JPS6041449A - ビフイドバクテリウム菌増殖促進因子を含有する飲食物の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ビフィドバクテリウム菌増殖促進因子を含有
する飲食物のＶ２遺法に関するものである。

生木内または生１４（外におけるピフイ１、′バクテリ
ウム菌の増殖を促進する作用を有する物質（以下ビフィ
ズス増殖因子という）としては従米錘々のものが報告さ
れており、それらの製造法あるいはそれらを含有させた
粉乳等の製造法も多数提案されている（特公昭４１−３
２９０８号、同４５−６５１０号、同４５−６８６５号
、同４５−２１６０．６−没、同４９−４０９５６号、
同４９４０９５７号等）。しかしながら、従来報告され
たビフィズス増殖因子の多くは、生体外の培養実験によ
り効果が確認されたものであって、生体内の活性につい
ては不明であるか極めて不十分なものであった。

ビフィドバクテリウム菌は大腸内に生育する有用細菌で
あって、その生理的意義や、峙に人工栄養乳児の腸内細
菌叢中該菌の占める割合を高めることに努力が払われて
いることについては今更評言する迄もない。したがって
、人為的に飲食物や培養基等に含有させるビフィズス増
殖因子としては、生体外におけるビフィドバクテリウム
菌の培養のみに利用する場合はともかく、生体内におい
ても確実且つ十分な効果が期待できるものであることが
望ましく、かかる観点からよりすぐれたビフィズス増殖
因子の開発が強く望まれていた。

本発明の目的は、上記要望に答え得る、生体内で高活性
を示すビフィズス増殖因子ｔ４π供することにある。

本発明は２発明からなり、その第１は一般弐〇ａｌ　−
（Ｇａｌ　）ｎ　−Ｇｌｃ （但し式中（ｉａｌはガラクトース残基、、Ｇｌｃ　は
グルコース残基、１］は１〜４の整数を、それぞれ表わ
す。） で示されるオリゴ糖全有効成分として含有するビフィド
バクテリウム菌のまイρ殖促進性組成物の発明であり、
その第２はアスペルギルス・オリゼの生産したβ−ガシ
クトシダーゼでラクトース又はラクトース含有物質を処
理して上記本発明の第１による組成物全有利に製造する
方法の発明である。

本発明によるビンイドバクテリウム菌増り面促進性組成
物中の有効成分すなわちビフィズス増殖因子である」二
記オリゴ糖の大部分は、本発明者らがラクトースにβ−
ガラクト／ダーゼを作用さぜたときに加水分解反応と共
に起こる転移反応につき研究中初めて発見したものであ
る。上記転移反応来、多数の報告があるが、現在まで（
（分離確認が報告されている転移オリゴ糖は、ｑａＩ−
（β刊、２）−Ｑ　Ｉ　ｃ　、、　Ｃｉ　ｇ〕Ｉ　−（
β−１，３）−Ｇｌ　ｃ　ＸＧａ１−（β−１，６）−
Ｇ　Ｉ　ｃ　、　Ｇ　ａ　Ｉ　−（β−］、３）−Ｃ２
１、Ｑａｌ−（β−Ｌ６）−Ｇ；ＩＩの２糖Ｊ」１と、
Ｇａ１−（β−１，６）−Ｃａｌ−（β−１，４）−（
↑１ｑＧ　ａ　ｌ　−（β−１，，６）−Ｇａｌ−（β
−１，６）−Ｇｌｃの３糖類である（カッコ内はガラク
トシド結合の態様を表わす）。４糖類についてはｌ１ｕ
ｌ）ｃｒ　らがその存在全確認しているが、構造は明ら
かにされておらず、５糖類以上の多糖類の生成を確認し
た例はない。

そしてこれらの報告の内容（は転移機構の解［ｊＪ、］
と生成しグとオリゴ糖の構造研究に正寸るものであって
、転移オリゴ糖とビンイドバクテリウム菌の増殖との関
係全報告しているものはない。

ビフィズス増殖因子である前記一般式を有するオリゴ糖
（以下単にオリゴ糖と言うときはこの特定のオリゴ糖を
さす）は、アスペルギルス・オリゼが生産したβ−ガラ
クトシダーゼでラクトースを処理すると生成する。この
処理を終った後の反応混合物中には未反応のラクトース
や加水分解で生成したガラクト−スやグルコースも存在
するから、ビフィズス増殖因子として高活性のものを得
るためには、酵素処理終了後に適宜精製する方法、オリ
ゴ１１Ｉ！牛成率の高い酵素処理条件を選ぶ方法、ある
いはこれらの方法を組合わぜた方法などにより、オリゴ
糖含有率の高いものとすればよい。

次に本発明の第２によってビンイドハクゾリウム菌の増
殖促進物り４［全製造する方法につき詳述する。

β−ガラクトシダーゼて処理するラクト−スとしては特
に高純度のものを用いる必要め：なく、通常市販されて
いるものをその１１使Ｊ１ｊすることができる。また全
乳、脱脂乳のようにラクト−スを・−成分として含有す
る物ＴＪも原オー１として用いることができる。

