JPS6036749B2 - １６ｍ−マクロライド−３−ヒドロラ−ゼ及びその製造方法並にその使用方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規な酵素１３Ｍ−マクロラィドー３−ヒドロ
ラーゼ、及びその製造方法並びにこの新規酵素を使用し
て３位に酸素を介してアシル基を有する１６員環マクロ
ラィド系抗生物質を脱アシル化することを特徴とする該
酵素の使用方法に関するものである。

既知のマクロラィド系抗生物質から新規で有用な抗生物
質を製造する主要な方法の一つにマクロラィド系抗生物
質の特定部位の水酸基を特定のアシル基によってアシル
化する方法がある。

この場合にアシル化反応とともに特定部位を脱アシル化
する方法を任意に組合わせる事が可能ならば、アシル化
反応のみによる方法に比べて多用な物質を、簡単な経路
で製造する事が可能となる。例えば、３位及び他の部位
に水酸基を有する１６員環マクロラィド系抗生物質の３
位以外の特定部位のみをアシル化した物質を化学合成的
方法で製造しようとする場合には、副反応として３位の
水酸基のァシル化が起って、目的とする生産物の収率は
低下し、合成経路も複雑なものを必要とするが、３位の
脱アシル化反応を組合わせる事により、原料物質から、
単純な経路で、高収率で目的物質を製造する事ができる
。又、すでに３位にアシル基を有する物質から、３位に
他のアシル基を有する物質を製造しようとする場合にも
本発明の脱アシル化反応を使用する事により、きわめて
単純な経路で、高収率で工業的に有利な製造を実施する
事ができる。本発明のＩＳＭ−マクロラィドー３ーヒド
ロラーゼの製造方法は次の通りである。

１母Ｍーマクロライド−３ーヒドロラーゼを生産する能
力を有する微生物、広く自然界または既に検索してある
微生物類に求めることができるが、特に有力な菌として
はバシルス属の細菌をあげることができ、そのうち本発
明に有利に使用できるものとしてバシルス・ズブチリス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓ肋ｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣＩ４５９
３をあげる事ができる。

さらに本発明に塞く検索方法、例えばブイョン堵地に細
菌を接種し、好気的条件下で十分に増殖せしめた後、培
養液に３位に酸素を介してアシル基を有する１６員環マ
クロラィド、例えばロイコマィシン〜を５仇ｈｃｇ／の
‘となる様に加え数時間反応させた後反応主成物を酢酸
エチルで抽出し、これを薄層クロマトグラフィーにかけ
てロィコマィシンＡ，の生成の有無を調べる方法により
本酵素を生産する他の細菌を容易に見だす事ができる。
この方法により１８Ｍーマクロラィド−３ーヒドロラ−
ゼを生産する能力を有する菌としてはバシルス・サーク
ランス（Ｂａｄｌｌ雌ｃｉｒｃのａ順）ｌＡＭＩＩ１２
、バシルス・ズブチリス（欧ｃｉｌｌ肌 ｓｕｂｔｍｓ
）ｌＡＭＩ１７０、バシルス ．レンタス（ＢａＣｉｌ
ｌｕＳｌｅｎｔ雌）ＡＴＣＣＩ聡４０などがあげられる
。酵素を生産するための培地組成及び培養条件としては
、その細菌を培養しうる一般的な培地組成と培養条件を
広く適用する事ができる。培地組成としては、その細菌
の資化しうる炭素源例えば、グルコース、マルトース、
グリセリン等．資化しうる窒素源例えば硫安、アミノ酸
類等、その他の要素としてビタミン類、無機イオン類を
適宜組合わせたものを利用する事もできるが、これらの
要素をすべて含有する有機質控の酸蓮浅原料例えばべプ
トン、酵母エキス、肉エキス、コーン・スチープ・リカ
ー、大豆粉等を１種類又は２種類以上混合して使用する
。通常の場合は０．１〜５ｇ／のの濃度で使用する事が
望ましく、培養条件としてはｐＨ６．０〜８．５、温度
２〜４０℃で好気的に培養する事が望ましい。これらは
使用する微生物の種類により最適の条件を見出す必要が
ある。酵素は対数増殖期から生産が始まり、主として菌
体内に蓄積する。

