JPS60259190A - 新抗生物質カプラマイシン及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新抗生物質４４６−３３−１およびその製造法
に関するものである。

本発明者らは、自然界微生物の生産する抗生物質探索の
過程で、土壌より分離した一放線菌４４６−３３株が新
抗生物質を生産することを見いだし、本菌株の菌学的性
質を調べ、又その抗生物質を単離して、その理化学的性
質および生物学的性質を調べることによって、本発明を
完成した。

本発明によって得られる抗生物質４４６−３３−１は次
に示すような理化学的性質を有する。

（１）元素分析値： Ｃ，４８，５０％、Ｈ５，４９％、 ０３３．７１％、Ｎ１２．３０％ （２）分子量： 二次イオンマススペクトル（Ｓ　Ｉ　−ＭＳ）　分析に
おいて、質量数５７０に（Ｍ＋Ｈ）“、５９２に（Ｍ＋
Ｎａ）　”　、６０８に（Ｍ十Ｋ）’が観測されること
−より、分子量は５６９と結論される。

（３）融点： １７：１１７６℃ （４）紫外線吸収スペクトル： メタノール中での吸収極大（λＭ＠ＯＨｎｍ（、、）ａ
ｘ は２１４　（１６２００）　、２５７　（肩９８００）
を示す。第１図のとおりである。また、水溶液、０．１
規定塩酸、および０．１規定水酸化ナトリウム水溶液中
での紫外部吸収スペクトルは、特徴的な吸収極大を示さ
ず、末端吸収を示すのみである。

（５）　赤外部吸収スペクトル： ＫＢｒで測定した赤外部吸収スペクトルは第２図に示す
通りである。吸収極大を示す波長はつぎの通りである。

単位はｃ「’。３４００．２９３０．１６８０．１５１
５．１２７０．１１００゜ （６）溶剤に対する溶解性： 水およびメタノールにきわめてよく溶け、エタノール、
アセトンに溶け、クロロホルムにやや溶け、酢酸エチル
、ベンゼン、ｎ−ヘキサンに不溶である。

（７）呈色反応： （陽性）過マンガン酸カリウム反応、モーリッシュ反応 （陰性）アンスロン反応、アニリン水素フタル酸塩反応
、塩化第二鉄反応、ニンヒド リン反応 （８）塩基性、中性、酸性の区分： 塩基性 （９）物質の色： 白　色 ＱＯｌ　Ｒｆ　値ニ ジリカゲル薄層クロマトグラフィー（メルク社製ＴＬＣ
プレート、シリカゲル６０ｈｓい厚さ０．２５■■）を
通常の方法で行った時のＲｆ値は、次のとおりである。

（イ）　クロロホルム：メタノール（２：　１）Ｒｆ値
　０．４３ （θ　ベンゼン：メタノール（２：　１）Ｒｆ値　０．
．２１ （→　ｎ−ブタノール：酢酸：水（３：　１　：　１）
Ｒｆｌｉ　０．　４３ １１）酸加水分解物−中にウラシルおよびリジンが存在
する。

１２）　’ＨＮＭＲ（４００ＭＩ（ｚ　、ｎ、ｏ　）δ
（ｐｐｍ）　：１．３７　（ＩＨ）　、１．６４　（Ｉ
Ｈ）、１．７８　（ＩＨ）　、１．８４　（ＬＨ）、１
．９３　（ＩＨ）　、２．００　（ＩＨ）、３．３　（
ＩＨ）　、３．３２　（３Ｈ，ｓ）、３．７７　（ＩＨ
，ｔ）　、４．２３　（ＩＨ）、４．４　（ＩＨ，ｔ）
　、４．５０　（ＩＨＸ　ｔ）、４．５３　（ＬＨ）　
、４．６５　（ＩＨ）、４．８０　（ＩＨ）　、５．４
　（ＩＨ，ｄ）、５．７８（ＩＨｌｄ）　、５．８８　
（ＩＨ，ｄ）、６．０４　（ＩＨ）　、７．７８　（Ｉ
Ｉ−１、ｄ）１３）　１３ＣＮＭＲ（１００ＭＨｚ　、
口２０　）　δ（ｐｐｍ）：２８．３８　（ｔ）　、２
８．６１　（ｔ）、３１．３３　（ｔ）　、４２．３３
　（ｔ）、５３．１０　（ｄ）　、５８．７０　（ｑ）
、６２．７２　（ｄ）　、６５．７２　（ｄ）、７２．
８０　（ｄ）　、７６．４２　（ｄ）、７８．９７　（
ｄ）　、８２．３９　（ｄ）、９０．７１　（ｄ）　、
１００．００　（ｄ）、１０２．４８　（ｄ）、１０９
．９２　（ｄ）、１４１．４５　（ｄ）　、１４２．０
６　（ｓ）、ｌｊｌ、６２　（ｓ）　、１６１．７４　
（ｓ）、１６６．３０　（ｓ）　、１７３．２０　（ｓ
）、１７６．４７　（ｓ） １４）以上の理化学的性質から、抗生物質４４６−３３
−１の構造式は次の如く推定される。

