JPH0315381A - 新規微生物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規な微生物菌株に関するものである。

本発明の新規微生物菌株は、特にα一Ｌ−アスパルチル
ーし−フエニルアラニン低級アルキルエステルの製造に
用いることができる。

α−Ｌ−アスパルチルーＬ−フエニルアラニン低級アル
キルエステル（以下α−ＡＰＥと云う）、特にメチルエ
ステルは新しい甘味剤として注目されている有用な物質
である。α一ＡＰＲの製造法としては、Ｎ一保ｉｆｌＬ
−アスパラギン酸無水物とＬ−フエニルアラニン低級ア
ルキルエステルな反応させてＮ一保護α−ＡＰＥとし、
保護基を除去してα−ＡＰＥとする方法、Ｎ一保護Ｌ−
アスパラギン酸とフェニルアラニン低級アルキルエステ
ルとを蛋白分解酵素の存在下で反応させてＮ一保護α一
ＡＰＥ，またＮ一保護α一ＡＰＥと７ェニルアラニン低
級アルキルエステルとの付加化合物とし、保護基を除去
してα一ＡＰＥとする方法などが知られている。

前者の方法は、Ｎ一保護α−ＡＰＥとともにＮ一保護β
−ＡＰＥが副生ずるという問題がある。

後者の方法は、そのような問題がない点及び原料として
ラセミ体を使用できる点などで優れた方法である。しか
し、いずれの方法でも、原料のアスパラギン酸又はその
無水物は、アミノ基をペンジルオキ７カルポニル基のよ
うな保護基で保護したのち用いる必要があった。

これらの公知技術では当然必要とされるアミノ基への保
護基導入及び除去の工程の不必要な方法を開発すること
ができれば工程の簡略化とそれに伴なう原料、製品等の
損失を避けることができ、工業的に非常な利点が生ずる
。

本発明者らは、Ｌ−アスパラギン酸の代りに、有機酸で
あり、より経済的なフマル酸を用いることができれば、
より有利なα一ＡＰＥｏ合或法が確立されると考え、フ
マル酸と７ェニルアラニ／低級アルキルエステルから直
接α−ＡＰＩを合成する方法について鋭意検討した結果
、シ３−ドモナス属に属する新規微生物、シュードモナ
ス・プチダＴＳ−１５００１を発見した。そして、この
微生物又はその処理物を用いることによって、フマル酸
，アンモニア及びＬ−７ェニルアラニン低級アルキルエ
ステルからα−ＡＰＩＣが生成することを見出した。