培養時間は、培地組成、培養条件にもよるが１日〜３日
が適当である。１８Ｍ−マクロラィド‐３ーヒドロラー
ゼは主として菌体内に生産蓄積されるものであるが、若
干は培地中にも蓄積されるものであり、菌体内に、ある
いは菌体に附着した酵素は、機械的破砕、細胞壁熔解酵
素による処理等、酵素の溶出に通常用いられる方法によ
り菌体から分離して水溶液とする事ができる。

この酵素溶液から通常の酵素の精製分離方法たる硫安等
による塩析法、アセトン、エタノール等による溶剤沈澱
法等による固形物としての分離、限外炉過法、逆浸透圧
法、減圧濃縮法等による濃縮、カラムクロマトグラフィ
ー等による精製、等を組合わせる事により精製酵素を採
取する事ができる。次にその具体的な方法の一例を実験
例として示す。実験例 １ 可溶性澱粉２．０ｇ／ｄ‘、酵母エキス２．０ｇ／の、
ベプト ン ０．１ｇ／の 、Ｋ２ＨＰ０４０．１ｇ／
の 、ＭｇＳ０４７日２００．０５ｇ／ｄ‘、ＮａＣ
ＩＯ．１ｇ／ｄ‘（ｐＨ７．２）からなる培地を５００
の‘振とうフラスコに５０拡【づつ入れ１２０００１５
分殺菌した後冷却し、スラント上に生育したバシルス・
ズブチリスＡＴＣＣＩ４５９３を接種し、３７０にて１
糊時間振とう培養し種母とした。

種母と同一組成の培養液８０〆を２００そ客の醗酵タン
クに仕込み、これに１６０机の消泡剤を添加した後１２
０ｑ０１５分間蒸気殺菌し、３７０まで冷却して前記種
母を５００のと接種し、通気、蝿梓条件下で３７℃にて
２４時間培養した。約７０その培養液をとり出し、シャ
ープレス式遠心分離機にて菌体を分離回収した。この菌
体をＮａＣ１（０．１９Ｍ）とＥＤＴＡ（０．１Ｍ）を
含む水溶液で２回洗浄し、菌体をリン酸緩衝液（０．０
９Ｋ、ｐＨ６．５、ＮａＣ１（０．脚Ｍ）とＥＤＴＡ（
０．０１Ｍ）を含む）３５のこ懸濁した。これにリゾチ
ーム１７．斑を加え３７ｏ０にて３０分間ゆるやかに蝿
拝して溶菌し、溶菌液をｐＨ７．６に調整した後、硫酸
プロタミンを７雌加え５℃にて約１袖時間放置し、遠心
分離にて不溶物を除去し、透明な上燈液約３０そを得た
。この液に約６０その冷却したアセトンを加え５℃にて
約１虫時間放置後、遠心分離にて、沈毅物を回収し、こ
れをリン酸緩衝液（０．０８Ｍ、ｐＨ７．６）約１．５
のこ溶解し、遠心分離にて不落物を除去した後、超遠心
分離機（１０５０００×ｇ、２時間）にかける事により
透明な区分の酵素液１．３そを得た。この液をリン酸緩
衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ７．６）を外液をして透析後、
ＤＥＡＥ−セフアデツクスＡ−５０を充填したカラム（
６．８仇ｘ５０伽）に流して酵素を吸着した後、リン酸
緩衝液（０．０が１、ｐＨ７．６、ＮａＣＩ濃度を０．
１Ｍ、０．２Ｍ、０．３地こ段階的に増加）にて溶出し
、酵素活性区分を集めて限外炉週にて濃縮した。

この濃縮液をリン酸緩衝液（０．０８Ｍ、ｐＨ７．６）
を外液として透析した後セフアデックスＧ−１００のカ
ラム（２．６伽×９０の）を通す事によりゲル炉過を行
い、酵素活性区分を集めて再び限外炉週にて濃縮した。
この濃縮液をＤＥＡＥーセフアデックスＡ−５０のカラ
ム（１．４肌×２０弧）にかけ、リン酸緩衝液（０．０
２Ｍ，ｐＨ７．６、ＮａＣＩ濃度を０．２→０．３５Ｍ
に連続的に増加）にて溶出し、ＮａＣＩＯ．２７９川こ
て溶出する酵素活性区分を集めた。この溶出液を再度セ
フアデックスＧ−１００のカラムにかけ、酵素活性区分
を集めた後、限外炉過にて１泌まで濃縮した。これをア
セトン３の‘を加えて、析出する沈澱を炉取し、低温に
て真空乾燥する事により１０の９の白色酵素粉末を得た
。この酵素粉末はティスク電気泳動法において単一な蛋
白質であり、蛋白質１ｇ当たりの活性は４０００山単位
（ｍｃＭ／豚、ｇ）であった。

