JPS6323896A - ウイルスの不活性化および活性蛋白質の精製 - Google Patents
ウイルスの不活性化および活性蛋白質の精製Info
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- JPS6323896A JPS6323896A JP62171330A JP17133087A JPS6323896A JP S6323896 A JPS6323896 A JP S6323896A JP 62171330 A JP62171330 A JP 62171330A JP 17133087 A JP17133087 A JP 17133087A JP S6323896 A JPS6323896 A JP S6323896A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
この開示は、一般に、ウィルスの不活性化工程を最後の
活性蛋白質精製工程の前に実施する、安全な効能の高い
活性蛋白質生成物の精製に関する。精製および引続くウ
ィルスの不活性化の普通の順序を逆転することによって
、比較的過酷な条件のウィルスの不活性化工程から生ず
る不活性または変性された蛋白質を除去することが可能
である。本発明は、アンチトロンビンとして知られてい
る特別の活性蛋白質を使用して例示する。しかしながら
、後述するように、開示する方法は他の生物学的に活性
な蛋白質に適用することができる。
活性蛋白質精製工程の前に実施する、安全な効能の高い
活性蛋白質生成物の精製に関する。精製および引続くウ
ィルスの不活性化の普通の順序を逆転することによって
、比較的過酷な条件のウィルスの不活性化工程から生ず
る不活性または変性された蛋白質を除去することが可能
である。本発明は、アンチトロンビンとして知られてい
る特別の活性蛋白質を使用して例示する。しかしながら
、後述するように、開示する方法は他の生物学的に活性
な蛋白質に適用することができる。
アンチトロンビンは、また、アンチトロンビンＩＩＩ、
ＡＴ−Ｉ Ｉ Ｉまたはヘパリンコファクターとして知
られており、凝固プロセスを阻害する能力をもつ血漿蛋
白質である。アンチトロンビンは凝固プロテアーゼ類の
阻害剤であり、その阻害剤活性はヘパリンの存在下に顕
著に増大される。ヘパリンは、雌具的に抗凝固剤として
広く使用されている動物起源の硫酸化グリコサミノグリ
カンである。
ＡＴ−Ｉ Ｉ Ｉまたはヘパリンコファクターとして知
られており、凝固プロセスを阻害する能力をもつ血漿蛋
白質である。アンチトロンビンは凝固プロテアーゼ類の
阻害剤であり、その阻害剤活性はヘパリンの存在下に顕
著に増大される。ヘパリンは、雌具的に抗凝固剤として
広く使用されている動物起源の硫酸化グリコサミノグリ
カンである。
血液血漿中のアンチトロンビンの正常の循環レベルに欠
ける患者は、血栓症の危険が増大しているＫとが示され
た。欠乏した状態は先天性または後天性であることがあ
る。プールした正常血漿のそれの７０％より低いアンチ
トロンビンレベルは、血栓症の危険に関連する。精製さ
れた血漿誘導アンチトロンビンを使用する置換の治療は
、このような欠乏を有する個体にとって、かなり有益で
あることがる。
ける患者は、血栓症の危険が増大しているＫとが示され
た。欠乏した状態は先天性または後天性であることがあ
る。プールした正常血漿のそれの７０％より低いアンチ
トロンビンレベルは、血栓症の危険に関連する。精製さ
れた血漿誘導アンチトロンビンを使用する置換の治療は