／ｍｌ、温度は２０〜５０゛Ｃが適当である。

反応時間はオリゴ糖の収率に大きな影響を及ぼす。酵素
処理の一例における反応時間と生成糖類の量との関係を
示す第１図から明らかなように、反応初期にはグルコー
ス、ガラクト−ス及びオリゴ糖がほぼ直線的に増加する
が、その後はいずれもやや複雑な曲線を描き、オリゴ糖
はある時点から徐々に減少する傾向を示す。オリゴ糖の
収率が最大になる時間は他の反応条件によって異なるか
ら、最適反応時間は実験により確認することか望ましい
。

なお反応混合物中のオリゴ糖は、例えば薄層クロマトグ
ラフィーにより他の成分と分力［シた後、Ａ、ｎｔｈｒ
ｏｎｃ法によって定量することができる。

酵、素反応は処理液を約９０’Ｃ以」二に５〜１０分加
熱することによシ停止さぜることがてきる。

酵素処理企終った反応混合ｑｌ／Ｊはその寸−４、ある
いＵ］適宜濃縮し又は乾燥して粉末化し、ビフィズス増
殖因子又（ｄ、これを含イＴする組成物（例えば乳製品
）として利用することができるが、必要に応じて、有効
成分であるオリゴ糖濃度を高めるための精製を行なって
もよい。鞘１１！！！は種々の方法て行うことができる
が、例えば反応混合物をイオン交換樹脂で処理して予（
！ｉｉｉ的にａ’ｉ’ｊ製した後、活性炭カラムに通し
てこれにオリゴ糖を吸着させ、次いでアルコール水溶液
で溶出させる方法がある。又反応混合物に単糖類及び２
糖類全資化する微生物を接種し培養して単糖類及び２れ
１１匁′４を消費させることによ）オリゴ糖の半部を容
易にする方法もある。

次に本発す」による組成物中のオリゴれ１１について、
標準的な条件で行われた後記実施例ＩＫよるオリゴ糖の
分析例全示して説明する。

■　分子量分布 Ｂｉｏ４３ｃｌ　Ｐ−２によるゲルカー１過の結果全第
２図に示した。クロマトグラムのビークＡ１１３、Ｃは
それぞれ３糖類、・】据方′１．５糖類に相当し、これ
らのピークの面積比から計ｎ−した構成比ば３糖類が約
５５％、４糖卿が約３２％、５糖類以上が約１３係であ
った。

■構成糖 ラクトース、オリゴ糖（未分別のもの）、第１−Ｉ　Ｃ
Ｉ中１００°Ｃで４時間加水分解した」局舎、及びβ−
ガラクトンダーゼで５０゛″Ｃにて１時間加水分解した
」局舎の生成糖のモル比を第１表に示した。この結果か
ら、オリゴ糖中の３糖類、４糖類及び５糖類のグルコー
スとガラクトースのφ モル比は、それぞれ１：２．１：３及び１ニーＩＦであ
ることがわかる。

第１表 ■　４’ｌ’ｆｆ成糖の結合態様 ３糖類巾の主成分（活性炭カラムクロマトグラフィーで
分離されたもの）全部分的に酸加水分解して得られた生
成物から、グルコースとガラクト−スのほかにラクトー
スとＱａｌ−（β−１゜θα１ （５）−件托が確認された。この結果と完全に加水分解
し／ζ物におけるグルコースとガラクト−スの比が１：
２であることから、この３糖類の構造はＧ　ａ　ｌ　−
（β−１，Ｇ）−Ｇ旧−（β−＋、ｚ＋）−Ｑｌｃであ
るものと推定された。

同様にして多数のオリゴＪ′１＋：ｉ成分につき分析を
行なった結果、オリゴ糖は前記一般式で示され且つガラ
クト−スーガラクｊ・−ス間結合（ｄβ〜１．３結合、
β−］、・１結合又はβ−１，６結合であってβ−１，
６結合が主であり、ガラクトース−グルコース間結合は
β−１，３結合、β−１，・１結合又はβ−１，６結合
であっ−Ｃβ−１，・１結合が主であることが確認され
た。

以上詳述したような本発明の組成物中のオリゴＳは、”
ｌ’ｎされたものについて検？ｉ、１シた限りにおいて
、個々のオリゴ糖単独でもビフィズス１１ｊ’／吻（ｊ
因子として働き、もちろん種）ｌのオリゴ糖の混合物の
゛ま１でもすぐれたビフィドバクテリウム師増殖促進作
用を示す。

本発明の組成物中のオリゴ糖がビフィズス増殖因子とし
て肪にすぐれている点は、その作用が生体外はもちろん
生体内においても極めて顕著なことである。

本発明による組成物のビフィドバクテリウム菌増殖促進
作用はビフィドバクテリウム菌の種類とはほとんど無関
係であって、ビフィドバクテリウム・ブリーベ、同ビフ
ィダム、同インファンティス、同アドレスセンチイス等
、すべての人肌内定着性ビフィドバクテリウム酌に対し
て発揮される。

