JPS6033472B2 - Ｄ−フルクト−ス；フエリチトクロ−ム酸化還元酵素及びその製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 従来、Ｄーフルクトース脱水素酵素としては、微生物お
よび動物肝臓起源のニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チド（酸化型）（ＮＡＤ）あるいはニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチドリン酸（酸化型）（ＮＡＤＰ）を補
酵素とする酵素、Ｄ−フルクトースＮＡＤ（Ｐ）酸化還
元酵素ェンザィムコード（ＥＣ）１．１．１．１２３が
知られている。

本発明者等は微生物、特に酢酸菌が酸化還元色素依存性
の新規なＤ−フルクトース脱水素酵素、即ちＤ−フルク
トースフェリチトクローム酸化還元酵素を産出すること
を初めて見し、出した。この酵素は菌体の膜画分に局在
し、界面活性剤により可溶化され、通常の方法により単
一標品にまで精製される。この精製酵素は補欠分子とし
てチトクロームを含み、電子受容体として適当な酸化還
元色素の存在下でのみＤ−フルクトースを相当する５−
ケトーＤ−フルクトースに酸化する酵素であり、ＮＡＤ
あるいはＮＡＤＰを電子受容体とは全くしない新規なＤ
ーフルクト−ス脱水素酵素（Ｄ−フルクトースフェリチ
トクローム酸化還元酵素）でＥＣＩ．１．２に属する酵
素である。これまで本酵素の理化学的諸性質が不明であ
ったために、暫定的にＥＣ．１．１．９９．１０とされ
ていた。更に上記酵素はＤ「フルクトースを５−ケト−
Ｄーフルクトースへ直接酸化する酵素であり、その活性
を可視部で測定することができる。よって、上記酵素は
Ｄ−フルクトースの酵素的定量法において極めて有利な
酵素である。本発明は上言己の知見に基づいて完成され
たものであって、Ｄ−フルクトースフエリチトクローム
酸化還元酵素及び該酵素生産菌を培地に培養して得られ
た培養菌体からＤ−フルクトースフェリチトクローム酸
化還元酵素を採取することを特徴とするＤーフルクトー
スフェリチトクローム酸化還元酵素の製造法である。

上記Ｄーフルクトースフェリチトクローム酸化還元酵素
（以下“本発明酵素”という）の製造法における本発明
酵素生産菌としては、酢酸菌、細菌、酵母およびカビ等
の微生物であって、本発明酵素を産生する菌は全て本発
明酵素の製造法において使用することができる。

本発明酵素を大量に産生する菌の例をあげれば、酢酸菌
に属するグルコノバクター属、例えば公知のグルコノバ
クタ−・セリヌス（ＧＩｕｃｏｎｏ舷ｃｔｅｒ ｃｅｒ
ｉｎｕｓＩＦＯ−３２６８）、グルコノバクター・イン
ダストリウス（ＧＩ肌ｏｎｏ舷ｃｔｅｒｉｎｄ瓜ｔｒｉ
ｓ『０−３２６０）（財団法人発酵研究所に保存）やア
セトバクター属、例えば公知のアセトバクター・キシリ
ヌス（Ａｃｅｔｏｂａｃにｒ 奴ｌｉｎｕｓＩＦＯ−３
２８８）（財団法人発酵研究所に保存）等があるが、特
にグルコノバクター・インダストリウスが望ましい。