、このような欠乏を有する個体にとって、かなり有益で
あることがる。
ヘパリンによるアンチ、トロンビン活性の増強は、主と
してヘパリンと阻害剤との間溶液の結合の相互作用のた
めである。この結合の相互作用の厳密な高度に特異的な
性質の認識は、生物学的流体からのアンチトロンビンの
吸着のための親和性支持体として、固定化されたヘパリ
ンを使用することを誘発した。アンダーソン（Ａｎｄｅ
ｒｓ。
してヘパリンと阻害剤との間溶液の結合の相互作用のた
めである。この結合の相互作用の厳密な高度に特異的な
性質の認識は、生物学的流体からのアンチトロンビンの
吸着のための親和性支持体として、固定化されたヘパリ
ンを使用することを誘発した。アンダーソン（Ａｎｄｅ
ｒｓ。
ｎ）らヘノ米国特許第３，８４２，０６１号参照。この
技術は、多数の研究者らによって、アンチトロンビンの
十分な精製を達成するための高度に有効な工程であるこ
とが示された。したがって、アンチトロンビンのための
事実上大規模な分離方法は、固定化されたヘパリン上へ
の親和吸着を用いる。アンチトロンビン精製の他の例は
よく知られている。
技術は、多数の研究者らによって、アンチトロンビンの
十分な精製を達成するための高度に有効な工程であるこ
とが示された。したがって、アンチトロンビンのための
事実上大規模な分離方法は、固定化されたヘパリン上へ
の親和吸着を用いる。アンチトロンビン精製の他の例は
よく知られている。
しかしながら、商業的コーン冷エタノール法（ｃｏｈｎ
ｃｏｌｄ ｅｔｈａｎｏｌ ｐｒ。
ｃｏｌｄ ｅｔｈａｎｏｌ ｐｒ。
ｃ ｅ ｓ ｓ）における初期の時点における血漿から
のアンチトロンビンの直接吸着のためのヘパリン親和ク
ロマトグラフィーの使用は、いくつかの理由で複雑であ
る。血漿は蛋白質類と親和性が変化する他の成分との高
度に複雑な混合物である。固定化されたヘパリン支持体
を血漿と直接接触させると、これらの成分の多くは吸着
する。同−源の血漿からいくつかの異なる蛋白質生成物
が得られるので、親和接触工程の結果として、これらの
生成物における悪い変化を導入する可能性に関して重要
な調節の考慮がなされる。
のアンチトロンビンの直接吸着のためのヘパリン親和ク
ロマトグラフィーの使用は、いくつかの理由で複雑であ
る。血漿は蛋白質類と親和性が変化する他の成分との高
度に複雑な混合物である。固定化されたヘパリン支持体
を血漿と直接接触させると、これらの成分の多くは吸着
する。同−源の血漿からいくつかの異なる蛋白質生成物
が得られるので、親和接触工程の結果として、これらの
生成物における悪い変化を導入する可能性に関して重要
な調節の考慮がなされる。
親和ゲルへの多数の血漿成分の吸着は、また、アンチト
ロンビンそれ自体の溶離の前に、望ましくない汚染物質
の選択的吸着を必要とする。これは単一の親和クロマト
グラフィー工程において達成することが非常に困難であ
ることが立証されそして、しばしば、これらの不純物を
除去するための追加の精製工程を含めることを必要とす
る。あるいは、ヘパリンのゲルからアンチトロンビンを
溶離する前に、広範な洗浄工程を含めることは、純度を
許容されうるレベルに増加するが、アンチトロンビンの
収量をかなり減少させるだけである。
ロンビンそれ自体の溶離の前に、望ましくない汚染物質
の選択的吸着を必要とする。これは単一の親和クロマト
グラフィー工程において達成することが非常に困難であ
ることが立証されそして、しばしば、これらの不純物を
除去するための追加の精製工程を含めることを必要とす