不発ψＪＫよる組成物は、筒底に鞘層されたオリゴ糖そ
のもののほか、オリゴ糖ｆ　Ｊ成分として含む任、Ｕの
混合物、し１」えばラクトース又はラクト−ス含有物質
をβ−ガラクトシダーセで処理してオリゴ糖全生成させ
た反応生成物そのもの又はその加工物からなる粉乳、発
酵乳などの飲食物、薬剤ｑ９、あるいは犯１ｊ製オリゴ
４Ｊ：！ｊ　Ｋ添加した任、仏の飲食′１勿、賓≦斉り
′！、（′ｉであり１１する。

以下実施例を示して本発明全説明する。なお実施例中で
は「ビンイドバクテリウムＪｋ「Ｂｉと略記した。

実施例１ ３．６Ｋｙのラクト−スを約６１の温水に溶解し、ＩＭ
−酢酸緩衝溶液（ｐＨ４，６）　５０ｍ／！、β−ガラ
クトシダーゼ１０万単位及び水を加えて１０１とし、３
７°Ｃで５１１Ｓ間反応さぜ／こ。次いで反応液を加熱
して酵素を変性さぜ、変性タンパク質に’ｌＪ’別した
後、陽イオン交換樹脂及び陰イオン交換樹脂のカラムを
通した。通過液は３０　Ｘ　３０　Ｃｍの活性炭充填カ
ラムに一夜接触させ、その後活性炭を脱イオン水ＧＯ１
で水洗して単糖類全溶出した後、５乃エタノール６０　
Ｃ次いで５０％エタノール６０１で溶出した。この５０
％エタノール溶出区分全約７４に濃縮し、孔径０２μの
メンブランフィルタ−で無菌沢過した後、再度イオン交
換して透明な糖液全行た。これを更に約２５１迄減圧濃
縮した粘稠な液全再度メンブランフィルタ−でｆ＝ｊ過
し　ｉＨ液を凍結乾燥して白色のオリゴ糖粉末無菌Ｆ”
１ｓｃｈｃｒ　系成熟雌ラット６匹に人糞便より分離し
た細菌１０種（１３・ブリーベを含む）全投力して腸内
にこれらの菌を定着させた後、■　ラフチーロースの３
係水溶液 ■　実施例１で層端した’Ｊ’　ＯＳの３％水浴液■　
ラクト−スの３％水溶液 を■−）■の順番で、それぞれ１週間ずつ、１１Ｊ：　
Ｅｌｌ馬力た。投与量は固形物として０．６　ｐ／ｊ」
＋・ノーことし、投与物質の切替に際しては１週間の空
白期間を置いた。この間ラットの糞便を採取して糞便中
のＢ・プリーベの生菌数を測定した。その結果を第３図
に示す。

同図から明らかなように、’Ｊ”Ｏ８を投Ｊヴすること
により糞便中のＢ・ブリーベ菌数は約１０倍に増加する
。ラクトース投与でも菌数増加は認められるものの稜め
て僅かであシ、ラフチーロース投与ではぽとんど変化が
認められない。

実施例３ 通常のＦｉｓｃ１１ｅｒ系成熟雄ラット６匹を用いて次
のような実験を行なった。なお投馬したＢ菌はＩ３・ブ
リーベ又はＩ３・インファンティスであり、これらは＼
’Ｌ−Ｑ培地で４８時間培養後遠心分肉ａし、得られた
菌体を牛乳培地に浮遊させて投馬した。ｉ　Ｌ＆４量ｔ
ｔｉ　ｍ１３カ２　Ｘ　Ｉ　０８／　Ｂ、　Ｔｏ　Ｓカ
ｓ係水溶液２ｏｔｎｌ／日である。

（ａ）　Ｊ″ｇ：初に菌液のみを１１ヨだけ飲丑ぜる。

（Ｉ））第２週は菌液のみ全毎日膜島する。

（Ｃ）　第３週は菌液と’Ｊ”ｏｓを毎目投掬する。

（ｃｌ）　第４週は’］’Ｏ８のみｋ　４Ｎ：　Ｅｌ投
投馬る。

この間、ラットの糞便中の１３菌（膜力した菌株のもの
）の生菌数を測定した結果を第４図に示す。

同図から、菌液とＴｏ８の並行投鳥によって腸内のＢ菌
数は顕著に増加し、その後菌液の投Ｊ：ｊを中止しても
高い菌数が維持されることがわかる。

実施例４ 健康成人５人に対し次のような実験を行なった。

なお投馬した菌液は実施例：うの場合と同様にして得ら
れたＩ３・ブリーベのものである。

実験スケジー−ル： １週目・・・　・・菌液のみ投馬 ２週目・・・・・・菌液及び′１゛○Ｓ　（３’！−／
日）を投乃３週目・・・・・・菌液及び’Ｊ’Ｏ８（１
０！／日）を投Ｊ５投力菌数：１０９／ｌ：１ ｒＪ？○Ｓ投匈方法投機方法に溶解し昼食後に飲用ｉ１
１す定：　各週３日日、５日日及び７Ｂ［］に各人の大
便中の１３・ブリーベ菌数金測定し、その週における平
均菌数をめた。

