JPS6039564A

JPS6039564A - 免疫反応試薬

Info

Publication number: JPS6039564A
Application number: JP14736683A
Authority: JP
Inventors: Yasushi Akiyoshi; 秋吉　泰
Original assignee: Fuji Photo Film Co Ltd
Current assignee: Fujifilm Holdings Corp
Priority date: 1983-08-12
Filing date: 1983-08-12
Publication date: 1985-03-01
Also published as: EP0135129A3; EP0135129A2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は優れた性能を有する免疫反応試薬に関する。更
に詳しくは１判定し易い凝集像を与え。

検出感度や経時安定性の向上したマイクロカプセル試薬
並びにＳ／Ｎ比の高い酵素免疫反応試薬に関する。本発
明はけん化度９０％以下のポリビニルアルコール（以下
ＰＶＡ　）を試薬に含有させると前記の如き効果が得ら
れるという知見に基づいている。

ＰＶＡを感圧紙用マイクロカプセルに使用することは知
られている（特開昭５５−１３２６３１）。

感圧紙用マイクロカプセルにおいてはカッセル壁の緻密
性が重大な問題であシ、緻密化を達成するためにＰＶＡ
の存在下（ＰＶＡは保護コロイドまたは乳化分散助剤と
して用いられる。）でマイクロカプセルが製造される。

しかしこの効果はＰＶＡのけん化度と厳密な相関関係が
あり、けん化度が９５−以上のＰＶＡを使用しなければ
ならない。けん化度が９０％以下のＰＶＡを使用した場
合にはむしろ所期の効果が極端に損われることが指摘さ
れている。

ところが本発明者はマイクロカシセルを免疫反応試薬の
担体として使用する場合には、　ＰＶＡのけん化度が９
０チ以下でなければ目的とする効果が得られないという
知見を得た。またＰＶＡの発現する効果はマイクロカプ
セル試薬のみならず酵素免疫反応試薬についても認めら
れた。

すなわち本発明は免疫学的活性成分を感作したけん化度９０チ以下のＰＶ
Ａ含有担体からなることを特徴とする免疫反応試薬に関
する。

ＰＶＡのけん化度は９０チを上限とする。それ以上のけ
ん化度２例えば前記感圧紙用マイクロカプセルで使用さ
れる９５チ以上では本発明の効果は全く認められず、効
果の有無の境界は劇的でさえある。けん化度の下限は上
限はどクリティカルではないが、入手可能であることや
化合物の安定性。

再現性を考慮すると大体７０チ程度である。これ以下の
けん化度を示すＰＶＡはそれ自体着色しているものが多
くこの点からも免疫反応試薬に使用するのには不適当で
ある。

けん化度９０チ以下のＰＶＡの重合度は大体１００〜４
０００程度の範囲のものがよい。マイクロカプセル試薬
の場合にはどちら刀・といえば１．０００以下の低重合
度のものが、酵素免疫反応試薬の場合には１５００以上
の高重合度のものが適している。

けん化度９０％以下のＰＶＡは最終的に試薬製品に含有
されればよいから、試薬製造工程のどの段階で添加して
もよいが特に以下の段階で添加すると有効である。なお
本発明においてマイクロカプセル試薬とはマイクロタイ
ター法に使用するマイクロカプセルを担体とする試薬を
意味する。

マイクロカプセル試薬の場合：（１）乳化工程における保護コロイドまたは乳化分散助
剤［と　けん化度が９０％よシ大きいポリビニルアルコール（例、　ＰＶＡ−１０
５，けん化度９８チ重合度５０ｏ）とぼリスチレンスル
ホン酸併用９トの添加段階：けん化度が９０チよシ大き
いポリビニルアルコールの１〜２５％（特記しない限シ
重量％。

以下同じ）程度。

（２）乳化後：けん化度が９０チよシ大きいポリビニル
アルコールの５〜２５％程度。

（３）　マイクロカプセル未反応残存物洗浄工程の洗液
として：０．０１〜５チ水溶液として使用する。

（４）感作後：０．０１〜５％水溶液として使用。

（５）　マイクロカプセル試薬を再分散する際の再分散
液として：０．０１〜５チ水溶液として使用。

酵素免疫反応試薬の場合：（１）感作後：０．０１〜５チ水溶液に浸漬。

このようにけん化度９０チ以下のＰＶＡ処理して得られ
た免疫反応試薬は以下に示す効果をもたらす。すなわち
、明瞭できれいに広がった凝集ノやターンを与え、検出
感度を上昇させかつ感作液の経時保存性を向上させ（以
上マイクロカプセル拭動。

