JPS6045595A - 大腸菌及びシユ−ドモナスに於ける正確に処理されたヒト成長ホルモンの分泌 - Google Patents

大腸菌及びシユ−ドモナスに於ける正確に処理されたヒト成長ホルモンの分泌

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JPS6045595A
JPS6045595A JP59082770A JP8277084A JPS6045595A JP S6045595 A JPS6045595 A JP S6045595A JP 59082770 A JP59082770 A JP 59082770A JP 8277084 A JP8277084 A JP 8277084A JP S6045595 A JPS6045595 A JP S6045595A
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growth hormone
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グレゴリイ・ローレンス・グレイ
ヘルベルト・ルイス・ヒンケル
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、シグナルペゾテドを有するヒト成長ホルモン
（ｈＧＨ，プレヒト成長ホルモン）の大腸菌（Ｅ、　ｃ
ｏｌｔ　）及びシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ　）内での産生、並びにシグナル配列をタンパクのｈ
ＧＨ部分から開裂して成熟ｈＧＨを生成するための細菌
宿主による未処理の（プレ）タンノぐりのプロセッシン
グに係る。
ヒトａ長ホルモン（ｈｃｕ）はヒト下垂体で分泌される
。ｈＧｆ（は成熟形態では１９１個のアミノ酸からなシ
、分子量が約２１，５σ０であや、従ってインシュリン
の３倍以上も大きい。組換ＤＮＡ技術が出現する前のｈ
ＧＨは限られた入手源、即ちヒトの死体の下垂体からや
っかいな抽出によってしか得られなかった。ｈＧＨはや
けど、創傷の癒合、ジストロフィー、骨の癒着、胃の散
在性山地及び偽関節症の処置に有効であることが提案さ
れていたにもかかわらず、前記のようにこの物質は少量
でしか得られないためその応用は下垂体機能低下小人の
治療に限られていた。実際、手に入り得るデータから見
積ると、組織から得られるｈＧＨは下垂体機能低下ｌＪ
Ｓ人患者の約５０係に対処する量でしかない。このよう
にｈＧＨを他の用途に利用することは不可能でちる。
近年、ｕｉ換宿主細胞１％にＥ、ｃｏｌｔ　によって下
垂体機能低下小人及びｈＧＩ（が有効な他の症状の処置
に充分々量でｈＧＨを産生し得るととが開示でれた。例
えば米国特許第４，３４２，８３２号参照。このような
技術の進歩は後述の理由でｈＧＨによって改善される見
込みのある病状等に悩む人々にとっては恵みとなるが、
米国特許第４．３４２．８３２号の方法を使用して得ら
れるｈＧＨは、天然のｈＧＨには見られないアミノ酸メ
チオニンがタンパクのＮ−末端に付いたｈＧＨを少なく
とも実質的な量で含有する。この多少異なるｈＧＨが感
受性の個体に対して何らかの重大で望ましくない・副作
用を生ずるかどうか証拠はないが、ともかくその構造は
「成熟Ｊ　ｈＧＨとは異なるものである。ヒトの体内で
産生されるホルモンとは多少異なるホルモン。
例えば牛や他の動物の組織から抽出して得られた種々の
インシュリンが多年に亘りヒトの病気の治療に有効に使
用でれてきた。それにもかかわらず、組換］）ＮＡ技術
の出現によって、体内で産生されるインシュリンと正し
く同じアミノ酸配列を有するインシュリンを得ることが
可能になった。とれによって科学的のみならず医学的に