抗生物質４４６−８３−１の生物学的性質は次の如くで
ある。

（１）　抗菌性 日本化学療法学会制定の方法〔最小発育阻止濃度（ＭＩ
Ｃ，）測定法典改訂について（ケモセラピー、２９．７
６−７９．１９８１））に準じて、寒天希釈法によって
測定したバクテリアに対する最小発育阻止濃度（Ｍ　Ｉ
　Ｃ）は第１表のとおりである。

第１表 バチルス・ズブチリス　〉１００ （Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ　）ＡＴＣＣ６
６３３ ミクロコツカス・ルテウス　〉■００ （Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ　Ｉｕｔｅｕｓ　）ＡＴＣＣ
９３４１ スタフィロコッカス・アラ　〉１００ レウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）
ＦＤＡ２０９ Ｐ、ＪＣ−１ ストレプトコッカス・フエ　＞ｔｏ。

カリス（５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａ＠ｃａｌｉｓ　） ストレプトコッカス・ニュー　１２．５モニアエ（Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ　）　Ｉ
　Ｉ　Ｄ　５５３　”ストレプトコッカス・ニュー　１
２．５モニアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕ
ｍｏｎｉａｅ　）　１１　Ｄ　５５４”ストレプトコッ
カス・ピオゲ　１００ ネス・クック“ （５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓＣｏ
ｏｋ　） ストレプトコッカス・ピオゲ　１００ ネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）　Ｉ　Ｉ　Ｄ　７１５申ナイセリヤ
・ゴノルヘア　〉１００ （Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）１１
Ｄ８４４” ナイセリャ・メニンギティデ　＞１００イス　（Ｎｅ１
ｓｓｅｒｉａ、 ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ　） ＩＩＤ８５４” ヘモフィルス・インフルエン　〉１００ザ（）ｌａｅｍ
ｏｐ旧１ｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）　Ｉ　Ｉ　Ｄ　９８５　”シュ
ウトモナス・エルギノ−１００ ザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　）　Ｎ　ＣＴ　Ｃ０４９０ シトロバクタ−・フロインデ　＞１００イ　（Ｃ４ｔｒ
ｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉＩ　）　Ｉ　Ｉ　Ｄ　９７６エンテロバ
クター・エロゲネ　〉１００ス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔ
ｅｒ ａ（３ｒｏｇｅｎｅｓ　） ＡＴＣＣ１３０４８ エンテロバクタ−・クロアカ　〉１００工（Ｅｎｔｅｒ
ｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ　）　９６３ ニジエリシア・コリ　〉１００ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔ　）ＮＩＨＪ　Ｊ
Ｃ−２ クレブシェラ・ニューモニア　〉１００工（Ｋｌｅｂｓ
ｉｅｌｌａ ｐｎｅｕ＋ａｏｎｉａｅ　） ＰＣＩ−６０２ プロテウス・ブルガリス　〉１００ （Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ　）Ｘ−１９ サルモネラ・エンテリティデ　〉１００イス（Ｓａｌｍ
ｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ　）　Ｇ　１４セラチア・マル
セセンス　〉１００ （５ｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ　）ＩＡＭ
１１８４ ミコバクテリウム・スメグマ　３．１３テイス（Ｍｙｃ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｎ＋ｅｇｍａｔｉｓ　） ＡＴＣＣ６０７゜ （注）＊印を付した試験菌にはチョコレート寒天培地を
使用し、＊＊印を付した試験菌には１％グルコース加普
通寒天培地を使用した。

なお、アスペルジラス・オリゼ（八ｓｐｅｒｇｉｌｌｕ
ｓｏｒｙｚａｅ　）　Ｉ　Ｆ　Ｏ５２３９、ペニシリウ
ム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｃｈｒｙ
ｓｏｇｅｎｕｍ）　Ａ　’ｌ’　ＣＣ１０００２、カン
ジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ
　）３１４７及びサツカロミセス・セレビシェ　（Ｓａ
ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　）　
Ｉ　Ｆ　００２０５などの真菌に対する最小発育阻止濃
度はいずれも１００ｍｃｇ／ｍ６以上である。

（２）毒性 マウスの静脈内に生理食塩水溶液を投与した場合、１，
０００■／ｋｇで全く毒性を示さなかった。

以上の如く抗生物質４４６−３３−１は主として連鎖状
球菌および抗酸性菌に有効であり、毒性は極めて少ない
ので、ヒト、動物などの感染症の治療薬その他の用途が
期待される。

上記の理化学的性質および生物学的性質を既知抗生物質
のそれらと比較した結果、該当する物質が見当たらない
ので、抗生物質４４６−８３−１を新抗生物質と判定し
た。

更に、’Ｈ−ＮＭＲＳ′３Ｃ−ＮＭＲおよび酸加水分解
物のアミノ酸分析により、抗生物質４４６−３３−１は
ウラシル基を含み、又リジン単位の残基を含有する、い
わゆるヌクレオシド抗生物質であることが確認された。

一方、既知のヌクレオシド抗生物質の中には、リジンを
含む物質は存在しないことから４４６−３３−１は新規
な抗生物質と判定し得る。

本発明の抗生物質４４６−３３−１の生産菌の一例とし
ては、昭和５７年８月、山形県山形市大字山寺の土壌か
ら、通常の方法で、新たに分離された放線菌で、ストレ
プトミセス・グリセウス・４４６−３３　（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ　４４６−３３）と同
定された菌株が上げられる。この４４６−３３株の菌学
的性質は次の如くである。

