JPS6037986A - イースト菌に除草剤に対する耐性を付与する遺伝子 - Google Patents
イースト菌に除草剤に対する耐性を付与する遺伝子Info
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- JPS6037986A JPS6037986A JP59090307A JP9030784A JPS6037986A JP S6037986 A JPS6037986 A JP S6037986A JP 59090307 A JP59090307 A JP 59090307A JP 9030784 A JP9030784 A JP 9030784A JP S6037986 A JPS6037986 A JP S6037986A
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- herbicide
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、イーストの形質変換後に、イーストの、除草
剤種の生長禁止剤に対する固有の耐性を付与する遺伝子
に関する。更に詳細には、本発明はプラスミドによって
形質変換されたイーストを、該禁止剤に対して内生的に
耐性にするためにそのような遺伝子が挿入されたプラス
ミドに関する。
剤種の生長禁止剤に対する固有の耐性を付与する遺伝子
に関する。更に詳細には、本発明はプラスミドによって
形質変換されたイーストを、該禁止剤に対して内生的に
耐性にするためにそのような遺伝子が挿入されたプラス
ミドに関する。
更に本発明はそのようなプラスミドで形ｆｆ、ｆ換する
ことによって除草剤種の生長踏止剤に対して耐性にした
イーストに関する。更に本発明はこの遺伝子を含むプラ
スミドによって形質変換されたイーストの選択的培養法
に関する。
ことによって除草剤種の生長踏止剤に対して耐性にした
イーストに関する。更に本発明はこの遺伝子を含むプラ
スミドによって形質変換されたイーストの選択的培養法
に関する。
ＤＮＡが形質変換された細胞において複製され且つ子孫
に伝達されるように、微生物を外因的ＤＮＡで形質変換
することによって遺伝子的に再プログラムすることは技
術的に公知である。これらの技術の一般的な利点は、外
因的Ｊ）ＮＡが、形質変換された細胞においてインシュ
リンのような医薬に用いるためのホルモン或いはアミラ
ーゼのような工業に用いるだめの酵素であってよい開業
的に興味深いボリペチドの表現を保証する少くとも１つ
の遺伝子を有する時に、明らかになる。確かに微生物を
形質変換されたままで適当な条件下に培養し、これに興
味あるポリペプチド、即ちポリペプチドが細胞に結合し
たま捷でいるか又は分泌されるかに依イメし７て微生物
それ自体から或いは培養媒体から回収されるポリペプチ
ドを生殖させることが十分である。
に伝達されるように、微生物を外因的ＤＮＡで形質変換
することによって遺伝子的に再プログラムすることは技
術的に公知である。これらの技術の一般的な利点は、外
因的Ｊ）ＮＡが、形質変換された細胞においてインシュ
リンのような医薬に用いるためのホルモン或いはアミラ
ーゼのような工業に用いるだめの酵素であってよい開業
的に興味深いボリペチドの表現を保証する少くとも１つ
の遺伝子を有する時に、明らかになる。確かに微生物を
形質変換されたままで適当な条件下に培養し、これに興
味あるポリペプチド、即ちポリペプチドが細胞に結合し
たま捷でいるか又は分泌されるかに依イメし７て微生物
それ自体から或いは培養媒体から回収されるポリペプチ
ドを生殖させることが十分である。
微生物を形質変換するだめに通常使用される実験室的方
法は、関連する遺伝子のベクトル（ｖｅ−ｃｔｏｒ）
として自動複製プラスミド、即ち宿主細胞においてレプ
リコン（ｒｅｐｌｉｃｏｎ）にするシ−ケンスを含む環
状（ｃｉｒｃｕｌａｒ）ｌ）ＮＡ分子を用いることにあ
る。このプラスミドは少くとも制限部位、即ち制限酵素
（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅｌｃよって特
異的に開裂しうるシーケンスを含有しなければならない
。
法は、関連する遺伝子のベクトル（ｖｅ−ｃｔｏｒ）
として自動複製プラスミド、即ち宿主細胞においてレプ
リコン（ｒｅｐｌｉｃｏｎ）にするシ−ケンスを含む環
状（ｃｉｒｃｕｌａｒ）ｌ）ＮＡ分子を用いることにあ
る。このプラスミドは少くとも制限部位、即ち制限酵素
（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅｌｃよって特
異的に開裂しうるシーケンスを含有しなければならない
。
開裂されたプラスミドが外因的ＤＮＡの制限（ｒｅｓｔ
ｒｉｃｔｉｏｎ）によって或いは試験管内合成によって
得られるＤＮＡフラグメントと一緒に結合している場合
、適当な普通の技術により、外因的ＤＮＡのフラグメン
トが制限部位に挿入されている所謂［混合染色体の（ｃ
ｈｉｍｅｒｉｃｌプラスミドを得ることが可能である。
ｒｉｃｔｉｏｎ）によって或いは試験管内合成によって
得られるＤＮＡフラグメントと一緒に結合している場合
、適当な普通の技術により、外因的ＤＮＡのフラグメン
トが制限部位に挿入されている所謂［混合染色体の（ｃ
ｈｉｍｅｒｉｃｌプラスミドを得ることが可能である。
そのようなプラスミドを含有するＤＮＡ調製物の存在下
に微生物の個体群を培養した後、混合染色体プラスミド
の１つ又はそれ以上を形質変換によって獲得した分枝系
を選別することができる。次いで得られた分枝系の隆起
（ｂａｎｋ）を選別して、本発明の遺伝子によＸつて再
プログラムされたゲノマ（ｇｅｎｏｍａ） ２有する１
つの又はいくつかの分枝系を同定する。
に微生物の個体群を培養した後、混合染色体プラスミド
の１つ又はそれ以上を形質変換によって獲得した分枝系
を選別することができる。次いで得られた分枝系の隆起
（ｂａｎｋ）を選別して、本発明の遺伝子によＸつて再
プログラムされたゲノマ（ｇｅｎｏｍａ） ２有する１
つの又はいくつかの分枝系を同定する。
これらの分枝糸は、指示剤又は選択的媒体上での培養に
よって容易に示すことのできる新しい表現型特徴を有す
るから或いは遺伝子操索の補助となるマレイン酸のよう
な特異的分子グローブ或いは対応するポリペプチドに対
する抗体のいずれかを用いることに基づく試験に対して
確実に応答するから、識別することができる。
よって容易に示すことのできる新しい表現型特徴を有す
るから或いは遺伝子操索の補助となるマレイン酸のよう
な特異的分子グローブ或いは対応するポリペプチドに対
する抗体のいずれかを用いることに基づく試験に対して
確実に応答するから、識別することができる。
分枝系操紫物の同定後、興味あるポリペプチドの最適な
生産を保証する発酵法を開発しなければならない。この
目的を達成するために、普通には２つの補足的方法が適
用される。一方で混合染色体のベクトルを種々な試験管
内増殖に供して、対応する遺伝子の暗号部分に表現を最
良に保証するシーケンスの絹を付与し、他方で形質変換
した微生物の生き残り及び／又は増殖に且つ発酵中に出
現するかも知れない表現型復帰突然変異体の排除に最も
適当である培養条件を選択する。そのような培養条件が
限定された時、発酵法は遺伝子的に安定であり、工業的
規模に移すことができる。
生産を保証する発酵法を開発しなければならない。この
目的を達成するために、普通には２つの補足的方法が適
用される。一方で混合染色体のベクトルを種々な試験管
内増殖に供して、対応する遺伝子の暗号部分に表現を最
良に保証するシーケンスの絹を付与し、他方で形質変換
した微生物の生き残り及び／又は増殖に且つ発酵中に出
現するかも知れない表現型復帰突然変異体の排除に最も
適当である培養条件を選択する。そのような培養条件が
限定された時、発酵法は遺伝子的に安定であり、工業的
規模に移すことができる。
上述の方法による微生物の形ｆＪｔ変換は、最もしばし
ば不安定な形質変換を生ずることが知られている。非選
択的培養媒体において培養されている連続（７た世代に
おける表現型復帰突然変異体の細 ２゜胞の生長部分の
出現は該不安定性の結果である。
ば不安定な形質変換を生ずることが知られている。非選
択的培養媒体において培養されている連続（７た世代に
おける表現型復帰突然変異体の細 ２゜胞の生長部分の
出現は該不安定性の結果である。
分析は結果によると、それらがそのプラスミドの殆んど
又はすべて會失なったということを示す（Ｋ、 Ｎａｇ
ａｈａｒｉ、 Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 １３６．
３１２（１９７８）を参照）。この状態は２つの現象
の組合せに由来する。
又はすべて會失なったということを示す（Ｋ、 Ｎａｇ
ａｈａｒｉ、 Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 １３６．
３１２（１９７８）を参照）。この状態は２つの現象
の組合せに由来する。
１、部分的又は全体的に処理した微生物の培養内での自
然な出現。
然な出現。
これｅまいくつかの原因に起因するニ