本発明酵素の製造法を実施するにあたっては、本発明酵
素生産菌を培地に培養するが、培地の栄養源としては、
微生物の培養に通常用いられるものが広く使用され得る
。

すなわち、炭素源としては資化可能な炭素化合物であれ
ばよく、例えばブドウ糖、果糖、庶糖、麦芽糖、五炭糖
、糖密などの糖類、グルコン酸、酢酸などの有機酸類、
グリセロール、エタノールなどのアルコール類、マンニ
ット、ソルビトールなどの糖アルコール類などが用いら
れるが、特にグリセロールを単一炭素源として用いるこ
とが好ましい。窒素源としては利用可能な窒素化合物で
あれば良く、例えば酵母エキス、カゼイン加水分解物、
コーンスチープリカー、ベプトン、肉エキスなどの天然
物、尿素、アンモニウム塩などが使用される。培地に加
える適当な無機塩としては、例えばナトリウム塩類、カ
リウム塩類、カルシウム塩類、マグネシウム塩類、リン
酸塩類などが適宜に使用され得る。そして更に必要に応
じて菌の生育あるいは酵素生産に必要な各種の有機物、
無機物などを培地に添加することができる。特に、グリ
セロールを単一炭素源として培養すれば、伴生するアル
コール脱水素酵素の産生量が大幅に減少し、本発明酵素
の精製が容易となる。

本発明酵素の製造法における培養の形態としては通常は
液体培養が好適であり、そして工業的には深部通気燈梓
培養を行うのが有利である。本発明酵素の製造法におい
て、培養温度は、本発明酵素生産菌が発育し、本発明酵
素を生産する範囲内で適宜変更することができるが、特
に好ましいのは２８〜３〆○である。．培養期間は条件
によって異なるが１〜３日程度であって、本発明酵素が
最高収量に達する時期を検討して適当な時期に培養を終
了すれば良い。

なお、培養中特にｐＨの調節をする必要はないが、強い
て述べるならば培地調製時にＰＨを６〜７付近に調節し
ておけば有利である。このようにして充分に本発明酵素
が生産された培養物からの本発明酵素の採取は、菌体内
酵素を分離、精製する常法に従って実施することができ
る。すなわち、例えば減圧櫨過法、遠心分離法などのよ
うな公知の適当な方法により培養物と菌体を分離し、集
めた菌体を適当な緩衝液に懸濁させた後、公知の適当な
方法、例えば超音波破壊フレンチプレス、ダィノーミル
等により菌体を破壊する。本発明酵素は２７，００仇ｐ
ｍ、９０分の超遠心分離で沈殿する膜国分に局在するが
、本発明酵素の可溶化は菌体破壊物に適当な濃度の界面
活性剤を加えても、また一度超遠心分離により調整した
膜画分を適当な濃度の界面活性剤を含む緩衝液に懸濁す
ることによっても行なえる。可溶化酵素は界面活性剤存
在下でカルボキシメチルセフアデツクス（以下“ＣＭー
セフアデツクス”と言う）。ジェチルアミノェチルセフ
アデツクス（以下“ＤＥＡＥ−セフアデツクス”と言う
）などの各種イオン交換剤に対する親和力の差をを応用
したイオン交換クロマトグラフィー、ハイドロキシアパ
タィト等の吸着剤を用いた吸着クロマトグラフィー、あ
るいはバイオゲル、セフアデツクスなどのゲル猿過剤を
用いたゲル猿過法などの通常の手段を単独でまたは適宜
組合わせて適用し、任意に精製された本発明酵素を得る
ことができる。

次に本発明酵素の理化学的性質について、生産菌のグル
コノバクタ−・インダストリウスＩＦＯ−３２６０より
得られた本発明酵素を例として述べる。

【１’作用：本発明酵素はＤーフルクトースを有する基
質に作用して相当する５ーケトーＤ−フルクトースに酸
化する。

電子受容体はチトクロームである。■ 基質特異性本発
明酵素はＤ−フルクトースに作用し、Ｄ−グルコース、
Ｄーマンノース、Ｄ一力Ｊラクトース、Ｄ−ソルビトー
ル、Ｄ−ソルボース、スクロース、マルトース、乳糖、
Ｄーキシロース、Ｄ−フルクトースー６ーリン酸、Ｄー
フルクトース−１，６−ジリン酸、５−ケト−Ｄ−フル
クトース、５ーケトーＤーグルコン酸、２−ケトーＤ−
グルコン酸、２−ケト−Ｌ−ギュロン酸、Ｄーグルコン
酸、Ｄーガラクトン酸、ジヒドロキシアセトンには作用
しない。