実験の結果は第５図のとおりであって、’ｒｏｓの投与
にょシ腸内の１３菌が顕著に増加することかわかる。

実施例５ 健康成人５人に対し次のような実験を行なったっ実験ス
ケジー−ル １週ト・・・・・・・ＴＯ８無投カ ２週ト・・・・・・　ＴＯ８３９−／日を投馬３　週６
　・−−ＴｏＳ　ｌ　Ｏ！／−／Ｂ　全＆与’ｒｏｓ投
与方法：実施例４と同じ 測定：実施例４と同様にして大便中の総Ｂ菌数を測定す
る。

実験結果を第６図に示す。同図から、ＴＯ８の投与によ
りヒトの腸内に常在するＢ菌数が増加するこ゛とがわか
る。

実施例６ 還元脱脂乳１０００１にアスペルギルス・オリゼのβ−
ガラクトシダーゼ１，０００刃車位全添加し、２時間４
０℃に保った後、加熱して酵素全失活させると共に殺菌
した。次いで培養タンクに移し、Ｉ３菌のスターター全
接種して３７”Ｃで２４時間培養し、培養終了後コ」゛
味別等を添加して均質化することにより、オリゴ糖と１
３菌とを含有する発酵乳を得た。

【図面の簡単な説明】

第１図：β−ガラクトシダーゼでシクト−スを処理した
ときの反応１ｊ贋；１］とＡ）、１８類の収量との関係
を示すグラフ。 第２図：オリゴ糖のゲル汐−１過の結果を示すグラフ。 第３図：実施例２の実験結果を示すグラフ。 ｉ４図：実施例３の実験結果を示すグラフ。 第５図：実施例４の実験結果を示すグラフ。 第６図：実り缶例５の実験結果を示すグラフ。 代理人　弁理士　板弁　−瑚 手続補正が（（方式） 昭和５０年６月２２日 特許庁長官　若杉和夫　殿 １、事件の表示 昭和５８年特ｙ（照温２４７２１９号 ２、発明の名称 ビフィドバクテリウノ、菌増殖促進因子を含有する飲食
物の製造法 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 （６１３８）株式会社ヤクルト本社 ４、代理人 〒１０７東京都港区北青山：３　（５−１８６、補正の
対象 委任状、明細書全文および図面。 ７、補正の内容 （１）指令に従い別紙委任状（印鑑証明書添付）を提出
する（なお原１、ｙ許出願の出願人の印鑑は上記委任状
に使われているものに変更された）。 （２）明細書全文を別紙のとお１）補正する（自発）。 （３）指令に従い適正な図面を提出する（但し、明細書
が上記により補正されたのにともない、第２図〜第４図
が削除され、第５図およびｆｉＳ６図が第２図および第
３図にそれぞれ変更され、新たな図面Ｐｔ５４図〜第９
図が加入された。）。 （全文訂正） 明　細　−１１ 、発明の名称 ヒフイト゛バクテリウム１′！■増ηイ１促進ＩＸ１子
を含イｊする飲食物の製造法 ２、特許請求の範囲 アスペルギルス・オリゼの生産したβ−ガラクトシダー
ゼで乳を処理することにより乳中のラクトースの全部ま
たは一部を一般式Ｇａ１−（Ｇａｌ）ｎ−Ｇｌｃ　（（
１４Ｌ式中（’、＋　ａ　ｌはガラクト−ス残」、（、
Ｇｌｃはクルコース残Ｊｌ！ｊｓ　ｌｌはｉ、　−４の
路数を、そオしそれ表わす）で示される’ｉ’ｊ：移オ
リコ゛糖に変換したのち加熱して」二記酢素を失活させ
、′、）：、す・で」二記処理後の２Ｌにビフイドハク
デリ・ン１２菌のスターターを接種してＪｊり養を行う
ことを１．７徴とする、ビフィドバクテリウム菌増殖１
是進因子を含有する飲食物の製造法。 ：３、発明の詳細な説明 本発明は、ビフィドバクテリウム１′！■増殖促進ひ、
１子を含イｉする飲食物の製造法ｔこ関するものである
。 生１本内または生木外におけるビフィドバクテリウム宜
１の増殖を促進する作用を有する物質（以下ビフィズス
増ｒＡＣｉ因子という）としては従来種々のものが報告
されており、それらの製造法あるいはそオ′Ｌらを含イ
１させた粉乳ｚ９・の製造法も多数提案されている（特
公昭４１−３２９０８号、同Ａ　５−６５１　（、）−
号、同４５−６８６５号、同４５−２１６０　Ｇ′；′
、′、同・・１９−・１０９５６号、同４９−　ｉｌ　