尚、以下の実験に用いた培地の組成は、特記しない限り
、特許庁編産業別審査基準の応用微生物工業（改訂２版
、昭和５７年８月）、第２８〜３３頁に放線菌の同定に
使用する培地として例示されている組成に従った。

４４６−３３株の菌学的性状 １）形態 ４４６−３３株のスターチ・無機塩寒天培地およびイー
スト・麦芽寒天培地を用いて２７℃で２週間培養したも
のは、淡い緑黄色の気菌糸を豊富に着生し、顕微鏡下で
観察すると気菌糸は単純分枝をなし、ゆるく屈曲し、又
部分的には直線状であり、又房状分枝を示す。車軸状分
枝や、らせん状の胞子着生菌糸は認められない。

電子顕微鏡そ観察すると、気菌糸の先端は１０個以上の
円筒状の胞子の連鎖をなし、胞子の大きさは直径０．５
〜１．０ｐｍ、長さ０．９〜１．８μｍ位で、胞子の表
面は平滑である。鞭毛や胞子嚢および菌核は認められな
い。

２）各種培地における生育状態 実験および観察は、イー・ビー・シャーリング及びディ
ー・ゴツトリーブ（Ｉｎｔ、　Ｊ、　５ｙｓｔ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、第１６巻、３１３頁、１９６６年
）の方法に準じて行った。色の記載に当っては、日本色
研事業株式会社発行の日本色研色名帖第３版（１９７４
年）に準拠し、（）内にＪＩＳ記号を示した。尚、以下
は特記しない限り、２７℃培養、２週間口の観察結果で
ある。

（１１シュークロース・硝酸塩寒天培地生育は良好で、
拡散して発育する。気菌糸の着生は不良で粉状を呈し、
白色（Ｎ９．０）ないし、ごくうすい緑黄色（１０Ｙ　
９／１．５）を呈する。基生菌糸裏面の色はうすい黄色
（５，５Ｙ　９／６）で、あかるい緑黄色（ＩＯＹ　８
．５／９）の溶解性色素を生成する。

（２）グルコース・アスパラギン寒天培地生育はやや不
良で平坦である。気菌糸の着生も貧弱で、ごくうすい緑
黄色（１０Ｙ９／１．５）の粉状を呈し、気菌糸上には
小水滴が観察されることもある。基体菌糸裏面の色はご
くうずい緑黄色（ＩＯＹ　９／１．５）であり、ごくう
すい緑黄色（１０Ｙ　９／１．５）の溶解性色素を生成
する。

（３）グリセリン・アスパラギン寒天培地（ＩＳＰ−５
培地） 盛り上がって良好な発育をする。気菌糸の着生は中程度
で、ごくうすい赤味がかった黄色（２，５Ｙ　９／２）
のベルヘット状の中に、ごくうすい黄色（５，５Ｙ　９
／１．５）の粉状の部分が点在する。基体菌糸裏面の色
は灰黄色（５，５Ｙ　８／３）で、うすい緑黄色（ＩＯ
Ｙ　９１５）の溶解性色素を生成する。

（４）スターチ・無機塩寒天培地（ＩＳＰ−４培地） 生育は良好で、拡散して発育する。気菌糸の着生はきわ
めて良好で、集落中央部は粉状、周縁部は凹凸のある粉
状で、ごくうすい黄緑色（、ＳＧＹ　８．５／１．５）
を呈する。基体菌糸裏面はにぷい黄“色（５，５Ｙ　１
１５）で、うすい緑黄色（１０Ｙ　９１５）の溶解性色
素を生成する。

（５）チロシン寒天培地 きわめて良好な生育を示し、盛り上がる。

気菌糸もよく着生し、灰白色（５Ｇ　９１０．５）のベ
ルベット状の部分と、ごくうすい黄緑色（５ＧＹ　８．
５／１．５＞の、凹凸のある粉状の部分とが混在する。

基体菌糸裏面の色は黄褐色（９ＹＲ４／４）で、ところ
どころ暗い黄褐色（９ＹＲ３／３）を呈し、ごくうすい
黄色（５゜５Ｙ　９／３）の溶解性色素を生成する。

（６）　栄養寒天培地 生育は不良で、白色（Ｎ９．０）の気菌糸を僅かに着生
する。基体菌糸裏面の色はごくうずい黄色（５，５Ｙ　
９／３）で、溶解性色素の生成はみられない。

（７）イースト・麦芽寒天培地（ＩＳＰ−２培地）きわ
めて良好な生育を示し、少し盛り上がり凹凸がある。気
菌糸は粉状にきわめて良く着生し、その色はごくうすい
緑黄色（ＩＯＹ９／１．５＞である。基体菌糸裏面の色
はにぶい黄色（５，，５Ｙ　７１５）で、あざやかな黄
色（５，５Ｙ　８．５／９）の溶解性色素を生成する。

（８）オートミール寒天培地（ＩＳＰ−３培地）生育は
やや不良で平坦である。気菌糸の着生も不良で、ごくう
すい緑黄色（ＩＯＹ９／１．５）の粉状に点在する。基
体菌糸裏面の色はごくうすい黄色（５，５Ｙ　９／３）
から灰黄色（５，５Ｙ　８／３）、さらに集落周縁部の
裏面はふかい黄色（２，５Ｙ７／１０）を呈する。ごく
うすい黄色 （５，５Ｙ　９／３）の溶解性色素を生成する。