も大きく進歩した。即ち、ヒトインシュリンの製造方法
全利用することによって、動物のインシュリンを摂取し
た糖尿病患者に起こる有害な副作用の危険が低下するか
らである。従って、天然に存在するものとは少しだけ異
なる活性形態のｈＧＨが利用できるにもかかわらず、ア
ミノ酸含量に於いて下垂体が産生ずるｈＧＨの１９１個
のアミノ酸だけから成るｈＧＨを有利に取得する必要性
がある。更に。
本発明はｍｅｔ　のないｈＧＨを産業上利用し得る量で
産生ずる方法を開示する。
形質転換した微生物宿主中で異種ｈＧＲを発現するため
のベクターを得るのに組換ＤＮＡ技術を使用することは
今では充分に確立された科学である。この分野での最初
の成功は、グラム陰性菌Ｅ、ｃｏｌｔの菌株９例えばＥ
、　ｃｏｌｔ　Ｋ−１２株２９４を用いて達成された。
しかしながら、複雑な異種ポリペプチドを得るために微
生物宿主とじてＥ、ｃｏｌｔを使用することには制限が
ある。比較的小さいポリペプチドは、宿主によって減成
分解されるのを防ぐ爬め、標的ポリペプチドが大きいポ
リペプチドの１部として産生される融合タンノｇりとし
て得なければ々らない。多くの場合、融合タンパクとし
て産生てれた小タン・９りは大きい分子から何らかの方
法で開裂して有用な産物を得なければならない。
大きい異種タンノ？りは細胞によって減成されることが
なく、適切に配置された開始コドンを含む直接発現用遺
伝子が適切なプロモーター遺伝子。
例えば良く知られたｌａｃ　プロモーターに結合きれて
いれば直接に産生ずることができる。ｍＲＮＡのコード
配列の翻訳開始シグナルは、アミノ酸メチオニン（Ｍｅ
ｔ）ｉコードしているＡＴＧ遺伝子コドンから生成し＆
ＡＵＧである。原核生物のあるものは得られるタンパク
のＮ−末端Ｍｅ　ｔを除去しないので、細菌宿主中細菌
のプロモーターの制御下で異種ＤＮＡを発現させると時
ぺ一第一アミノ酸がメチオニンであるようなタン／Ｒり
が得られる。
例えばＥ、ｃｏｌｉでのｈＧＨ産生に関する今日１での
結果が示しているところでは、宿主細胞は細胞内でメチ
オニンを開裂するという限られた能力しか有していない
。又、細胞外で開裂する便利な方法も々い。従って、前
記したように、米国特許第４．３４２．８３２号の方法
によって微生物内で発現したｈ’ＧＨは、少なくとも実
質的な部分はメテオニレへ゛基が付いている産物であり
、このメチオニンは、ある種の環境では、このタン、Ｌ
！り産物を治療用途に用いた場合異種タン、ｅりとして
認識はせ得る。
（以下余白） 天然に存在する多くのタン）Ｑりは通常の環境では最初
付加的なペプチド配列が付いた形で発現される。この付
加的ペプチド配列によシ、タン／９りはそれが製造され
た細胞の細胞膜を通過し得るようになる。このようにし
て開裂されるこの付加ペプチドは「シグナル」ペゾチド
と称される。シグナル配列の遺伝子を含有する異種遺伝
子が細菌プロモーターの制御下に配置され且つ細菌が細
胞内でシグナル配列を開裂すると、メチオニンの付いて
いない成熟タンノ３りが得られるであろう。しかし、宿
主によって開裂されないと、シグナル配列は細胞外では
容易に開裂できないので成熟タン／Ｑりの単離が複雑に
なる。
「未成熟」タンノｑり、即ちシグナル配列と結合した所
望のタンノξりを旦、刈旦で産生じようという努力が払
われたが、Ｅ、ｅｏｌｉの如きグラム陰性菌はこのタン
パクのシグナル配列を有効に開裂処理しないことが示唆
されている。小さいタンノぐりであるプレプロインシュ
リンはＥ、　ｃｏｌｉ中で部分的にプロセッシングを受
けてシグナルペプチドが除去されることが示された。し
かしながら、線維芽細胞インターフェロン及び白血球イ
ンターフェロンのような大きな分子ではうまくいった例
はない。線維芽細胞インターフェロンの場合は、生物学