る。あるいは、ヘパリンのゲルからアンチトロンビンを
溶離する前に、広範な洗浄工程を含めることは、純度を
許容されうるレベルに増加するが、アンチトロンビンの
収量をかなり減少させるだけである。
商業的血漿の分画の間に通常用いられる大きい体積およ
び処理の後の工程から誘導される生成物へのクロマトグ
ラフィーの起こりうる衝撃のために、処理の使用した廃
棄分画はアンチトロンビン源として考慮されてきた。と
くに、アルブミンの精製前 の中間工程から誘導される
、通常廃棄される沈殿である血漿源コーンフラクション
ＩＶ−１は、アンチトロンビンに富んでいることが発見
された。参照、ウィッカーハウゼル（Ｗｉｃｋｅｒｈａ
ｕｓｅｒ）ら、ボックス・サンプ（Ｖ ｏ ｘＳａｎｇ
、）３６．２８１−２９３ （１９７９）。しかしなが
ら、このような源は、多量のリポ蛋白質および他の変性
された成分のために、クロマトグラフィー（再懸濁後）
のための理想的な解決ではない。収量を大量に犠牲にし
ないで、固定化されたヘパリンのコーンフラクションＩ
Ｖ−１の溶液の直接クロマトグラフィーにより、高いレ
ベルのアンチトロンビンの純度を得ることは通常非常に
困難である。
び処理の後の工程から誘導される生成物へのクロマトグ
ラフィーの起こりうる衝撃のために、処理の使用した廃
棄分画はアンチトロンビン源として考慮されてきた。と
くに、アルブミンの精製前 の中間工程から誘導される
、通常廃棄される沈殿である血漿源コーンフラクション
ＩＶ−１は、アンチトロンビンに富んでいることが発見
された。参照、ウィッカーハウゼル（Ｗｉｃｋｅｒｈａ
ｕｓｅｒ）ら、ボックス・サンプ（Ｖ ｏ ｘＳａｎｇ
、）３６．２８１−２９３ （１９７９）。しかしなが
ら、このような源は、多量のリポ蛋白質および他の変性
された成分のために、クロマトグラフィー（再懸濁後）
のための理想的な解決ではない。収量を大量に犠牲にし
ないで、固定化されたヘパリンのコーンフラクションＩ
Ｖ−１の溶液の直接クロマトグラフィーにより、高いレ
ベルのアンチトロンビンの純度を得ることは通常非常に
困難である。
プールした血漿または生物学的に活性な蛋白質の他の源
から蛋白質を精製するための追加の考慮は、ウィルスの
汚染の可能性である。肝炎Ｂ型ウィルスおよびエイズの
ウィルスがとくに考えられる。肝炎Ｂ型ウィルスに関す
ると、０．５モルのクエン酸ナトリウムの存在下に６０
℃に１０時間加熱すると、ウィルスは完全に不活性化す
ることが示された。参照、ティパー（Ｔａｂｏｒ）ら、
血栓症の研究（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅ５ｅａｒ
ｃｈ）２２．２３３−２３８ （１９８１）。
から蛋白質を精製するための追加の考慮は、ウィルスの
汚染の可能性である。肝炎Ｂ型ウィルスおよびエイズの
ウィルスがとくに考えられる。肝炎Ｂ型ウィルスに関す
ると、０．５モルのクエン酸ナトリウムの存在下に６０
℃に１０時間加熱すると、ウィルスは完全に不活性化す
ることが示された。参照、ティパー（Ｔａｂｏｒ）ら、
血栓症の研究（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅ５ｅａｒ
ｃｈ）２２．２３３−２３８ （１９８１）。
アンチトロンビンの活性の大部分はこの熱処理の間に維
持されるが、有意なかつ変化する量の不活性化が起こる
ことが観測された。参照、上のティパー（Ｔａｂｏｒ）
ら、およびバロウクリッフェ（Ｂａｒｒｏｗｃｌｉｆｆ
