JPH0144198B2 - - Google Patents
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- JPH0144198B2 JPH0144198B2 JP57060381A JP6038182A JPH0144198B2 JP H0144198 B2 JPH0144198 B2 JP H0144198B2 JP 57060381 A JP57060381 A JP 57060381A JP 6038182 A JP6038182 A JP 6038182A JP H0144198 B2 JPH0144198 B2 JP H0144198B2
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K4/00—Peptides having up to 20 amino acids in an undefined or only partially defined sequence; Derivatives thereof
- C07K4/04—Peptides having up to 20 amino acids in an undefined or only partially defined sequence; Derivatives thereof from bacteria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/12—Antihypertensives
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/99—Enzyme inactivation by chemical treatment
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は新規なアンジオテンシン変隔酵素阻
害物質IS83に関する。
害物質IS83に関する。
アンジオテンシンはアンジオテンシン変換
酵素によつてアンジオテンシンに変えられる。
アンジオテンシンは血圧上昇活性を有する物質
である。従つてアンジオテンシン変換酵素阻害
剤は血圧降下剤として有用である。
酵素によつてアンジオテンシンに変えられる。
アンジオテンシンは血圧上昇活性を有する物質
である。従つてアンジオテンシン変換酵素阻害
剤は血圧降下剤として有用である。
本発明は新規アンジオテンシン変換酵素阻害
物質の検索を目的として広く微生物の培養物を検
討した結果、ストレプトミセス属
（Streptomyces sp.）に属する放線菌がアンジオ
テンシン変換酵素を強く阻害する新規なアンジ
オテンシン変換酵素阻害物質IS83を生産すると
いう知見に基づいて完成されたものであり、その
目的とするところは新規なアンジオテンシン変
換酵素阻害剤IS83を提供するにある。
物質の検索を目的として広く微生物の培養物を検
討した結果、ストレプトミセス属
（Streptomyces sp.）に属する放線菌がアンジオ
テンシン変換酵素を強く阻害する新規なアンジ
オテンシン変換酵素阻害物質IS83を生産すると
いう知見に基づいて完成されたものであり、その
目的とするところは新規なアンジオテンシン変
換酵素阻害剤IS83を提供するにある。
本発明に使用する微生物はアンジオテンシン
変換酵素の阻害物質IS83物質の生産能を有するも
のであり、ストレプトミセス属に属する放線菌で
ある。その１例として本発明者らが埼玉県下の土
壌より分離たストレプトミセス・エスピーNo.
1647P−２株を挙げることができる。本菌株は、
名称、「ストレプトミセス・エスピー
（Streptomyces sp）No.1647−P2」、微生物寄託番
号「微工研菌寄第6343号」として工業技術院微生
物工業技術研究所に寄託されており、次のようう
な菌学的性状を有する。
変換酵素の阻害物質IS83物質の生産能を有するも
のであり、ストレプトミセス属に属する放線菌で
ある。その１例として本発明者らが埼玉県下の土
壌より分離たストレプトミセス・エスピーNo.