的に活性な物質は産生されなかった（　Ｔａｎｉｇｕｃ
ｈｉ。
Ｔ、ｅｔ　ａｌ、ｔ　Ｐｒ６ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、　’［ＪＳＡ＋　７７゜５２３０〜５２３３　
（１９８０）　）。白血球インターフェロンの場合は、
生物学的に活性な物質が産生されたが、輸送されず又適
格なプロセッシングもされなかった。
予期に反し本発明者等は、プレーｈＧＨの遺伝子、即ち
成熟タンノ（りの１９１１固のアミノ酸及びそのシグナ
ル配列チｒの２６岡のアミノ酸をコードしている遺伝子
がグラム陰性菌中で発現されてプレｈＧＨが得られ、こ
のプレｈＧＨは次に細胞内でプロセッシングを受けて成
熟タン／Ｑりからシグナルペプチドが開裂されることを
発見した（プレｈＧＨ又はプレタンノ９りとは、天然環
境下で所望タンパクを分泌させるシグナル配列を含有す
る所望のタンノ９りを意味する）。その結果としてｈＧ
Ｈが成熟形態で、天然環境では関連結合している他のタ
ンパクを含まない状態で得られる。即ち、本発明方法を
使用すると、ヒト由来のタンパクを含まないｈＧＨを、
天然に存在するタンノぐりのアミノ酸配列に加えて余分
なメチオニンを含まない形態で産業上有用な量で得るこ
とが可能になる。
又、本発明は、上、９月とＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓの両
方及び他の原核生物細菌種で使用することができる、未
成熟タン、ｅりの遺伝子の発現用複製可能ベクターをも
提供する。更に本発明は、このようなベクターで形質転
換され九原核生物宿主を提供する。
従って本発明の目的は、組換ＤＮＡ技術によってｈＧＨ
を得るための改良方法である。
他の目的は、天然の形態には見られない付加的アミノ酸
を含有しないｈＧＨを取得することである。
これらの目的及びその他の目的の達成は、以下に記載す
る好ましい態様から明らかに々るであろう。
本発明の一般的手順は、宿主原核細胞内で複製可能であ
シ且つ発現を司どるＤＮＡに有効に（発現するように）
連結されている未成熟ｈＧＨの発現をコーｒしているＤ
ＮＡ配列を含有する発現ベクター又はクローニングベヒ
クルの調製である。
本明細書中で使用する「原核生物」という用語は、核を
含有せず従ってその染色体が細胞質から分前されていな
い細胞を意味する。原核生物は例えば細菌を包含するが
酵母の如き有核微生物は包含しない。
特定的には、プラスミドは、プレｈＧＨを発現し且つプ
レｈＧＨからシグナル配列を開裂処理するという細菌宿
主の能力を示すべく　Ｅ、　ｃｏｌｉ及びＰｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ菌株の双方を形質転換するために使用し得る
発現ベクターとして構築した。
既に示されているように、Ｔ１匹旦中で異種ＤＮＡを発
現すべく改良された基本的プラスミドであるＥ、ｃｏｌ
ｉプラスミドｐＢＲ３２２は、広範囲の宿主でクローン
化されると、Ｐ　ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（Ｐ８．　）　
ａｅｒｕｇｅｎｏｓａ　（ａ、　）中に安定に維持でき
、同様に工、紳プラスミドであるスルホンアミド耐性（
ＳｕＲ）、ストレプトマイシン耐性（ＳｍＲ）ｆ）プラ
スミドｐＲ３Ｆ１０１０も同じである。Ｗｏｏｄｅｔ　
ａｌ−ｓ　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、ｓ　１４１４４８
　（１９８１）及びＳａｋａｇｏｕｃｈＬ　Ｃｕｒｒａ
ｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ
ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ＋　９６＋　３１　（１
９８２）参照。従ってｈＧＨをコードしておち且つ工、
印旦と旦訃双方の菌株を形質転換するのに使用し得るプ
ラスミドを得るために、タンノぐりの発現用遺伝子を含
有するハイブリッドプラスミドをｐＢＲ３２２及びｐＲ
８Ｆ１０１０から調製した。
未成熟ｈＧＨ，即ちシグナル配列の２６（ｒＩＡのアミ
ノ酸に結合したｈＧＨの１９１個のアミノ酸の発現をコ
ードするプラスミドの構築を第１図Ｂに示す。
ａｎｄ　Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎ９Ｍ＋Ｊ、　（Ｐｒａｅ
ｇｅｒ＋　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　）＋４６２−４８１　（
１９８２）に記載されているｐＢＲ３２２誘導体、即ち
ｐＨＧＨ２０７−１を使用する。
第１図Ｂに示したＩ）ＨＧＨ２０７−１を灰弦ＲＩで部
分消化し、最大断片をポリアクリルアミドゲル電気泳動
で精製した。この断片からＤＮＡポリメラーゼＫｌｅｎ
ｏｗ断片を用いて第２鎖を合成（５ｅｃｏｎｄｓｔｒａ
ｎｄ　５３ｒｎｔｈｅｓｉｓ　）　シＴ　４　ＤＮＡリ
ガーゼを用いて結合して、ｔｒｐプロモーター−リポゾ
ーム結合部位とｈＧＨ構造遺伝子との接合部に唯一のＥ
ｅ。
ＲＩ部位を有するプラスミドｐＨＧＨ２０７−１”を形
成した。ｐＨＧＨ２０７−１をＰｓｔ　Ｉで部分的に開
裂し、最大断片をポリアクリルアミドゲル電気泳動で精
製した。この断片からＤＮＡポリメラーゼに１ｅｎｏＶ
Ｊ断片を用いて第２鎖合成しＴ４ＤＮＡリガーゼを用い
て結合して、ｈＧＨ構造遺伝子中に唯一のＰａｔ　Ｉ部
位を有するシラスミドｐＨＧＨ２０７−１”−ＡＰＳを
作成した。ｐＨＧＨ２０７−１−ＡＰＳをＥｃｏＲＩ及
びＰｓｔ　Ｉで完全に消化し、最大断片をポリアクリル
アミドゲルを用いるゲル電気泳動によって精製した。こ
の断片はｔｒｐプロモーターと成熟ｈＧＨ遺伝子の５′
端を含有している。
嬉１図Ｂに示した第２のプラスミドｐＨＧＨｃＤＮＡを
Ｍａｒｔｉａｌ　ｅｔ　ａｌ−＋　５ｃｉｅｎｃｅ＋　
２０５＋　６０２−６０６（１９７９）に記載の如く調
製し、Ｈｐａ…で処理してｈＧＨのシグナルペプチドＤ
ＮＡ配列と成熟ｈＧＨのアミノ末端部分との大部分をコ
ードしている４６２塩基対（ｂｐ）断片を切除した。こ
の断片をポリアクリルアミドデルを用いるゲル電気泳動
で精製ｔ。
た。この断片をＰａｔ　Ｉで消化してｈＧＨのシグナル
ペプチドＤＮＡ配列と成熟ｈＧＨのアミノ−末端部分と
の大部分をコードしている１９２．　ｂｐ断片を切除し
た。この断片をポリアクリルアミドゲルを用いるゲル電
気泳動によって精製した。
第１図Ａに未成熟ｈＧＨのシグナルポリペプチドのアミ
ノ酸配列と、ＲＮＡ配列とを示す。この配列は細菌中で
の翻訳開始シグナルとなるｆ−ＭｅｔのコドンＡＵＧを
有しておシ、更に５′端近くにＨｐａ１部位を有してい
る。シグナル配列の遺伝子を完全にすると共にＥｃｏ　
ＲＩ及びＨｐａ　Ｉ［部位を形成するために、第１図Ｂ
に示す２個の合成オリゴヌクレオチドをＣｒｅａ、　Ｐ
ｒｏｃ、　Ｎａｔ’ｌ　、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ　、　
＋ＵＳＡ。
７５、５７６５　（１９７８）の改良トリエステル法で
合成した。２個の合成オリゴヌクレオチドの各５μｙの
試料をＧｏｅｄｄｅｌ　ｅｔ　ａｌ　、　ｓ　Ｐｒｏｃ
　、　Ｎａｔ’ｌ　、　Ａｃａｄ。
Ｓｅｔ、　ＵＳＡ、　７６、１０６（１９７９）に記載
の如くＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ及び〔γ−”ＰＩ
ＡＴＰ（ＮＥＮ）を用いてリン酸化した。次にこれら反
