JPS603287B2 - キヤベツジユ−ス中より突然変異原性物質の突然変異性を阻害する因子を分離精製する方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、キャベツジュース中より突然変異原性物質の
突然変異性を阻害する因子を分離精製する方法に関する
。

Ｎーブチル−Ｎーアセトキシメチルニトロンアミン、ソ
ルビン酸と西硝酸との反応生成物、２ーアミノアントラ
セン、エチジウムブロマイド、トリプトフアンやオルニ
チン等のアミノ酸の加熱分解産物などが突然変異原性物
質であることは知られている。

従来自然界にもサルノコシカケ、ヒラタケ、シイタケ等
制ガン効果があるといわれるものがいくつかあり、この
ほかにも未知の制ガン作用を有するものがあると考えら
れる。

本発明者らは、自然界から制ガン作用ある物質を探索す
る目的で研究を行なった結果、食生活の身近かなキャベ
ツにトリプトフアンの加熱分解産物の突然変異性を阻害
する因子が存在することを知った。

本発明により、前記の突然変異性阻害物質を分離精製す
るには、該阻害物質を含有するキャベツを水洗し、低温
例えば０℃に保ってジューサーにかけ、キャベツジュー
スとし、これを遠心して組織片を除去し、その上清をさ
らに超遠心して上清を採取し、該上蒲を陰イオン交換セ
ルロースと接触し、陰イオン交換セルロースに吸着しな
い画分について腸イオン交換セルロースに適用し、低塩
濃度で溶出する活性画分を採取し、場合により限外ロ過
を行った後該画分を分子ふるいに吸着することによって
達成される。

前記上蒲を超遠心する工程と、前記陰イオン交換セルロ
ースと接触する工程の間に、透析か、または分子ふるい
に吸着して吸着される低分子を除去する工程を含むこと
もできる。

また全工程を通じ、操作は５℃以下で行うのが好ましい
。透析は、例えばセロフアン膜を使用し、５０ｍＭのＨ
ＥＰＥＳ（Ｎ−２ーヒドロキシエチルピベラジン−Ｎ′
−２−ェタンスルホン酸）またはリン酸緩衝液で行う。

また分子ふるいは、分子量１０００以下の低分子を吸着
するものが選ばれる。使用し得る陰イオン交換セルロー
スとしては、ＤＥＡＥーセルロース、ＴＥＡＥ−セルロ
ース、ＡＥ−セルロースがある。

陽イオン交換セルロースとしては、ＣＭＣ、Ｐーセルロ
ース、ＰＰＭ−セルロースがある。

最後の工程で使用し得る分子ふるいとしては、セフアク
リル、セフアデツクスＧ一７ｉバイオゲルＰ−３０カギ
ある。（セフアクリル、セフアデツクスはスウェーデン
Ｐｈａ肌ａｃｉａ社の、バィオゲルは米国Ｂｉｏ−Ｒａ
ｄ社の商品名である。以下同じ。）限外ロ過膜は、ＵＭ
−１０、ＵＭ−２庇、ＰＭ−３０等の分子量３００００
以下の分子を透過する限外ロ過膜が使用できる。（ＵＭ
−１０、ＵＭ−２皿、ＰＭ−３０は米国Ａｍｉｃｏｎ社
の商品名である。以下同じ。）本発明方法によって得ら
れる突然変異性阻害因子は２８加川および４０４ｎのに
特徴的な吸収スペクトルを有し、熱に安定でタンパク分
解酵素で失活する。これをドデシル硫酸ナトリウムーゲ
ル電気泳動法により測定すると、分子量約４３０００の
タンパク性物質である。該物質は、後記のヒスチジン要
求性サルモネラＴＡ９玖珠のトリプトフアン熱分解産物
による突然変異試験において、突然変異を顕著に阻害し
た。該因子の構成アミノ酸のモルパーセントは次のとお
りである。

Ａｓｐ １
３．２２Ｔｈｒ
８４３Ｓｅｒ
６．７０ＧＩｕ
６．３８Ｐｒｏ
６．５６ＧＩｙ
７．物ＡＩａ
９．８９Ｃ＄
１．７３Ｖａ１
５．７
７Ｍｅｔ ｌ．
２９ｌｉｅｕ
３．４４Ｌｅｕ
ｌｌ．６４Ｔｙｒ
ｌ．３１Ｐｈｅ
５．３６Ｌｙｓ
２．５９Ｈｉｇ
ｌ．０７Ａｒｇ
７．４０以下実
施例によって本発明方法をさらに詳細に説明する。