またブランクレベルの低下をもたらし感度を上昇させる
（以上酵素免疫反応試薬）。

マイクロカプセル試薬の場合、特に保護コロイドとして
けん化度が９０％より大きいＰＶＡ　、好ましくはけん
化度９５チ以上のＰＶＡ　（例、けん化度９８チ２重合
度５００のＰＶＡ　）及びポリスチレンスルホン酸との
組合せを使用して得られる感作液の経時保存性向上効果
は極めて顕著である。

酵素免疫反応試薬の場合特にけん化度９０％以下のＰＶ
Ａ処理効果の顕著な担体は、テフロン、三酢酸セルロー
ス、二酢酸セルロース、ポリエチレンテレフタレート、
ポリメチルメタクリレート。

ポリサルフォン、　ＡＢＳ樹脂、ポリカーボネート。

ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン。

ナイロン等である。

本発明において担体として使用するマイクロカプセルは
油性物質の芯とこれを包囲する壁材とからなる。その一
般的な製法は例えば近藤朝士著「マイクロカシセル」日
刊工業新聞社刊（昭和４５年）に詳説されている。また
具体的な油性物質や壁材、各種添加剤等については特開
昭５７−１９６６２１　、同５７−１９６６２等に詳細
な記載がある。

抗原又は抗体をマイクロカプセルに感作するには常法に
よシ抗原又は抗体をマイクロカプセル壁に吸着させて行
なう。

マイクロカプセル担体は比重０．８５〜１．２５程度、
平均粒子サイズ０５〜２０μｍ程度、好ましくは１〜１
０μｍの範囲から選択するのが望ましく。

固型分として通常１〜３％程度で使用するのが望ましい
。

以下実施例によシ本発明をさらに詳細に説明する。

実施例１（１）　マイクロカプセルの調製ツインプロピルナフタレン８．４　ｇと塩素化・母ラフ
イン（トヨパラソクス１５０．東洋曹達社製。

塩素化度５０チ）１６．６．９の混合油（比重約１．１
４）に油溶性赤色螢光染料オレオゾール・レッドＢＢ（
０１ｅｏｓｏｌ　Ｒｅｄ　Ｂ　Ｂ住友化学製、Ｃ，Ｉ’
、２６１０５）０２５Ｊを溶解した。得られた溶液に１
．１．１−トリス〔（３−イ・ソファナトー４−メチル
フエニノリカルバモイルオキシメチル〕グロ、やン（バ
ーノックＤ−７５０、大日本インキ社製）１．６Ｎをメ
チルエチルケトン２！ｙに溶解した溶液を混合した。こ
の油性物質液を乳化分散助剤としてけん化度が９０チよ
り大きいポリビニルアルコール（’　ＰＶＡ　−１０５
゜クラレ社製、けん化度９８チ２重合度５００）２ｇと
ポリスチレンスルホン酸の一部ナトリウム塩（ゾロフタ
−・ギャンブル社製、　ＶＥＲ３Ａ　、　ＴＬ−５００
、平均分子量５ｏ万）ＩＩとを水７５ｍ１に溶解した溶
液の中に加えて、攪拌、乳化し、油滴の平均サイズを約
５μｍに調製した。これにヘキサメチレンジアミン２．
６１を水２５ｍ１に溶解した溶液を加え、水７５ｍ１で
希釈した後、７０℃で２時間反応させてマイクロカプセ
ル化を行なった。

マイクロカプセル生成後、生理食塩水で遠沈洗浄して未
反応残存物を除去し、マイクロカプセル粒子濃度が１０
チになるように生理食塩水に分散した。

（２）　マイクロカプセル試薬の調製（１）で調製したマイクロカプセル１゜５ｇを分取し。

生理食塩水８．５コに希釈分散した。市販の抗ヒトアル
ブミン抗体（カッペル社製、ヤギ血ｉ　、　Ｉｇ、Ｇ留
分）を生理食塩水で４０倍に希釈し、その２ＷＬｌをマ
イクロカプセル希釈液２ゴに加え、３７℃で９０分イン
キュベートした。遠心分離後、沈渣を０．１チけん化度
９０％以下のポリビニルアルコール（ＰＶＡ　−２０５
，クラレ社製、けん化度８８チ。

重合度５００）含有０．１５Ｍ！Ｊン酸緩衝生理食塩水
（ＰＢＳ　）　４　ｍｌに分散し、３７℃で４５分イン
キュベートした。次いでＰＢＳで遠沈洗浄を３回繰り返
し、３チウ７血清アルブミン（ＢＳＡ　）含有ＰＢ８２
ｍｌに分散してヒトアル７゛ミン検出試薬とした。