３）生理的性質 （１）生育温度範囲 スターチ・無機塩寒天培地及びイースト・麦芽寒天培地
を用い、１５℃、２０℃、２７験した結果、１５℃〜３
７℃の各温度では生育するが、４０℃及び４５℃では生
育しない。

生育の最適温度は２７℃付近である。

（２）ゼラチンの液化（グルコース・ペプトン・ゼラチ
ン培地を用い、２０℃で穿刺培養した。）陽性である。

即ち培養７日目では液化はみられず、１４日目頃から液
化が始まり、ごく徐々に進行する。

（３）スターチの加水分解（スターチ・無機塩寒天培地
上で、２７℃で培養し、常法に従って判定した。） スターチの加水分解力は比較的強い。

（４）脱脂牛乳の凝固、ペプトン化（脱脂牛乳培地で２
７℃、及び３７℃で培養した。）脱脂牛乳の凝固は２７
℃、３７℃のいずれでも認められない。ペプトン化は、
２７℃では４日目から、３７℃では１０日目頃から始ま
り、徐々に進んで約３週間口にはいずれの温度において
もほぼ完了する。

（５）メラニン様色素の生成（チロシン寒天培地、ペプ
トン・イースト鉄寒天培地及びトリプトン・イースト・
ブロス：いずれも２７℃で培養した。） 上記いずれの培地においてもメラニン様色素の生成は認
められない。

４）炭素源の利用性 ブリドハム・ゴツトリーブ寒天培地（１’　Ｓ　Ｐ−９
培地）を使用して、２７℃で培養して試験した結果、Ｄ
−キシロース、Ｄ−グルコース、Ｄ−フラクトース、Ｄ
−マンニット、Ｄ−ガラクトースおよびチロシンを利用
し、シュークロースおよびイノシトールの利用性は疑わ
しく、Ｌ−−アラビノース、Ｌ−ラムノース、ラフィノ
ース及びセルロースは利用しない。

５）　細胞壁のジアミノピメリン酸の分析細胞壁の構成
アミノ酸の一つであるジアミノピメリン酸をティ・ハセ
ガワら：ジャーナル・オブ・ザ・ジェネラル・エンド・
アプライド・マイクロバイオロジー（Ｔ、　Ｈａｓｅｇ
ａｗａ、　ｅｔ　ａｌ、＊Ｊ、Ｇｅｎ、＾ｐｐ１．　Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌ、）　２９　、　３１９−３２２　（
１９８３）の方法に準じて分析した結果は、ＬＬ−型で
あった。

以上の結果を要約すると、４４６−３３の気菌糸は単純
分枝をなし、大部分がゆるく屈曲し、分生胞子の着生部
分は房状分枝を示し、輪生技及びラセン形成は認められ
ず、胞子の表面は平滑である。鞭毛や胞子量および菌核
は認められない。種々の培地上で、ごくうすい黄色ない
し、ごくうすい緑黄色から黄褐色、暗い黄褐色ないし灰
黄色の基体菌糸を形成し、気菌糸はごくうすい緑黄色、
ごくうすい黄緑色、ごくうすい黄色ないし、ごくうすい
赤味がかった黄色を呈する。なお、ごくうすい緑黄色、
ごくうすい黄色、うすい緑黄色ないし、にぶい黄色の溶
解性色素を生ずる。１５℃から４５℃で試験した結果、
１５℃から３７℃の間において生育し、４０℃以上では
生育しない。ゼラチンを液化し、スキムミルクを凝固せ
ず、ペプトン化する。スターチをよく氷解し、メラニン
様色素を生成しない。、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルコー
ス、Ｄ−フラクトース、Ｄ−マンニット、Ｄ−ガラクト
ース及びチロシンを利用し、シュークロース及びイノシ
トールの利用は疑わしく、Ｌ−アラビノース、Ｌ−ラム
ノース、ラフィノース及びセルロースは利用しない。細
胞壁のジアミノピメし、プリドハムとトレスナーの分類
におけるイエローシリーズに属することは明らかである
。そこでバーシーズ・マニュアル・オブ・デターミネイ
ティブ・バクテリオロジー第８版及びインターナショナ
ル・ジャーナル・オブ・システマテインク・バクテリオ
ロジー、１８巻３３２頁によって比較した所、第２表に
示した如く、ストレプトミセス・グリセウスの記載とよ
く一致する。しかしながら、新抗生物質４４６−３３−
１を生産する点において、明らかな相違が認められるの
で、４４６−８３株はストレプトミセス・グリセウスに
属する新菌株とすることが妥当と結論し、ストレプトミ
セス・グリセウス（ＳＬｒｅｐｔｏｍｙｅ−・Ｉ　ｇｒ
ｉｓｅｕｓ）４４６−３３と命名した。

なお、本菌株はストレプトミセス・エスピー・４４６−
３３　（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ、　４４６−
３３）として工業技術院微生物工業技術研究所に寄託さ
れ、受託番号は微工研菌寄第７４１６号（ＦＥＲＭＰ−
７４１６）である。