応生成物を混合し、９０Ｃで５分間加熱し、次いで２２
Ｃに冷却することで２個の分子をアニールした。
断片ｐＨＧＨ２０７−１及びｐＨＧＨｃＤＮＡ並びに合
成オリゴヌクレオチドを、Ｔ４リガーゼを用いる３ｖｒ
片結合法（ｔｈｒｅｅ　ｗａｙ　ｌｉｇａｔｉｏｎ　）
によって結合して第１図８に示すプラスミＦｐＰｒｅＨ
ＧＨ２０７−１を得た。このプラスミドｐＰｒｅＨＧＨ
２０７−１を３０匹に一１２株２９４（一旦、坤２９４
）中でクローン化しｆｃ、、このＥ、　ｃｏｌｉ　２９
４は１９７６年１０月２８日に−Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔ
ｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎに寄託
されてお）、ＡＴＣＣ受託番号は３１４４６である。こ
のプラスミドをＴｏのコロニーから単離した。ｔｒｐプ
ロモーター並びにｈＧＨシグナルポリペプチド及びアミ
ン末端アミノ酸のコドンを含有する領域のヌクレオチド
配列はジデオキシチェインターミネーション法で確認し
た。ＭｅｓｓｉｎｇｓＪ、　＊　Ｃｒｅａ＋　Ｒ，＊　
ａｎｄ　Ｓｅｅｂｕｒｇ、　Ｐ、　Ｈ，、Ｎｕｃｌｅｉ
ｅｐＰｒｅＨＧＨ２０７−１及びｐＨＧＨ２ｊ）７−１
をＸｂａ　ｌ及びＢａｍ　ＨＩで消化した。ｐ　Ｐ　ｒ
　ｅＨＧＩ（２０７−１の小さい方の断片をゲル電気泳
動で精製した。
この断片はプレｈＧＨ遺伝子全体を含有する。
ｐＨＧＨ２０７−１の大きい方の断片をゲル電気泳動で
精製した。この断片はｔｒｐプロモーターを含んでいる
。これら２個の断片を混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで処
理するとプラスミドｐＰｒｅＨＧＨ２０７−２が得られ
た。このシラスミドはｔｒｐプロモーターとプレｈＧＨ
遺伝子を含有する。ｐＰｒｅＨＧＨ２０７−２及びｐＲ
８Ｆ１０１０をＥｃＯＲＩで処理し、Ｔ４リガーゼで結
合してプラスミドｐＲＰＨ−２’ｅ得た。
このプラスミドを使用してＥ、　ｃｏｌｔ　２９４　ｆ
形質転換した。ｐ　ＲＰＨ−２ｋ　ＴｃＲ及びＢｍＲヲ
示すコロニーから得た。
発現ベクターｐＲＰＨ−２’ｅ使用してＰｓ、ａ、株Ｐ
ＡＯ２，００３を形質転換した。Ｃｈａｎｄｌｅｒ　ｅ
ｔ　ａｌ、　。
形質転換した細胞を、５０μｇ／ｍｅのテトラサイクリ
ンを含むＬｕｒｉａブロス（ＬＢ）中３７℃で一晩対数
期まで増殖させた。セルペレットを３０　ｍＭＴｒｉｓ
、　ｐＨ８，０、２０Δドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤ
Ｓ）に再懸濁し超音波処理した。細胞抽出物を、Ｐｈａ
ｅｄａｂａｓ　ｈＧＨＰＲＩＳＴキット（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ）を用いるラジオイムノアッセイによって分析す
るため順次希釈した。実質的レベルのｈＧＨが確認され
た（４Ｘ１０’　ｎｇ／”／Ａ３５０）。細胞抽出物を
ポリアクリルアミドゲル上１２．５１ＳＤＳ中で電気泳
動した。抗−ｈＧＨウサギ抗−面精（Ｋａｂｉ社製）と
１′２５　ニー標識Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａを用いる免疫ゾ
ｏｙト技術（ｉｒｒｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ　ｔｅｃ
ｈｎｉｑｕｅ）でｈＧＨを可視化した。オルトラジオグ
ラフィーによシ、細胞抽出物が抗−ｈＧＨと反応し真正
下垂体ｈＧＨと同じ電気泳動度を有する１種の主成分を
含有していることが判明した。いくらか泳動度の低い小