けん化度９０チ以下のＰＶＡ浴を行なわなかった以外は
実施例１（２）と同様にして比較試薬Ａを得た。

実施例１（２）で作成した試薬について以下の操作に従
い、マイクロタイター法を用いて抗原抗体反応を行なっ
た。明らかな凝集を認めた管を陽性とし、陽性を示す血
清の最高希釈倍数をめ、それを抗体価とした。

ヒトアルブミン（力ｙ−２ル社製）１％溶液ヲ１％　Ｂ
ＳＡ含有ＰＢＳで１万倍に希釈したものおよび陰性コン
トロールとして正常ヤギ血清を同じく１チＢＳＡ含有Ｐ
ＢＳで１０倍希釈した。Ｖ字底マイクロプレートの各管
孔に、それぞれを２５μｌずつ採取し、　１　％　ＢＳ
Ａ含有ＰＢＳを用いて２倍間隔に希釈して倍数希釈列を
作成した。

次に実施例１（２）で作成したマイクロカプセル試薬の
２５μｌをドロッパーで採取し、マイクロプレートの被
検液希釈列の管孔に滴下した。マイクロプレートを５分
間振動し、抗原抗体反応を進めた。

室温で３時間静置後、マイクロプレート管底の凝集像を
観察し、第１表の如き抗体価を得た。

比較試薬Ａについても（３）と同じ条件で操作し。

第１表の如き抗体価を得た。

抗ヒトアルブミン抗体をマイクロカプセルに固定後けん
化度９０％以下のＰＶＡ浴を行なった本発明の試薬をマ
イクロタイター法に用いた場合、きれいな、よく広がっ
た凝集像を形成し、凝集判定が極めて容易であシ、検出
感度も比較試薬Ａよシ高かった。これに対し、比較試薬
Ａで得られた凝集像はその周辺がぎざぎざになっておシ
、広がシが小さく凝集か沈降かの判定が困難であった。

（４）経時保存性テスト実施例１（２）で調製した試薬および比較試薬Ａを・ぐ
イアルびんに入れ密栓し、４℃の冷蔵庫に１力月間静置
後、（３）の操作でマイクロタイターテストを行ない、
第２表の如き抗体価を得た。

第　２　表　（１力月経時）第２表から明らかなように本発明による試薬の場合は、
けん化度９０チ以下のＰＶＡ浴を行わなかった比較試薬
Ａの場合にくらべ、冷蔵保存中の感度の低下が少ない。

実施例２実施例１（１）において油性液を乳化する際に用いる高
分子保護コロイド溶液として、ＰＶＡ−１０５２Ｉ、ポ
リスチレンスルホン酸の一部ナトリウム塩Ｉｇの他に、
さらにポリビニルアルコールＰＶＡ−２０５０，２ｇを
加え水７５ｍに溶解したものを用いた他は、実施例１（
１）に従ってマイクロカシセルを作成した。

このマイクロカッセルに実施例１（２）と同様にして抗
ヒトアルブミン抗体を固定し、ヒトアルブミン検出試薬
とするがｙ’　ＰＶＡ−２０５浴は行わなかった。

実施例３実施例１（１）に従ってマイクロカシセル化ζ行なった
。但しマイクロカプセル生成後の遠沈洗浄における洗液
として、第１回：生理食塩水、第２回：０．１チポリビ
ニルアルコール含有生理食塩水、第３回　生理食塩水を
用い、この沈渣をマイクロカブセル粒子濃度が１０チに
なるように生理食塩水に分散した。

このマイクロカプセルに実施例１（２）と同様にして抗
ヒトアルブミン抗体を固定し、ヒトアルブミン検出試薬
を作成した。

実施例４実施例１（１）で作成したマイクロカプセルを用い。

これに実施例１（２）と同様にして抗ヒトアルブミン抗
体固定反応を行なりた。ＰＢＳで遠沈洗浄後。

２．５％ＢＳＡおよび０．１　％　ＰＶＡ−２０５含有
ＰＢ８２ｍｌに分散しヒトアルブミン検出試薬を作成し
た。

マイクロカプセル試薬の評価実施例２〜４で作成したマイクロカプセル試薬について
実施例１（３）に従ってマイクロタイター法による評価
を行なった。また４℃の冷蔵庫に１力月静置した試薬に
ついても同様のテストを行ない。

第３表に示す抗体価を得た。

けん化度８８チのポリビニルアルコールを、マイクロカ
プセルの粒子形成時、マイクロカプセル生成後未反応残
存物除去操作中、或いは最終試薬液中に加えることによ
シ、凝集像の改良、検出感度上昇、保存経時中の感度低
下の減少等実施例１と同様の効果が得られた。