本発明の抗生物質４４６−３３−１の製造法の実施に当
っては、ストレプトミセス属に属し、抗生物質４４６−
３３−１を生産する能力を有する菌株、例えばストレプ
トミセス・エスピー・４４６−８３（徽工研菌寄第７４
１６号）を栄養源含有培地に接種して好気的に発育させ
ることによって、抗生物質４４６−３３−１を含有する
培養物が得られる。栄養物としては放線菌の栄養源とし
て公知のものを使用できる。例えは市販されている澱粉
、デキストリン、マルトース、蔗糖、グルコース、グリ
セリン、糖蜜などの炭水化物、あるいは有機酸、油脂な
どの炭素源および脱脂大豆粉、大豆粉、綿実粉、ＮＺ−
アミン、コーンスチープリカー、カゼイン氷解物、ディ
スティソーダ・ソリュブル、魚粉、ペプトン、肉エキス
、酵母エキス、硫酸アンモニヤ、硝酸ソーダ、硝酸アン
モニヤ、アンモニヤなどの窒素源と、燐酸塩、マグネシ
ウム塩、亜鉛塩、カリウム塩、ナトリウム塩、カルシウ
ム塩などの無機塩その他必要に応じて微量の金属塩を加
えることもできる。これらの物は生産菌が利用し、抗生
物質４４６−３３−１の生産に役立つ物であればよく、
放線菌の公知の培養材料はすべて用いることができる。

抗生物質４４６−３３−１の能率的な生産には液体培養
が好ましく、培養温度は生産菌が発育し抗生物質４４６
−３３−１を生産する範囲内であればよい。培養は普通
の場合、抗生物質４４６−３３−１が充分蓄積するまで
続けられる。例えはグリセリン１．８％、ポリペプトン
０．６％、肉エキス０８５％、食塩０．３％からなる液
体培地（ｐＨ７，０）に寒天斜面培地で培養した４４６
−３３株を接種し、２８±１℃で好気的に回転振盪培養
を行うと、培養２日目から目的とする抗生物質の蓄積が
みられ、４日口ないし６日目に最高に達する。抗生物質
４４６−３３−１の、定量には、試験菌としてミコバク
テリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）　Ａ　Ｔ　ＣＣ６０７を使用する
通常の円筒平板法又はペーパーディスク平板法を行なえ
ばよい。

この様にして得られる培養物において、抗生物質４４６
−３３−１の大部分は培養濾液又は遠心上澄液中に存在
する。それらの溶液から抗生物質４４６−３３−１を採
取するには種々の方法が用いられる。即ち種々を吸着剤
を用いて吸脱着をおこなう方法、あるいは種々なイオン
交換樹脂を用いて精製する方法などを実施することがで
きる。

例えば゛、吸着剤として、多孔性非イオン性吸着樹脂で
あるダイヤイオンＨＰ２０（三菱化成工業社製、商品名
）を使用すると、抗生物質４４６−３３−１はＨＰ２０
に吸着され、アセトン水、メタノール水等によって溶出
される。又弱酸性陽イオン交換樹脂であるアンバーライ
トＩＲＣ−５０（米国、ローム・アンド・）＼−ス社製
、商品名）水素型に吸着され、希薄な酸、例え−ば０．
０５Ｎ塩酸で溶出される。このような方法で得られた抗
生物質４４６−３３−１の粗粉末は例えばクロロホルム
、メタノール、ベンゼン、酢酸エチル、アセトン・等の
溶媒の、適当な組み合わせよりなる混合溶媒系を用いた
シリカゲル・カラムクロマトグラフ法によって精製する
ことができる。そのほかに、クロマトグラフ用の弱酸性
陽イオン交換樹脂、例えばアンバーライトＣＧ−５０（
米国、ローム・アンド・ハース社製、商品名）水素型や
、ゲル濾過クロマトグラフ用樹脂、例えばトヨパールＨ
Ｗ−４０（東洋曹達工業社製、商品名）を用いて精製す
ることもできる。また、含水アルコールやアルコール−
酢酸エチル等の混合溶媒を用いて再結晶を繰返して高純
度の抗生物質４４６−３３−１を得ることも出来る。

次に本発明の実施例を示すが、これらは単なる一例であ
って、本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例１ ストレプトミセス・エスピー・４４６−３３株（Ｓ　ｔ
ｒｅρｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ、　４４６−５３）　（微
工研菌寄第７４１６号）の斜面培養を種菌とし、培地と
してグリセロール１．８％、ポリペプトン０．６％、牛
肉エキス０．５％、塩化ナトリウム０．３％の組成のも
のをｐＨ６，９に調整した後、１２１　’Ｃで１５分間
滅菌したものを用いた。種菌−白金耳を５００ｍｆｆ容
エルレンマイヤーフラスコに入れた上記の培地１００ｍ
ｊ！に接種し、２８℃で２日間振盪培養した。この種培
養液を１００ｍ１Ａ！の前記培地を含む５００ｍＡ容エ
ルレンマイヤーフラスコ２５本に各３％の割合で接種し
、２８℃で６日間回転振盪培養ａ（１８０回転毎分）で
培養した。