ｅ）ら、Ｆｒ、Ｊ、Ｈａｅｍａｔ ｏ １ ｏｇｙ）、
５５．３７−４６ （１９８３）。こうして、ウィルス
の汚染からの安全性を確保する必要は、アンチトロンビ
ン自体の不活性化を引き起こす危険を多少伴なう。この
後者の可能性は、熱変性された蛋白質の注射が、これら
の物質の潜在的に新しい抗原性のために、患者に応答を
誘発することがあるので、面倒である。
持されるが、有意なかつ変化する量の不活性化が起こる
ことが観測された。参照、上のティパー（Ｔａｂｏｒ）
ら、およびバロウクリッフェ（Ｂａｒｒｏｗｃｌｉｆｆ
ｅ）ら、Ｆｒ、Ｊ、Ｈａｅｍａｔ ｏ １ ｏｇｙ）、
５５．３７−４６ （１９８３）。こうして、ウィルス
の汚染からの安全性を確保する必要は、アンチトロンビ
ン自体の不活性化を引き起こす危険を多少伴なう。この
後者の可能性は、熱変性された蛋白質の注射が、これら
の物質の潜在的に新しい抗原性のために、患者に応答を
誘発することがあるので、面倒である。
現在まで、臨床的アンチトロンビン濃縮物のための大規
模な調製法は、固定化されたヘパリン上の親和吸若工程
に引続いて、低温設面工程を組込んだ。こうして、これ
らの生成物は、上のバロウクリッフｘ （Ｂａｒｒｏｗ
ｃｌｉｆｆｅ）らが示すように、大量の変性されたアン
チトロンビンを潜在的に含有する。われわれは、変性ま
たは不活性化された蛋白質および他の不純物をウィルス
の不活性化後に除去する、生物学的に活性な蛋白質生成
物を調製する方法を知らない。
模な調製法は、固定化されたヘパリン上の親和吸若工程
に引続いて、低温設面工程を組込んだ。こうして、これ
らの生成物は、上のバロウクリッフｘ （Ｂａｒｒｏｗ
ｃｌｉｆｆｅ）らが示すように、大量の変性されたアン
チトロンビンを潜在的に含有する。われわれは、変性ま
たは不活性化された蛋白質および他の不純物をウィルス
の不活性化後に除去する、生物学的に活性な蛋白質生成
物を調製する方法を知らない。
上の問題の各々を処理する、生物学的に活性な蛋白質の
精製法を、ここに記載する。この方法は、多くの活性な
治療的蛋白質について適用可能であると考えられる。後
に例示するように、本発明の方法は、血漿蛋白質の混合
物、例えば、コーンフラクションＩＶ−１からアンチト
ロンビンを分離するためにとくに適する。この手順の必
須の成分は、２つの工程を含む：初期のつ・ｒルスの不
活性化（例えば、低温殺菌）工程および引続く生物学的
に活性な蛋白質の調製工程。アンチトロンビンの例示す
る場合において、部分的に精製されたアンチトロンビン
の濃縮物をウィルスの不活性化工程（例えば、ティパー
（Ｔａｂｏｒ）らが前に記載したような、０．５モルの
クエン酸ナトリウムの存在下の低温殺菌）にかける。次
いで、この熱処理したアンチトロンビン溶液を、例えば
、ヘパリン親和ゲル（固定化されたヘパリン）の直接の
クロマトグラフィーによって、分離する。この親和クロ
マトグラフィーは、最初の精製から誘導される汚染物質
の大部分の除去ならびに、熱処理工程から生ずる、不活
性なアンチトロンビン自体を包含する変性された蛋白質
の大部分の除去を確実にする。次いで、アンチトロンビ
ンを？ｉ［し、そしてｅＭする。次いで、濃縮物は、好
ましくは、さらに処理して、例えば、所望の賦形剤を含
め、そして凍結乾燥する。得られる凍結乾燥された蛋白
質（アンチトロンビン）濃縮物は、非常に高いレベルの
純度、かなりの程度のウィルスの安全性、および変性さ
れたまたは不活性のアンチトロンビンの事実上の不存在
によって特徴づけられる。活性蛋白質、例えば、アンチ