従って本発明は新規微生物菌株、シュードモナスブチダ
ＴＳ−１５００１をｔＵｔするものである。

本発明者らによって山口県新南陽市の土壌中より分離さ
れたこの微生物菌株の菌学的性質は下記の通りである。

（ａ）形態 肉汁寒天培地で３７℃．６〜２４時間生育した場合 ■　細胞の形及び大きさ 桿菌　０５〜Ｑ．７　ｘ　１．０　〜１．５　，ｍ■　
細胞の多形性の有無　　単菌又は双菌■　運動性の有無
　　　　　有　極　鞭毛■　胞子の有無　　　　　　無 ■　ダラム染色性　　　　　陰性 ■　抗酸性　　　　　　　　無 （ｂ）　　各培地における生育状態 ■　肉汁寒天平板培養（３７°Ｇ，２日間培養）イ）コ
ロニー形状の遅速　普通　直径約６ｍｍロ）コロニーの
形　　　　円形 ハ）コロニー表面の形状　平滑 二）コロニーの隆起状態　半レンズ状 ホ）コロニーの周縁　　　全縁 へ）コロニーの内容　　　均質 トンコロニーの色調　　　乳白色 チ）コロニーの透明度　　半透明 り）コロニーの光沢　　　鈍光 ヌ）可溶性色素の生成　　可溶性淡緑色色素生成■　肉
汁寒天斜面場養（３７℃，２日間培養）イ）生育の良否
　　　　　生育良好 ロ）コロニーの形　　　　平滑 二）コロニーの光沢　　　鈍光 ホ）コロニー表面の形状　平滑 へ）コロニーの透明度　　半透明 ト）コロニーの色　　　　乳白色 チノコロニーの質　　　　パター質 ■　肉汁液体培養（３７”ｃ，２日間培養）イ）表面の
生育　　　　　なし ロ）濁　度　　　　　　　やや濁る ハ）沈　殿　　　　　　　粉末状 二）ガス発生　　　　　　むし ホ）培地の着色　　　　　なし ■　肉汁寒天穿刺培養（３７℃．２日間培養）イ）生育
の場所　　　　　上下一様 ロ）コロニーの形状　　　乳頭状 ■肉汁ゼラチン穿刺培養（２０’Ｃ，１４日間培養）イ
）ゼラチン液化　　　　なし ■　リトマスミルク（３７℃，７日間培養）イ）反　応
　　　　　　　　ＢｃＰを青色に、リトマスを青紫色に
する なし ロ７凝固、液化 （ｃ）　　生理学的性質 ■　硝酸塩の還元 ■　脱窒反応 ■　ＭＲテスト ■　ＶＲテスト ■　インドールの生或 ■　硫化水素の生成 ■　デンブンの加水分解 ■　クエン酸の利用 ■　無機窒素源の利用 ［相］　色素の生成 ■　ウレアーゼ ■　オキシダーゼ ［相］　カタラーゼ ■　生育の範囲 ＋（Ｗ） ＋ アンモニア態のみ利用 緑黄色水溶性蛍光色素生成 ・ト ＋ ｐＨ　５〜９，５ 温度　１０〜４３℃ ［相］　酸素に対する態度　　　好気性［相］　０−Ｆ
テスト　　　　　　０ ■　糖類からの酸及びガスの生成の有無酸　　　ガス ＋１）　　Ｌ−アラピノース　　　＋ （２｝Ｄ−キシロース　　　＋ （３）Ｄ−グルコース　　　＋ （４）Ｄ−マンノース　　　＋ （５）Ｄ−フラクトース （６）Ｄ−ガラクトース　　＋ ｛７｝麦芽糖 （８）ショ糖 （９）乳　糖 ａ呻　トレハロース ０１）　　Ｄ−ソルビット　　　ー ０３　　Ｄ−マンニット Ｑ３　　イノシット ０４　　グリセリン αタ　デンプン ［相］　アルギニン　ジヒドロラーゼ　＋（Ａｒｇｉｎ
ｉｎｅ　Ｄｉｈｙｄｒｏｌａｓｅ）［相］　炭素源の利
用（３７°Ｃ，　　１〜７日間培養）利用するもの；Ｄ
−グルコース．Ｌ−バリン，β−Ｌ−アラ二ン， Ｌ−アルギニン 利用しないもの；　トレハロース，メソイノシトールゲ
ラニオール バージイズ・マニアル・オプ・デターミネイティブ●バ
クテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏ
ｆＤｅｔｅｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇ
ｙ）、８版（１９７４年）の記載に従って帰属同定を行
なうと本菌はシュードモナス属の特徴を有する。

更に細胞にポリーβ−ヒドロキシ酪酸（ｐｏｌｙβ一ｈ
ｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ）の蓄積がないこと。蛍
光性色素を生成丁ること。アルギニン・ジヒドロラーゼ
（ａｒｇｉｎｉｎｅ　ｄｉｈｙｄｒｏｌａｓｅ）が存在
することからシュードモナス属のエアロギノサ種（Ｐ．
　ａｅｒｏｇｉｎｏｓａ）、プチダ種（Ｐ．ｐｕｔｌａ
）、７０レセンｓ（Ｐ，　ｆｌｕｏｒｅｓｃ−二）、ク
ロラフィス種（Ｐ．　ｃｈｌｏｒａｐｈｉｓ）、オウレ
オファシエンス種（Ｐ．　ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）
のいずれかに該当することがわかった。

そして生育温度範囲はプチダ種のそれよりも高くエアロ
ギノサ種に近いものを示すが、硝酸塩を還元しないこと
。ゲラニオール，イノシット及びトレハロースを資化せ
ず、バリン及びβ−アラニンを資化することからブチダ
種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａ）の変種と同
定した。

本発明の新規微生物菌株、シュードモナス・プチダ（Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ト星懸）　Ｔ　Ｓ　−　１　５
　０　０　１は工業技術院微生物工業技術研究所に寄託
されている（微工研条寄第１５９号）。

この微生物を培養するための培地としては、炭素源．窒
素源，有機栄養源，無機栄養源などを含む通常の栄養培
地が使用できる。

炭素源としては、グルコース，シュクロース．糖蜜等の
炭水化物ならびに酒石酸，フマル酸，マレイン酸．リン
ゴ酸等の有機酸及びその塩類を、窒素源としては通常の
醗酵に用いられる硫酸アンモニウム，塩化アンモニウム
，アンモニア，リン酸アンモニウム，硝酸アンモニウム
等の無機窒素化合物及び尿素，コーン・スティープ・リ
カーカゼイン，ペプトン，酵母エキス，肉エキスなどの
有機窒素化合物を用いることができる。

その他無機栄養源としては、例えば、カルシウム塩，マ
グネシウム塩，カリウム塩，リン酸塩，鉱塩．マンガン
塩．亜鉛塩，銅塩々どが用いられる。

この微生物の培養は慣用の方法で行なうことができる。

通常、温度約２０ないし約４０℃、好まし《は約２５な
いし約５８℃で、ｐＨ約５　ｆｇいし約９、好ましくは
約５．５ないし約７５で、振と５，通気攪拌などの手段
により好気的に行なわれる。