‘３１ 最適ｐＨ４．０ 安定ｐＨ範囲３．５〜６．０（第１，２図参照）｛４’
力価の測定法本発明酵素の力価の測定法は、Ｄーフルク
トースを基質として、フェリシアン化カリウムの存在下
で反応させた後、反応停止剤として硫酸第２鉄・デュパ
ノール液を使用し、生成するプルシアンフルーの６６仇
ｍにおける吸光度の増加を分光々度計で測定することに
よって算出する。

即ちＤ−フルクトースを含む資料０．１の【、１０Ａモ
ルのフェリシアン化カリウムを含むマッキルベィン緩衝
液（ｐＨ４．５）０．８の‘及び酵素液０．１のＺを混
合した。２５℃で反応させ、反応停止は硫酸第２鉄・デ
ュパノール試薬（０．５の‘）を添加して行なう。

次いで反応混液に蒸留水３．５の‘を加え、２５ｑ０で
２び分間保持して星色を安定化してから６６瓜ｍの波長
における吸光度を分光々度計で測定し、その直線部分か
ら１分間当りの吸光度の増加を算出する。即ち対照とし
て上記組成中Ｄーフルクトースの代りに水を用いて同様
の操作を行ない、試験液の６６仇ｍの吸光度から対照の
それを差引く。酵素力価の表示は、上記条件下で１分間
に１ムモルの５ーケトーＤ−フルクトースを生成せしめ
る酵素量を１単位として行なう。‘５） 作用適温の範
囲 ２０〜２５ｑ〇 ‘６１ ｐＨや温度等による失活の条件 ｐＨ８．５より酸性側、ｐＨ７よりアルカリ側で失活。

３５℃を越えて長時間放置することにより失活。酸、ア
ルカリ、有機溶媒（例えばアセトン）との接触。【７１
阻害、活性化及び安定化 阻害：重金属イオン、例えばＨｇ、Ａｇ、Ｐｂ＋１安定
化：界面活性剤：例えばトリトンＸ−１００、コール酸
ナトリウム 側 分子量 本酵素の分子量は約１４０，０００と算出され、ドデシ
ルサルフェートポリアクリルアミドゲル電気泳動によれ
ば、分子量６７０００，５０８００及び１９７００の３
つのサプュニツトからなるものと推察される。

・‘９’紬本発明酵素の見掛けの物は１×１０‐２Ｍで
ある。

Ｑ■ 沈降定数超遠心沈降図で酵素標品の均一性を示す
。

沈降定数５．＄ 結果は参考写真に示す。

（１１）結晶構造 未だ結晶化に至っていないので禾分析 （１２ 元素分析値 元素分析の代りにアミノ酸分析を行なった。

アミノ酸分析の結果は第１表に示す通りである。第１表
酵素の分解条件は、磯塩酸で１１０℃、２独特間処理で
ある。

未定量の意味は、該条件で加水分解すると破壊され、定
量できなかったことを示す。（１３）その他の性質本発
明酵素はチトクロームＣと強固に結合して存在する。

還元状態：５５０〜５５丸ｍ，５２かｍ，４１７ｎｍに
最大吸収酸化状態：４０帥ｍに最大吸収 結果は第３図に示す。

次に本発明を実施例により説明する。

実施例 １ グリセロール０．４％（重量％の意味、以下同じ）、グ
ルタミン酸ナトリウム０．６％、リン酸１カリウム及び
リン酸２カリウムを夫々０．５％、硫酸マグネシウム（
７日２０）０．０２％、硫酸鉄（７日２０）０．００１
％、塩化ナトリウム０．００１％、硫酸マンガン（７日
２０）０．００１％、チアミン塩酸塩０．０４雌％、ニ
コチン酸０．０４ｍｏ％、パントテン酸カルシウム０．
０４の９％、パラアミノ安息香酸０．０１の９％の混合
物（冊６．０〜６．５）２５そを、５０そ容積のジャー
ファーメンターに仕込み、１２０℃で３０分間蒸気滅菌
して培地を得た。