５００ｍ７！容工ルレンマイヤーフラスコ２５本分の培
養物を合して得た培養物２．５１を、２Ｎ−塩酸でｐ１
１７に調整後、遠心分離した。得られた上澄液をダイヤ
イオンＨＰ２０樹脂のカラム（２００ｍ　ｊ２　）に通
し、目的物質を吸着させ、水洗後ＬＯＯＯｍｊ２の５０
％含水アセトンで溶出した。？容出して得られた活性区
分２００ｍβを減圧下で濃縮し、さらに凍結乾燥して褐
色粉末１．８０ｇを得た。この褐色粉末をメタノールを
用い°ζ充填したトヨパールＨＭＩ−４０Ｆゲルのカラ
ム（東洋曹達工業社製、４５０ｍＪ）にのせ、メタノー
ルで展開溶出し、活性分画（分画番号１２番〜１４番、
２０ｍｊ！／分画）を得た。

この活性分画５　Ｑ　ｍ　１１を減圧下で蒸発乾固し、
褐色固形物０．５０ｇを得た。得られた褐色固形物０．
５０ｇを少量のメタノールに溶かし、クロロホルムで充
填したシリカゲルのカラム（和光純薬工業社製ワコーゲ
ルＣ−２００，４００ｍ＃）にのせ、クロロホルムで展
開し、次にクロロホルム：メタノール（’３：１）の混
合溶媒で展開溶出して、活性分画（分画番号２５番〜３
６番、１０ｍ１１７分画）を得た。この活性分画１２０
ｍ１を減圧下で蒸発乾固し、曝−淡黄色粉末２００■を
得た。これをさらにクロロホルムで充填したシリカゲル
のカラム（１５０ｍ＃）にのせ、クロロホルムで展開し
、次にクロロホルム：メタノール（５：　１）　、クロ
ロホルム：メタノール（３：　１）の混合溶媒を用いて
順次展開溶出した。この活性区分３０　ｍ　１２を減圧
下で濃縮し、酢酸エチルを加えることによって得られた
沈澱を濾別し、乾燥して抗生物質４４６−３３−１の白
色粉末１．８０■を得た。このものの理化学的性質は、
前記の理化学的性質と一致した。

実施例２ 種菌として、実施例１の培地で培養した種培養液の２ｍ
ｌを予め滅菌した４０％シュークロース水溶液２ｍ６の
入ったスクリュープラグ付試験管に加えて混合し、−８
０℃に凍結保存したものを用いた。この種培養液を室温
に戻し、実施例１の培地１００ｍｊ＋が入った５　００
ｍ／容エルレンマイヤーフラスコに接種し、２８℃で１
日間、振盪培養した。この種培養液を１００ｍＮの培地
が入っり５００　ｍ　Ｉｔ　容エルレンマイヤーフラス
コ５０本に各３％の割合で接種し、２８℃で６日間振盪
培養を行った。この場合、培地としては、グリセロール
２．０％、グルコース０．５％、ポリペプトン０．６％
、牛肉エキス０．５％、塩化ナトリウム０．３％の組成
のものをｐＨ６，９に調整した後、１２１℃で１５分間
滅菌して用いた。

得られた培養物５．ＯＮを遠心分離し、培養上清を得た
。これをダイヤイオンＨＰ２０樹脂のカラム（５００ｍ
＃）に通して目的物質を吸着させ。

水洗後、１．５７！の５０％含水アセトンで溶出して得
られた活性区分５５０ｍｆを減圧下で蒸留してアセトン
を留去し、その後、凍結乾燥して褐色粉末３．５ｇを得
た。これをメタノールに溶かしてクロロホルムで充填し
たシリカゲルのカラム（７００ｍ４）にのせ、クロロホ
ルムで展開し、次にクロロホルム：メタノール（５：　
１）　、クロロホルム：メタノール（３：１）の混合溶
媒を用いて順に展開溶出し、活性分画（分画番号２１０
番〜２４０番、２０ｍ＃／分画）を得た。この活性分画
を減圧下で濃縮し、酢酸エチルを加えることによって得
られた白色沈澱を濾別し、減圧下で乾燥することにより
淡黄色粉末０．９０ｇを得た。

これを水に溶かしてｐＨを７．５に調整した後、弱酸性
陽イオン交換樹脂アンバーライトＣＧ−５０（水素型２
５０ｍ／）に通して目的物質を吸着させた。

次に、水で洗浄し、さらに０．０５Ｎ−塩酸で溶出し、
活性区分３３０■１１！を得た。得られた活性区分を減
圧下で２０ｍＡ！まで濃縮し、これを水で充填したトヨ
パールＨＷ−４０Ｆのカラム（３４０ｍｌ）にのせ、水
で展開溶出し、活性区分５０ｍ１を得た。これを凍結乾
燥し、抗生物質４４６−５３−１の白色粉末３９０ｍｇ
を得た。このものの理化学的性質は前記の理化学的性質
と一致した。