なお、培養に当って、培地中にα−ＡＰＦ．，フェニル
アラニン低級アルキルエステル等を少量添加しておくこ
とによって得られる微生物の培養物又はその処理物のα
一ＡＰＥ生産能を高めることができる。

本発明の新規微生物菌株、シュードモナス・ブチダＴＳ
−１５００１の培養物又はそれらの処理物は、フマル酸
、アンモニア及びＬ−フエニルアラニン低級アルキルエ
ステルと接触させることによってα一ＡＰＥを生或させ
ることができる。

本発明の新規微生物菌株の培養物又はその処理物とはこ
の微生物を培養して得られた培養液、この培養液等から
採取した菌体、これらを処理して得た洗浄菌体、乾燥菌
体、菌体破砕物、自己消化等による菌体消化物、菌体の
超音波処理物、その他の溶菌生戒物又はこれらを固定化
したものなどを云う。また、これらの培養物から得られ
た酵素蛋白質区分も含むものである。

培養液からの菌体の分離．得られた菌体の処理等は慣用
の方法で容易に行なうことができる。

本発明の新規微生物菌株の培養物又はその処理物を用い
てα一ＡＰＥを生成させる反応は以下の様な反応式で説
明できるものと考えられる（式中Ｒは低級アルキル基を
表わす）。

｝｛００Ｃ−Ｃ！−Ｈ 一一→　ＨＯＯ（！−Ｃ！Ｈ２−ＣＨ−　ＣＯＮＨ−（
！Ｈ−　ＧＯＯＲここで用いる、フマル酸、アンモニア
及びＬ−フエニルアラニン低級アルキルエステルは、ソ
れぞれ遊離の形のものであってもよいし、それぞれの塩
の形のものであってもよい。フマル酸に対するアンモニ
アの量比は通常当量比で、前者１に対して後者約０５な
いし約１０程度、好ましくは約１々いし約５である。従
って、実際的にはこの両原料としてフマル酸アンモニウ
ム（フマル酸水素アンモニウム又はフマル酸ニアンモニ
ウム）を用いるのが便利である。

本発明の微生物の培養物又はその処理物を、フマル酸，
アンモニア及びＬ−フエニルアラニン低級アルキルエス
テルと接触させる際の濃度には格別の制限はないが、フ
マル酸及びＬ−フエニルアラニン低級アルキルエステル
の濃度は、通常、約１重ｔ％ないし溶解度の許す範囲、
好ましくは約５重量％ないし約４０重量％程度である。

本発明の微生物の培養物又はその処理物の使用量にも格
別の制限は々いが、これらは通常モル濃度でより低い濃
度の基質１モル当り、湿菌重量で約１０２ｋいし約１　
０　０　Ｏ　ｆ、好ましくは約５０２ないし約５００２
の菌体に相当する培養物又は処理物を用いる。

この反応の方法の反応温度は通常約１０℃ないし約５０
℃、好ましくは約２５℃々いし約４０℃である。また、
反応液の液性は、ｐＨ約４ないし約７、好ましくは約５
ないし約６である。従ってこの調節のために緩衝剤，酸
又は塩基等を適当に添加してよい。

反応時間は何ら限定的でないが、通常約１時間ないし約
４０時間、好ましくは約１０時間ないし約２０時間程度
が便利である。

本反応で用いるＬ−７ェニルアラニン低級アルキルエス
テルの低級アルキル基は、メチル基，エチル基，イノプ
ロビル基などの基である。

フェニルアラニン低級アルキルエステルのＤ−体は利用
されず、また反応に関与しないので、そのＬ一体に代え
てラセミ体を用いてもよい。

生或したα−ＡＰＩは公知の分離精製手段により分離精
製することができる。例えば、反応液に菌体等の固形分
を含むときは、遠心分離，Ｆ過等によりこれを分離した
のち、必要に応じて除蛋白等の処理を行ない、慣用σノ
カラムクロマトグラフィ，薄層クロマトグラフィー，晶
析，減圧下での乾燥等の分離精製手段によりα−ＡＰＦ
ｉを精製単離することができる。

本発明の新規微生物菌株の培養物又はその処理物の利用
によって、Ｌ−アスパラギン酸や、そのＮ一保護体の代
りに、より容易に得られ、かつより経済的なフマル酸を
用いて、直ちにα一ＡＰＥを製造することができる。ま
た生化学反応を利用するので、原料としてラセミ体を用
いてもα−ＡｐｇのＬＬ一体のみを選択的に製造するこ
とができる。また、β一ＡＰＨの副生がない。