本発明の１８Ｍーマクロラィドー３−ヒドロラーゼは新
規な酵素であって次の性質を有する。‘１１作用３位に
酵素原子を介してアシル基を有する１６員環マクロラィ
ド系抗生物質の３位のェステル結合を加水分解して当該
アシル基を脱アシル化する。

■ 基質特異性 基質となり得る物質は３位に酸素原子を介してァシル基
を有する１６員環マクロライド系抗生物質であり、既知
の構造の内では特に表１に示すロィコマィシン系抗生物
質とスピラマィシン系抗生物質に強く作用する。

‘３１ 至適ｐＨ及び安定ｐＨ 反応の至適ｐＨは７．８〜８．０でありＰＨ６．０〜９
．５の範囲でも反応性を示す。

ｐＨ７．８〜７．７で最も安定でありｐＨ６．５〜９．
５の範囲で比較的安定である。｛４｝ 作用温度の範囲
作用至適温度は３７０であり、１０℃〜５０℃の範囲で
反応性を有する。

■ ｐＨ、温度等による失活の条件 リン酸緩衝液（０．１Ｍ）中で３時間３７０にて保持し
た場合に、ｐＨ７．５〜７．８では約１５％失活し、Ｐ
Ｈ７．０，８．２では約３０％失活し、ｐＨ８．４では
約５５％に失宿する。

（６）阻害物質に対する挙動 ＣａＨ、Ｚｎ什、Ｈｇ什イオン、ヂオキシコール硫酸ナ
トルウムにより強く阻害を受け、ＣＯ什イオン、Ｐ−ク
ロロマーキユリーベンゾエートによりやや阻害を受け、
Ｆｅ什，ＭｇＨ，ＭｎＨ，Ｃａ什イオン、２−メルカプ
トエタノール、ジチオスレイトール、ＥＤＴＡ（エチレ
ンジアミンテトラアセティツクアシド）により阻害を受
けない。

‘７｝ 分子量 セフアデツクスＧ−１００によるゲルカラムクロマトグ
ラフィーによる分子量は４４０００脚 力価測定法酵素
液０．２の‘、リン酸緩衝液（ｐＨ７．８、０．０５ゆ
基質水溶液（ロィコマィシンんを１Ｍ／泌の濃度に弱酸
性水に溶解したもの）を混合し、３７ｑ０で６０分間反
応させた後、クリシン−Ｎａ。

日緩衝液（ＰＨ９６，市Ｍ）を２泌加えて反応を停止し
、これを０．５の‘のトルェンにて抽出し、反応中に生
成したロィコマィシンＡ，を薄層クロマトグラフィーに
て定量し、１分間に１仏ＭのロィコマィシンＡ，を生成
する酵素量を１単位とする。脚力価 蛋白１ｇ当たりの力価は４０００山単位である。

‘１瓜 元素分析炭素、酸素、窒素及び硫黄を含有する
。

（１１）等露点 ＰＨ４．６５である。

（１２）アミノ酸分析 リジン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、ス
レオニン、セリン、ブローリン、グルタミン酸、グリシ
ン、アラニン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロ
イシン、チロシン、フヱニルアラニン及びトリプトフア
ンを含有する。

次に本酵素の使用方法すなわち３位に酸素を介してアシ
ル基を有する１６員環マクロラィド系抗生物質の当該ア
シル基の脱アシル化法につき説明する。

本発明の酵素を使用するには、基質たる所望の１６員環
マクロラィド系抗生物質と、酵素又は酵素含有物とを水
性溶液中で接触せしめる事が必要であるが、酵素含有物
とは、培養液、菌体、種々の段階の半精製物、不熔イ控
酵素がいり、酵素含有物が不溶イ控酵素である場合には
、これをカラムにした後基質水溶液を流過ごせる方法を
採る事ができる。