ー Ｍｕ胞分裂中のプラスミドの統計学的分離；−プラ
スミドの及びクロモンームのａｌＡの解離（口ｎｃｏｕ
ｐｌ ｉｎｇ）ニ ー内生的プラスミドに劣る混合染色プラスミドの４ｊｔ
ｎの欠陥（Ｃ，Ｐ−Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ。
スミドの及びクロモンームのａｌＡの解離（口ｎｃｏｕ
ｐｌ ｉｎｇ）ニ ー内生的プラスミドに劣る混合染色プラスミドの４ｊｔ
ｎの欠陥（Ｃ，Ｐ−Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ。
ｔ）、ｕｒｒ、 ’、［’ｏｐ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
、 Ｉｍｍｕｎｏｌ。
、 Ｉｍｍｕｎｏｌ。
旦を、１１９（１９８２）を参照）。
全体的Ｋ又は部分的にキュア（ｃｕｒｅ）した微生物の
、形質変換が耐える選択的欠点による優先的な増’Ｘｆ
ｉ （Ｋ、 Ｓａｋａｇｕｃｌ＋ ｉ、 Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒｂｒｅｅｄｉｎｇ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃｓ
ｏｆ ａｐｐｌｉｅｄｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍ、
Ｋ、 Ｓａｋａｇｕｃ旧及び 。
、形質変換が耐える選択的欠点による優先的な増’Ｘｆ
ｉ （Ｋ、 Ｓａｋａｇｕｃｌ＋ ｉ、 Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒｂｒｅｅｄｉｎｇ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃｓ
ｏｆ ａｐｐｌｉｅｄｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍ、
Ｋ、 Ｓａｋａｇｕｃ旧及び 。
Ｍ、 ０１ｃａｎ ｉ ｓ ｈ ｉ編、Ａｃａｄｅｍｉ
ｃ Ｐｒｅｓｓ。
ｃ Ｐｒｅｓｓ。
１９８０年１頁。
この欠点は、プラスミドに含まれるＲ（ｒ子の表現が強
くなるＫつれてより重要となり、細胞の経済性のより重
要な部分を必要とする。
くなるＫつれてより重要となり、細胞の経済性のより重
要な部分を必要とする。
この状態は、工業的に有利な発酵法を開発したい研究者
がそのエネルギーを分枝された遺伝子の最大の表現に費
したいから埋）Ｂｌに合わない。
がそのエネルギーを分枝された遺伝子の最大の表現に費
したいから埋）Ｂｌに合わない。
′それ故に、発酵中の微生物の個体群の遺伝的安定性を
制御するために、人為的選択圧力を形質変換体に有利に
行使することが必要である。この圧力は、培養媒体に、
ベクトル−プラスミドが外因的耐性マーカーを含んでい
る対象の生長禁止剤を添加するととＫよって行使するこ
とができる：そのようなｓ合は、形質変換体に−アンピ
ゾリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ） （β−ラクタマーゼ
によシネ活性化）、ネオマイシン（ｎｅｏ＋ｎｙｃｉｎ
） （ホスホリラーゼにより不活性化）、フロラ／フェ
ニコール（アセチラーゼにより不活性化）のような種々
の抗生物質に対する抵抗性を与える原核生物の遺伝的増
殖に対しで用いられるベクトルの殆んどである。
制御するために、人為的選択圧力を形質変換体に有利に
行使することが必要である。この圧力は、培養媒体に、
ベクトル−プラスミドが外因的耐性マーカーを含んでい
る対象の生長禁止剤を添加するととＫよって行使するこ
とができる：そのようなｓ合は、形質変換体に−アンピ
ゾリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ） （β−ラクタマーゼ
によシネ活性化）、ネオマイシン（ｎｅｏ＋ｎｙｃｉｎ
） （ホスホリラーゼにより不活性化）、フロラ／フェ
ニコール（アセチラーゼにより不活性化）のような種々
の抗生物質に対する抵抗性を与える原核生物の遺伝的増
殖に対しで用いられるベクトルの殆んどである。
選択圧力（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）は
、必須代謝物に欠ける人工的培養媒体中で発酵を行なう
ことによっても働かすことができる。この新しい合成法
はベクトルによってもっばら運はれる遺伝子によシ暗号
化された酵素によって保鉦され、宿主のクロモンームに
」：って運ばれる対応する対立遺伝子は突然変異によっ
て不活性化される。この条件は特にイーストに適用され
る。イーストは最も通常に使用されるベクトルを用いる
形質変換によりロイシン（ｐＪＯＢ ２０７を参照）、
トリプトファン（ＹＲｐ７）、又はウラシル（ｐＦ’Ｌ
１）を含まない媒体中における生長の能力を＞ＩＮ’Ｊ
する。
、必須代謝物に欠ける人工的培養媒体中で発酵を行なう
ことによっても働かすことができる。この新しい合成法
はベクトルによってもっばら運はれる遺伝子によシ暗号
化された酵素によって保鉦され、宿主のクロモンームに
」：って運ばれる対応する対立遺伝子は突然変異によっ
て不活性化される。この条件は特にイーストに適用され
る。イーストは最も通常に使用されるベクトルを用いる
形質変換によりロイシン（ｐＪＯＢ ２０７を参照）、
トリプトファン（ＹＲｐ７）、又はウラシル（ｐＦ’Ｌ
１）を含まない媒体中における生長の能力を＞ＩＮ’Ｊ
する。
安定性の制御は、一般に不規（莫の工業的発酵法、例エ
バホルモン又はワクチンのような非常に高い伺加価値を
有する薬学的に興味ある生成物を装造するために開発さ
れたものの確立に対して重要なハンディキャップとなら
ない：主たる費用又は供給問題は最初の選択：ｒ！ｉで
心配する必要がなく、一方人工培養媒体の使用は実際上
の父は経揖的な観点刀１ら第２の選択種で許容される；
いずれかの場合において、必−安とされる量は比較的限
定された１逢である。
バホルモン又はワクチンのような非常に高い伺加価値を
有する薬学的に興味ある生成物を装造するために開発さ
れたものの確立に対して重要なハンディキャップとなら
ない：主たる費用又は供給問題は最初の選択：ｒ！ｉで
心配する必要がなく、一方人工培養媒体の使用は実際上
の父は経揖的な観点刀１ら第２の選択種で許容される；
いずれかの場合において、必−安とされる量は比較的限
定された１逢である。
しかしながら、そのような実ｈｍにたよる必要性は、大
規模な工業的発酵法、例えば土塊の栄養を用いる及び形
質変換されたイーストから生産されるある種の酵素に対
するように、比較的低い付加１ｌｌＩｉ値を有する生成
物を多が、で製造することを意図する方法を１７１メ立
することの見匝しを制限する。この場合、表現型復帰突
然笈ｊ゛４体（形質変換体に対する如き）を合成するこ
とのできない必須代謝物の欠けた人工媒体を使用するこ
とが、これらの媒体のａｊｉｌ ｉ３のｊ＋ｌａ及びそ
の禁止のだめの費用を考えると特に不利である。
規模な工業的発酵法、例えば土塊の栄養を用いる及び形
質変換されたイーストから生産されるある種の酵素に対
するように、比較的低い付加１ｌｌＩｉ値を有する生成
物を多が、で製造することを意図する方法を１７１メ立
することの見匝しを制限する。この場合、表現型復帰突
然笈ｊ゛４体（形質変換体に対する如き）を合成するこ
とのできない必須代謝物の欠けた人工媒体を使用するこ
とが、これらの媒体のａｊｉｌ ｉ３のｊ＋ｌａ及びそ
の禁止のだめの費用を考えると特に不利である。
一方比較的豊富で安価な天然の培＃媒体例えはラクトセ
ラム（ｌａｃｔｏｓｅｒｕｍ）又は糖蜜の使用は、それ
が必須代謝物を比較的高含量で有していて、本来非選択
性であるが故に１ｍ合的に好ましくないことがわかる。
ラム（ｌａｃｔｏｓｅｒｕｍ）又は糖蜜の使用は、それ
が必須代謝物を比較的高含量で有していて、本来非選択
性であるが故に１ｍ合的に好ましくないことがわかる。
後者の媒体における、最近形質変換によってイーストに
外生耐性を与えることのできた対象、即ち抗生物質例え
ばフロラフェニコール又は０４１８として公知のネオマ
イシン詞導体の重要な量での添加（Ｃ，Ｐ、 Ｍｏｌ
ｌｅｎｂｅｒｇ。
外生耐性を与えることのできた対象、即ち抗生物質例え
ばフロラフェニコール又は０４１８として公知のネオマ
イシン詞導体の重要な量での添加（Ｃ，Ｐ、 Ｍｏｌ
ｌｅｎｂｅｒｇ。
ＩＣＮ−ＵＣＬＡ Ｓｙｍｐ−Δ−１ｏ１． Ｃｅ１１
． Ｂｉｏｌ、。
． Ｂｉｏｌ、。
１５．３３５（１９７９）及びＡ、ＪｉｍｅｒＨ及びＪ
。
。
Ｄａｖｆｓ、 Ｎａｔｕｒｅ、 ２８７． ８６９ （
１９８０） ）は、発酵の費用をかなり増大させるばか
りでなく、その優先的な使用が医学又は獣医掌である場
合にはこれらの分子に対して深刻な供耐困畑になること
も含んでいる。更にイーストは、他の真核生物のように
、現在存在する抗生物質の多くに無関係であるととも公
知であるニーｆ：れ故にその＜ｍの禁止剤に対する耐性
の他のマーカーはイーストに対して発見できそうになく
、また安定ｔ４：を効果的に制御するために有利に使用
できる大きな理由もない。
