギニンアミドを用いる以外はエステラーゼ活
性測定法と同様にして測定する。

３７℃、６０分間反応後、００２５３Ｍｍを測定し、反
応直後のＯＤ　２５３Ｍｍとの吸光度差が１．０のとき
の酵素力価を１単位とする。

実施例１ （１）ペプチド合成用プロテアーゼ遺伝子の大腸菌によ
るクローニング 斉藤らの方法〔ハイオキミカ・エト・ハイオフイジカ・
アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓ
ｉｃａ＾ｃｔａ）第７２巻第６１９頁（１９６３年）〕
に従い鋼製したバチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
　ｓｐ、）　ＮａＮａ３６ＦＥＲＰ　Ｎｏ、　４７３６
株の染色体ＤＮＡ　１．８ｐｇを含む２ｐＥと旧ｎｄｌ
ｆｆ用緩衝液（０，１Ｍ１−リス塩酸緩ｔＦ液（ｐＨ７
，５＞　２容、７０ｍＭ塩化マグネシウム水溶液２容、
０．６Ｍ食塩水２容及び蒸留水１ｏ容からなる混液）４
Ｍと制限酵素旧ｎｄｌｌ［、（宝酒造社製品）０．１扉
を混合し、３７℃、５分間反応後６５℃、１ｏ分間の加
熱により反応を停止させた。次に旧ｎｄＩＩＩで消化後
、アルカリホスファターゼ処理したｐＢＲ３２２約１０
Ｊ’ｇを含む４　ｐＥ　、　Ｔ　４　Ｄ　Ｎ　Ａリガー
上１　ｐｉ’、７５ｍＭ塩化マグネシウム水溶液８ｇ、
５００ＭＭＡＴＰ水溶液６　ｐＥ、０．１Ｍジチオスレ
イトール５　ｐＥを混合し、１０℃、２０時間反応させ
る。この反応液のｌｋｌ’を用いて斉藤の方法〔ジャー
ナル・オブ・ハクテリオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ
　Ｂａｃｔ、ｅｒｉｏｌｏｇｙ　）第１２１巻第３５４
　頁（１９７５年）〕により、ニジエリシア・コリ（Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　Ｃ６００ｒＨ−ｍ
Ｒ−ｔｈｉ　ｔｈｒ−１ｅｕ−を受容株として形質転換
した。３７℃で約２時間Ｌ−ブロス（Ｌ−ｂｒｏｔｈ　
）　５　ｒｔｄ！に培養した菌株を集菌し、０．１Ｍ食
塩５　ｍＭ、塩化マグネシウムを含む５ｍＭ）リス塩酸
緩衝液（ｐＨ７，６）　３　ｍｌ！で洗浄し、次に　１
００ｍＭ塩化カルシウム、　２５０ｍＭ塩化カリウムを
含む同緩（ｈ液３祿にて懸濁した。懸濁液を０℃、２５
分間インキュヘート後、遠心分離し、菌体を再ひ１１０
０ＩＴＩ塩化カルシウム、２５０ｍＭ塩化カリウムを含
む同緩衝１０．５ｍＣ’に懸濁したのち、ＤＮＡ反応液
１０ｐ！！を混合し、０℃、３０分間インキュヘート後
、３７℃、２０分間保温し、遠心分離により菌体を集め
て洗浄後、５　ｍｌ！のＬ−ブロスに懸濁し、３７℃で
２時間培養した。アンピシリン（＾ｍｐｉｃｉｌｌｉｎ
、ベーリンガー社製品）　１．０　ｋｇ　／　ｍＥとス
キムミルク１％を含むＭ−３寒天培地（ディフコ社製品
〉に上記培養液０．２ｍＥをまき、生育するアンピシリ
ン耐性株のうち、プロテアーゼ生産性を持つ形質転換株
３株を得た。このうちの１株を選び、常法に従ってプラ
スミドを調製し、制限酵素ＥｃｏＲＩ　（宝酒造社製品
）、ＣＬａＩ　（ベーリンガー社製品）等を用いて、サ
ブクローニング、挿入遺伝子断片の低分子化を行い、プ
ラスミドｐＲＴ１１５を調製した。このプラスミド制限
酵素地図を第１図ａに示す。又、プラスミドｐＲＴ１１
５を制限酵素ＥｃｏＲＶ　（宝酒造社製品）で切断し、
ＥｃｏＲｌ　’Ｊンカーを接続後、制限酵素ＥｃｏＲＩ
で切断して、ＥｃｏＲｌで消化後、アルカリホスファタ
ーゼ処理したｐＢＲ３２２と結合し、上記と同様に大腸
菌０６００株に形質転換し、次いでプロテアーゼ生産性
形質転換株よりプラスミドｐＲＴ２０３を鋼製した。