トロンビンのだめの血漿源はよく知られている。本発明
の好ましい源は、コーンフラクションＩＶ−１ペースト
として知られている現在廃棄される分画である。
精製法を、ここに記載する。この方法は、多くの活性な
治療的蛋白質について適用可能であると考えられる。後
に例示するように、本発明の方法は、血漿蛋白質の混合
物、例えば、コーンフラクションＩＶ−１からアンチト
ロンビンを分離するためにとくに適する。この手順の必
須の成分は、２つの工程を含む：初期のつ・ｒルスの不
活性化（例えば、低温殺菌）工程および引続く生物学的
に活性な蛋白質の調製工程。アンチトロンビンの例示す
る場合において、部分的に精製されたアンチトロンビン
の濃縮物をウィルスの不活性化工程（例えば、ティパー
（Ｔａｂｏｒ）らが前に記載したような、０．５モルの
クエン酸ナトリウムの存在下の低温殺菌）にかける。次
いで、この熱処理したアンチトロンビン溶液を、例えば
、ヘパリン親和ゲル（固定化されたヘパリン）の直接の
クロマトグラフィーによって、分離する。この親和クロ
マトグラフィーは、最初の精製から誘導される汚染物質
の大部分の除去ならびに、熱処理工程から生ずる、不活
性なアンチトロンビン自体を包含する変性された蛋白質
の大部分の除去を確実にする。次いで、アンチトロンビ
ンを？ｉ［し、そしてｅＭする。次いで、濃縮物は、好
ましくは、さらに処理して、例えば、所望の賦形剤を含
め、そして凍結乾燥する。得られる凍結乾燥された蛋白
質（アンチトロンビン）濃縮物は、非常に高いレベルの
純度、かなりの程度のウィルスの安全性、および変性さ
れたまたは不活性のアンチトロンビンの事実上の不存在
によって特徴づけられる。活性蛋白質、例えば、アンチ
トロンビンのだめの血漿源はよく知られている。本発明
の好ましい源は、コーンフラクションＩＶ−１ペースト
として知られている現在廃棄される分画である。
血漿中に存在するか、あるいは遺伝子工学に付される微
生物または細胞系から発現される、他の活性蛋白質、例
えば、血小板因子ＩＶ、凝固因子Ｉ工、Ｖ、ＶＩＩ、Ｖ
ＩＩＩ、工ｘおよびＸ、蛋白質ＣおよびＳおよび蛋白質
（例えば、抗生物質、成長因子α１−Ｐｌ、および精製
のために利用できる生物学的親和性を有する事実上任意
の蛋白質）を、同様に調製し、そして活性ウィルスを実
質的に含有せずかつ不活性な形態の蛋白質を実質的に含
有しないようにすることができる。
生物または細胞系から発現される、他の活性蛋白質、例
えば、血小板因子ＩＶ、凝固因子Ｉ工、Ｖ、ＶＩＩ、Ｖ
ＩＩＩ、工ｘおよびＸ、蛋白質ＣおよびＳおよび蛋白質
（例えば、抗生物質、成長因子α１−Ｐｌ、および精製
のために利用できる生物学的親和性を有する事実上任意
の蛋白質）を、同様に調製し、そして活性ウィルスを実
質的に含有せずかつ不活性な形態の蛋白質を実質的に含
有しないようにすることができる。
アンチトロンビンの精製の場合において、本発明の好ま
しい分離工程は、炭水化物の支持体上に固定化されたヘ
パリン（例えば、セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）
アガロースへ共有結合したヘパリン）を使用する。この
開示の方法を使用して、活性ウィルスを実質的に含有ぜ
ず、そして合計にアンチトロンビン蛋白質の１ｍｇにつ
き少なくとも約６国際単位の生物学的に活性なアンチト
ロンビンの活性を有する、精製されたアンチトロンビン
生成物を得ることができた。
しい分離工程は、炭水化物の支持体上に固定化されたヘ