１９８０） ）は、発酵の費用をかなり増大させるばか
りでなく、その優先的な使用が医学又は獣医掌である場
合にはこれらの分子に対して深刻な供耐困畑になること
も含んでいる。更にイーストは、他の真核生物のように
、現在存在する抗生物質の多くに無関係であるととも公
知であるニーｆ：れ故にその＜ｍの禁止剤に対する耐性
の他のマーカーはイーストに対して発見できそうになく
、また安定ｔ４：を効果的に制御するために有利に使用
できる大きな理由もない。
本発明の目的は、遺（ｉ子を含む自動蝮与プラスミドを
用いることによるイースト細胞での形質変侠後に、イー
ストが会成イ１機除革剤種の１つ又はいくつかの生長禁
止剤に対して内生的に剛性になるような該遺伝子を提供
することである。そのような禁止剤は、抗生物質に相対
することであるが、豊富で安抽という利点を有する。本
発明の具体例の１つにおいて、この遺伝子はそのように
形質変押されたイーストに、式 ％式％ 〔式中、Ａｒは芳香族性をイｊする現を含有する基であ
り、 ■モ、は水素、メチル基又はヒドロキシル基を含んでな
る港から選択される請でりり、Ｒ，は゛アルギル、シク
ロアルキル、アルケニル、アルキルアミノ、／クロアル
キルアミノ、アルコギシアルキルアミン及びアルコキシ
基を含んでなる。、ｆｉｌから選択される基である〕 の除草剤に対する剛性を付与する。他の具体・ρりでは
、本発明１はイーストに一般式 〔式中、Ｘがクロル、メトキシ及びメチルチオ基を含ん
でなる群から選択される基であり、そして Ｒ０乃びＲ２はエチルアミノ及び／又はイソプロピルア
ミノ基を含んでなる群から選択′ される基である〕 の除草剤に対する耐性を付与する遺伝子を提供する。
用いることによるイースト細胞での形質変侠後に、イー
ストが会成イ１機除革剤種の１つ又はいくつかの生長禁
止剤に対して内生的に剛性になるような該遺伝子を提供
することである。そのような禁止剤は、抗生物質に相対
することであるが、豊富で安抽という利点を有する。本
発明の具体例の１つにおいて、この遺伝子はそのように
形質変押されたイーストに、式 ％式％ 〔式中、Ａｒは芳香族性をイｊする現を含有する基であ
り、 ■モ、は水素、メチル基又はヒドロキシル基を含んでな
る港から選択される請でりり、Ｒ，は゛アルギル、シク
ロアルキル、アルケニル、アルキルアミノ、／クロアル
キルアミノ、アルコギシアルキルアミン及びアルコキシ
基を含んでなる。、ｆｉｌから選択される基である〕 の除草剤に対する剛性を付与する。他の具体・ρりでは
、本発明１はイーストに一般式 〔式中、Ｘがクロル、メトキシ及びメチルチオ基を含ん
でなる群から選択される基であり、そして Ｒ０乃びＲ２はエチルアミノ及び／又はイソプロピルア
ミノ基を含んでなる群から選択′ される基である〕 の除草剤に対する耐性を付与する遺伝子を提供する。
本発明の他の目的は、遺伝子の子孫への複製及び伝達並
ひに表現を遺伝子に相当する耐性表現型の形質変換され
たイーストにより保証するような条件においてイースト
を形質変換するために使用することのできる上述の如き
遺伝子を含むプラスミドを提供することである。
ひに表現を遺伝子に相当する耐性表現型の形質変換され
たイーストにより保証するような条件においてイースト
を形質変換するために使用することのできる上述の如き
遺伝子を含むプラスミドを提供することである。
本発明の史に他の目的は、上７ｊ３の如きプラスミドを
用いる形％ｌＪ４％によって少くとも１つの合成有機除
絶剤に対して耐（テ１ミに−ｒしめたイーストを侍供す
ることである。
用いる形％ｌＪ４％によって少くとも１つの合成有機除
絶剤に対して耐（テ１ミに−ｒしめたイーストを侍供す
ることである。
本発明の他の目的（ハ、そのようなプラスミドで形タノ
変択５されたイーストの遺伝子的に安定な発酵を工業的
用膜で開発せしめうる方法を提供することである。
変択５されたイーストの遺伝子的に安定な発酵を工業的
用膜で開発せしめうる方法を提供することである。
イーストの生Ｊ＊ ＆ｊ：農業又は園芸栽培における全
体的又は選択的除草剤として現在ｉ史用されている多く
の自戒化学生成物によって禁止されることが予期を越え
て発見された。この事実は、これらの除草剤の殆んどが
偵物の光付成に作用することが知られ、一方イーストが
全体的に光＠Ｈ；５．．１６性に欠けるという点で庚に
角〈べきことである。
体的又は選択的除草剤として現在ｉ史用されている多く
の自戒化学生成物によって禁止されることが予期を越え
て発見された。この事実は、これらの除草剤の殆んどが
偵物の光付成に作用することが知られ、一方イーストが
全体的に光＠Ｈ；５．．１６性に欠けるという点で庚に
角〈べきことである。
これらの除草剤の中で、多く使われるものは一般式
％式％
〔式中、Ａｒが芳香族性の現を含む基である〕によって
化学的に特徴づけられる。この人ｒ基ｄ一般に１つ又は
いくつかの極性置換基例えばノ・ロゲン原子或いはメト
キシ又はトリフルオルメチル基を含んでいてよいベンゼ
ン又はアルキルベンゼン環である。とのＡｒ基は初素現
族例えはベンントリアゾールメはチアジアゾールであっ
てもよい。
化学的に特徴づけられる。この人ｒ基ｄ一般に１つ又は
いくつかの極性置換基例えばノ・ロゲン原子或いはメト
キシ又はトリフルオルメチル基を含んでいてよいベンゼ
ン又はアルキルベンゼン環である。とのＡｒ基は初素現
族例えはベンントリアゾールメはチアジアゾールであっ
てもよい。
この一般式において、Ｒ，は一般に水沫原子であるが、
アルキル又はヒドロキシル基であってもよい。Ｒ，はア
ルキル、ンクロアルキル又はアルケニル基であってよい
。そのような場合は、Ａ、ｒが一般（（置撲されたフェ
ニルであるカルボキンアニリド型の除草剤に対してであ
る。これらの除草剤は先台〕戊に禁止作用を示すことが
公知である。代表的な例は、一般に”Ｐｒｏｐａｎ ｉ
Ｉ ”の一般名で公知の３／、４／−ジクロルグロピ
オアニリドである（Ｃ１，、］ＬＷｎｒｔｈｉｎｇ Ｒ
４、” １７ｈｅ ］’ｅＳ ｔ ｉｃ ｉｄｅＭａｎ
ｕａｌ ” 、 ＢＣＰＣ第 ６ｇＦ１．−、１ ’Ｊ
７ ９”ｌ三、 ４４６頁）。
アルキル又はヒドロキシル基であってもよい。Ｒ，はア
ルキル、ンクロアルキル又はアルケニル基であってよい
。そのような場合は、Ａ、ｒが一般（（置撲されたフェ
ニルであるカルボキンアニリド型の除草剤に対してであ
る。これらの除草剤は先台〕戊に禁止作用を示すことが
公知である。代表的な例は、一般に”Ｐｒｏｐａｎ ｉ
Ｉ ”の一般名で公知の３／、４／−ジクロルグロピ
オアニリドである（Ｃ１，、］ＬＷｎｒｔｈｉｎｇ Ｒ
４、” １７ｈｅ ］’ｅＳ ｔ ｉｃ ｉｄｅＭａｎ
ｕａｌ ” 、 ＢＣＰＣ第 ６ｇＦ１．−、１ ’Ｊ
７ ９”ｌ三、 ４４６頁）。
Ｒ，は除草剤がカーバメート型Ｋｆｉする場合アルコキ
シ型であってもよい。代表的な例は、普通ＩＩ ｓ ｗ
ｅｐｌｌ （同上、５６９頁）と叶１ｆれ月っ作用が光
合成にも及ぶメチル−３，４−ジクロルフェニル；／Ｊ
／＜ メートであるｏ 他ノ例ｒＪ、 ”Ｃ’ｈｌｏ
ｒｐｒｏｐｈａｙｎ”として良く公知のイソプロピル−
Ｎ−（３−クロルフェニル）カーバメートである。
シ型であってもよい。代表的な例は、普通ＩＩ ｓ ｗ
ｅｐｌｌ （同上、５６９頁）と叶１ｆれ月っ作用が光
合成にも及ぶメチル−３，４−ジクロルフェニル；／Ｊ
／＜ メートであるｏ 他ノ例ｒＪ、 ”Ｃ’ｈｌｏ
ｒｐｒｏｐｈａｙｎ”として良く公知のイソプロピル−
Ｎ−（３−クロルフェニル）カーバメートである。
Ｒ２は１１ヨ後にアルキルアミノ、／クロアルキルアミ
ノ、アルコキシアルキンルアミノ、ジアルキルアミノ、
・・・・基であってよい。この’Ｍ ８、除草剤は氷素
由米のものであり、光＠成への禁止作用に対しても良く
知られている。この棟の除草剤の古典的な列は、痔通ｕ
Ｔ） ｉ Ｕ ｒ（ｌ ＩＩ ” （同上２２４頁）
と呼はれる３−（３，４−ジクロルフェニル）−１，１
−ジメチル尿素である。Ａｒが貧慢隼族環である代表的
な化合物の例として、ペンゾチアズロン（同上３７頁）
と呼ばれる１−（２−ベンゾチアゾリル）−３−メチル
尿素及びテブチウロン（同Ｊ： ９４９５ ）と呼ばれ
る１−（５−１ｃｒｔブチル−１，３，４−チアジアゾ
ル−２−イル）−１，３−ジメチル尿素を挙げることが
できる。
ノ、アルコキシアルキンルアミノ、ジアルキルアミノ、
・・・・基であってよい。この’Ｍ ８、除草剤は氷素
由米のものであり、光＠成への禁止作用に対しても良く
知られている。この棟の除草剤の古典的な列は、痔通ｕ
Ｔ） ｉ Ｕ ｒ（ｌ ＩＩ ” （同上２２４頁）
と呼はれる３−（３，４−ジクロルフェニル）−１，１
−ジメチル尿素である。Ａｒが貧慢隼族環である代表的
な化合物の例として、ペンゾチアズロン（同上３７頁）
と呼ばれる１−（２−ベンゾチアゾリル）−３−メチル
尿素及びテブチウロン（同Ｊ： ９４９５ ）と呼ばれ
る１−（５−１ｃｒｔブチル−１，３，４−チアジアゾ
ル−２−イル）−１，３−ジメチル尿素を挙げることが
できる。
イーストの生長に禁止作用することが注目されてきた他
の重安な除草Ｒ１１神は一般式〔式中、Ｘ（・まクロル
、メトキシ又はメチルチオ姑で、１８）つてよく、そし
て ■モ、及びＲ２はエチルアミノ及び、／又はイソプロピ
