JPS6040834B2 - ウロキナ−ゼの製法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は粗製ウロキナーゼから、ウロキナーゼの力価を
低下させることなく、混入する着色成分（色素）を除去
し、ウロキナーゼを回収することからなるウロキナーゼ
の製法に関するものである。

ウロキナーゼは人尿中に徴量に存在する酵素であり、血
清中に含まれるプラスミノゲンを活性化してフィブリン
溶解能を有するブラスミンを生成する機能がある。

それ故ウロキナーゼは線溶系の賦活剤として有効である
から、人尿又は賢組織培養液から分離精製され、各種血
栓症の治療に広く臨床使用されている。尿等のウロキナ
ーゼを含有する水溶液からウロキナーゼを製造する方法
には、通常２つの主要工程すなわち濃縮と精製回収があ
る。

濃縮の公知方法としては｛１’冷却沈澱法、■硫酸バリ
ウムによる吸着法、糊シリカゲルによる吸着法（特公昭
３４−鼠７号）、‘４｝陽イオン交換体による吸着法（
特公昭４０一２７８３び号）、【５｝アクリロニトリル
による吸着法（特公昭４８一１０２３２号）等が行われ
ている。しかしいずれの方法を行っても濃縮の際に尿中
の着色成分を吸着し、これがウロキナーゼとともに濃縮
されるので粗悪なウロキナーゼが集められる。ウロキナ
ーゼ含有水溶液の濃縮液を更に分離精製してウロキナー
ゼを回収するにはクロマトグラフィー法が一般的であり
、陽イオン交換樹脂（特公昭４５−５４３号）セフアデ
ツクス特公昭４１−１６５３３号）、ハイドロキシ・ア
／ぐタイト・ＤＥＡＥーセルロース（特公昭４４−８０
６４号）等が用いられている。このような方法を組み合
せることによって高度に精製されたウロキナーゼを十分
な収量で回収でき、これらの方法は比活性の上昇や発熱
性物質の除去等の工夫はなされているが、尿中に存在す
るアルカロイド類等の色素を除去することについては十
分な効果を挙げていない。この色素の除去法を検討し文
献はすでに存在し、例えば陰イオン交換樹脂による吸着
除去によってある程度の効果があると報告（袴公昭４０
一２７８３０号）されているが、これにしても従属する
工程の精製効果を高める等の点で十分なものでなかった
。本発明者らは粗製ゥロキナーゼに含まれる色素等の着
色成分の効果的な除去を目的として、その製造工程にお
いて使用される坦体の選択あるいは分画について種々研
究を行った。

その結果、現在ウロキナーゼの製法として工業化されて
いる濃縮工程や、精製回収の工程との関係及び着色成分
の除去効果等の点から、濃縮工程と回収工程の中間工程
に陰イオン交換体を組込むのが最良であることを見き出
し、さらに現在使用されている数百の陰イオン交予期樹
脂の中から一群のものが極めて効率的に尿中の着色成分
を吸着することを見し、出した。次いで選択した陰イオ
ン交換樹脂の処理条件を検討した結果、これを精製回収
前の濃縮液に中間工程として追加することを可能とし、
これらの新知見に基づいて着色成分の除去を目的とする
本発明を完成した。本発明は第四級アンモニウムを交換
基とし、ポリスチレン・ジビニルベンゼン共重合体を基
体とする強塩基性陰イオン交換樹脂をｐＨ７〜９の綾衡
液によって平衡化し、これと粗製ゥロキナーゼ水溶液を
接触させて未吸着のウロキナーゼを含む水溶液を回収し
、粗製ゥロキナーゼ水溶液中の着色成分を上記陰イオン
交換樹脂に吸着させて除去するのである。

本発明において使用される粗ゥロキナーゼ溶液とは、特
に限定されるものではないが、公知のシリカゲル、アク
リロニトリル、硫酸バリウム等のウロキナーゼの吸着剤
を使用して得た比活性１００〜１０００１Ｕ／の９のウ
ロキナーゼを含有する水溶液が適している。