反応温度は１０００〜５０ｑ○で反応するが３０℃〜４
５ｑｏが望ましく、反応ｐＨは６．０〜９．５の範囲で
反応するが７．０〜８．５の範囲が望ましい。

基質の量と酵素の量との関係は酵素１単位に対して基質
１００雌〜１ｇとし、反応時間は２〜１０時間とするの
が望ましい。反応中の基質濃度としては１０伽ｃｇ／の
‘〜５００肌ｃｇ／の‘が望ましい。反応液に緩衝液を
使用する事は必須条件ではないが、反応を安定して行う
には緩衝液を使用する事が望ましく、この場合の緩衝液
としてはリン酸緩衝液、クエン酸緩衝液等通常酵素反応
に用いられるものが使用できる。反応中はゆるやかに燈
拝する事が望ましいが、好気的条件を必要としない。本
発明が適用できる１６員環マクロラィド系抗生物質の内
既知のものとしては表１に示す基本構造を有するものが
ある。

これらの基本構造を有する物質につき、基質と反応生成
物との関係の例を表２に示す。

表１ マクロラィド系抗生物質の基本構造基本構造１．
ロイコマイシン系物質 基本構造０．タイシロン系物質 基本構造ｍ．スピラマイシン系物質 表−２ ３位の脱アシル化反応における基質と生成物の
関係の一例なお、本酵素の性質からして、前記の構造と
細部においては異るが構造的には類似する他の１６員環
マクロライド系抗生物質についても、又前記以外のＲ，
、及びＲ２を有する場合においても本発明が適用できる
事は言うまでもない。

なお、表２に記載されている物質は、いずれも既知物質
あるいは本発明の出願人によりすでに特許出願された（
特願昭５０−１５８総８、侍願昭５１−５５６２０特顔
昭５１−１０８９６７）物質であり、これらの出願の明
細書中に、その理化学的性質、生物学的性質等は記載さ
れている。

実施例 １ 種母としてべプトン１ｇ／ｄ‘、酵母エキス１ｇ／ｄ‘
、Ｋ２ＨＰ０４０．１ｇ／ｄ‘、Ｍが０４７日２００．
０薄／ｄ‘（ｐＨ７．０）からなるものを５００の【三
角フラスコに１００泌づつ入れて１２０℃２０分間蒸気
殺菌したものを便用した。

本塔地としては、上記種母塔地に消泡剤として、デカノ
ール０．蟹／ｄ‘を加えたものを全容２００そのタンク
に８０〆仕込み１２０℃にて２０分間殺菌し冷却したも
のを使用した。

ブイヨンスラント上に培養したバシルス・ズブチリスＡ
ＴＣＣＩ４５９３を種母塔地に接種し、３５℃のロータ
リーシェーカ−で１日培養後その１本（１００の‘）を
上記本塔地に接種し、通気、瀦梓条件下で３５ｑｏにて
１日培養した。

この間に必要に応じて上記消泡剤を追加添加した。この
培養液を２０そジャーファーメンタ−５本に１０そづつ
に分けて入れ、これを表３に示す。

マクロラィド系抗生物質を基質として１種類づつそれぞ
れのジャーファーメンターに１ｇづつ加え３７０にて燈
拝しながら３時間反応せしめた。反応後それぞれの反応
液は同様の方法により次の様に処理し、反応生成物を精
製採取した。反応液約１０〆づつをジャーファーメンタ
ーから取り出し、これをｐＨ８．０とした後３０℃にて
２〆づつのベンゼンで２回抽出し反応生成物をベンゼン
層に移した。これを分離し、ベンゼン層を酢酸緩衝液（
ＰＨ３．壕）１〃づつと２回‘こわたって７℃にて混合
し、反応生成物を緩衝液層に移した。この緩衝液層を分
離した後希ＮａＯＨにて軸７．０とし、これを３０午０
にて５００の【づつのベンゼンで２回抽出し、反応生成
物をベンゼンに移した後、これを分離してベンゼン層を
減圧濃縮し、ざらに乾固する事により約１．５〜２．腿
づつの黄褐色の物質を得た。これをカラムクロマトグラ
フィー（ＷＡＫＯ−ＧＥＬＣ−２００を使用し、これを
直径１．５肌、長さ５０奴のカラムとし、溶世液として
ベンゼン：９〆 メタノール：３の混合溶媒（数値は容
量比を示す。