ルアミノノンである〕 で化学的に特孕つけられる。即ちこれらの除草剤は、光
合成にも作用するＳ −ト’Ｊアジンに由来する。これ
らはかなり商業＋’＋＜ｔに＋［（要である。しばしば
用いられるψくのものの１つは゛’Ａｔｒａｚ団ｅ”（
同一１−２１頁）として公知の２−クロル−４−エチル
アミノ−６−イツプロビルアミノー１，３゜５−トリア
ジンである。他の１つは”Ｓｉｍａｚｉｎｅ”（同−ｆ
＝４７４函）として呼にすれる２−クロル−４、Ｃ）−
ビス（エチルアミン）−１，３，５−トリアジンでめる
。
の重安な除草Ｒ１１神は一般式〔式中、Ｘ（・まクロル
、メトキシ又はメチルチオ姑で、１８）つてよく、そし
て ■モ、及びＲ２はエチルアミノ及び、／又はイソプロピ
ルアミノノンである〕 で化学的に特孕つけられる。即ちこれらの除草剤は、光
合成にも作用するＳ −ト’Ｊアジンに由来する。これ
らはかなり商業＋’＋＜ｔに＋［（要である。しばしば
用いられるψくのものの１つは゛’Ａｔｒａｚ団ｅ”（
同一１−２１頁）として公知の２−クロル−４−エチル
アミノ−６−イツプロビルアミノー１，３゜５−トリア
ジンである。他の１つは”Ｓｉｍａｚｉｎｅ”（同−ｆ
＝４７４函）として呼にすれる２−クロル−４、Ｃ）−
ビス（エチルアミン）−１，３，５−トリアジンでめる
。
上述の一般式に相当しｌシい＋ｌ１４の除革蛸も本発明
に従って使用しうる。代表的な例によれば、ｆｉ’Ｍア
ミトロールと呼ばれる３−アミノ−１，２，４−トリア
ゾールを挙けることができる。この除草剤はカロチノイ
ドの生曾成釦作用することが公知である。
に従って使用しうる。代表的な例によれば、ｆｉ’Ｍア
ミトロールと呼ばれる３−アミノ−１，２，４−トリア
ゾールを挙けることができる。この除草剤はカロチノイ
ドの生曾成釦作用することが公知である。
これらの除草剤のイーストへの作用４の正荷す機構は詳
細に研究されていないけれど、４酊及び吋−吸の双方葡
させるグルコースのような炭素Ｉ２１ｉｉ？Ｌ−包む媒
体中で行なった対照の培養と比較［７て、唯一の炭素源
が呼吸基質、例えばグリセロールでりる媒体中における
イーストの生長に及Ｉチず異なる作用を考λ、ると、で
の作用は多くが呼吸機能に対するものであると考えるこ
とかで芦る。
細に研究されていないけれど、４酊及び吋−吸の双方葡
させるグルコースのような炭素Ｉ２１ｉｉ？Ｌ−包む媒
体中で行なった対照の培養と比較［７て、唯一の炭素源
が呼吸基質、例えばグリセロールでりる媒体中における
イーストの生長に及Ｉチず異なる作用を考λ、ると、で
の作用は多くが呼吸機能に対するものであると考えるこ
とかで芦る。
少くとも１つの場計、除草Ｑｊｌ （Ｄ ｉ ｕ ｒ
ｏｎ ） に対して内生的に耐性であるイースト、即ち
有胆子酔母（Ｓａｃｃｌｌａｒｏｔｎｙｃｅｓ ｒｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ）の朶然変異性体が分離できた（ Ａ、
ｔｖｉ、 ＣＯｌ ｓ ｏｎら、ｌｕ（。
ｏｎ ） に対して内生的に耐性であるイースト、即ち
有胆子酔母（Ｓａｃｃｌｌａｒｏｔｎｙｃｅｓ ｒｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ）の朶然変異性体が分離できた（ Ａ、
ｔｖｉ、 ＣＯｌ ｓ ｏｎら、ｌｕ（。
Ｊ、Ｂｉｏｃｌ＋ｅｍ、７４． ７２１（１９７７）を
参照）。
参照）。
し〃・しながら、対応する逍畝子マーカー（ｇｅ−ｎｅ
ｔｉｃ ｍａｒｋｅｒ）の例外のないミトコンドリアの
位１縦は、形質ｉ Ｊ’９ｊによってイーストに削性表
現型を与えるいずれの試みに対して総合的に不適当にす
る。一方、内生的耐性マーカーは一般的に劣性形質であ
り、本質的に上述の目的における分枝系に対して不適当
であるということが公知である。
ｔｉｃ ｍａｒｋｅｒ）の例外のないミトコンドリアの
位１縦は、形質ｉ Ｊ’９ｊによってイーストに削性表
現型を与えるいずれの試みに対して総合的に不適当にす
る。一方、内生的耐性マーカーは一般的に劣性形質であ
り、本質的に上述の目的における分枝系に対して不適当
であるということが公知である。
このノ、す５則（ｆ２シいずれの場合においてもイース
ト有胞子酵母に当て１はまり（Ｊ、 Ｎ、 ５ｔｒａｔ
ｈｅｒｎ、 ｌＤ、Ｗ。
ト有胞子酵母に当て１はまり（Ｊ、 Ｎ、 ５ｔｒａｔ
ｈｅｒｎ、 ｌＤ、Ｗ。
Ｊｎｎｅｓ及びＪ、 Ｒ，、ｆ（ｒｏａｃｈ［１，１，
Ｆ、、 １３ｒｎａｃｈ。
Ｆ、、 １３ｒｎａｃｈ。
’Ｊ’ｌ＋ｃ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｈｉｎｌｎｇｙ
ｏｆ ｔｈｅ ＹｅａｓｔＳａｃｃｈａｒｏｍｙａｓ
ｃｅｒｖｉｓｉａｅ−Ｌｉｆｅ Ｃｙｃ１６ａｎｄ １
ｎｈｅｒｉ ｔａｎｃｅ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ
ＨａｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８１，７２３ｎ
を参ｔＪ＠ ）、この原則（よイースト有胞子ｈｔ母に
おける内生的耐性の劣）１生形ηマーカーの分枝糸の公
知の一＠せたけ明確に確Ｖさね、それに対し対応する禁
ＩＥ剤（抗生物質トリコダーミン（ｔｒｉｃｈｏｄｅｒ
ｒｎｉｎ） ）への耐性の表現型は形伸震換において表
現でさなかった（Ｃ，Ｐ、 Ｈｏｌ ｌｅｎｂｅｒｇ、
Ｃｕｒｒ、 ＴＯＩ）、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。
ｏｆ ｔｈｅ ＹｅａｓｔＳａｃｃｈａｒｏｍｙａｓ
ｃｅｒｖｉｓｉａｅ−Ｌｉｆｅ Ｃｙｃ１６ａｎｄ １
ｎｈｅｒｉ ｔａｎｃｅ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ
ＨａｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８１，７２３ｎ
を参ｔＪ＠ ）、この原則（よイースト有胞子ｈｔ母に
おける内生的耐性の劣）１生形ηマーカーの分枝糸の公
知の一＠せたけ明確に確Ｖさね、それに対し対応する禁
ＩＥ剤（抗生物質トリコダーミン（ｔｒｉｃｈｏｄｅｒ
ｒｎｉｎ） ）への耐性の表現型は形伸震換において表
現でさなかった（Ｃ，Ｐ、 Ｈｏｌ ｌｅｎｂｅｒｇ、
Ｃｕｒｒ、 ＴＯＩ）、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。
■ｍ＋ｎｕｎｏｌｏ、９６，１１９（１９８２）を参照
）。
）。
今回、上述の如き除草剤伸禁止剤に内生的に耐性であり
、また耐性の表現型の裏づけになる遺伝子マーカーが核
のクロモソーム中の位置する及びそれが準優性形質であ
るという事実によって特徴づけられるイースト有胞子酵
母の突然変異体を分離することができるということが発
見された。これは本発明の重要な観点である。そのよう
な突然変異体は関連する除草剤を含有する培養媒体上で
の古典的な選択法によって得られてきた。
、また耐性の表現型の裏づけになる遺伝子マーカーが核
のクロモソーム中の位置する及びそれが準優性形質であ
るという事実によって特徴づけられるイースト有胞子酵
母の突然変異体を分離することができるということが発
見された。これは本発明の重要な観点である。そのよう
な突然変異体は関連する除草剤を含有する培養媒体上で
の古典的な選択法によって得られてきた。
これらの突然変異体の耐性の現象の研究から、それはそ
の選択を可能にする除草剤に対してばかりで７ｉ＜、１
ｉＪの台成有截除草剤種禁止剤に対しても耐性のあるこ
とが予期を越えて発見された。この特徴は、本発明のＩ
Ｍ有の耐性遺伝子の重要な性質を構成する。
の選択を可能にする除草剤に対してばかりで７ｉ＜、１
ｉＪの台成有截除草剤種禁止剤に対しても耐性のあるこ
とが予期を越えて発見された。この特徴は、本発明のＩ
Ｍ有の耐性遺伝子の重要な性質を構成する。
更にイースト有胞子酵母はその種の遺伝子での形質変換
によシ元の突然変異体と同様の多数の耐性表面型を獲得
できるということが発見された。
によシ元の突然変異体と同様の多数の耐性表面型を獲得
できるということが発見された。
これは本発明の他の重要な観点でるる。
感性のイーストの、本発明の言及する除草剤の少くとも
１つに耐性のあるイーストへの形質変換は、関連する固
有の耐性遺伝子のいずれかを用いて本質的に行なうこと
ができ、イースト有胞子酵母に対して使用しうるいずれ
かの自動袢製ベクトルによって行なうことができる。そ
のような用途に至る公知のベクトルの例として、Ｊ、
Ｐ、 Ｊ３ｅｇｇｓ（ｐ ＪＤＢ ２０７．ｐＪＤＢ
２１９．ｐＪＤＢ ２４８；参照、Ｊ、 Ｄ、 Ｂｅｇ
ｇｓ、 Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ２
、Ｒ，ｖＶｉ ｌ ｌ ｉａｍｓｏｎ編、Ａｃａｄｅ＋
ｎｉｃ Ｐｒｅｓｓ。
１つに耐性のあるイーストへの形質変換は、関連する固
有の耐性遺伝子のいずれかを用いて本質的に行なうこと
ができ、イースト有胞子酵母に対して使用しうるいずれ
かの自動袢製ベクトルによって行なうことができる。そ
のような用途に至る公知のベクトルの例として、Ｊ、