さいバンドも検出されたが、これは恐らく未処理のプレ
ｈＧＨでおろう。
細胞抽出物の主要な反応性成分を精製して免疫親和力ク
ロマトグラフィー（ｉｒｒｍｕｎｏａｆｆｉｎｉｔｙ　
ｃｈｒｏ−ｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）及び高速液体クロマ
トグラフィーによる均一成分を得た。アミノ−末端のア
ミノ酸配列は剛罷ｎの減成法（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ
　ｍｅｔｈｏｄ）によって決定した。ｈａｎ　ｅｔ　ａ
ｌ、　Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｎ、。
１、８０　（１９６７）参照。その結果均質でアシ、配
列Ｐｈｅ　−Ｐｒｏ　−Ｔｈｒ　−Ａｌａで始まること
が判明した。
これは下垂体ｈｌｌ、Ｈの配列に完全に相当する。
Ｅ、ｃｏｌｉとＰｓ、ｐｕｔｉｄａのｐ　ＲＰＨ−２に
よる形質転換体を用いてプレｈＧＨを発現させ原核生物
の開裂によって成熟ｈＧＨを得る実験を同様に行なった
ところ、Ｅ、ｃｏｌｉがシグナルペプチドを有するイン
ターフェロンのプロセッシングをしないという過去の知
見に反して、グラム陰性菌のプレｈＧＨを首尾よくプロ
セッシングする能力は普遍的な現象であるととが示され
た。
本発明の精神を逸脱することなく好ましい具体例に種々
の改良を加えることができるということは、以上の記載
から当業者には自明であろう。例えば、使用する組換宿
主がＥ、ｃｏｌｔであればシラー１又はｐ　ＰｒｅＨＧ
Ｈ２０７−２を使用して皿、叩其中で発現させることも
できる。従って、本発明は特許請求の範囲に記載した法
的範囲にのみ限定されるべきである。
４、図面の簡単な説明　５’、、、　Ａ　ＡＵＧ　ＧＣ
ＬＪ　ＡＣＡ　１嶌 ポリペプチドのアミノ酸配列及びｍＲＮＡ配列を示す図
であシ、第１５．＠はｈＧＨ発現プラスミドｐ　ＲＰＨ
２の構築を示す図である。
代理人弁理士今　村　元 ｇｌｙ　ｓｅｒ　ａｒｇ　Ｊｈｒ　ｓｅｒ　ｌｅｕ　１
ｅｒｒ　ｌｅｕ　ｖｉａ　ｐｈｅ３ＧＣＵＣＣＣＧＧ　
ＡＣＧ　ＵＣＣＣＵＧ　ＣＵＣＣＵＧ　ＧＣＬＩ　ＵＵ
Ｕφσ１１ ｃｙｓ　ｌｅｕ　ｐｒｏ　ｌｒｐ　Ｊｅｕ　ｇｉｎ　ｇ
／ｕ　ｇａｙ　ｓｅｒ　ａｈａＪＧＣＣＵＧ　ＣＣＣＵ
ＧＧ　ｃｕｕ　ＣＡＡ　ＧＡＧ　ＧＧＣＡＧＵ　ＧＣＣ
Ｕ　、、、３’第１頁の続き ■Ｉｎｔ、ＣＩ、’　識別記号　庁内整理番号０発　明
　者　ヘルベルト・ルイス・　アメリカ合衆国、ヒンケ
ル　ム、イーストン・ カリフォルニア・９４０１０、バーりンゲイドライヴ・
２６２１ 手彰■ネ山正叡］　（フリ：［（） １．事イ′１の表示　昭和５９年特許願第８２７７０月
２、発明の名称　大賜菌及びシュードモナスに於ける正
ｊｉｆｒに処理されたヒト成長小ルー［ンの分泌 ３、補正をする者 事イ′１との関係　特許出願人 名　称　ジエネンテツク・イン：」−ポレイデツド４、
代　理　人　東京都新宿区新宿１丁目１番１４号　山田
ビル（郵便番号１６０）電話（０３）　３５４−８６２
３８、補正の内容　部平を用いて適正な用紙に鮮明に描
いた第１Ｂ図を別紙の通り補正する。
（内容に変更なし）

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 （１）　アミノ酸配列が天然に存在するヒト成長ホルモ
    ン（ｈＧＨ）のアミノ酸配列から成シ、天然環境で関連
    結合している他のタン、Ｑりを実質的に含有せず、組換
    原核生物宿主によシ産生きれるヒト成長ホルモン。 （２）原核生物宿主細胞中でプレｈＧＨをコードしてい
    るＤＮＡ配列を発現させ得るＤＮＡ配列と有効に結合し
    ている前記プレｈＧＨ’（ｆコードしているＤＮＡ配列