実施例５（１）酵素免疫試薬の調製三酢酸センイ素フィルム（ＴＡＣ）４．／ｌ／　ム）　
ｔ：　’２Ｎ水酸化ナトリウム后液に室温で１時間浸漬
してけん化した。水洗後、けん化生成物を１ｃｍ２角に
細断した。塩化シアヌル０７４ｇをジオキサ７３ｍ７！
に溶解し、これを水２００　ｍｌに加えた。この混合液
に１ｃｎ１２角に裁断した前記フィルム１００枚を入れ
。

水冷下ｐＨ７として２時間反応させた後洗浄した。

ヘキサメチレンジアミン１，２Ｉを水２００ｄに溶解し
た液に塩化シアヌルを反応させた前記フィルム（１００
枚）を入れ、５０℃４５分間反応させた。更に８０℃に
温度を上げ１５分間反応を行なった。未反応残存物を洗
浄後、２５％のグルタルアルデヒドを生理食塩水で１０
０倍に希釈した液３０ｍ１に得られたフィルムのうち３
０枚を入れ。

３７℃で６００分間反応せた。水洗後、抗ヒトＩｇＧ抗
体（マイルス社）を生理食塩水で５０倍に希釈した液３
０ｍ１にこのフィルム３０枚を入れ。

３７℃で３時間反応させた。生理食塩水で洗浄後次の溶
液に各１０枚ずつ３０分浸漬した。

（イ）　ＰＶＡ−２１，７（けん化度８８チ２重合度１
７００゜クラレ社）１％含有ＰＢＳ（ロ）　ＰＶＡ−１１７（けん化度９８チ２重合度１７
００゜クラレ社）１チ含有ＰＢＳ（ハ）　ＰＢＳ次いで、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳに浸漬し、ヒトＩｇＧ検
出フィルムとした。

（２）試薬の評価実施例５（１）で作成した３種のフィルム（イ）、←）
及び（ハ）のブランクレベル比較を行なった。ヤギＩｇ
Ｇ（マイルス社）１チ溶液をＰＢＳで１００倍に希釈し
そのｌ　ｍｌに実施例５（１）のフィルムを１枚ずつ浸
漬し、３７℃で２時間インキュベートした。ＰＢＳで洗
浄後、　ＰＯＤ標識抗ヒ）　ＩｇＧ　（マイルス社、ヤ
ギ免疫）をｏ、　ｉチＢＳＡ含有ＰＢＳで２００倍に希
釈した液１　ｒｎｌにフィルム１枚を浸漬し、３７℃で
一９０分インキュベートした。０．１　％　ＢＳＡ含有
ＰＢＳで洗浄後１　％　ＢＳＡ含有ＰＢＳに浸漬し１次
の酵素発色テストに供した。

リン酸ノーグーくえん酸のｐＨ５緩衝液３９ｍ１にオル
トフェニレンジアミン１２１ｖ及び０．５％過酸化水素
水０．２　ｒｕｇを溶解した溶液を作った。この溶液’
ｌ　ｍｌをとシ３７℃に保って上記処理を行なったフィ
ルムを１牧人れた。３７℃で１０分反応させた後ＩＮ硫
酸３Ｍを加えて反応を停止した。この反応液における４
　９２　ｎｍの波長の光学濃度を１ｃｔｎのセルを使用
して日立分光光度計２００型で測定した。得られた光学
濃度値を第４表に示す。

けん化度８８％の、ｊ？　リビニルアルコール処理すれ
た本発明の試薬はす７ドイツチ法を用いる酵素免疫法の
ブランクレベル抑制に極めて有効である。

牙牟言￥出ｋ（人、窩す写糞７・ルＡオ未へ澄儲七イ〜
′理Ａ、　青ｆ甲ｔ　ｋケｌｌｌ　五岬むイ也　１　）
ｂ　）

Claims

【特許請求の範囲】

（１）　免疫学的活性成分・を感作したけん化度９゜チ
以下のポリビニルアルコール含有担体かうすること全特
徴とする免疫反応試薬。
（２）前記けん化度が９０％以下７０％以上のポリビニ
ルアルコールである特許請求の範囲１に記載の免疫反応
試薬。
（３）　前記免疫学的活性成分が抗原又は抗体であゃ、
前記担体がマイクロカプセルである特許請求の範囲１に
記載の免疫反応試薬。
（４）　前記免疫学的活性成分を感作した担体がそれに
対して酵素標識免疫学的活性成分を適用しうるものであ
る特許請求の範囲ｌに記載の免疫反応試薬。