Ｐ、 Ｊ３ｅｇｇｓ（ｐ ＪＤＢ ２０７．ｐＪＤＢ
２１９．ｐＪＤＢ ２４８；参照、Ｊ、 Ｄ、 Ｂｅｇ
ｇｓ、 Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ２
、Ｒ，ｖＶｉ ｌ ｌ ｉａｍｓｏｎ編、Ａｃａｄｅ＋
ｎｉｃ Ｐｒｅｓｓ。
１９８１年、１７５頁）により或いはＣ，Ｐ。
Ｈｏｌ ｌｅｎｂｅｒｇ （ｐＭＰ ７８．９Ｍ８１
： Ｃ，Ｐ。
： Ｃ，Ｐ。
Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ、 Ｃｕｒｒ、 Ｔｏｐ、 Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ。
ｃｒｏｂｉｏｌ。
Ｊｍｍｕｎｏｌ、 ９６． １１９（１９８２）を参照
）或いは））ｈ、 ｌ？’ｏｕｒｎ ｉｅｒら（ヨーロ
ッパ特許’１ｐｊ１第 １１・５６２号）によシ作られ
たものを列挙することができる。
）或いは））ｈ、 ｌ？’ｏｕｒｎ ｉｅｒら（ヨーロ
ッパ特許’１ｐｊ１第 １１・５６２号）によシ作られ
たものを列挙することができる。
本発明による耐性遺伝子が予しめ挿入されたそのような
プラスミドの１つＫよって形質変？慣れたイーストは、
商業的目的のために、例えば表明１が耐性遺伝子に対す
るものと同一のプラスミド中へ挿入された遺伝子によっ
て保証されているポリペプチドの工業的生産のために培
養する仁とができ、これは発酵の遺伝子的安定性を保証
する条件下に且つ安定性を制御するための現在有用な方
法にとって固有の上述の欠点又は障壁を避けつつ行なわ
れる。この目的のために、培養媒体には形質変換によっ
てイーストを耐性にした対象の生長禁止剤の１つを、発
酵中に明１われうる表現型復帰突然変異体と反対に形質
変換体だけが生き残り及び／又は増殖するような濃度で
添加することが十分である。
プラスミドの１つＫよって形質変？慣れたイーストは、
商業的目的のために、例えば表明１が耐性遺伝子に対す
るものと同一のプラスミド中へ挿入された遺伝子によっ
て保証されているポリペプチドの工業的生産のために培
養する仁とができ、これは発酵の遺伝子的安定性を保証
する条件下に且つ安定性を制御するための現在有用な方
法にとって固有の上述の欠点又は障壁を避けつつ行なわ
れる。この目的のために、培養媒体には形質変換によっ
てイーストを耐性にした対象の生長禁止剤の１つを、発
酵中に明１われうる表現型復帰突然変異体と反対に形質
変換体だけが生き残り及び／又は増殖するような濃度で
添加することが十分である。
本発明による遺伝子の１史用の他の特徴及び利点は本発
明の範囲内に入ると考えられる。本発明を更によく例示
するために、これを制限するものではないが、次の実施
例を与える。
明の範囲内に入ると考えられる。本発明を更によく例示
するために、これを制限するものではないが、次の実施
例を与える。
実施例１
除草剤型の生長禁止剤に対して自然に耐性である自然に
面］性であるＤ２７３−１０Ｂ／Ａ２１／ＤＷ＋ｚ（以
下ＤＩ（Ｊヶ、７）と呼はれる突然変異体を、１）ｉｕ
ｒｏｎを１００８Ｍのｆ％＋Ｓ−で添加したグリコール
媒体上での選択によシ有胞子酵−＃：創Ｄ ２７３−１
０Ｂ／Ａ２１から分離した（この種に対する７５μＭの
禁止のしきい値は、ハブロイド並ひ７プロイド細胞に対
して予じめ実験的に決にした）。
面］性であるＤ２７３−１０Ｂ／Ａ２１／ＤＷ＋ｚ（以
下ＤＩ（Ｊヶ、７）と呼はれる突然変異体を、１）ｉｕ
ｒｏｎを１００８Ｍのｆ％＋Ｓ−で添加したグリコール
媒体上での選択によシ有胞子酵−＃：創Ｄ ２７３−１
０Ｂ／Ａ２１から分離した（この種に対する７５μＭの
禁止のしきい値は、ハブロイド並ひ７プロイド細胞に対
して予じめ実験的に決にした）。
該突然変異体のこの耐性マーカーの核局＜’ｈ化を、突
然変異体ＤＩＩＪ２１． 及び感性種間の交叉培養の子
孫への伝達様式によって確認した：四分子の分析ｔまマ
ーカーが典型的にメンデル則である分離に従うことを示
した。該交叉から生ずる異型接合のジグロイドの耐性表
現型の分析は耐性マーカーの準優性形質を示した：禁止
のしきい値は存在する場合１００μＭであり、一方ハプ
ロイド突然変異体は１５０μＭの濃度に耐性になった。
然変異体ＤＩＩＪ２１． 及び感性種間の交叉培養の子
孫への伝達様式によって確認した：四分子の分析ｔまマ
ーカーが典型的にメンデル則である分離に従うことを示
した。該交叉から生ずる異型接合のジグロイドの耐性表
現型の分析は耐性マーカーの準優性形質を示した：禁止
のしきい値は存在する場合１００μＭであり、一方ハプ
ロイド突然変異体は１５０μＭの濃度に耐性になった。
この突然変異体はそれを選別するために用ｂ／こ除ｍ剤
に対してばかりでなく、呼吸禁止型の他の除草剤、例え
ば次のものに対しても耐性のあることがわかった： ａｔｒａｚｉｎｅ （Ｌきい値２ｍＭ、耐性５ｍＭ）ｃ
ｈｌｏｒｐｒｏｐｈａｍ （（、きい値０．３ ｍＭ、
耐性１ｍＭ） ｃｈｌｏｒｏｘｕｒｏｎ ３−４− （４−クロルフェ
ノキシ）フェニル−１，１−ジメチ ル尿素（しきい値０．０１ｍＭ。
に対してばかりでなく、呼吸禁止型の他の除草剤、例え
ば次のものに対しても耐性のあることがわかった： ａｔｒａｚｉｎｅ （Ｌきい値２ｍＭ、耐性５ｍＭ）ｃ
ｈｌｏｒｐｒｏｐｈａｍ （（、きい値０．３ ｍＭ、
耐性１ｍＭ） ｃｈｌｏｒｏｘｕｒｏｎ ３−４− （４−クロルフェ
ノキシ）フェニル−１，１−ジメチ ル尿素（しきい値０．０１ｍＭ。
耐性０゜０５ｍＭ）
ｍｏｎｕｒｏｎ ３ （４−クロルフェニル）−１，１
−ジメチル尿素（しきい 値０．５ ｍＪＶＬ耐性１．５ ｍＭ ）ｍｏｎｏｌ
１ｎｕｒｏｎ ３− （４−クロルフェニル）−１−メ
トキシ−１−メチル尿素 （しきい値１ｍＭ、耐性３ｍＭ） ｄｅｓｍｅｔｒｙｎｅ ２−イソプロピルアミノ−４−
メチルアミノー６−メチルチオ −１，３，５−１リアジン（し きい値１ｍＭ、耐性５ｍＭ） ｒｎｅｔｒｉｂｕｚｉｎｅ ４−アミノ−６−ｔｅｒｔ
−グチル−４，５−ジヒドロ−３−メ チルチオ−１，２，４−）リア ジン−５−オン（しきい値５ｍ Ｍ１耐性５０ ｍＭ ） ｄ １ｎｏｓｅｂ ２−５ｅｅ−ブチル−４，６−シニ
トロフエノール（しきい値 ０．２ｍＭ、耐性０．４ ｍＭ ）。
−ジメチル尿素（しきい 値０．５ ｍＪＶＬ耐性１．５ ｍＭ ）ｍｏｎｏｌ
１ｎｕｒｏｎ ３− （４−クロルフェニル）−１−メ
トキシ−１−メチル尿素 （しきい値１ｍＭ、耐性３ｍＭ） ｄｅｓｍｅｔｒｙｎｅ ２−イソプロピルアミノ−４−
メチルアミノー６−メチルチオ −１，３，５−１リアジン（し きい値１ｍＭ、耐性５ｍＭ） ｒｎｅｔｒｉｂｕｚｉｎｅ ４−アミノ−６−ｔｅｒｔ
−グチル−４，５−ジヒドロ−３−メ チルチオ−１，２，４−）リア ジン−５−オン（しきい値５ｍ Ｍ１耐性５０ ｍＭ ） ｄ １ｎｏｓｅｂ ２−５ｅｅ−ブチル−４，６−シニ
トロフエノール（しきい値 ０．２ｍＭ、耐性０．４ ｍＭ ）。
実施例２
イースト有胞子酵母における内因的耐除草剤性のＤＮＡ
を突然変異体ＤＩＵ２１７” の液体培養物から精製し
、酵素Ｐｓｔｌを用いる制限（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ
）に供した。
を突然変異体ＤＩＵ２１７” の液体培養物から精製し
、酵素Ｐｓｔｌを用いる制限（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ
）に供した。
得られた制限フラグメントを、アンピシリン（ａ＋ｎｐ
ｉｃｉｌｌｉｎ）に対すル耐性マーカーノ部位Ｐｓｔｌ
に制限されたシャトル（ｓｈｕｔｔｌｅ）−グラスミド
ｐＪＩ）Ｂ２０７における試験管内組換えによって挿入
した。大腸菌の種１−ＩＢ １０１をこれらのプラスミ
ドで形質変換し、大腸菌の約１００，０００の分校系を
含んでなる集積の形のもとて突然変異体ＤＩＲＴ、、の
ゲノムの隆起を構成キ＋！：た。これらの各々は１つ又
はそれ以上の混合染色体のプラスミドを含み、アンピシ
リンに感性でテトラシフリンに耐性の表現型を示した。
ｉｃｉｌｌｉｎ）に対すル耐性マーカーノ部位Ｐｓｔｌ
に制限されたシャトル（ｓｈｕｔｔｌｅ）−グラスミド
ｐＪＩ）Ｂ２０７における試験管内組換えによって挿入
した。大腸菌の種１−ＩＢ １０１をこれらのプラスミ
ドで形質変換し、大腸菌の約１００，０００の分校系を
含んでなる集積の形のもとて突然変異体ＤＩＲＴ、、の
ゲノムの隆起を構成キ＋！：た。これらの各々は１つ又
はそれ以上の混合染色体のプラスミドを含み、アンピシ
リンに感性でテトラシフリンに耐性の表現型を示した。
大腸菌の培養は、そこに含有されるすべての混合染色体
のプラスミドを増大させるために、この隆起のすべての
分枝系を接種することによって行なった。Ｄ Ｎ Ａを
その培養物から抽出し、次いでプラスミドをエチジウム
ブロマイドの存在下における塩化セシウムでの等密度遠
心分離により精製した。これらのプラスミドを用いて古
典的方法（んｌ（ｉ ｎ ｎ ｅ ｎら、ｐｒｏｃ、Ｎ
ａｔｌ、Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、。