（以下余白） （２）ペプチド合成用プロテアーゼ遺伝子のバチルス属
細菌への形質転換 プラスミドｐＲＴ１１５約１０７５ｇを含む溶液１０ｐ
１と制限酵素ＥｃｏＲＩ用緩衝液〔組成：ＩＭＦリス塩
酸緩衝液（ｐＨ７，５）　５ｍｅ、１Ｍ塩化マグネシウ
ム水溶液０．３５ｍ、５Ｍ塩化ナトリウム０．５−１２
Ｍ２−メルカプトエタノール０．１７５ｍ、１％ウシ血
清アルブミン１−１滅菌水２９．７５ｍ）　１０ｐ１、
蒸留水２８ｍと制限酵素ＥｃｏＲＩ２４を混合し、３７
℃、３時間反応後、６５℃、１０分間の加熱により反応
を停止させた。次にあらかじめ、ＥｃｏＲＩで消化後、
アルカリホスファターゼ処理したプラスミドｐＵＢ１１
０の約３ｐｇを含む１０ｐＲ，Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ１
ｍ、７５ＩＩＩＭ塩化マグネシウム水溶液８ｐ１．５０
０μＭ　ＡＴＰ水溶液６ｐ１、Ｏ，１Ｍジチオスレイト
ール６ｐＩ！を混合し、１０℃、２０時間反応させた後
、反応液の５０ｐ１を用いてチャック（Ｃｈａｎｇ　）
の方法〔モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジエネテ
イクス（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒａｎｄ　Ｇｅｎｅｒａｌ　
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）第１６８＠第１１１〜１１５頁（１
９７９年）〕によりバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ　ＲＭ１２５株（ｒＭ−ｏ＋
Ｍ−＾ｒｇ−Ｌｅｕ−）を受容株として形質転換した。

即ち、３０℃、約４時間Ｍ−３培地５ｒＩｅにて培養し
た菌体を集菌し、ＳＭＶＰ　Ｏ，４〆に懸濁し、リゾチ
ーム１■を含むＳＭＭＰ　０．１ｍを加えて３７℃、２
時間反応後、遠心分離により集菌し、ＳＭＭＰＩ−を加
えて洗浄後、ＳＭＭＰ　０．５ｍ！に懸濁させてプロト
プラストサスペンションとした。次にこのサスペンショ
ンに上記プラスミド反応液５０ｐ１を加え、更に１．５
ｄの４０％ポリエチレングリコールを加えて、直ちに２
分間軽く振盪後、ＳＭＭＰ５−を加えて遠心分離した。

生じた沈澱にＳＭＭＰｌｌＲｌを加えて懸濁後、３０℃
、９０分間インキュベートし、次いでカナマイシンを３
００ｐｇ　／　ｄ！含むＤＭ３培地にプレートし、３０
℃、２日間培養した。こうしてプレート上に生育したカ
ナマイシン耐性株をプロテアーゼ試験用寒天培地〔組成
：培地１０〇−当りリン酸２カリウム１．４ｇ、リン酸
１カリウム０．６ｇ　。

硫酸アンモニウム０．２ｇ、クエン酸ナトリウム０．１
ｇ、カザミノ酸０．２ｇ、グルコース０．３ｇ　、カゼ
イン１ｇ及びカナマイシン１■をそれぞれ含む。〕に移
し、３０℃、２４時間後、大型ハローを形成するコロニ
ーを取得し、プラスミドを調べた結果、プラスミドｐＲ
Ｔ１１５とｐＵＢｌｌｏＡ＜　ＥｃｏＲＩ切断位置で結
合したシャトルベクターであることが確認され、プラス
ミド９０１１Ｂ１１５と命名した。

なお、プラスミドｐＲＴ２０３についても全く同様に行
い、プロテアーゼ生産性形質転換株から調製されたプラ
スミドの解析を行ったところ、プロテアーゼ遺伝子断片
がＥｃｏＲＩ切断位置でｐＵ８１１０に組み込まれたも
のであることが確認され、そのプラスミドの１つをｐＵ
Ｔｌと命名した。

（３）各種プロテアーゼ生産株によるプロテアーゼ及び
夾雑酵素の生産性 親株であるバチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓ
ｐ、）Ｎｏ　３６　Ｆｌｌ！ＲＭ−Ｐ隘４７３６、形質
転換株バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕ
ｂｔｉｌｉｓ　）　９Ｍ１２５　（ｐｏｌＩＢ１１５　
）ＦＥＲＭ−Ｐ　Ｎｏ、　７６３１、形質転換株バチル
ス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ
　）　９Ｍ１２５　（ｐＵＴｌ）　ＦＥＲＭ−ＰＩｎｌ
ｌｌｔ　７６３０、及び対照菌株としてのバチルス・ズ
ブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ　）　
９Ｍ１２５　（ｐＵ８１１０）のそれぞれを、可溶性澱
粉５％、大豆粉２％、リン酸１カリウム０．２％、硫酸
マグネシウム０．２％、炭酸カルシウム０．１％の組成
を有する培地１０〇−を含む５００ｄ容坂ロフラスコで
振盪培養した。培養条件は、親株は、４５℃で３５時間
、形質転換株は、３７℃で４８時間それぞれ行った。培
養終了後、除菌して得られたそれぞれの培養上清中のプ
ロテアーゼ、及び夾雑酵素であるエステラーゼ及びアミ
ダーゼ活性を測定した。その結果は表−１に示したよう
に、親株に比して形質転換株のプロテアーゼ活性が１．
７〜１．８倍に上昇しており、エステラーゼ活性は両者
においてほとんど変わらないことがわかった。なおアミ
ダーゼ活性に関しては、親株にはなく形質転換株におい
て若干みられるが、この程度ではペプチド合成に支障は
ない。