    を含有する発現ベヒクル。 （３１−プレｈＧＨの発現を有効にコードしているｐＲ
    ８Ｆ１０１０と　ｐＢＲ３２２由来プラスミドとのハイ
    ブリッドシラスミドでアシ、原核生物宿主細胞中でプレ
    ｈＧＨを産生せしめ得る発現ベヒクル。 （４）　プラスミドｐＲＰＨ２゜ （５）　プレｈＧＨをコードしているＤＮＡ配列を発現
    させ得るＤＮＡ配列と有効に結合している前記プレｈＧ
    ＨをコードしているＤＮＡ配列を有する発現ベヒクルで
    形質転換した原核生物宿主。 （６）宿主がグラム陰性菌であることを特徴とする特許
    請求の範囲第５項に記載の形質転換体。 （力　宿主が大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｔ　）菌株であるこ
    とを特徴とする特許請求の範囲第６項に記載の形質転換
    体。 （８）菌株が大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　Ｋ　−１２株２
    ９４であることを特徴とする特許請求の範囲第７項に記
    載の形質転換体。 菌株であることを特徴とする特許請求の範囲第６項に記
    載の形質転換体。 （ＩＩ　宿主が菌株ＰＡ　０２００３であることを特徴
    とする特許請求の範囲第９項に記載の形質転換体。 （１υ　宿主がシュードモナス°ビュチダ（ｐａｅｕｄ
    （２）ｎａｓｐｕｔｉｄａ）の菌株であることを特徴と
    する特許謂求の範囲第６項に記載の形質転換体。 ０２発現ベヒクルがプレｈＧＨの発現を有効にコードし
    ているｐＲ８Ｆ　１０１０とＰＢＲ３２２由来シラスミ
    ドとのハイブリッドシラスミドであることを特徴とする
    特許請求の範囲第５項乃至第１１項のいずれかに記載の
    形質転換体。 （１［有］　シラスミドがｐＲＰＨ−２であることを特
    徴とする特許請求の範囲第１２項に記載の形質転換体。 Ｏａ　天然のヒト成長ホルモンのアミノ酸から成りヒト
    由来の他のタン／（りを実質的に含有しない成熟ヒト成
    長ホルモンの製造方法であって、プレヒト成長ホルモ／
    をコーＰしているＤＮＡ配列を発現させ得るＤＮＡ配列
    に有効に結合しＤＮＡ配列を有する発現ベヒクルで原核
    生物宿主を形質転換し、 得られた形質転換体を、前記形質転換体がプレヒト成長
    ホルモンの遺伝子を発現させ且つシグナル配列テＰを開
    裂するような条件下で接善することからなる方法。 （１９微生物宿主がグラム陰性菌であることを特徴とす
    る特許請求の範囲第１４項に記載の方法。 （１６１細菌を大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｔ）　、緑膿菌（
    Ｐｓｅｕｄｏｒｒａｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　）又
    はシュードモナス・ピュチダ（Ｐｓｅｕｄｏ−ｒｎｏｎ
    ａｓ　ｐｕｔｉｄａ）の菌株から選択することを特徴と
    する特許請求の範囲第１５項に記載の方法。 ０７）発現ベヒクルがプラスミドであることを特徴とす
    る特許請求の範囲第１６項に記載の方法。 （ｌ腸　プラスミドがｐＲ８Ｆ１０１Ｏと　ｐＢＲ３２
    ２誘導体とのハイブリッドであシ、前記ｐ　ＢＲ３２２
    が前記ＤＮＡ配列を含有していることを特徴とする特許
    請求の範囲第１７項に記載の方法。 ａｌ　プラスミドがｐＲＰＨ−２であることを特徴とす
    る特許請求の範囲第１８項に記載の方法。
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