のプラスミドを増大させるために、この隆起のすべての
分枝系を接種することによって行なった。Ｄ Ｎ Ａを
その培養物から抽出し、次いでプラスミドをエチジウム
ブロマイドの存在下における塩化セシウムでの等密度遠
心分離により精製した。これらのプラスミドを用いて古
典的方法（んｌ（ｉ ｎ ｎ ｅ ｎら、ｐｒｏｃ、Ｎ
ａｔｌ、Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、。
ＵＳＡ、７５，１９２９．１９７８）に従って有胞子酵
母の棟ＡＨ２２を形質変換した。形Ｓ−１変換体をロイ
シンを含まないグルコース媒体上で選別し、Ｄｉｕｒｏ
ｎ耐性の形質変換した分枝系を、１）ｉｕｒｏｎを１０
０μＭの濃度で添加したグリセロール媒体での培養によ
って選択した。
母の棟ＡＨ２２を形質変換した。形Ｓ−１変換体をロイ
シンを含まないグルコース媒体上で選別し、Ｄｉｕｒｏ
ｎ耐性の形質変換した分枝系を、１）ｉｕｒｏｎを１０
０μＭの濃度で添加したグリセロール媒体での培養によ
って選択した。
この方法に従って得られる多くの分枝系の耐性の表現型
は、種ＤＩＵ；、、に由来する耐性マーカーを運ぶ１つ
又はそれ以上の混合染色体のプラスミドの存在に効果的
に基づく。この果実を２つの異なる方法によって検査し
た。
は、種ＤＩＵ；、、に由来する耐性マーカーを運ぶ１つ
又はそれ以上の混合染色体のプラスミドの存在に効果的
に基づく。この果実を２つの異なる方法によって検査し
た。
第一に、集積の各分枝系のキュア（ｃｕｒｉｎｇ）をｌ
（ｏ １１ｅｎｂｅｒｇ法（Ｃ，Ｐ、Ｈｏｌｌｅｎｂｅ
ｒｇ、 Ｃｕｒｒ。
（ｏ １１ｅｎｂｅｒｇ法（Ｃ，Ｐ、Ｈｏｌｌｅｎｂｅ
ｒｇ、 Ｃｕｒｒ。
Ｔｏｐ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、ｉｍｍｕｎｏｌ、９６，
１１９（１９８２）参照）に従って行ない、それらの多
くがロイシンに関して栄養要求性であり及びキュア後に
ｐｉｕｒｏｎに対して感性である表現型に先祖戻りする
Ｃとを検査した：この試験を完全に終ｒしない分枝系を
排除した。一方ＤＮＡ ？ｒ−１この試験に従って保持
された分枝系の１つを接種した液体培養物から抽出し、
このＤＮＡを用いて大腸菌の４’４ＨＢ１０１を形質変
換し、言及したイースト分枝糸のプラスミドの隆起を構
成させた。
１１９（１９８２）参照）に従って行ない、それらの多
くがロイシンに関して栄養要求性であり及びキュア後に
ｐｉｕｒｏｎに対して感性である表現型に先祖戻りする
Ｃとを検査した：この試験を完全に終ｒしない分枝系を
排除した。一方ＤＮＡ ？ｒ−１この試験に従って保持
された分枝系の１つを接種した液体培養物から抽出し、
このＤＮＡを用いて大腸菌の４’４ＨＢ１０１を形質変
換し、言及したイースト分枝糸のプラスミドの隆起を構
成させた。
以下「２次」と呼ぶ大腸菌の得られた分枝系を５０の分
枝糸のｔＪｉにおいて集め、上述した如くプラスミドを
抽出した混合培養物の接種を行なった。
枝糸のｔＪｉにおいて集め、上述した如くプラスミドを
抽出した混合培養物の接種を行なった。
これらのプラスミドを用いて上述したように種ＡＩ−ｆ
２２ｆ：形質変換した；この方法によれば、以下「２次
」と呼ばれるＤｉｕｒｏｎ耐性のイースト分校系の高教
が非常に高い類１犀で得られる。
２２ｆ：形質変換した；この方法によれば、以下「２次
」と呼ばれるＤｉｕｒｏｎ耐性のイースト分校系の高教
が非常に高い類１犀で得られる。
大腸菌の２次隆起において呈示される混合染色体のプラ
スミドのすべての中で、観察された剛性に有効であるプ
ラスミドを発見する採索を行なった。この目的のために
、上述の方法を繰返した。
スミドのすべての中で、観察された剛性に有効であるプ
ラスミドを発見する採索を行なった。この目的のために
、上述の方法を繰返した。
個々の分枝系の各のプラスミドはイーストの２次転換の
試験を遂行する５０のプラスミド群ｆ：栴成し、これを
精製した。これによって多種類のプラスミドが得られる
ことが電気Ｉｉｋ動によって観察された。これは一方で
プラスミドへ挿入されたフラグメントの大きさに関して
、他方でその＊１＋限の様子に関して重要な相違を示し
た。これらの異なるプラスミドは１次のイースト形質Ｋ
ｍのへテロプラスミド特性を示す約１０の明確な種類に
それ自体分類できた；この状態は初期の形質変換事象が
多数回起こることに、また絹換え事象の更なる可能性に
由来する。
試験を遂行する５０のプラスミド群ｆ：栴成し、これを
精製した。これによって多種類のプラスミドが得られる
ことが電気Ｉｉｋ動によって観察された。これは一方で
プラスミドへ挿入されたフラグメントの大きさに関して
、他方でその＊１＋限の様子に関して重要な相違を示し
た。これらの異なるプラスミドは１次のイースト形質Ｋ
ｍのへテロプラスミド特性を示す約１０の明確な種類に
それ自体分類できた；この状態は初期の形質変換事象が
多数回起こることに、また絹換え事象の更なる可能性に
由来する。
これらの種類の各に代表である分校系を同定し、その各
を用いてそれぞれ上述したように精製したプラスミドを
］Ｊした。ｐＤＩＵ２０２と呼ばれるそれらの１つは、
上述の方法に従う種ＡＨ２２の形質変換によって、ロイ
シンに関して原始栄養であシ且つ元の突然変異体ＤＩＵ
”；、、が耐性であるものと同一の除草剤に対して耐性
のある表現型を同時に付与する能力を示した。プラスミ
ドｐＤＩＵ２０２に挿入されたフラグメンＩ・の大きで
は電気泳動で約１．５ｋｂに評価されに０ プラスミドｐＤＩＵ２０２によって変換された大腸菌の
種は、Ｃｅｎｔｒａａ、１ｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒＳｃ
ｌ＋ｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ （Ｑｏｓｔｅｒｓｔ
ｒａａｔ １゜３７４０ＡＧ Ｂａａｒｎ、Ｎｅｔｈｅ
ｒｌａ、ｎｄｓ）に）ＬＭＤ８ ａ、ｏ ７＝ＣＢＳ
３９６゜８３の７１１号で１９８３年５月４日に登録さ
れブで、。
を用いてそれぞれ上述したように精製したプラスミドを
］Ｊした。ｐＤＩＵ２０２と呼ばれるそれらの１つは、
上述の方法に従う種ＡＨ２２の形質変換によって、ロイ
シンに関して原始栄養であシ且つ元の突然変異体ＤＩＵ
”；、、が耐性であるものと同一の除草剤に対して耐性
のある表現型を同時に付与する能力を示した。プラスミ
ドｐＤＩＵ２０２に挿入されたフラグメンＩ・の大きで
は電気泳動で約１．５ｋｂに評価されに０ プラスミドｐＤＩＵ２０２によって変換された大腸菌の
種は、Ｃｅｎｔｒａａ、１ｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒＳｃ
ｌ＋ｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ （Ｑｏｓｔｅｒｓｔ
ｒａａｔ １゜３７４０ＡＧ Ｂａａｒｎ、Ｎｅｔｈｅ
ｒｌａ、ｎｄｓ）に）ＬＭＤ８ ａ、ｏ ７＝ＣＢＳ
３９６゜８３の７１１号で１９８３年５月４日に登録さ
れブで、。
実施例３
除草剤に対して固有の耐性の、ａ嵌子を含むプラスミド
によって転化された・「−スＨｎ胞子酵母の、実施例２
に記述したようにプラスミドｐＤＩＵ２０２を用いて予
じめ形質変換した有胞子酵母の桃Ａｌ１２２の液体培り
物ヲ、Ｄｉｕｒｏｎを１００μＭの最終渋腹で添加した
完全グリセロール媒体１００ｍ１を含有する三角フラス
コ中において一定に攪拌しながら３０℃で生長させた。
によって転化された・「−スＨｎ胞子酵母の、実施例２
に記述したようにプラスミドｐＤＩＵ２０２を用いて予
じめ形質変換した有胞子酵母の桃Ａｌ１２２の液体培り
物ヲ、Ｄｉｕｒｏｎを１００μＭの最終渋腹で添加した
完全グリセロール媒体１００ｍ１を含有する三角フラス
コ中において一定に攪拌しながら３０℃で生長させた。
この培養の指数相（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｐｈａｓ
ｅ） 中、培養物の１部分を取り出し、これを用いて、
こσ）第２の培養がすぐに生長の指数１−にあるような
希釈比で同様の培養媒体に接種した。この操作を：ｉ
ｏ ｏ時間の観察期間中同一の方法に従って繰返した。
ｅ） 中、培養物の１部分を取り出し、これを用いて、
こσ）第２の培養がすぐに生長の指数１−にあるような
希釈比で同様の培養媒体に接種した。この操作を：ｉ
ｏ ｏ時間の観察期間中同一の方法に従って繰返した。
操作は１３２回の連続した阻代に相当した。
これらの連続培養中に、次の連続世代番号に相当する時
点で試料を採取した：０．８．１５．２５．４３．５７
．６８．７８．９１．１１０及び１３２゜それぞれの場
合、分離したコロニーを得るために、固体の完全グリセ
ロール媒体を含むベトリ血中において細胞を広げた。各
の場合無菌ツースービック（ｔｏｏｔｌｌ−ｐｉｃｋ）
法に従い、次の固体媒体を含有した４つのベトリ箱上
で５０のコロニーを準培養した： １、完全グリセロール ２、完全グリセロール及び１）ｉｕｒｏｎ １００μＭ
３、最小グリセロール及びヒスチジン ４、最小グルコース及びヒスチジン これらのベトリ皿の容土で生長したコロニーを、それぞ