）を使用したもの。）により分離し、主反応生成物のみ
を含む区分を集めて減圧濃縮乾固し、白色粉末を得た。
この白色粉末を再び上話のカラムクロマトグラフィーに
かけて精製し、減圧濃縮乾固し、これをさらに真空乾燥
器で乾燥する事により表３の反応生成物の欄に示すＲ，
及びＲ２を有し、表１の基本構造１に示す構造を有する
ロィコマィシン系物質を得た。これらの物質はすでに報
造されている理化学的性質と比較する事により上記の構
造を確認した。表−３ 基質と反応生成物の関係 実施例 ２ 【１｝ 実験例１と同様の方法により得た菌体を凍結乾
燥する事により、灰白色の酵素活性を有する粉末（Ｅ−
１）を得た。

‘２）実験例１の方法により得た菌体をアセトンで処理
した後乾燥する事により酵素蒲性を有する白色のアセト
ン処理粉末（Ｅ−２）を得た。

■ 実験例１の方法により得た菌体をリン酸緩衝液（Ｐ
Ｈ７‐６家）に懸濁し、超音波破砕機機により菌体を破
砕し、これを超遺０分離機にかける事により黄色の上燈
液を得、これに２倍量の冷アセトンを加え、できた沈澱
を炉取し、乾燥する事により淡黄色の酵素活性を有する
粉末を得た。（Ｅ−３）■ 前記の‘洲こおいて得た超
遠心上燈液を限外炉過器にて濃縮する事により分子量の
小さい無機塩類、着色物質、その他の有機物等を除去し
た後、酵素液を凍結乾燥する事により淡黄色の酵素粉末
を得た。（Ｅ−４）｛５ー 前記■の酵素粉末を使用し
、通常用いられるアクリルアマィドポリマーによる抱埋
法で不溶化酵素を得た。

（Ｅ−５）上記の方法により調製した酵素含有物（Ｅ−
１〜Ｅ−５）の０．５ｇづつをそれぞれ別々に１０の‘
のり徹鰯液（ＰＨ８．壕蝋解又雌濁し・これにロィコマ
ィシンＡ３（表１における基本構造１にＲ，！アセチル
基、Ｒ２＝ィソバレリル基を有する物質）を１０仇ｈｃ
ｇ／の【濃度に溶解し、３７０にて３０分間ゆるやかに
振とうしながら反応せ上 めた後、グリシン−ＮａＯＨ
緩衝液（ｐｉｌｌＯ．０）そ机えて反応を停止し、反応
生成物をトルェンにて抽出し反応生成物を薄層クロマト
グラフィーにマ同定し、ロィコマィシンＡ，（表１にお
ける基本構造にＲ，＝水素、Ｒ２＝ィソバレリル基を有
する物質）である事を確認した。

なお薄層クロマトグラフィーは次の方法によって行った
。薄層板はメルク社製〜ｔ．５７１５を使用し、展開溶
媒は１ ベンゼン（８５）、メタノ−ル（１０）トルエ
ン（５）、ピリジン（１０）メチルセロソルブ（５．５
）、酢酸（５．５）２ ベンゼン（６．５）、アセトン
（１０）３ ｎ−へキサン（３０）、アセトン（１０）
メタノール（１０）、ベンゼン（２５）酢酸エチル（２
０） ４ クロロホルム（８０）、メタノール（２０）（ ）
内は容量比を示す。

を使用し、展開は反応生成物と既知比較物質との重ね展
開及び並行展開する事により比較してその同異を調べた
。

発色は硫酸加熱発色法によった。

実施例 ３ 実施例２．側において調整した不溶化酵素（Ｅ−５）を
直径１肌、長さ１０弧のカラムとし、これに５仇ｈｃｇ
／の‘の濃度に３ーアセチルーヂーィソバレリルスピラ
マィシン（表１における基本構造ｍにＲ，＝アセチル基
、Ｒ２＝ィソバレリル基を有するもの）を溶解した前記
リン酸緩衝液を流週せしめ、流出液を実施例２一蹴の方
法によって調べ、反応生成物としてヂーィソバレリルス
ピラマィシン（表１における基本構造山にＲ，＝水素、
Ｒ２＝ィソバレリル基を有する物質）を認めた。