【図面の簡単な説明】

第１図は、抗生物質４４６−３３−１の紫外線吸収スペ
クトル（メタノール中で測定）を、第２図は、赤外線吸
収スペクトル（ＫＢｒ法）を示す。 第１図 吸　水（ｎｍ） 手続？１ｌｉｉ′Ｅ”　５９．１０．２３昭和　年　月
　日 １、事件の表示　昭和５９年特許廓第１１６３１５号２
、発明の名称　斜杭生物’ｉ！ｆ４４６−３３−１およ
びその製造法３゜補正をする者 事件との関係　出願人 名　称　関東医師製薬株式会社 ４、代理人 ５、補正命令の日付　自　発 ７、補１正の内容 （１）明細書の特許請求の範囲を別紙の通り訂正する。 （２）同書第７頁第６〜１０行の“また、・・・示すの
みである。′を削除する。 （３）同書第８頁第９行の“塩基性”を「弱酸性」と訂
正する。 （４）同書第２８頁第１４行の“例えは”を「例えば」
と訂正する。 （５）同書第３１頁第１２行の“アルコール−酢酸エチ
ル等”を「アルコールと酢酸エチル等］と訂正する。 特許請求の範囲 １）次の理化学的性質を有する新抗生物質４４６−５３
−−１゜ １１１元素分析値： Ｃ４８，５０％、　Ｈ５，４９％、 ｏ３３．７１％、　Ｎ１２．３０％ （２）分子量： 二次イオンマススペクトル（Ｓ　Ｉ　−ＭＳ）分析にお
いて、質量数５７０に（Ｍ＋Ｈ）”、５９２に（Ｍ＋Ｎ
ａ）　”　、６０　Ｂに（Ｍ＋Ｋ）”が観測されること
より、分子量は５６９と結論される。 （３）融　点： １７３−１７６℃ （４）紫外線吸収スペクトル： メタノール中での吸収極大 （ＩＭｅＯＨｎｍ（ｔ）　）は２１４　（１６２００”
）、　ａ　ｘ ２５７（肩９８００）を示す。第１図のとおりである。 （５）赤外部吸収スペクトル： ＫＢｒで測定した赤外部吸収スペクトルは第２図に示す
通りである。吸収極大を示す波長はつぎの通りである。 単位は（２）１゜３４００．２９３０．１６８０．１５
１５．１２７０．１１００゜ （６）溶剤に対する熔解性： 水およびメタノールにきわめてよく熔け、エタノール、
アセトンに熔け、クロロホルムにやや熔け、酢酸エチル
、ベンゼン、ｎ−ヘキサンに不溶である。 （７）呈色反応： （陽性）過マンガン酸カリウム反応、モーリッシュ反応 （陰性）アンスロン反応、アニリン水素フタル酸塩反応
、塩化第二鉄反応、ニン ヒドリン反応 （８）塩基性、中性、酸性の区分： 弱酸性 （９）物質の色： 白色 ＱＩＲｆ値ニ ジリカゲル薄層クロマトグラフィー（メルク社製ＴＬＣ
プレート、シリカゲル６０Ｆ　１厚さ０．２５ｍ）を通
常の方法で行った時のＲｆ値は、次のとおりである。 （イ）　クロロホルム：メタノール（２：　１）Ｒｆ値
　０．４３ （ロ）ベンゼン：メタノール（２：　１）Ｒｆ値　０．
２１ ？Ｑ　ｎ−プクノール：酢酸：水（３：　１　ｊ　１）
Ｒｆ値０．４３ ０１）酸加水分解物中にウラシルおよびリジンが存在す
る。 （１）　’ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ、　Ｄ２０）δ（ｐ
ｐｍ）：１．３７（ＩＨ）、１．６４（ｉｌｌ）、１．
７８（ＩＨ）、１．８４　（ＩＨ）、１．９３（１）１
）、２．００（ＩＨ）、３．３　（１）１）、３．３２
　（３Ｂ、、ｓ）、３．７７　←■、　ｔ）　、４．２
３　（１）１）　、４．４　（ＩＨｌｔ）、４．５０　
←■、ｔ）、４、５３　（ｉｌｌ）　、　４．６５（１
８）　、４．８０（ＩＨ）　、　５．４　（ＩＨＳｄ）
　、５．７８（ＩＨｌｄ）　、５．８８　（ＩＨ，ｄ）
　、６．０４（ＩＨ）　、　７．７８　←■、ｄ）、Ｑ
轡”ＣＮＭＲ（Ｌ、ＯＯＭＨｚ、Ｄ２０）　δ　（ｐｐ
ｍ）：２　Ｂ、　３８１ｔｌ、　２８．６　１　（ｔ）
、３１．３３（ｔｌ、　４２．３３　（ｔｌ、５３、１
　０１ｄｌ、　５　Ｂ、　Ｔ　Ｏｔｑ＞、６２、７　２
　＋ｄｌ、　６５．７　２　（ｄｌ、７２、８０　＋ｄ
）、　７６．４２　＋ｄ）、７８、９７　（ｄｌ、　８
２．３９　（ｄｌ、９０、７　１　＋ｄ＋、　１００．
　ＯＯ（ｄｌ、１０２、４８　（ｄ）、　１０９．９２
　（ｄｌ、１４１、４５　＋ｄ＋、　１４２．０６　＋
３１．１５１、６２　（Ｓ）、　１６１．７４　（Ｓ）
、１６６、３０１３）、　１７３．２０　＋３１．１７
６．４７（３１， ２）ストレプトミセス属に属する抗生物質４４６−３３
−１の生産菌を培養し、その培養物から抗生物質４４６
−３３−１を採取することを特徴とする新抗生物質４４
６−３３−１の製造法。 ３）生産菌がストレプトミセス・グリセウス・４４６−