れの場合に数えた。すべての場合、５０の準培養したコ
ロニーの各１つが上例定義しだベトリ血の容土で生長し
たことが観察された。これらの結果は、培養の連続した
１３２世代においてロイノン栄養要求性に対しても、ま
たＤｉｕｒｏｎ感性に対しても表現型復帰突然変異体が
現われず、Ｄｉｕｒｏｎの存在のために確実な選択力が
行使されたことを示す。プラスミドｐＤＩＵ ２０２を
用いて形質変換したイーストの個体群の上述した著るし
い遺伝子的安定性は、本発明のプラスミドｏ １’）
Ｔ Ｔｌ ２１１９． ｙ’ｒ：Ｍ−Ｊ−Ｌ Ｙ’ｌｉ
： ｎ Ｊ＋ｕｒｈ白ｕ＋ ｒｗ ｍ フ’ −ｙスミ
ド（イーストエビシーｑル（Ｅｐｉｓｏｍａｌ）プラス
ミド）を用いて転換したイーストに対する過去の技術（
参照： Ｎ、 ＧＵＮＧＥ、 Ａｎｎ、 Ｒｅｖ、 Ｉ
ｎｉ ｃ ｒｏ−ｂｉｏｌ、、３７，２５３．１９８３
）において示された観察に関して、容易に予期されるも
ので６−１なかった。該自動複Ｍプラスミドを用いる場
合に（づ１、例え選択圧力を行使しても（すべて前述し
た事例では、この圧力は負の種類のものであった）、１
Ｍ。
点で試料を採取した：０．８．１５．２５．４３．５７
．６８．７８．９１．１１０及び１３２゜それぞれの場
合、分離したコロニーを得るために、固体の完全グリセ
ロール媒体を含むベトリ血中において細胞を広げた。各
の場合無菌ツースービック（ｔｏｏｔｌｌ−ｐｉｃｋ）
法に従い、次の固体媒体を含有した４つのベトリ箱上
で５０のコロニーを準培養した： １、完全グリセロール ２、完全グリセロール及び１）ｉｕｒｏｎ １００μＭ
３、最小グリセロール及びヒスチジン ４、最小グルコース及びヒスチジン これらのベトリ皿の容土で生長したコロニーを、それぞ
れの場合に数えた。すべての場合、５０の準培養したコ
ロニーの各１つが上例定義しだベトリ血の容土で生長し
たことが観察された。これらの結果は、培養の連続した
１３２世代においてロイノン栄養要求性に対しても、ま
たＤｉｕｒｏｎ感性に対しても表現型復帰突然変異体が
現われず、Ｄｉｕｒｏｎの存在のために確実な選択力が
行使されたことを示す。プラスミドｐＤＩＵ ２０２を
用いて形質変換したイーストの個体群の上述した著るし
い遺伝子的安定性は、本発明のプラスミドｏ １’）
Ｔ Ｔｌ ２１１９． ｙ’ｒ：Ｍ−Ｊ−Ｌ Ｙ’ｌｉ
： ｎ Ｊ＋ｕｒｈ白ｕ＋ ｒｗ ｍ フ’ −ｙスミ
ド（イーストエビシーｑル（Ｅｐｉｓｏｍａｌ）プラス
ミド）を用いて転換したイーストに対する過去の技術（
参照： Ｎ、 ＧＵＮＧＥ、 Ａｎｎ、 Ｒｅｖ、 Ｉ
ｎｉ ｃ ｒｏ−ｂｉｏｌ、、３７，２５３．１９８３
）において示された観察に関して、容易に予期されるも
ので６−１なかった。該自動複Ｍプラスミドを用いる場
合に（づ１、例え選択圧力を行使しても（すべて前述し
た事例では、この圧力は負の種類のものであった）、１
Ｍ。
代当シ約１％又はそれ以上の表現型先祖返りの頻度が観
察されることが良く知られている。例によれは、次のプ
ラスミドを用いて変換したイーストに関する観察を挙げ
ることができる。これらは遺伝子的安定性を示すニ ー ｐｌｅｕ １．４ ｅｔ及び２．６（参照： Ｊ、
Ｂ、 ＨｉｃｋＳ、 Ａ、 Ｈｉｎｎｅｎ及びＧ、
Ｒ。
察されることが良く知られている。例によれは、次のプ
ラスミドを用いて変換したイーストに関する観察を挙げ
ることができる。これらは遺伝子的安定性を示すニ ー ｐｌｅｕ １．４ ｅｔ及び２．６（参照： Ｊ、
Ｂ、 ＨｉｃｋＳ、 Ａ、 Ｈｉｎｎｅｎ及びＧ、
Ｒ。
Ｆｉｎｋ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｓｙｍｐｏ−ｓｉｕｍ ｏｎ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖ
ｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ。
Ｓｙｍｐｏ−ｓｉｕｍ ｏｎ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖ
ｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ。
４３、 １３０５． １９７９）
−ｐＪＤＢｌｌｏ、ｐＪＤＢ２０７．ｐＪＤＢ２０９゜
ｐＪＤＢ２１０及びＪ）ＪＩ）Ｂ２１］（／；照： Ｊ
、 Ｄ、 ＢｅｇｇＳ、 Ａ、 Ｂｅｎｚｏｎ ３ｙｍ
ｐｏ−ｓｉｕｍ、 １．６． ３８３． １９８］、）
−ｐＪ’ＤＢ２１９ （参照： Ｊ、 Ｄ、 ＢｅｇｇＳ、 Ａ、 Ｂｅｒ＋
ｚｏｎ ｓｙｍｐｏ−ｓｉｎｍ、ｉ６． ３８．３．
１９８１ ；Ｃ，Ｐ、Ｈｏｌｌ−ｐｎｌ）ｅｒｇ、 Ｃ
ｕｒｒ、 Ｔｏｐ、Ｍｉｃｒｏｂｉｎｌ。
ｐＪＤＢ２１０及びＪ）ＪＩ）Ｂ２１］（／；照： Ｊ
、 Ｄ、 ＢｅｇｇＳ、 Ａ、 Ｂｅｎｚｏｎ ３ｙｍ
ｐｏ−ｓｉｕｍ、 １．６． ３８３． １９８］、）
−ｐＪ’ＤＢ２１９ （参照： Ｊ、 Ｄ、 ＢｅｇｇＳ、 Ａ、 Ｂｅｒ＋
ｚｏｎ ｓｙｍｐｏ−ｓｉｎｍ、ｉ６． ３８．３．
１９８１ ；Ｃ，Ｐ、Ｈｏｌｌ−ｐｎｌ）ｅｒｇ、 Ｃ
ｕｒｒ、 Ｔｏｐ、Ｍｉｃｒｏｂｉｎｌ。
ｉｍｍｕｎｏｌ、９６，１１９．１９８２ ：Ａ、Ｔｏ
ｈ−Ｅ、 Ｐ、 Ｇｕｅｒｒｙ−Ｋｏｐｅｃｌ（ｏ及び
Ｉｔ、 Ｂ。
ｈ−Ｅ、 Ｐ、 Ｇｕｅｒｒｙ−Ｋｏｐｅｃｌ（ｏ及び
Ｉｔ、 Ｂ。
〜Ｖｉｒｋｎｅｒ、Ｊ、Ｂａｃｌｅｒｉｏｌ、、１４１
． ４１３゜Ｌ ９８０ ； ＩＬ Ｍ、 Ｗａｌｓｌ
ｅｙ、 Ｔ、）、 Ｃ，Ｊ。
． ４１３゜Ｌ ９８０ ； ＩＬ Ｍ、 Ｗａｌｓｌ
ｅｙ、 Ｔ、）、 Ｃ，Ｊ。
Ｇａｒｄｎｅｒ及びＳ、 Ｇ、 ０１１ｖｅｒ、 Ｍｏ
１． Ｇｅｎ。
１． Ｇｅｎ。
Ｇｅｎｅｔ、す４２，３６１．１９８３）Ｇ９
（＠照： Ｃ，Ｇｅｒｂａｕｄ、 Ｐ、 Ｆｏｕｒｎ
ｉｅｒ、 Ｈ１ｆ３１ａｎｃ、Ａり、 Ａｉｇｌｅ、
Ｈ，１ｉｅｓｌｏｔ及び屹Ｑｕｅｒｉｎｅａｕ、Ｇｅｎ
ｅ、５，２３３．１９７９）ＹＥｐ１３ （参照： Ｃ’：、Ｌ、 Ｈｓ ｉ ａｏ及びＪ、 Ｃ
ａｒｌ）ｏｎ。
ｉｅｒ、 Ｈ１ｆ３１ａｎｃ、Ａり、 Ａｉｇｌｅ、
Ｈ，１ｉｅｓｌｏｔ及び屹Ｑｕｅｒｉｎｅａｕ、Ｇｅｎ
ｅ、５，２３３．１９７９）ＹＥｐ１３ （参照： Ｃ’：、Ｌ、 Ｈｓ ｉ ａｏ及びＪ、 Ｃ
ａｒｌ）ｏｎ。
ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７
８゜３７６０．１９８１） ＹＥｐ４ （参照二Ｋ、５ｔｒｕｈｌ、 ｆ）、 ’ｒ、 Ｓｔｉ
ｎｃｈｃｏｍｂ、 Ｓ。
８゜３７６０．１９８１） ＹＥｐ４ （参照二Ｋ、５ｔｒｕｈｌ、 ｆ）、 ’ｒ、 Ｓｔｉ
ｎｃｈｃｏｍｂ、 Ｓ。
Ｓｃｌ＋ｅｒｅｒ及びｌｉ、、 Ｗ、 Ｉ）ａｖｉ ｓ
、 ｐｒｎｃ、 Ｎａｔｌ。
、 ｐｒｎｃ、 Ｎａｔｌ。
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７６．１０３５．１９７９
）プラスミドｐＪＤＢ２０７（Ｄｉｕｒｏｎ Ｋ対する
耐性の原因となる１、 ５ Ｋｂ フラグメントを欠い
ていることを除いてｐＤＩＵ２０２に同一；それ故に培
養媒体中において後者の除草剤を添加することにより正
の選択圧力を維持することは不可能であった）によって
形質変換した対照培養物の不安定性の特性を確認するた
めに、実施例２に記述したようにプラスミドｐＪＤＢ２
０７を用いて予じめ形質変換した有胞子酵母の種ＡＨ２
２の液体培養物を、Ｄｉ ｕｒｏｎを媒体に添７ＪＩＩ
Ｌないこと及び試料を次の世代コ０，１３．２Ｇ、３
８．５１及び６６に相当する時点で採取することを除い
て上述の方法に従ってル！Δ製した。ロインンに関して
栄養袈求性を有する復帰突然変異体は第２６世代（２％
）という早期に観桜され、次の結果から理解できるよう
な増加類Ｉにを示したコ ３８世代後 ４％ ５１世代後 ６％ ６６世代後 ２０％ これらの結果は、本発明の選択的培養が、除草剤に対し
て固有の耐性の；１１１伝子を含むプラスミドを含有す
る細Ｆｉｌｌに好都合な該除草剤で行使される正の選択
圧をＪ−１４いることによって形質変換したイーストの
（＋＝’＝１体群の遣に不安定性を保証する七いうこと
−を明らかに確証する。
）プラスミドｐＪＤＢ２０７（Ｄｉｕｒｏｎ Ｋ対する
耐性の原因となる１、 ５ Ｋｂ フラグメントを欠い
ていることを除いてｐＤＩＵ２０２に同一；それ故に培
養媒体中において後者の除草剤を添加することにより正
の選択圧力を維持することは不可能であった）によって
形質変換した対照培養物の不安定性の特性を確認するた
めに、実施例２に記述したようにプラスミドｐＪＤＢ２
０７を用いて予じめ形質変換した有胞子酵母の種ＡＨ２
２の液体培養物を、Ｄｉ ｕｒｏｎを媒体に添７ＪＩＩ
Ｌないこと及び試料を次の世代コ０，１３．２Ｇ、３
８．５１及び６６に相当する時点で採取することを除い
て上述の方法に従ってル！Δ製した。ロインンに関して
栄養袈求性を有する復帰突然変異体は第２６世代（２％
）という早期に観桜され、次の結果から理解できるよう
な増加類Ｉにを示したコ ３８世代後 ４％ ５１世代後 ６％ ６６世代後 ２０％ これらの結果は、本発明の選択的培養が、除草剤に対し