1647P−２株を挙げることができる。本菌株は、
名称、「ストレプトミセス・エスピー
（Streptomyces sp）No.1647−P2」、微生物寄託番
号「微工研菌寄第6343号」として工業技術院微生
物工業技術研究所に寄託されており、次のようう
な菌学的性状を有する。
(1) 形態
基生菌糸はよく分枝し、通常基生菌糸の分断
は認められない。基生菌糸から気菌糸が伸長
し、その主軸より単純分枝して胞子柄を形成す
る。その先端は曲状でまれに開環状のあるいは
不規則らせん状を呈する。胞子は３〜10コ連鎖
し、胞子表面は平滑である。胞子の大きさは
0.5〜0.8×1.0〜1.5ミクロンで楕円型あるいは
卵型である。鞭毛胞子、胞子のう、菌核および
車軸分枝は認められない。
は認められない。基生菌糸から気菌糸が伸長
し、その主軸より単純分枝して胞子柄を形成す
る。その先端は曲状でまれに開環状のあるいは
不規則らせん状を呈する。胞子は３〜10コ連鎖
し、胞子表面は平滑である。胞子の大きさは
0.5〜0.8×1.0〜1.5ミクロンで楕円型あるいは
卵型である。鞭毛胞子、胞子のう、菌核および
車軸分枝は認められない。
(2) 各種培地における生育状態
シユークロース・硝酸塩寒天培地
発 育（Ｇ）：貧弱、無色
気菌糸（AM）：貧弱、白色
裏 面（Ｒ）：無色
可溶性色素（SP）：なし
グルコース・アスパラギン寒天培地
Ｇ：良好、帯黄オレンジ
AM：中程度、淡黄色
Ｒ：強い帯黄オレンジ
SP：なし
グリセリン・アスパラギン寒天培地
Ｇ：良好、黄色
AM：中程度、淡黄色
Ｒ：強い黄色
SP：なし
スターチ・無機塩寒天培地
Ｇ：良好、帯黄オレンジ
AM：中程度、淡黄色
Ｒ：強い帯黄オレンジ
SP：なし
チロシン寒天培地
Ｇ：中程度、帯黄ブラウン
AM：形成されない
Ｒ：帯黄ブラウン
SP：なし
栄養寒天培地
Ｇ：中程度、あさい帯黄ブラウン
AM：形成されない
Ｒ：あさい帯黄ブラウン
SP：なし
オートミール寒天培地
Ｇ：良好、黄色
AM：貧弱、白色
Ｒ：強い黄色
SP：なし
イースト麦芽寒天培地
Ｇ：良好、明るい黄色
AM：形成されない
Ｒ：明るい黄色
SP：なし
培養温度は全て28℃である。
(3) 生理学的性質
ア 生育温度範囲：14.5〜38.0℃至適温度27〜
31℃ イ ゼラチンの液化（グルコース・ペプトン・
ゼラチン培地）：陰性 ウ スターチの加水分解（スターチ寒天培
地）：陽性 エ 脱脂乳の凝固：陰性 ペプトン化：陽性 オ 硝酸塩の還元：陽性 カ メラニン様色素の生成 チロシン寒天培地：陰性 ペプトン・イースト鉄寒天培地：陰性 (4) 炭素源の利用性（プリドハム・ゴトリーブ寒
天培地） 利用する：Ｄ−グルコース、Ｌ−アラビノー
ス、Ｄ−キシロース、シユクロースイノシトー
ル 利用しない：Ｄ−フラクトース、Ｌ−ラムノー
ス、Ｄ−マンニトール、ラフイノース (5) 細胞壁成分 細胞壁組成成分中のジアミノピメリン酸は
LL−型であつた。
31℃ イ ゼラチンの液化（グルコース・ペプトン・
ゼラチン培地）：陰性 ウ スターチの加水分解（スターチ寒天培
地）：陽性 エ 脱脂乳の凝固：陰性 ペプトン化：陽性 オ 硝酸塩の還元：陽性 カ メラニン様色素の生成 チロシン寒天培地：陰性 ペプトン・イースト鉄寒天培地：陰性 (4) 炭素源の利用性（プリドハム・ゴトリーブ寒
天培地） 利用する：Ｄ−グルコース、Ｌ−アラビノー
ス、Ｄ−キシロース、シユクロースイノシトー
ル 利用しない：Ｄ−フラクトース、Ｌ−ラムノー
ス、Ｄ−マンニトール、ラフイノース (5) 細胞壁成分 細胞壁組成成分中のジアミノピメリン酸は
LL−型であつた。
以上、No.1647P−２株の性状を要約すると次の
通りになる。細胞壁成分としてLL−ジアミノピ
メリン酸を有し、形態的にはスターチ寒天、グル
コース・アスパラギン寒天等で若干の気菌糸を着
生し、その先端は曲状あるいは不規則らせん状で
単純分枝である。胞子は気菌糸上に３〜10コ連鎖
して着生し、胞子表面は平滑である。鞭毛胞子お
よび胞子のうは観察されない。培養上の諸性質と
しては、基生菌糸は黄色ないしは黄褐色を呈す
る。気菌糸の色調は白色ないしは淡黄色を呈し、