　Ｓ　３−　（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅ
ｕｓ　４４６−５３）である特許請求の範囲第２項記載
の製造法。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）次の理化学的性質を有する新抗生物質４４６−３３
   −１゜ （１）元素分析値： Ｃ４８，５０％、Ｈ５，４９％、 ０３３．７１％、Ｎ１２．３０％ （２）分子量： 二次イオンマススペクトル（Ｓ　Ｉ　−ＭＳ）分析にお
   いて、質量数５７０に（Ｍ＋Ｈ）”、５９２に（Ｍ＋Ｎ
   ａ）″、６０８に（Ｍ十Ｋ）”が観測されること−より
   、分子量は５６９と結論される。 （３）融点： １７３−１７６℃ （４）紫外線吸収スペクトル： メタノール中での吸収極大（λＭｅＯＨｎｍａｘ （ε））は２１４　（１６２００）　、２５７（肩９８
   ００）を示す。第１図のとおりである。また、水溶液、
   ０．１規定塩酸、および０．１規定水酸化ナトリウム水
   溶液中での紫外部吸収スペクトルは、特徴的な吸収極大
   を示さず、末端吸収を示すのみである。 （５）赤外部吸収スペクトル： ＫＢｒで測定した赤外部吸収スペクトルは第２図に示す
   通りである。吸収極大を示す波長はつぎの通りである。 単位はａｍ　−’。３４００．２９３０．１６８０．１
   ５１５．１２７０．１１００゜ （６）溶剤に対する溶解性： 水およびメタノールにきわめてよく溶け、エタノール、
   アセトンに溶け、クロロホルムにやや溶け、酢酸エチル
   、ベンゼン、ｎ−ヘキサンに不溶である。 （７）　呈色反応： （陽性）過マンガン酸カリウム反応、モーリッシュ反応 （陰性）アンスロン反応、アニリン水素フタル酸塩反応
   、塩化第二鉄反応、ニン ヒドリン反応 （８）塩基性、中性、酸性の区分： 塩基性 （９）物質の色： 白　色 Ｑ＠Ｒｆ　値ニ ジリカゲル薄層クロマトグラフィー（メルク社製ＴＬＣ
   プレート、シリカゲル６０Ｆ２Ｓ４、厚さ０．２５ｍ）
   を通常の方法で行った時のＲｆ値は、次のとおりである
   。 （イ）クロロホルム：メタノール（２：１）Ｒｆ値　０
   ．４３ （ロ）ベンゼン：メタノール（２：　１）Ｒｆ値　０．
   ２１ （１）ｎ−ブタノール：酢酸：水（３：　１　：　１）
   Ｒｆ値　０．４３ （１１）酸加水分解物■中にウラシルおよびリジンが存
   在する。 （１２）　’ＨＮＭＲ（、４００ＭＨ２，０２０）δ（
   ｐｐｍ）　：１、　３７　（ＬＨ）　、１．　６４　（
   ＩＨ）　、１、．７８　（ＩＨ）　、１．　８４　（Ｉ
   Ｈ）　、１、　９３　（ＩＨ）　、２．　００　（ＬＨ
   ）　、３、　３　（１１−１＞　、３．　３２　（３Ｈ
   ，ｓ）　、３、　７７　（ＩＨ，ｔ）　、４．　２３　
   （ＩＨ）　、４、　４　（ＩＨ，ｔ）　、４．　５０（
   ＩＨＳ　ｔ）　、４、　５３　（ＩＨ）　、　４．　６
   ５　（ＬＨ）　、４、　８０　（ＩＨ）　、５．　４　
   （ＩＨ，ｄ）　、５、　７８（ＩＨ，ｄ）　、５．　８
   ８（ＩＨ，ｄ）　、６、　０４　（ＬＨ）　、７．　７
   ８　（ＩＨ，ｄ）（１３）　”’（：　ＮＭＲ（１００
   ＭＨ２、ＤｇＯ）δ＜ｐｐｍ＞　：２８、　３８　（ｔ
   ）　、２８．　６１　（ｔ）　、３１、　３３　（ｔ）
   　、　４２．　３３　（ｔ）　、５３、　１０　（ｄ）
   　、５８．　７０　（ｑ）　、６２、　７２　（ｄ）、
   ６５．　７２　（ｄ）　、７２、　８０　（ｄ）　、７
   ６、　４２　（ｄ）　、７８、　９７　（ｄ）　、８２
   ．　３９　（ｄ）　、９０、７１　（ｄ）　、１００．
   　００　（ｄ）　、１０２、　４８　（ｄ）　、１０９
   ．　９２　（ｄ）　、１４１、　４５　（ｄ）　、１４
   ２．０６　（ｓ）　、１５１、　６２　（、ｓ）　、１
   ６１．　７４　（ｓ）　、１６６、　３０　（ｓ）　、
   １７３．　２０　（ｓ）　、１７６、　４７　（ｓ） ２）　ストレプトミセス属に属する抗生物質４４６−３
   ３−１の生産菌を培養し、その培養物から抗生物質４４
   ６−３３−１を採取することを特徴とする新抗生物質４
   ４６−３３−１の製造法。 ３）生産菌がストレプトミセス・グリセウス・４４６−
   ３３　（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ　
   ４４６−３３）である特許請求の範囲第２項記載の製造
   法。