て固有の耐性の；１１１伝子を含むプラスミドを含有す
る細Ｆｉｌｌに好都合な該除草剤で行使される正の選択
圧をＪ−１４いることによって形質変換したイーストの
（＋＝’＝１体群の遣に不安定性を保証する七いうこと
−を明らかに確証する。
特許出願人 ラボフイナ・ソシエテ・アノニム
第１頁の続き
■Ｉｎｔ、ＣＩ、’ 識別記号
０発 明 者 アニー・エフ・ジエ
イ・パン・ベトセリ
ニーパン・ブレクホー
ベン
庁内整理番号
ベルギー国２６００ベルジェム・メブルークールトマン
ストラーイ９
ストラーイ９
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、 イースト閑の細胞に、該細胞の形質変換によ）、
合成有機除草剤柱の少くとも１つの生長禁止剤に対して
細胞に固有の耐性を付与する遺伝子。 ２、除草剤が一般式 ％式％ 〔式中、Ａｒは芳呑族性を翁する環を含有する基であり
、 Ｒｏは水素、メチル基又はヒドロキシル基を含んでなる
群から選択される基であり、Ｒ２はアルキル、シクロア
ルキル、アルケニル、アルキルアミン、シクロアルキル
アミノ、アルコキシアルキルアミン及びアルコキシ基を
含んでなる群から選択される基である〕 に相当する特許請求の範囲第１項記載の遺伝子。 ３、除草剤のＲ１基がメチルアミン、ジメチルアミノ及
びメトキシメチルアミノ基を含んでなる群から選択され
る喘：許請求の範囲第２項記載の遺伝子。 ４、除草剤のＡｒ基が置換されていてもいなくてもよい
ベンゼン環を含む特許請求の範囲第２ −又は３項記載
のいずれか１つの遺伝子。 ５、除草剤のＡｒ基がハロゲン原子、或いはアルキル、
メトキシ又はトリフルオルメチル蘂を含んでなる群から
選択される置換基を１つ又は２つ含有するフェニル基で
ある特許請求の範囲第４項記載の遺伝子。 ６、除草剤がイソプロピル−Ｎ−（３−クロルフェニル
）カーバメートである特許請求の範囲第２項記載の遺伝
子。 ７、除草剤が３−（３，４−ジクロルフェニル）−１、
１−ジメチル尿素である特許請求の範囲第２項記載の遺
伝子。 ８、除草剤が一般式 〔式中、Ｘがクロル、メトキシ及びメチルチオ基を含ん
でなる群から選択される基であり、そして Ｒ，汲びＲ２はエチルアミノ及び／又はイソプロピルア
ミン基を含んでなる群から選択される基である〕 に相当する特許請求の範囲第１項記載の遺伝子。 ９、除草剤が２−クロル−４−エチルアミノ−６−イソ
プロピルアミン基１，３．’５−４リアジンである特許
請求の範囲第８項記載の遺伝子。 １０、除草剤が２−クロル−４，６−ビス（エチルアミ
ン）−１，３，５−トリアジンである特許請求の範囲第
８項記載の遺伝子。 １１、除草剤が３−アミノ−１，２，４−）リアゾール
である特許請求の範囲第１項記載の遺伝子。 ストに付与する特許請求の範囲第１〜１１項記載のいず
れか１つに記述した遺伝子を含有するプラスミド。 １３、特許請求の範囲第１２項記載のプラスミドを含有
する少くとも１つの合成有機除草剤に耐性のあるイース
ト。 １４、発酵中に個体群の遺伝子の安定性を特徴する特許
請求の範囲第１２項記載のプラスミドによって形質変換
されたイーストの選択的培養法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| LU84795A LU84795A1 (fr) | 1983-05-09 | 1983-05-09 | Genes conferant la resistance de la levure a des herbicides |
| LU84795 | 1983-05-09 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6037986A true JPS6037986A (ja) | 1985-02-27 |
Family
ID=19730093
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59090307A Pending JPS6037986A (ja) | 1983-05-09 | 1984-05-08 | イースト菌に除草剤に対する耐性を付与する遺伝子 |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4745065A (ja) |
| JP (1) | JPS6037986A (ja) |
| BE (1) | BE899607A (ja) |
| CA (1) | CA1225949A (ja) |
| CH (1) | CH670254A5 (ja) |
| DE (1) | DE3416540A1 (ja) |
| FR (1) | FR2545836B1 (ja) |
| GB (1) | GB2139631B (ja) |
| IT (1) | IT1174083B (ja) |
| LU (1) | LU84795A1 (ja) |
| NL (1) | NL8401421A (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| WO1993022422A1 (en) * | 1992-04-27 | 1993-11-11 | Northwestern University | Genetically engineered eukaryotic organism capable of detecting the expression of heterologous ion channels |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| US4535060A (en) * | 1983-01-05 | 1985-08-13 | Calgene, Inc. | Inhibition resistant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthetase, production and use |
| GB8405650D0 (en) * | 1984-03-03 | 1984-04-04 | Standard Telephones Cables Ltd | Ceramic capacitors and dielectric composition |
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-
1984
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- 1984-05-04 FR FR8406934A patent/FR2545836B1/fr not_active Expired
- 1984-05-04 NL NL8401421A patent/NL8401421A/nl not_active Application Discontinuation
- 1984-05-08 CA CA000453764A patent/CA1225949A/en not_active Expired
- 1984-05-08 GB GB08411698A patent/GB2139631B/en not_active Expired
- 1984-05-08 US US06/608,162 patent/US4745065A/en not_active Expired - Fee Related
- 1984-05-08 JP JP59090307A patent/JPS6037986A/ja active Pending
- 1984-05-08 BE BE0/212895A patent/BE899607A/fr not_active IP Right Cessation
- 1984-05-09 IT IT20854/84A patent/IT1174083B/it active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| LU84795A1 (fr) | 1985-03-21 |
| GB2139631B (en) | 1987-01-21 |
| IT8420854A1 (it) | 1985-11-09 |
| FR2545836A1 (fr) | 1984-11-16 |
| IT1174083B (it) | 1987-07-01 |
| CA1225949A (en) | 1987-08-25 |
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| US4745065A (en) | 1988-05-17 |
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| NL8401421A (nl) | 1984-12-03 |
| CH670254A5 (ja) | 1989-05-31 |
| GB8411698D0 (en) | 1984-06-13 |
| IT8420854A0 (it) | 1984-05-09 |
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