カラーシリーズは“ホワイトシリーズ”ないしは
“イエローシリーズに属するものと考えられる。
メラニン様色素および可溶性色素を産生しない。
通りになる。細胞壁成分としてLL−ジアミノピ
メリン酸を有し、形態的にはスターチ寒天、グル
コース・アスパラギン寒天等で若干の気菌糸を着
生し、その先端は曲状あるいは不規則らせん状で
単純分枝である。胞子は気菌糸上に３〜10コ連鎖
して着生し、胞子表面は平滑である。鞭毛胞子お
よび胞子のうは観察されない。培養上の諸性質と
しては、基生菌糸は黄色ないしは黄褐色を呈す
る。気菌糸の色調は白色ないしは淡黄色を呈し、
カラーシリーズは“ホワイトシリーズ”ないしは
“イエローシリーズに属するものと考えられる。
メラニン様色素および可溶性色素を産生しない。
これらの結果より、No.1647P−２株は明らかに
ストレプトミセス属に属する菌種であるが、本菌
株の気菌糸形成能は貧弱で菌めて劣化し易く、現
時点で種を決定することは困難である。よつて本
菌株をストレプトミセスエスピー
（Streptomyces sp.）と呼ぶことにした。
ストレプトミセス属に属する菌種であるが、本菌
株の気菌糸形成能は貧弱で菌めて劣化し易く、現
時点で種を決定することは困難である。よつて本
菌株をストレプトミセスエスピー
（Streptomyces sp.）と呼ぶことにした。
No.1647−Ｐ−２株は他の放線菌の場合に見られ
るように、その性状が変化しやすく、例えば紫外
線、放射線、高周波、化学薬品等を用いる人工的
変異手段で変異しうるものであり、このようにし
て得られる変異株であつてもアンジオテンシン
変換酵素阻害剤IS83の生産能を有するストレプト
ミセス属に属する菌株は、すべて本発明の方法に
使用することができる。
るように、その性状が変化しやすく、例えば紫外
線、放射線、高周波、化学薬品等を用いる人工的
変異手段で変異しうるものであり、このようにし
て得られる変異株であつてもアンジオテンシン
変換酵素阻害剤IS83の生産能を有するストレプト
ミセス属に属する菌株は、すべて本発明の方法に
使用することができる。
本発明において、IS83生産菌を使用し、IS83を
製造するにあたつて用いられる液体培地は、通常
の微生物の培養培地である。すなわちIS83生産菌
が資化しうる炭素源、蓄素源および無機塩、さら
に必要ならば微量栄養素を含有するものであれば
よい。
製造するにあたつて用いられる液体培地は、通常
の微生物の培養培地である。すなわちIS83生産菌
が資化しうる炭素源、蓄素源および無機塩、さら
に必要ならば微量栄養素を含有するものであれば
よい。
炭素源としては、例えばグルコース、マルトー
ス、シユークロース、可溶性デンプン等の炭水化
物グリセリン等のアルコール類が用いられる。窒
素源としては、例えば硫酸アンモニウム、塩化ア
ンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウ
ム塩、硝酸ナトリウム等の硝酸塩、アミノ酸類、
さらにペプトン、大豆粉、およびこれらの加水分
解物等が用いられる。その他無機塩としては、例
えばリン酸塩が適宜用いられ、また有機微量栄養
源としてはアミノ酸、ビタミンおよびこれらを含
有するペプトン、酵母エキス等が適宜用いられ
る。
ス、シユークロース、可溶性デンプン等の炭水化
物グリセリン等のアルコール類が用いられる。窒
素源としては、例えば硫酸アンモニウム、塩化ア
ンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウ
ム塩、硝酸ナトリウム等の硝酸塩、アミノ酸類、
さらにペプトン、大豆粉、およびこれらの加水分
解物等が用いられる。その他無機塩としては、例
えばリン酸塩が適宜用いられ、また有機微量栄養
源としてはアミノ酸、ビタミンおよびこれらを含
有するペプトン、酵母エキス等が適宜用いられ
る。
培養条件は培地組成その他によつて異なるが、
例えば通常PH５〜10、温度15〜35℃で振盪培養、
通気撹拌培養等、好気的条件下で培養が行われ
る。
例えば通常PH５〜10、温度15〜35℃で振盪培養、
通気撹拌培養等、好気的条件下で培養が行われ