他方同組成培地を用い、３０ｑｏで２０〜２岬時間振と
う培養しておいたグルコノバク夕−・インダストリウス
ｍ○−３２６０の培養物１５００の‘を前記培地に無菌
的に滅菌し、３０ｑｏで凝梓（５０仇ｐｍ）しながら２
５〜３０そ／分の通気条件件で、２餌時間通気培養する
。連続遠心分離機を用い培養液２５〆を１２，０００夕
で集めた菌体（５０夕湿重量）を、水冷した水で２回洗
浄する。

洗浄菌体を蒸溜水に懸濁し、フレンチプレスを用い１，
０００ｋ９／めで２回菌体を破砕する。未破砕の菌体は
、遠心分離機を用い５，０００夕で１び分間処理して除
去する。細胞破砕物は超遠心分離機（日立製５坪−７型
）により６８，０００夕で９０分間処理し、細胞膜破砕
物を集める。

以下の操作は０〜５℃の室温で行つｏこの細胞膜分画を
、２の音稀釈したマッキルベィン緩衝液（ｐＨ６．０）
に懸濁し、蛋白質含量〔蛋白質の定量はＬｏｗひの方法
（参考文献Ｌｏｗひ０・日・）Ｎ，Ｊ．Ｒｏｓｅｂｒｏ
ｕｇｈ，Ａ，Ｌ，Ｆａｒｒ，ａｎ服．Ｊ，Ｒａｎｄａｌ
ｌ ｌ９５１：Ｐｒｏｔｅｉｎｍｅｓｍｅｍｅｎｔ Ｍ
ｔｈ ｔｈｅＦｏｌｉｎｐｈｅｎｏｌ ｒｅａｇｅｎｔ
．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９３ ２６７〜２７５）
による〕が３０の９／泌になるように調整する。

この懸濁液に１０％トリトンＸ−１００と２一メルカプ
トェタノールを加え最終濃度が夫々１％とｌｍモルにな
るようにし、３時間ゆっくりと縄梓した後、遠心分離機
により６８，０００夕で６０分間処理して細胞破砕例を
除去し燈赤色の上清液を得た。得られた上情液３４０の
とを、０．１％トリトンＸ−１００とｌｍモルの２一メ
ルカプトェタノールを含んだ２の者稀釈のマッキルベィ
ン緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化しておいたＤＥＡＥー
セルロース（２．５×２０ｃｍ）充填カラムに流し、本
発明酵素を吸着する。更に樹脂の平衡化に使用した緩衝
液３００の‘で不純物を洗い流した後、ｐＨ６．０の２
び音稀釈されたマッキルベィン緩衝液（０．１％トリト
ンＸ−１００とｌｍモルの２−メルカプトェタノール含
有）５００地のＰＨ４．５の２０倍稀釈マッキルベィン
緩衝液（０．１％トリトンＸ−１００とｌｍモルの２一
メルカプトエタノール含有）でｐＨ勾配をつくり、徐々
にｐＨを下げながら溶出するとｐＨ５．２の付近で燈赤
色の本発明酵素が溶出される。分別された本発明酵素含
有区分を集め（３００机‘）、メンプレンフイルター（
東洋ウルトラフイルターＵＰ−５０）がポリエチレング
リコール６，０００で濃縮する。濃縮された酵素液は、
ＤＥＡＥ−セルロースを平衡化した緩衝液と同−の緩衝
液で平衡化しておいたハイドロキシアパタィト充填カラ
ム（２×５肌）に流し、本発明酵素を吸着する。更に同
一の緩衝液１００の‘で洗浄し＊＊た後、２以昔稀釈し
たマッキルベィン緩衝液（０．０１％トリトンＸ−１０
０とｌｍモル２−メルカプトエタノールを含有し、ｐＨ
６．０）２００の‘と稀釈しないマッキルベィン緩衝液
（０．１％トリトンＸ−１００とｌｍモルの２−メルカ
プトェタノールを含有しｐＨ６．０）２００の‘とで濃
度勾配をつくり徐々に緩衝液濃度を上げながら燈赤色の
本発明酵素の含有区分（２００〜２５０の【で流出開始
）約７５の‘を採取した。この酵素区分をポリエチレン
グリコール６，０００で脱水し５の‘とする。次いで酵
素液よりポリエチレングリコールを除くために透析し、
透析中に生じた沈澱を遠心分離して除去する。かくして
比活性１７２Ｕ／の９の本発明酵素約１０の９が得られ
た。上記精製操作中における各段工程の蛋白量、全活性
、比活性、回収率は第２表のとおりである。