（以下余白） 表−１ 実施例２ 加熱によるエステラーゼ及びアミダーゼの除去実施例１
（３）において得られた親株バチルス・エスピー（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、）　Ｎａ３６　ＦＥＲＭ−Ｐ　１
ｌｋＬ４７３６、形質転換株バチルス・ズブチリス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）　ＲＭ１２５　（ｐ
ＯＵＢ１１５　）　ＦＥＲＭ−Ｐ　Ｎａ７６３１、形質
転換株バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂ
ｔｉｌｉｓ）　ＲＭ１２５　（ｐｔ！Ｔｌ）　Ｆｔ！Ｒ
Ｍ−Ｐ　Ｎ１７６３０のそれぞれの培養上清を６５℃、
１時間加熱処理した後、プロテアーゼ、エステラーゼ及
びアミダーゼ活性を測定した。その結果は表−２に示す
ように、いずれの形質転換株もプロテアーゼ活性の減少
はほとんどみられず、かつエステラーゼ及びアミダーゼ
活性は完全に消失した。一方親株の方は、エステラーゼ
活性が残存していた。

表−２ （発明の効果） 本発明は、ペプチド合成用プロテアーゼ生産菌を遺伝子
組換え技術を応用し、改良することによって、より優れ
たペプチド合成用プロテアーゼを安価に製造することを
可能にならしめたものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明のプラスミドｐＲＴ１１５の制限酵素
地図を示すものである。 特許出願人　天野製薬株式会社 Ｎ１図 ５ａｌｔ　ＢａｍＨＩ　”　ｎ′：ｌｌｉ’手続補正書
く自発） 昭和５９年８月に日 １、事件の表示 昭和５９年特許願第１０７１４５号 ２、発明の名称 ペプチド合成用プロテアーゼの製造法 ３、補正をする考 事件との関係　特許出願人 住所　愛知県名古屋市中区錦−下目２番７号５、補正の
対象 図面 ６、補正の内容 図面を別紙の通り訂正します。 第１図 ５ａＴＩ　ＢａｍＨＩ 手続補正書（自発） 昭和６０年１月３１日 特許庁長官　志　賀　学　殿 ■、事件の表示 昭和５９年特許願第１０７１４５号 ２、発明の名称 ペプチド′合成用プロテアーゼの製造法３、補正をする
者 事件との関係　特許出願人 住所　愛知県名古屋市中区錦−下目２番７号５、補正の
対象 明細書の１発明の詳細な説明」の欄及び「図面」 ６、？ｉＭ正の内容 （１〉明細書第４頁第１２行の’　Ａｃ１ｄ」とあるを
「＾ｃｉｄｓ　Ｊと訂正する。 （２）明細書第９頁第１０行の’　Ｌｅｕ−Ｊとあるを
’　１ｅｕ−Ｊと訂正する。 （３）明細書第１０頁第９行のｒＣＬａＩ」とあるを’
Ｃ１ａＩ」と訂正する。 （４）明細書第１１頁第１７行の「チヤツプ」とあるを
「チャン」と訂正する。 （５）明細書第１２頁第１行の「（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　
５ｕｂ−ｔｉｌｉｓ　ＲＭ　１２５株Ｊとあるを’　（
Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂ−ｔｉｌｉｓ　）　ＲＭ　１
２５株」と訂正する。 （６）明細書第１２頁第１行の’　Ａｒｇ’−Ｊとある
を’　ａｒｇ−Ｊと訂正する。 （７）明細書第１２頁第２行の’　Ｌｅｕ−Ｊとあるを
ｒ　Ｉｅｕ　Ｊと訂正する。 （８）図面を別紙の通り訂正する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　バチルス属菌由来のペプチド合成用プロテアーゼ構
   造遺伝子を宿主菌へ導入して形質転換を行い、得られた
   ペプチド合成用プロテアーゼ生産性形質転換菌株を培養
   し、培養物中にペプチド合成用プロテアーゼを生産蓄積
   せしめた後、これを採取することを特徴とするペプチド
   合成用プロテアーゼの製造法。 ２　バチルス属菌由来のペプチド合成用プロテアーゼ構
   造遺伝子が、バチルス・エスピー陽３６ＦＥＲＭ−Ｐ　
   Ｎａ　４７３６菌由来のものである特許請求の範囲第１
   項記載のペプチド合成用プロテアーゼの製造法。 ３　宿主菌がバチルス属菌である特許請求の範囲第１項
   記載のペプチド合成用プロテアーゼの製造法。