る。
本発明のIC83は、大部分培養液中に存在し、
IS83を単離するには、例えば、ブタノール抽出、
透析およびイオン交換、吸着、分配ゲル過等の
クロマトグラフイーを適宜組み合せて行う。
IS83を単離するには、例えば、ブタノール抽出、
透析およびイオン交換、吸着、分配ゲル過等の
クロマトグラフイーを適宜組み合せて行う。
例えば、菌体を除去した培養液をダイヤイオ
ンHP−30（三菱化成社製）に吸着させ、水で洗
浄した後、塩酸酸性のメタノールで溶出する。活
性画分は、減圧下濃縮し、0.005Mの酢酸緩衝液
（PH4.8）で平衡化した弱性陽イオン交換樹脂、た
とえばCM−セフアデツクスＣ−25（フアルマシ
ア社製）に注ぎ、同緩衝液で溶出を行うことがで
きる。
ンHP−30（三菱化成社製）に吸着させ、水で洗
浄した後、塩酸酸性のメタノールで溶出する。活
性画分は、減圧下濃縮し、0.005Mの酢酸緩衝液
（PH4.8）で平衡化した弱性陽イオン交換樹脂、た
とえばCM−セフアデツクスＣ−25（フアルマシ
ア社製）に注ぎ、同緩衝液で溶出を行うことがで
きる。
IS83を含む溶出物は、ダイヤイオンHP−30に
注ぎ、水で十分洗浄し、メタノールで溶出する。
溶出液は濃縮乾固し、IS83の粗粉末をうることが
できる。弱酸性陽イオン交換樹脂を用いるカラム
クロマトグラフイーは他の多くの不純物との分離
に有効で、CM−セフアデツクスＣ−25を用いる
クロマトグラフイーをくり返すことによつて精製
することができる。純粋なIS83は、カラムとし
て、ラジアルパツクＡ（粒径5μｍ、0.8（i.d.）×10
cm、ウオーターズ社製）を用い、溶離液としてア
セトニトリル−0.05M（NH4）2HPO4（22：78）を
用いる高速液体クロマトグラフイーによつて分取
を行い、IS83を含む溶出液をダイヤイオンHP−
30カラムクロマトグラフイーに吸着し、0.1N塩
酸、さらに水洗後、メタノールで溶出する。溶出
液は濃縮後凍結乾燥することにより白色粉末とし
て得ることができる。
注ぎ、水で十分洗浄し、メタノールで溶出する。
溶出液は濃縮乾固し、IS83の粗粉末をうることが
できる。弱酸性陽イオン交換樹脂を用いるカラム
クロマトグラフイーは他の多くの不純物との分離
に有効で、CM−セフアデツクスＣ−25を用いる
クロマトグラフイーをくり返すことによつて精製
することができる。純粋なIS83は、カラムとし
て、ラジアルパツクＡ（粒径5μｍ、0.8（i.d.）×10
cm、ウオーターズ社製）を用い、溶離液としてア
セトニトリル−0.05M（NH4）2HPO4（22：78）を
用いる高速液体クロマトグラフイーによつて分取
を行い、IS83を含む溶出液をダイヤイオンHP−
30カラムクロマトグラフイーに吸着し、0.1N塩
酸、さらに水洗後、メタノールで溶出する。溶出
液は濃縮後凍結乾燥することにより白色粉末とし
て得ることができる。
以上述べた方法は一例であり、培地組成、培養
条件、IS83の生産量等に応じ、さらに適切な方法
を工夫することができる。例えば、前述の方法の
一部を省略し、反復しもしくは順序を変えて行う
ことは、有効であり、また他の分離法、例えばセ
ルロースを用いるクロマトグラフイーも有効であ
る。
条件、IS83の生産量等に応じ、さらに適切な方法
を工夫することができる。例えば、前述の方法の
一部を省略し、反復しもしくは順序を変えて行う
ことは、有効であり、また他の分離法、例えばセ
ルロースを用いるクロマトグラフイーも有効であ
る。
前述の方法で得たアンジオテンシン変換酵素
阻害剤、IS83は下記の特徴を有している。以下本
発明のIS83の理化学性質を示す。
阻害剤、IS83は下記の特徴を有している。以下本
発明のIS83の理化学性質を示す。
(a) 比旋光度：〔α〕D＝−45.2゜（Ｃ＝0.5％、H2O）
(b) 安定PH範囲：酸性側で安定
(c) 分子量：マツダ型質量分析計を用いたFAB
−マススペクトル（Fast Atom
Bombardment Mass Spectrum）から求めた
分子量は1962であつた。
−マススペクトル（Fast Atom