Ｑ　り　５７号等）。しカルなが呟従来報告されたビフ
ィズス増殖因子の多くは、　生木外の培養天験により効
果が確認されたものであって、生体内の活性については
不明であるか、極めて不充分なものであった。ビフイｌ
ζバクテリウム菌は人腸内１こ生育する；イ、ｒ　Ｊｌ
！細菌であり、その生理的意義や、腸内細菌中でこの菌
の占める割合をｊｊ’ｊｌぬることに努力か払われてい
ることについては、命更３’Ｃ？ｉするよでもない。し
たがって、人為的に飲食物へ・γに含有させるビフィズ
ス増殖因子としては、生木外におけるビフイド／＼クテ
リウム菌の培五のみに利用する場合はともかく、生木内
においても確実かつ充分な効果が期待できるわめである
ことか望ましく、かかる観点から、よりすぐれたヒフィ
ズス増殖因ｒ−の開発か強く望まれていた。 」二連のような要望に答えイ：）るちのとして、’ｌ、
＋ｆ＃′ｌｌｌ／？　５４−１２８３７号（特公昭５８
−２０２６６号）の明細３１には、本発明者らと同し発
明者によるビフィス増殖因子に関する発明、すなわち一
般式〇ａ１４Ｇａｌ）＋ｒに　ｌｃ　（ｌｌ　Ｌ式中Ｇ
ａｌはガラクトース残基、にＩＣはグルコース残基、＋
１は１〜パ１の整数を、それぞれ表わす〕で示される転
移オリゴ糖からなるビフノドバクテリウム菌増殖促進剤
の発明が記載されており、更に、アスペルギルス・オリ
ゼの生産したβ−ガラクトシダーゼでラクト−スを処理
して」二元ビフイト１１クテリウム菌増殖促進剤を製造
する方法の発明も記載されている。ビフィズス増殖因子
である」−記オリゴ糖の大部分は、本発明者らかラクＦ
−スにβ−力゛ラクトシグーゼを作用させたとき加水分
１１１１反応ととらに起こる転移反応につき何元中初め
て発見したちのである。上記転移反応につい−こは、１
　！Ｊ　５　］年にＷａＬｌｅｎ−［Ｑ１ｓ／ｌ憎１え
告して以来多数の報告かあるが、現在までｔこ分離ｍｃ
認か報告されている転移Ａリボ糖は、Ｇａ　ｌ　−（β
司、２）−Ｇｌｃ、Ｇ　ａ　ｌ　−（β−１、：３　）
−Ｃ；ｌｃ、　Ｇａ１−’（β−１、Ｇ　）−Ｇ　ｌｃ
、　にａＬ（β−３、、３）−Ｇａｌ、Ｇ！１１（β−
１、６）−Ｃｏａｌの２糖頬と、Ｇ　ａ　ｌ　−（β−
１、６）−Ｇａｉ（β暑、−４）−Ｃ，ｌｃ、Ｃ；　ａ
　Ｉ　−（β−１，６）−Ｇａｉ（β−１、Ｇ）−Ｇｌ
ｃの３糖頬である（力ンコ内はガラクトシド結合の態様
を表わす）。４糖頓については、Ｈｕｂｃｒらがその存
在を確認しているが、構造は明らかにされて才３らず、
５糖頬以上の多糖類の生成を撞：認した例はない。そし
てこれらの報告の内容は、転移（民活の解明と生成した
オリゴ糖の構造４１１元くことどまるものであって、転
移オリゴ糖とビフィドバクテリウム菌の増殖との関係を
報告しているものはない。、Ｌ〕こ本国特許第２８２６
５０３号明細店には、ラクトースをラクターゼで処Ｊ里
してオリゴ糖を製造する方法が記載されているが、この
方法で１１１られるオリゴ糖の４１゛４造についての記
ｉＦｌはなく、またその用途としては、アイスクリーム
およびチョコレートミルク飲料の安定剤、中心部が軟か
いチョコレートの充填物、ラッカー、フィルム、コーチ
インク剤等の接３゛ｉ剤もしくは原料が挙げられている
にすぎない。 本発明は、上記本発明者らによるヒフィズス増Ｍ因ｒ゛
およびその製造法に関する発明に基つき完成されたもの
であって、生体内で有効なビフィズス増殖因子とビフイ
１ξバクテリウム菌とをｆノ１ぜで含有するおいしくし
かも健康の、ｔｌｌ；Ｊ：冒１′す進に有用な飲食物の
製造法、すなわちアスペルギルス・オリゼの生産したβ
−ガラクトシダーゼで乳を処理することにより２Ｌ中の
ラフ１−又の全部よたは−■Ｉ序ビフィズス増殖因子で
ある一般式Ｃ１ａｌ−（Ｃ；ａｌ）ｎ−Ｇｌｃ　（但し
式中Ｇａｌはガラクトース残）、（、Ｇｌｃはグルコー
ス残基、Ｉ）はコ〜・１の整数を、それぞれ表わす）の