実施例 ４ リン酸緩衝液（０．０９ Ｍ，ｐＨ７．６）５０の‘に
３ーアセチルーヂーイソバレリルスピラマイシンを１０
０雌溶解し、さらに実験例１と同様の方法により調製し
た酵素１の９を加えて溶解し、３７０にてゆっくり燭拝
しながら２時間反応させた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 下記に示す諸性質により特定される酵素１６Ｍ−マ
   クロライド−３−ヒドロラーゼ（ａ）作用及び基質特異
   性 ３位に酵素原子を介してアシル基を有する１６員環マク
   ロライド系抗生物質の３位のエステル結合を加水分解し
   て当該アシル基を脱アシル化する。 既知の物質の内ではロイコマイシン系物質とスピラマイ
   シン系物質に特に強く作用する。 （ｂ）至適ｐＨ及び安定ｐＨ反応至適ｐＨは７．８〜８
   ．０であり、ＰＨ６．０〜９．５の範囲でも反応性を示
   す。 ｐＨ７．８〜７．９で最も安定であり、ＰＨ６．５〜９
   ．５の範囲で比較的安定である。（ｃ）作用温度の範囲 作用至適温度は３７℃であり、１０〜５０℃の範囲で反
   応性を有する。 （ｄ）ｐＨ、温度等による失活の条件 リン酸緩衝液（０．１Ｍ）溶液中３時間３７℃に保持し
   た場合に、ｐＨ７．５〜７．８では約１５％失活し、Ｐ
   Ｈ７．００、８．２０では約３０％失活し、ｐＨ８．４
   ０では約５５％失活する。 （ｅ）阻害、活性化及び安定化 Ｃｕ■、Ｚｎ■、Ｈｇ■イオン、デオキシコール酸、ド
   デシル硫酸ナトリウムにより強く阻害を受け、ＣＯ■イ
   オン、Ｐ−クロロマーキユリーベンゾエートによりやや
   阻害を受け、Ｆｅ■，Ｍｇ■，Ｍｎ■，Ｃａ■イオン、
   ２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、ＥＤ
   ＴＡ（エチレンジアミンテトラアセテイツクアシド）に
   より阻害を受けない。 保護作用、活性化作用を及ぼす物質は見あたらない。 （ｆ）分子量 セフアデツクスＧ−１００のカラムクロマトグラフイー
   により測定した分子量は４４０００（ｇ）元素分析炭素
   、酸素、窒素、水素及び硫黄を含有する。 （ｈ）等電点ｐＨ４．６５である。 （ｉ）アミノ酸分析 リジン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、ス
   レオニン、セリン、プローリン、グルタミン酸、グリシ
   ン、アラニン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロ
   イシン、チロシン、フエニルアラニン、トリプトフアン
   を含有する。 ２ バシルス属に属し１６Ｍ−マクロライド−３−ヒド
   ラーゼを生産する能力を有する微生物を該微生物が資化
   しうる栄養源を含む培地中で好気的に培養し、培養菌体
   から採取することを特徴とする１６Ｍ−マクロライド−
   ３−ヒドロラーゼの製造法。 ３ バシルス属に属し１６Ｍ−マクロライド−３−ヒド
   ロラーゼを生産する能力を有する微生物がバシルス・ズ
   ブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴ
   ＣＣ１４５９３である特許請求の範囲第２項記載の製造
   法。 ４ ３位に酸素を介してアシル基を有する１６員環マク
   ロライド系抗生物質に、１６Ｍ−マクロライド−３−ヒ
   ドロラーゼ又はこれを含有するものを作用せしめること
   を特徴とする該１６員環マクロライド系抗生物質の３−
   ０−アシル基を脱アシル化する方法。 ５ １６Ｍ−マクロライド−３−ヒドロラーゼ又はこれ
   を含有するものをｐＨ６．０〜９．５及び温度１０〜５
   ０℃の条件下で作用さしめることを特徴とする特許請求
   の範囲第４項記載の方法。