Bombardment Mass Spectrum）から求めた
分子量は1962であつた。
(d) IR−スペクトル：KBrペレツトを用いて測
定した結果を第１図に示す。
定した結果を第１図に示す。
(e) IS83 1.122mgを水にとかし10mlとした水溶液
で測定したUVスペクトルの結果を第２図に示
す。
で測定したUVスペクトルの結果を第２図に示
す。
(f) 溶剤に対する溶解性：水、メタノールに可
溶、エーテル、アセトンに不溶 (g) 呈色反応：ニンヒドリン反応に陽性。トリフ
エニルテトラゾリウム、α−ナフトール−硫酸
反応に陰性。
溶、エーテル、アセトンに不溶 (g) 呈色反応：ニンヒドリン反応に陽性。トリフ
エニルテトラゾリウム、α−ナフトール−硫酸
反応に陰性。
(h) 外 観：白色粉末
(i) 融 点：240〜260℃（徐々に黒変）
(j) クロマトグラフイーのRf値
(1) セルロースプレート（メルク社製）
（展開溶媒）
ｎ−ブタノール−メタノール−水（20：５：
10） 0.73 ｎ−ブタノール−ピリジン−酢酸−水（15：
10：３：12） 0.70 (2) キーゼルゲル60F254プレート（メルク社
製） （展開溶媒） ｎ・ブタノール・水（20：５：10） 0.31 (k) 構成アミノ酸 IS83はペプチドであり、IS83を常法によつて
6N塩酸を用いて加水分解し、アミノ酸自動分
析計JEOL−5AHでアミノ酸分析を行うことに
よつて、リジン(1)、トリプトフアン(1)、アスパ
ラギン酸(2)、セリン(1)、グルタミン酸(1)、
threo−β−メチルランチオニン(2)、プロリン
(1)、meso−ランチオニン(1)、グリシン(2)、バ
リン(1)、ロイシン(1)、フエニルアラニン(1)、デ
ヒドロアラニン(1)から構成されていることがわ
かつた（カツコ内はモル比をあらわす）。
10） 0.73 ｎ−ブタノール−ピリジン−酢酸−水（15：
10：３：12） 0.70 (2) キーゼルゲル60F254プレート（メルク社
製） （展開溶媒） ｎ・ブタノール・水（20：５：10） 0.31 (k) 構成アミノ酸 IS83はペプチドであり、IS83を常法によつて
6N塩酸を用いて加水分解し、アミノ酸自動分
析計JEOL−5AHでアミノ酸分析を行うことに
よつて、リジン(1)、トリプトフアン(1)、アスパ
ラギン酸(2)、セリン(1)、グルタミン酸(1)、
threo−β−メチルランチオニン(2)、プロリン
(1)、meso−ランチオニン(1)、グリシン(2)、バ
リン(1)、ロイシン(1)、フエニルアラニン(1)、デ
ヒドロアラニン(1)から構成されていることがわ
かつた（カツコ内はモル比をあらわす）。
IS83はアンジオテンシン−変換酵素に対して
阻害活性を有し、サーモライシン、ペプシン、α
−キモトリプシンに対しては阻害活性を示さな
い。IS83の水溶液（7.6μｇ／ml）を用いて阻害活
性を測定した結果は以下の通りであつた。
阻害活性を有し、サーモライシン、ペプシン、α
−キモトリプシンに対しては阻害活性を示さな
い。IS83の水溶液（7.6μｇ／ml）を用いて阻害活
性を測定した結果は以下の通りであつた。
アンジオテンシン変換酵素 100％
サーモライシン ０％
ペプシン ０％
α−キモトリプシン ０％
酸素活性の阻害度の測定法を以下に示す。
0.3Mの塩化ナトリウムを含む0.1Mトリス塩酸緩
衝液（PH8.0）に溶解させた試料0.125mlおよび
0.3Mの塩化ナトリウムを含む0.3Mトリス塩酸緩
衝液（PH8.0）に溶解させた16.0mMP−ニトロベ
ンゾイルグリシルグリシルグリシン0.2mlを混合
して、37℃５分間、あらかじめ温めた後、0.3M
の塩化ナトリウムを含む0.1Mトリス塩酸緩衝液
（PH8.0）に溶解させたアンジオテンシンＩ変換酵
素液0.1mlを混合して37℃で反応させ、その後に
アンモニア水0.2mlを加えて反応を停止する。反
応液はその一定量を高速液体クロマトグラフに導
入し、生じたＰ−ニトロベンゾイルグリシン量
（Is）をＰ−ニトロベンゾイルグリシンの標準品
より得た検量線を用いて定量する。一方試料溶液