転移オリゴ糖（以下、オリゴ糖というときは二の１．１
足のオリゴ糖をさす）に変換したのち加熱して上記酵素
を失活させ、次いで、Ｌ記処理後のＩＬにビフイトｔ′
クテリウム菌のスクータ−を接種してＬ９ｉを行うこと
を特徴とする、ビフィドバクテリウム菌Ｊｊよびその増
殖促進因子を含有する飲食物の製造法をＰＬ供するもの
である。 本発明の製法におい−こ、原料のＩＬとしては、全乳、
ＩＩＩＬ脂！し、またはこれらの７しの粉？Ｌからの還
元？Ｌなどを、ｂ・ずれも用し・ることができる。 β−ガラクトシダーゼはアスペルギルス・オリゼの生産
したちのをＪｌ］いるが、これは、後記天験例＋Ｈこ示
したようｉこ、ラフ）・−スから上記ヒフィズス増ηｆ
１囚゛トを生成する反応の収率１こおいて、アスペルギ
ルス・ンリゼの生産したβ−ガラクトジグ−七′は池の
（起源を異にする）β−ガラク１シダーセ′、Ｊ：りち
；ｔしくすぐれているからて′ある。 β−ガラクトシグーセ処理を行う揚台、？シ固形分濃度
は１５〜３０％程度、１）１１は３〜８（好ましくは６
〜７）、酵素濃度は１〜１００単位／　＋１）ｌ、温度
は２０〜５　ｏ−（：が適当である。 反応時間はビフィズス増殖因子の収率に大きな影響を及
ぼす。 ラクトースを７スペルギルス・オリゼの生産したβ−ガ
ラクトシダーゼで処１」ｉシたモデル的な酵素処理の一
例における反応時間と生成糖類の量との関係を示す第１
図から明らかなように、反応初期にはクルコース、ガラ
クトースおよびオリゴｉｉ、ｌｊかほぼ直線的−二増力
１けるが、その後はいずれもやや複雑な曲線を描き、オ
リゴ糖はある時；、’ｆ、から徐々に減少する傾向を示
す。そしてオリゴ糖の収率か最大になる時間は池の反応
条件にＪ：っても異なるから、最適反応時間は天験によ
り確認することが望よしい。なお、反応混合物中のオリ
ゴ糖ＩＪ、たとえば薄Ｊ９リクロマトグラフィ−１こよ
り池の成分と分１ｉ１１　したのも、１ＸｎＬｂｒｏｎ
ｅ法により一〇定量することができる。 酵素反応は、処１７１ｊ　Ｌだ乳を肴、すり　０　’Ｃ
以」二に５〜１（）分間加熱して酵素を失活させること
により停止さぜることがで外る。 酵素処理を終わった乳は、加熱して殺ＩＹ目−る。この
殺菌処理は、上記１１１Ｙ素失活処理と同時［こ行なっ
てもよい。その後、ｊｒｌ養タンクに移し、ビフイドバ
クテリウ１．菌のスクータ−を核種し、３７℃ｉ’＋ｉ
ｉ後で培養を行う。なお、１ｊつ五は乳を培地とするビ
フイドバクテリウ１１菌培養の常法により行う、二とか
でｂ、ビフィドバクテリウム菌と共に乳酸菌を＃種しで
培養してもよい。培養中、ビフィドバクテリウム菌は資
化し易い単糖類ないし２糖類を反光的に利用するか呟」
二記オリゴ糖からなるビフィズス増殖因子はそのほとん
どが培養終了後の？Ｌ中に残っている。 以」二のようにしてイ：（られるＪ（り着物は、ビフィ
ズス増殖因子とビフィト゛バクテリウ１３菌とを含み、
ビフイドバクテリウｌ、菌による通常の発酵乳と同様の
が（味のもので・あるから、これをそのまま食用に（Ｊ
ｌ、することができるが、適宜希釈するか均質化するな
どの加二Ｉ−を施したり、」１味１．１、香料ｑを加え
るなどして、飲食物としての形態や味を調整してから飲
食に供してもよい。 本発明によれば、生木内で有効なピッイス又増殖因了と
ビフィドバクテリウム菌とを含有すること１こより人腸
内におけるビフィ）パバクデリウム菌菌数の増加にトわ
めてイＪ効で栄養ハ゛ランスもすぐれた飲食物を、」二
ｊムのよう［二５′Ｌを涼オ、１として、これｌこ簡単
な酵素処理と培養処理を加えるたけて゛容易に製造する
ことができる。 以下、本発明の製法によりイ：１られる飲食物が含有す
るビワ２スス増殖因子の作用効果を確認した実験例１お
よび２、β−力゛ラクトシグーゼの種類によるビフィス
増殖因子の収率の相違を確認した天１φβ例３、ならび