以下、本発明の新規微生物菌株の利用例を示す。

カリウム０１％，リン酸１水素２カリウム０１％，硫酸
マグネシウム・７水塩ＣＬＯ５％，硫酸第２鉄・７水塩
（１０１％，塩化マンガンＣＬＯ１％，塩化ナトリウム
０．０１％及び残部水からなる培地（ｐＨｓ．ｓ）ｉ．
ｏｚを２ｔ容ミニジャー型醗酵槽に入れ、１２０℃．１
５分間滅菌馨行なった。

これにこれと同一組成の培地（ｐＨ５．５）に７ュード
モナス　プチダＴＳ−１５００１を５７℃で１６時間培
養して得た前培養液５０−を接種し、培養期間中ｐＨ５
．５〜６．０を維持するように２Ｎ−　Ｈａｔ水溶液，
２Ｎ−ＮａＯＨ水溶液を添加しながら培養温度３７℃，
攪拌器回転数５００ｒｐｍ，通気量１ｔ空気／分の条件
下で通気攪拌培養を行なった。１６時間培養後、得られ
た培養液のうち、その５００−を遠心分離して菌体を集
め（湿潤菌体量５９）、これを１／５０Ｍリン酸塩緩衝
液（　ｐ｝｛５．５）２５ｍに！？ｌ！Ｌた。この懸濁
液をフマル酸水素アンモニウム五５？，Ｌ−７ェニルア
ラニンメチルエステル４．５２を含む水溶液２５−に加
え、振とうしながら３７°Ｃで１６時間反応を行なった
。

反応了終後、反応液を１５°Ｃ，　　１　０，０　０　
０　ｒｐｍで３０分間遠心分離して菌体な除いた。得ら
れた上清液を水：エタノール（容量比８０：２０）を溶
離液とするカラムクロマトグラフィー（充填剤トヨパー
ル５５Ｆ　　商標、東洋曹達工業■製）により分画を行
なった。α−Ｌ−アスパルチルーＬ７エニルアラニンメ
チルエステルに相当する分画区分を減圧下で濃縮を行な
い白色粉末５０ηを得た。このものの元素分析値及び物
理化学的性質は以下の通りであった。

Ｃ　　　５７７０　　　　　　　　　　５７．１４Ｈ　
　　　６．２０　　　　　　　　　　　　６．１２Ｎ　
　　１０．０５　　　　　　　　　　　９．５２融点：
２３５〜２３６℃で分解した。

比旋光度：〔α〕早　＋３２．０（０＝１．０，酢酸）
アミノ基をトリフロロアセチル化、カルポキシル基をメ
チル化したものの分子量は４０４であった。

また、これをＬ−７ェニルアラニルーＬ−フェニルアラ
ニン，Ｌ−７ェニルアラニルーＬ−フェニルアラニ／メ
チルエステル，ジケトビベラジン，Ｌ−フェニルアラニ
ン．Ｌ−フェニルアラニ／メチルエステル，Ｌ−アスパ
ラギン酸，Ｌ−アスパルチルーＬ−７ェニルアラニン，
Ｌ−アスパルチルーＩ，−７スバ−ｙ　キン酸，α一Ｌ
−アスパルチルーＬ−フェニルアラニンメチルエステル
．β−Ｌ−アスバルチルーＬ−フエニルアラニンヲ標準
物質として薄層クロマトグラフィー，高速液体クロマト
グラフィー及びアミノ酸分析計で分析を行なった。更に
塩酸メタノールによるメチル化及びトリフロ口アセテー
トメチルエステルによるトリフロロアセチル化処理を行
なった試料のガスクロマトグラフィーならびにガスクロ
マトグラフィー・マススペクトルグラフィー分析により
これがα一Ｌ−アスパルチルーＬ−７エニルアラニンメ
チルエステルであることを同定確認した。

例２ ゾユードモナス　プチダＴＳ−１　５００　１を実施例
１と同一組成の培地に同一条件で培養した。

得られた培養液のうち、その５００ｒｎｔから遠心分離
により菌体な集め（湿潤菌体量５　Ｆ　）　、１／５０
Ｍ　ＩＪン酸塩緩衝液２５−に懸濁した。こうして得た
菌体懸濁液を５℃で１５分間超音波処理して菌休を破砕
した。破砕液を５℃，１０，０００ｒｐｍで１５分間遠
心分離して得た上清液なフマル酸水素アンモニウム五〇
？及びＬ−フェニルアラニンメチルエステル４．５？を
含む水溶液２５−に加え、振とうしｋがら３７℃で１６
時間反応を行なった。

以下実施例１と同嘩に処ηを行々い、Ｌ−アスパルチル
ーＬ−７ェニルアラニンメチルエステルσノ白色粉末３
０ηを得た。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）シュードモナス・プチダＴＳ−１５００１（微工
   研条寄第１５９号）。