の代りに0.3Mのナトリウムを含む0.1Mトリス塩
酸緩衝液（PH8.0）を用い、同様に処理してＰ−
ニトロベンゾイルグリシン量（Ic）を求める。さ
らにアンジオテンシン変換酵素を加えずに同様
の処理を行い、最後に同酵素0.1mlを加えて
HPLCで分析してＰ−ニトロベンゾイルグリシン
量（Ib）を測定する。阻害率は Ic−Is／Ic−Ib×100（％） で算出する。なお、阻害様式はＰ−ニトロベンゾ
イルグリシルグリシンを基質として測定したとき
拮抗阻害であつた（図３）。
0.3Mの塩化ナトリウムを含む0.1Mトリス塩酸緩
衝液（PH8.0）に溶解させた試料0.125mlおよび
0.3Mの塩化ナトリウムを含む0.3Mトリス塩酸緩
衝液（PH8.0）に溶解させた16.0mMP−ニトロベ
ンゾイルグリシルグリシルグリシン0.2mlを混合
して、37℃５分間、あらかじめ温めた後、0.3M
の塩化ナトリウムを含む0.1Mトリス塩酸緩衝液
（PH8.0）に溶解させたアンジオテンシンＩ変換酵
素液0.1mlを混合して37℃で反応させ、その後に
アンモニア水0.2mlを加えて反応を停止する。反
応液はその一定量を高速液体クロマトグラフに導
入し、生じたＰ−ニトロベンゾイルグリシン量
（Is）をＰ−ニトロベンゾイルグリシンの標準品
より得た検量線を用いて定量する。一方試料溶液
の代りに0.3Mのナトリウムを含む0.1Mトリス塩
酸緩衝液（PH8.0）を用い、同様に処理してＰ−
ニトロベンゾイルグリシン量（Ic）を求める。さ
らにアンジオテンシン変換酵素を加えずに同様
の処理を行い、最後に同酵素0.1mlを加えて
HPLCで分析してＰ−ニトロベンゾイルグリシン
量（Ib）を測定する。阻害率は Ic−Is／Ic−Ib×100（％） で算出する。なお、阻害様式はＰ−ニトロベンゾ
イルグリシルグリシンを基質として測定したとき
拮抗阻害であつた（図３）。
下記に本発明の具体的な実施例を示す。
実施例 １
グルコース１％、グリセロール１％、大豆粉１
％、硫酸アンモニウム0.5％、塩化ナトリウム0.4
％、炭酸カルシウム0.4％、酵母エキス0.25％、
肉エキス0.2％、K2HPO40.05％、MgSO40.05％か
らなる培地をPH7.2に調製した後、500mlの三角フ
ラスコにそれぞれ50mlずつ分注し、120℃で20分
間殺菌した。この培地にストレプトミセス・エス
ピーNo.1647−P2の斜面培地よりそれぞれ１白金
耳を接種し、28℃で４日間振盪培養（210rpm）
を行つた。
％、硫酸アンモニウム0.5％、塩化ナトリウム0.4
％、炭酸カルシウム0.4％、酵母エキス0.25％、
肉エキス0.2％、K2HPO40.05％、MgSO40.05％か
らなる培地をPH7.2に調製した後、500mlの三角フ
ラスコにそれぞれ50mlずつ分注し、120℃で20分
間殺菌した。この培地にストレプトミセス・エス
ピーNo.1647−P2の斜面培地よりそれぞれ１白金
耳を接種し、28℃で４日間振盪培養（210rpm）
を行つた。
この培養液600mlをグリセロール３％、カゼイ
ン1.5％、大豆粉0.4％、硫酸アンモニウム0.5％、
炭酸カルシウム0.4％、塩化ナトリウム0.4％、酵
母エキス0.25％、肉エキス0.1％、K2HPO40.05
％、MgSO40.05％からなる培地30の入つた50
容ジヤーフアーメンターに移し、28℃で毎分30
の無菌空気を送り300rpmの回転かきまぜによつ
て本培養を行つた。65時間後、培養をやめ、遠心
分離によつて菌体を除去し、上清22を得た。こ
の培養上清液の200倍希釈液の21μのアンジオ
テンシン変換酵素阻害率は50％であつた。この
培養液をダイヤイオンHP−30（2.4）を詰め
たカラムに通過させた後、水で洗浄し、IS83を塩
酸酸性メタノールで溶出した。IS83を含む約２
のメタノール溶出液を減圧下で濃縮した後、120
c.c.のCM−セフアデツクスＣ−25のH+型を詰め
たカラムに通過させ、水洗した後、0.2Mの塩化
ナトリウム水で活性を溶出した。IS83を含む溶出
液は1.2のダイヤイオンHP−30を用いて上記の
方法で脱塩し、減圧下で濃縮した。得られた粗製