に本発明の天施例を示して、本発明を説明する。 ３　、　Ｇ　Ｋｇ）７　クトースを約［’ｉｃの温水に
溶解し、］　Ｍ−Ｉ’ｉ＋酸援↑ｔｊ　’ｊＦｒ液（１
＋ｌ−１−！１．　、　Ｇ　）　５０　ｍｌ、β−ガラ
クトシダーゼ］０万単位および水を加えて１０ｃとし、
３７℃で５時間反応させた。次いで反応液を加熱して酵
素を失活させ、生成した変性タンパク質を濾別した後、
陽イオン交換樹脂のカラムを通した。通過液は３　（ｌ
　Ｘ　３０　ｃａｎの活性戻光」眞カラムに一夜接触さ
せ、その後、活性炭を脱イオン水ＧＯＣで洗浄して単Ｋ
１．！ｉ頬を溶出シた後、５％エク／−ルＧ　ＯＣ１次
いで５０％エタノール６０Ｃで溶出した。この５０％エ
タノール溶出区分を約７ＣＩ：濃縮し、孔径（）、２ノ
λのメン７ランフイルターで無！’ｊｔ＋Ａｉ過しだ後
、再度イオン交換して透明な糖液を初だ。これを更に約
２．５Ｃ，）：でｊ威圧ＨＨ３縮して得らオ゛シた粘稠
な散を＋ｌｒ度メンフランフィルターで濾過し、ｄ・５
、液を凍結乾燥して白色のオリゴ糖（ヒフイスス増３ｉ
Ｑ囚子；以下、′Ｉ′ｏｓという）　、”）　ｆ）　Ｏ
ｇを１：ｊ−た。 この’ｒ　ｏ　ｓは、３糖類が約５５％、・・［糖類が
約３２％、５糖類以」二が約１３％のちのであり、また
、これらのンリゴ糖におけるグルツースとガラクトース
のモル比は、３ゎ７ｉ　Ｍの場合１：２．４糖顛の場合
１：３．５糖頬の場合１　：４であった。 このｌ″Ｏ８を用いて、健康１反人５人に対し次のよう
な実！倹を行なった。なお投１ｊ、　した菌液は、ビフ
ィドバクテリウム・ブリーベを＼；Ｌ−Ｇ梠地で４８時
間培養したのち遠心分離することにより１１４られた］
イ１本を牛乳培地に浮遊させたものである。 実験スケジュール １週目・・・・・・菌液のみ投与 ２週目・・・・・・菌液およびＴＯ３（３＋ｘ／ＩＥＩ
）を投与３週１」・・・・・・菌液およびｌ’Ｏ８（１
０＋：／１」）を投与投与菌数：１０’／Ｌｌ ’］’　ＯＳ投与方法：徽渇渇に溶１’ｌ’ｉ、　Ｌ　
４−１：食後に飲用側　定：各週３日１］、５１旧」お
よび７　ＥＩ　Ｌｌに各穴の大便中のヒ゛フィト゛ハク
テリウｌ、・７リーベ１肖故を：則疋し、その週におけ
る平均菌数をめた。 冥験の結果は第２図のとおりであって、ｉ’　ＯＳの投
与ｌこよりｌｌｖ内のヒフイドバクテリウム＋’ｌｈか
題、乙に増加することかわかる。 実験例　２ 健康１反人５人【二月し次のような芙験ネー行なった。 芙験スケジュール １週１１・・・・・”ｌ’　ＯＳ無投与２週１」・・・
　・ＴＯ３（３ｇ７日）を投与３週１」−−・ＴＯ３（
］　Ｏ０＋、：／１１）　を投ｊｊＴ　９３投与方法：
実験例１と同し 測　定：火験例コと同様にして大便中の総、ビフィドバ
クテリウ１１菌故を測定する。 実！倹結果を第３図に示す。同図から、’「Ｏ３の投与
によりヒトの１ｌｔｌｔ内に常在するピフイト゛バクテ
リウｌ、菌数が増加することかわかる。 実験例　３ 起源を異にする下記６種類のβ−ガラクトシダーゼにつ
いて、天ｊ験例１の場合と同４；）−にして（供し＋）
Ｉ−１は各酵素の至ｊ首ｐｌ＋ニ合ワせ、酵素Ａ　、Ｂ
、］’　＜７）場合１．ｔ　’１．５　トＬ、ＭＮＣ＋
Ｄ、Ｅの場合は７．０とした）、ラフ）−スな処理した
場合の処理時間の経過にともなう反応混合物中の糖１１
１成の変化を調べた。 酵素Ａ：アスペルギルス・オリゼを用いて製造したβ−
力゛ラクトシグーゼ。 酵素Ｂ：アスペルギルス・ニガーの生産したβ−ガラク
トシターゼ（協和発醇ネ」製品）。 酵素Ｃ：す／力ロミセス・７ランリスの生再：したβ−
ガラクトシダーゼ（協和発酵社製品）。 酵素ｌ）：　クリュイウ′エロミセ又・ラクティスを用
いて製造したβ−ガラクトシグーゼ。 醇素ＩＥ：エシェリキア・コリの生産したβ−カラクト
シダーゼ（ベーリンガーマンハイム社製品）。 ｆｉ！：素Ｆニアプリコント・エノ、ルシン（（Ｉｆ）
名７ンズ゛）より製造したβ−ガラクトシダーゼ なお反応混合物中の糖の定量は、高速（（層・１（クロ