キャベツ１０００〜２０００夕を十分水洗し、０℃に保
ってジューサーにかけ、キャベツジュースを得た。

このジュースを４℃において９００ので３０分間遠心し
、クロロプラスト、ミトコンドリア核等の組織残澄を除
去し、その上清を４℃にて２００００的で２時間超遠心
し、ミクロソーム、リボンーム等を除去した。ここで得
られた５２８の‘の上情をセロフアン透析膜を用い、５
０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．８）にて透析した
。透析液は２回交換した。透析によって分子量約１００
０以下の低分子化合物は除かれる。透析したキャベツジ
ュースは、次にＤＥＡＥ−セルロースの力ラムクロマト
グラフイにかけた。カラムサィズは４×３７肌で、流速
は１２２の【／時、溶出量は試験管当り１５の【づつ採
取した。溶出液は５０のＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６
．８）中、塩化カリウム濃度が０〜５００ｍＭに段階的
に変化する溶液を使用した。溶出は４℃で行う。得られ
る各画分について２８仇肌のタンパク吸収を調べたとこ
ろ、５つの分離ピークが認められた。これら各画分につ
いて、トリプトフアンの加熱分解物に対する阻害効果を
後述の試験方法で調べたところ、ＤＥＡＥーセルロース
に吸着しない函分、すなわち塩化カリウム濃度０の画分
にのみ強い活性を認めた。この溶出曲線を第１図として
示す。このようにして強い阻害効果を認めた画分１１０
０Ｍで得られ、これをカルボキシメチルセルローズの力
ラムクロマトグラフイにかけた。カラムサイズは２．５
×８肌で、流速６９叫／時、溶出量は試験管当り３の‘
づつ採取した。溶出緩衝液は、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩
衝液１２０羽と、０〜０．８ＭＫＣ１ １２０叫（Ｎａ
ＣＩでもよい）とでＫＣＩにつき濃度勾配を作成し、Ｋ
ＣＩ濃度を連続的に変化させて溶出した。

操作はすべて４℃で実施した。得られた各画分について
２８加川のタンパク吸収を調べたところ、４つの分離ピ
ークが認められた。これら各画分について、後述の試験
方法によって阻害効果を調べたところ、ＫＣＩ濃度０．
０９Ｍ‘こ最大溶出ピークを有する画分にその活性を認
めた。このＫＣＩの低濃度で溶出される試験管７本分の
画分を集めたところ、２１Ｍを得た。この熔出曲線を第
２図に示す。この高活性画分をＵＭ−１０フィル夕を用
いて限外ｏ過し、さらに濃縮した。濃縮した画分２．０
の‘をセフアクリルＳ−２００カラムにてさらに分離精
製を行った。カラムサイズは１×９２肌、溶出液は５０
ｍＭトリス一日ＣＩ（ｐＨ８．０）緩衝液で、溶出速度
は試験管当り４０滴づつ採集した。操作はすべて４℃で
行った。これら各画分について前述同様２８仇肌のタン
パク吸収を調べたところ、大きく４つに分離ピークが認
められた。これら各画分について後述の試験法により阻
害効果を調べたところ、２番目の熔出した画分に強い阻
害活性が認められた。精製の各段階における精製度を知
るため、ローリー法で測定したタンパク量を基準とし、
５０％変異阻害度の活性比を求めたところ、もとのキャ
ベツジュースを１とすれば、ＤＥＡＥセルロース処理に
より約２倍、ＣＭＣカラムクロマトグラフィーにより約
２０ぴ音、セフアクリルカラム処理により約４５ぴ音活
性が高められていることがわかった。

このキャベツから分離精製した突然変異性阻害因子は、
ｌｏｏ。Ｃ９粉ごの加熱において５０％が失活するに過
ぎないが、プロナーゼにより失活することが判明した。
ドデシル硫酸ナトリウム電気泳動法により、分子量約４
３０００のタンパク性物質であることがわかった。該因
子は４０４ｎのに特徴的な吸収を有しているが、この吸
収はへムタンパクに特有なＳｏｒｅｔｂａｎｄを示すも
のであり、該因子は原子吸光分析により、タンパク量１
の２当り、鉄０．鼠２ムタ含有し、本因子の分子量４３
０００からタンパク１モル当り鉄は０．４班モルと計算
された。