なおこの方法によって得られた酵素は超遠心分離機およ
びセフアデツクスＧ−２００によるゲル猿過において均
一な蛋白成分よりなっていた（第３図）。粗抽出液から
の活性回収率は２６％であり、比活性の上昇は２８倍に
達した。

収率と比活性

【図面の簡単な説明】

第１図は最適ｐＨを示すグラフ、第２図は安定ｐＨ範囲
を示すグラフ、第３図は吸光度を示すグラフである。 第１図 第２図 第３図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 下記の理化学的性質を有し、且つチトクロームを電
   子受容体としてＤ−フルクトースを有する基質に作用し
   対応する５−ケト−Ｄ−フルクトースに酸化するもので
   あることを特徴とするＤ−フルクトース；フエリチトク
   ローム酸化還元酵素。 （ａ） 基質特異性：Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース
   、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−ソルボー
   ス、スクロース、マルトース、乳糖、Ｄ−キシロース、
   Ｄ−フルクトース−６−リン酸、Ｄ−フルクトース−１
   ，６−ジリン酸、５−ケト−Ｄ−フルクトース、５−ケ
   ト−Ｄ−グルコン酸、２−ケト−Ｄ−グルコン酸、２−
   ケト−Ｌ−ギユロン酸、Ｄ−グルコン酸、Ｄ−ガラクト
   ン酸、ジヒトロキシアセトンには作用しない。（ｂ）
   最適ｐＨ：４．０、安定ｐＨ範囲：３．５〜６．０（ｃ
   ） 作用適温の範囲：２０〜２５℃（ｄ） 失活条件：
   ｐＨ３．５より酸性側及びｐＨ７よりアルカリ側で失活
   。 ３５℃を越えて長時間放置することにより失活。 酸、アルカリ、有機溶媒との接触により失活。（ｅ）
   阻害、活性化及び安定化：重金属イオンが阻害剤として
   働き、界面活性剤が安定化に寄与する。 （ｆ） 分子量：約１４００００で、３つのサブユニツ
   トからなる。 ２ Ｄ−フルクトース；フエリチトクローム酸化還元酵
   素生産菌を培地に培養し、得られた培養物からＤ−フル
   クトース；フエリチトクローム酸化還元酵素を採取する
   ことを特徴とする、下記理化学的性質を有するＤ−フル
   クトース；フエリチトクローム酸化還元酵素の製造法。 （ａ） 基質特異性：Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース
   、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−ソルボー
   ス、スクロース、マルトース、乳糖、Ｄ−キシロース、
   Ｄ−フルクトース−６−リン酸、Ｄ−フルクトース−１
   ，６−ジリン酸、５−ケト−Ｄ−フルクトース、５−ケ
   ト−Ｄ−グルコン酸、２−ケト−Ｄ−グルコン酸、２−
   ケト−Ｌ−ギユロン酸、Ｄ−グルコン酸、Ｄ−ガラクト
   ン酸、ジヒトロキシアセトンには作用しない。（ｂ）
   最適ｐＨ：４．０、安定ｐＨ範囲：３．５〜６．０（ｃ
   ） 作用適温の範囲：２０〜２５℃（ｄ） 失活条件：
   ｐＨ３．５より酸性側及びｐＨ７よりアルカリ側で失活
   。 ３５℃を越えて長時間放置することにより失活。 酸、アルカリ、有機溶媒との接触により失活。（ｅ）
   阻害、活性化及び安定化：重金属イオンが阻害剤として
   働き、界面活性剤が安定化に寄与する。 （ｆ） 分子量：約１４００００で、３つのサブユニツ
   トからなる。