マ）グラフィーにより下記の条件で行なった。 カラム：Ｙへ４Ｃ−ｐａｎＸＡ−６１２（Ｎ　Ｉｔ、）
株式会社島久製品、６　ｍｌｎφＸ　’１．５１１１１
１移動相：アセに１リル／′水（７０／３０　）流速：
　２＋１１１／ｍｉｎ 検出器：示差屈折計 各側における反応混合物のＩｌ、’ｊ　、１１１戒の経
ＩＬｌｌ的変化は第・１図〜ｆ：ＩＳＯ図のとおりであ
り、また、オリゴ糖生成５１シが最大になる時点におけ
る反応）１１合物絹成（ｊ’＋ｔ１１７．％）は第１表
のとおりであっブこ。 第１表 ＬＩＬ−ト　？Ｌυズ糖　−低」め−通　−・屋釘ｔｌ
’ｉ％　ｊ谷し二ろＡ　２６．２　３１．３　５．８　
３６．７Ｂ　］　・ｉ、　、　７　４　Ｊ　、　６！：
ｌ　、　２　、’３・・［，５Ｃ１７，８’１２．７　
］Ｓ、’３　２・１．２１）　１４．３　、・Ｌ８．Ｓ
　１７．０　２０．２Ｅ　１４．５　２９．０　２Ｇ、
７　２ｃ、〕、８Ｆ　８　、０　・＋５．０　１３，８
　’＜３．２実験粘果か呟アスペルギルス・オリ七の生
産したβ−ガラクトシダーゼ（酵素ｌ＼）が、１屯より
も顕著にすくれたオリゴ糖生成′をノｊえることかわか
る。また、この酵素を用いたｊ易介は、単１こ反応収率
が１ｔ；１いたけでなく、１１的とＶるＡリボ糖・＼の
転位反応の速度か大きく、オリゴ糖生成′！ｊｉ、は反
応開始後１時間でノυ大収ζ’４ｉ、：月し約７６％の
水イ（（に達する（この人°人でｌｌ１Ｙ素Ｃ，Ｅ、Ｆ
”よりもすぐれている）。そしてその後は約１）時ｆｉ
ｔｌで最大収率を示すか、生成した。ｔ　ｌ）ゴ糖を単
糖または転（多２１入り、ｌｉｌこ変］負する１［真向
１土はとんど認められず、したがって、酵素反応の条件
に多少の変動があっても、常に安定した収！η′および
品質か達成されるという長所かある（酵素Ｃ１１）、１
−：、Ｆは、反応時間の経過にともなうオリフ糖その池
のＪｌ、’を類の増ｊ威力惜しい。）。以」二に、Ｊ：
す、アスペルギルス・オリ七の生産するβ−ガラクトシ
グーゼがオリゴ糖製造用の酵素として顕著にすくれた性
１１ヒを有することがわかる。 実施例　１ 脱脂粉乳２０　（ｌ　ｋ８を水に７８解して］　、　（
，１＋、１　ｔ、＋　（“とじ、これにアスペルギルス
・Ａリゼの生産したβ−力゛ラクトシダーゼ１　、００
０刃車位を添加し、２時１１肌　４　ｆｌ　”Ｃに保っ
たのち、加熱して酵素を失活させると其に殺菌した。次
いで培養タンクに移し、ビフィドバクテリウム菌のスタ
ーターを接種して３７°Ｃで２・・１時間培養し、ｊ１
ｊ養終了後、“ｌ」線材等を添加して均質化することに
より、オリゴ糖３　り　１．＜　／　（’とヒフイドバ
クテリウム苗Ｑ’Ｊ　１ｉ１　′／　Ｉｎ　ｌとを含有
する発１Ｍ「１．をイｉｊた。 パ１０図面の簡単な説明 第１１］１：β−ガラクトシダーゼでラフ１−又を処理
したときの反応＋１；’ｊ＋　ｌ＋ＩｌとＪｌ、！ｉ頬
の収量との関係を示すグラ刀第２図：天験例］の実験ｉ
１１＋！ｉ果を示・ｊ−グラフ。 ｆ：Ｘｓ３し１：実験例２の天袋結果を示すグラフ。 第４図〜第０図ニジ４験例３の×験粘果を示すり′ラフ
。 代理人　弁理士　板井−Ｍ’Ｌ 菟１図 反応旧聞（Ｈｒ） 范２図 ＢンＪでヌｕｇ間（Ｈｒ） □ 円 錠　（％）窄聞腓 も 町 瞑

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. アスペルギルス・珂すゼの生産したβ−ガラクトシグー
   セでラクトースまたはラフ）−ス含イ１物貿を処理する
   ことを特徴とする、一般式Ｇａ１−（（’：ａｌ）ｎ−
   Ｃ；ｌｃ　（但し式中（ｉａｌは力゛ラクト−ス残Ｊ１
   （、（、；ｌｃはグルコース残ノ１１５．１１は１〜４
   のル゛；６数を、それぞれ表わす〕で示さｊしるヒフイ
   ドバクテリウム菌増殖促進因子を含有する飲食物の製造
   法。