IS83を、0.005Mの酢酸バツフアー（PH5.0）で緩
衝化したCM−セフアデツクスＣ−25（190c.c.）に
注ぎ、水で展開し、活性画分を減圧下で濃縮し
た。さらにCM−セフアデツクスＣ−25カラムに
よる精製操作を２回くり返すことによつてIS83の
粗製品0.69ｇを得た。
ン1.5％、大豆粉0.4％、硫酸アンモニウム0.5％、
炭酸カルシウム0.4％、塩化ナトリウム0.4％、酵
母エキス0.25％、肉エキス0.1％、K2HPO40.05
％、MgSO40.05％からなる培地30の入つた50
容ジヤーフアーメンターに移し、28℃で毎分30
の無菌空気を送り300rpmの回転かきまぜによつ
て本培養を行つた。65時間後、培養をやめ、遠心
分離によつて菌体を除去し、上清22を得た。こ
の培養上清液の200倍希釈液の21μのアンジオ
テンシン変換酵素阻害率は50％であつた。この
培養液をダイヤイオンHP−30（2.4）を詰め
たカラムに通過させた後、水で洗浄し、IS83を塩
酸酸性メタノールで溶出した。IS83を含む約２
のメタノール溶出液を減圧下で濃縮した後、120
c.c.のCM−セフアデツクスＣ−25のH+型を詰め
たカラムに通過させ、水洗した後、0.2Mの塩化
ナトリウム水で活性を溶出した。IS83を含む溶出
液は1.2のダイヤイオンHP−30を用いて上記の
方法で脱塩し、減圧下で濃縮した。得られた粗製
IS83を、0.005Mの酢酸バツフアー（PH5.0）で緩
衝化したCM−セフアデツクスＣ−25（190c.c.）に
注ぎ、水で展開し、活性画分を減圧下で濃縮し
た。さらにCM−セフアデツクスＣ−25カラムに
よる精製操作を２回くり返すことによつてIS83の
粗製品0.69ｇを得た。
実施例 ２
実施例１で得た粗製品を溶離液としてアセトニ
トリル−0.05M（NH4）2HPO4（22：78）を用し、
カラムとしてラジアルパツクＡ（粒径5μｍ、0.8
（id.）×10cm、ウオーターズ社製）を用い高速液
体クロマトグラフで分取を行つた。得られたIS83
を含む溶出液はダイヤイオンHP−30に吸着さ
せ、0.1N塩酸、水で洗浄しメタノールで溶出を
行い、減圧下で濃縮し、凍結乾燥を行うことによ
つて高純度のIS83の白色粉末を得た。収率は70％
であつた。
トリル−0.05M（NH4）2HPO4（22：78）を用し、
カラムとしてラジアルパツクＡ（粒径5μｍ、0.8
（id.）×10cm、ウオーターズ社製）を用い高速液
体クロマトグラフで分取を行つた。得られたIS83
を含む溶出液はダイヤイオンHP−30に吸着さ
せ、0.1N塩酸、水で洗浄しメタノールで溶出を
行い、減圧下で濃縮し、凍結乾燥を行うことによ
つて高純度のIS83の白色粉末を得た。収率は70％
であつた。
第１図はIS83を臭化カリウムに混じて測定した
赤外吸収スペクトルを示し、第２図は溶媒として
水を用いたときのIS83の紫外吸収スペクトルを示
し、第３図はＰ−ニトロベンゾイルグリシルグリ
シンを基質としたときのLineweaver−Burkプロ
ツトを示す。横軸に基質濃度の逆数（mM-1）、
縦軸に反応速度（μM／min）の逆数を示した。
赤外吸収スペクトルを示し、第２図は溶媒として
水を用いたときのIS83の紫外吸収スペクトルを示
し、第３図はＰ−ニトロベンゾイルグリシルグリ
シンを基質としたときのLineweaver−Burkプロ
ツトを示す。横軸に基質濃度の逆数（mM-1）、
縦軸に反応速度（μM／min）の逆数を示した。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 下記(1)〜(7)に示す理化学的性質を有するアン
ジオテンシンＩ変換酵素阻害剤IS83。 (1) 性状：白色粉末 (2) 旋光度：［α］D＝−45.2゜（Ｃ＝0.5％、H2O） (3) 融点：240〜260゜C（除々に黒変） (4) 溶解性： 水、メタノールに可溶、エーテル、アセトン
に不溶。 (5) 呈色反応 ニンヒドリン反応に陽性、トリフエニルテト
ラゾリウム、α−ナフトール−硫酸反応に陰
性。 (6) 分子量：1962（FAB−マススペクトルによ