使用される強塩基性陰イオン交換樹脂は第四級アンモニ
ウムを交換基とし、ポリスチレン・ジビニルベンゼン共
重合体を基体とするもので、選択された市販商品として
Ｄｏｗｅｘｌｌ（ダウケミカル社製）、ダイヤオンＳＡ
シリーズ、ダイヤオンＰＡシリーズ（以上三菱化成工業
社製）の２０〜１００メッシュの最強塩基性陰イオン交
換樹脂が好ましい。陰イオン交モ剣樹脂のウロキナーゼ
を含む水溶液との援触のための平衡化は、適当な低塩濃
度緩衝液（例えば０．１Ｍリン酸緩衝液）によってｐＨ
を７〜９に調整する必要があり、より好ましいｐＨは７
．５〜８．５である。陰イオン交換樹脂の使用量はゥロ
キナーゼ約１０００１Ｕ′の‘を含有する水溶液１０比
ｃに対して約２０〜１００の‘で十分である。両方の接
触は単に混合してもよく、陰イオン交４予期樹脂を充填
した塔にウロキナーゼ画分溶液を通過させてもよい。ゥ
ロキナーゼは陰イオン交換樹脂に吸着されずに水溶液中
に残り、色素等の着色成分は陰イオン交換樹脂に吸着さ
れるからこの樹脂とともに着色成分を除去する。接触の
条件は特に限定されないが、温度は３〜２０℃、時間は
５００泌で約１時間が適当である。ウロキナーゼを十分
に回収するため接触後のゥロキナーゼ水溶液を上記平衡
化と同じ緩衝液で洗練し、この際接触に使用した樹脂量
の約１．５〜３．３音の緩衝液を用いる。このようにし
て着色成分の除去処理を行ったウロキナーゼ水溶液は公
知の陽イオン交換体その他の吸着体を用いて高度に精製
し、医療に用いて安全なウロキナーゼ製剤とする。本発
明における着色成分の除去効果は、実験例で示したよう
に、吸光波長４０則ｍでの吸光度による比率で表すと約
８０％以上の着色成分が除去されているから極めて効果
があり、ウロキナーゼの回収率も約９３〜１００％であ
り、工程が簡単で、処理時間が短かいから中間工程とし
て容易に追加できる。

以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明し、本発明
の効果を実験例によって証明するが、本発明はこの実施
例に限定されるものではない。

なおＩＵは医薬品研究Ｖｏｌ封３｝，２９５〜３０８（
１９７４）に記載の国際単位である。実施例 １ ダウケミカル社製のＤｏｗｅｘ−１１１００夕を蒸溜水
に懸濁してデカント法で微粒子を除き、内径２０側のガ
ラスカラムに高さが３５肋となるように充填した。

次いでＩＮの苛性ソーダ溶液を樹脂の５倍量流下させ、
５倍量又はそれ以上の蒸溜水を流下してカラムを洗膝し
、さらにＩＮの塩酸溶液を５倍量流下させ、同じように
５倍量又はそれ以上の蒸溜水を流下させた。この操作を
３回繰り返した後ｐＨ８．０，０．１Ｍの燐酸緩衝液を
樹脂の１折音量流下して平衡化した。尿から捕集して濃
縮した粗製ウロキナーゼ水溶液５００叫（活性４０５ａ
Ｕ′肌、比活性３７２１Ｕ／の９）をカラムを通過させ
、さらに上記のリン酸緩衝液を樹脂の２倍量流下させた
。

その通過液のウロキナーゼ活性、蛋白量（２８瓜ｍ吸光
度）、着色度（４０別ｍ吸光度）を通過前夜と比較して
みると、力価残存率は１００％、不純たん白除去率は２
０．４％、さらに着色成分除去率は８２．１％に達した
。なおこの時の比活性は通過前液の２情強であった。実
施例 ２三菱化成工業社製のダイヤオンＳＡ−１１Ａ５
０夕を蒸溜水に懸濁してデカント法で微粒子を除いた後
、内径３仇肌のガラスカラムに高さが２５肋となるよう
充填し、実施例１と同じ処理を行って平衡化した。

粗製ウロキナーゼ水溶液１５０の‘（活性１４５ａＵ／
の‘、比活性６４２１Ｕ／ｍｇ）をカラムを通過させ、
実施例１と同じように緩衝液を流下させた。その通過前
後を比較すると、力価残存率は１００％、不純たん白除
去率は１６．９％、着色成分除去率６６．４％であった
。実験例 陰イオン交側樹脂による着色成分の除去率の比較実験を
行った。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 第四級アンモニウムを交換基とし、ポリスチレン、
   ジビニルベンゼン共重合体を基体とする強塩基性陰イオ
   ン交換樹脂をｐＨ７〜９の緩衝液によつて平衡化し、こ
   れと粗製ウロキナーゼ水溶液を接触させて未吸着のウロ
   キナーゼを含む水溶液を回収し、粗製ウロキナーゼ水溶
   液中の着色成分を上記陰イオン交換樹脂に吸着させて除
   去することを特徴とするウロキナーゼの製法。