また重亜硫酸ナトリウムを加えると該Ｓｏｒｅｔ舷ｎｄ
が４３６．則肌にシフトし、吸収強度が減少する等の現
象からして、酸化型（Ｆｅ３十）から還元型（Ｆｅ２十
）への変化によるものと認められることからへムタンパ
クの性質を有することが判明した。トリプトフアン加熱
分解産物に対する突然変異阻害効果試験：ジメチルスル
ホキシド０．０２の‘に溶解したトリプトフアン熱分解
産物１０〃のこ、前述の方法で分離した各画分０．５の
‘を加え、３７ｑ０で３０分間反応させ、その後系中の
阻害因子をすべて不活性化するため１００ｑｏにて１０
分間加熱処理する。

加熱処理後、ソフトアガー（０．５％ＤｊｆｃｏＡ鞍ｒ
、米国ＤｉにｏＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）３の‘
を加え、サルモネラＴＡ蛾（ヒスチジン要求性）の菌液
０．１肌を加える。これにＳＤ系ラットより、ＰＣＢに
て酵素活性を高めた肝臓を摘出し、ホモジネートおよび
遠○して得られた肝ミクロソームと以下の組成からなる
緩衝液を加えたＳ−９ミックス０．３の‘を、以下の寒
天塔地へ流し、３７ｏ０で２日間培養し、ヒスチジン非
要求性の復帰変異コロニー数を教える。Ｓ−９に加えら
れる無機塩：肝ミクロソーム ３私 〇．２８ＭＮａ２ＨＰ。

４ ４の‘〇．ｌａＭＭｇＣ
１２ ０．５の‘０．６８
ＭＫＣＩ Ｏ‐５凧【〇
．〇８Ｍ Ｇ一６一ｐ ｌ．〇泌
〇．〇山ＭＮＡＤＰ Ｉ．〇
のＺ選択用寒天塔地：ＭＮ（Ｘ２０）
５０の【４０％グルコース
１０叫Ｄ的ｏ ＮｕＵｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈｏ．８
％（米国ＤｉｆｃｏＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）
１０の【ビオチン（１０比′泌）
１ｍ【アガー
１５夕蒸留水 ９３０叫Ｍ
Ｎ（×２０）の組成：（Ｎ比）２Ｓ０４
２．０％ＫＨ２Ｐ０４
２０．０％ＭｇＳ０４・７日２０
０．２％クエン酸ナトリウム
１．０％ＫＯＨにてｐＨ７．０に調節阻害効果は
、キャベツジュース処理をしない突然変異原物質である
トリプトフアンの加熱分解産物の復起変異コロニー数が
３００〜４０の固であり、これと比較してキャベツジュ
ースで処理したトリプトフアン加熱分解産物の復帰コロ
ニー数を計数し、復帰コロニー数がどの程度減少するか
を調べた。

【図面の簡単な説明】

第１図はＤＥＡＥ−セルロースカラムクロマトグラフィ
における溶出曲線図、第２図はＣＭＣ力ラムクロマトグ
ラフィにおける溶出曲線図である。 図一 蝦 図 Ｎ 幸船

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 突然変異原性を有する物質の突然変異性を阻害する
   因子を含むキヤベツジユースを遠心する工程その上清を
   超遠心する工程、その上清を陰イオン交換セルロースと
   接触する工程、陰イオン交換セルロースに吸着しない画
   分に陽イオン交換セルロースに適用する工程、低塩濃度
   で溶出する活性画分を採取する工程、該画分をさらに分
   子ふるいに吸着して精製する工程とを含むことを特徴と
   する２８０ｎｍおよび４０４ｎｍに特徴的な吸収スペク
   トルを有し、熱に安定でタンパク分解酵素で失活する前
   記の突然変異性阻害因子を分離精製する方法。 ２ 前記上清を超遠心する工程と前記陰イオン交換セル
   ロースと接触する工程との間に、透析を行うか、または
   分子ふるいに吸着して吸着される低分子を除去する工程
   を含む特許請求の範囲第１項の方法。 ３ 全工程を５℃以下の温度で行う特許請求の範囲第１
   項または第２項の方法。