る。） (7) 構成アミノ酸 リジン、アスパラギン酸、セリン、グルタミ
ン酸、プロリン、グリシン、バリン、ロイシ
ン、フエニルアラニン、トリプトフアンからな
る。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57060381A JPS58177920A (ja) | 1982-04-13 | 1982-04-13 | 酵素阻害剤ｉｓ８３ |
| US06/482,356 US4526866A (en) | 1982-04-13 | 1983-04-05 | Angiotensin I-converting enzyme inhibitor and preparation of the same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57060381A JPS58177920A (ja) | 1982-04-13 | 1982-04-13 | 酵素阻害剤ｉｓ８３ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58177920A JPS58177920A (ja) | 1983-10-18 |
| JPH0144198B2 true JPH0144198B2 (ja) | 1989-09-26 |
Family
ID=13140504
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57060381A Granted JPS58177920A (ja) | 1982-04-13 | 1982-04-13 | 酵素阻害剤ｉｓ８３ |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4526866A (ja) |
| JP (1) | JPS58177920A (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5314807A (en) * | 1991-03-29 | 1994-05-24 | Nippon Gohsei Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha | Method for producing an angiotensin converting enzyme inhibitor-containing composition |
| JP3093378B2 (ja) * | 1991-10-17 | 2000-10-03 | 日本合成化学工業株式会社 | アンギオテンシン変換酵素阻害剤含有組成物の製造方法 |
| JPH05279374A (ja) * | 1992-03-31 | 1993-10-26 | Sawao Murao | スイダトレスチン及びその製造方法 |
| CN115785200B (zh) * | 2020-02-17 | 2026-01-06 | 中国医学科学院医药生物技术研究所 | 一组具有抗病毒活性的肽类化合物奥米克欣b族化合物的应用 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4404282A (en) * | 1982-08-19 | 1983-09-13 | Eli Lilly And Company | Process for enzyme inhibitor |
-
1982
- 1982-04-13 JP JP57060381A patent/JPS58177920A/ja active Granted
-
1983
- 1983-04-05 US US06/482,356 patent/US4526866A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS58177920A (ja) | 1983-10-18 |
| US4526866A (en) | 1985-07-02 |
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