パリン（例えば、セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）
アガロースへ共有結合したヘパリン）を使用する。この
開示の方法を使用して、活性ウィルスを実質的に含有ぜ
ず、そして合計にアンチトロンビン蛋白質の１ｍｇにつ
き少なくとも約６国際単位の生物学的に活性なアンチト
ロンビンの活性を有する、精製されたアンチトロンビン
生成物を得ることができた。
実施側光
（アンチトロンビンの精製）
コーンフラクションＩＶ−１ペースト、６ｋｇ（プール
した血漿から集め、そして−３０℃に凍結して貯蔵した
もの）を、０．１モルのトリス、０．０２モルの塩化ナ
トリウムから成る緩衝液、ｐＨ８，２、の合計５０リツ
トル中に溶解した。
した血漿から集め、そして−３０℃に凍結して貯蔵した
もの）を、０．１モルのトリス、０．０２モルの塩化ナ
トリウムから成る緩衝液、ｐＨ８，２、の合計５０リツ
トル中に溶解した。
５℃において１時間貯蔵した後、この溶液を４０℃に加
温し、そしてさらに１時間攪拌した０次いで、０．０２
モルのトリス、０．１５モルｃ７）ＮａＣ１、ｐ）（７
，８、中で前もって平衡化した、ヘパリン−セファロー
スゲル（固定化されたヘパリン）、６ｋｇを、コーンフ
ラクションＩＶ−１の溶液に添加し、そして２０分間攪
拌した。この懸濁液をフィルターの漏斗に移し、モして
濾液のコーンフラクションＩＶ−１の溶液を集め、保存
した。次いで、ゲルを０．０２モルのトリス、０．３モ
ルのＮａｃｌから成る緩衝液、ｐＨ７。
温し、そしてさらに１時間攪拌した０次いで、０．０２
モルのトリス、０．１５モルｃ７）ＮａＣ１、ｐ）（７
，８、中で前もって平衡化した、ヘパリン−セファロー
スゲル（固定化されたヘパリン）、６ｋｇを、コーンフ
ラクションＩＶ−１の溶液に添加し、そして２０分間攪
拌した。この懸濁液をフィルターの漏斗に移し、モして
濾液のコーンフラクションＩＶ−１の溶液を集め、保存
した。次いで、ゲルを０．０２モルのトリス、０．３モ
ルのＮａｃｌから成る緩衝液、ｐＨ７。
５、で、溶離液の吸収（２８０ｎｍ）が０．３６に到達
するまで、よく洗浄した。次いで、０．０２モルのトリ
ス、２モルのＮａＣ１から成る緩衝液、ｐＨ７，５、で
ゲルを洗浄することによって、アンチトロンビンを溶離
した。０．２（２８０ｎｍ）より大きい吸収で溶離され
る物質のすべてを、さらに処理するために、プールとし
て集めた。
するまで、よく洗浄した。次いで、０．０２モルのトリ
ス、２モルのＮａＣ１から成る緩衝液、ｐＨ７，５、で
ゲルを洗浄することによって、アンチトロンビンを溶離
した。０．２（２８０ｎｍ）より大きい吸収で溶離され
る物質のすべてを、さらに処理するために、プールとし
て集めた。
次いで、パッチのヘパリン−セファロース吸着からプー
ルした溶離液を、中空！！雄の限外濾過装置（ロミコン
（Ｒｏｍｉｃｏｎ）） で４．０リツトルの最終体積に
濃縮し、そして０．０２１、のリン酸ナトリウム、０．
１５モルのＮａＣ１，０，５モルのクエン酸ナトリウム
から成る最終緩衝液、ｐＨ７，５、に対して透析した。
ルした溶離液を、中空！！雄の限外濾過装置（ロミコン
（Ｒｏｍｉｃｏｎ）） で４．０リツトルの最終体積に
濃縮し、そして０．０２１、のリン酸ナトリウム、０．
１５モルのＮａＣ１，０，５モルのクエン酸ナトリウム
から成る最終緩衝液、ｐＨ７，５、に対して透析した。
次いで、この溶液を、ウィルスの不活性化を確実にする
ために十分な条件下に加熱した（例えば、６０℃±０．
５℃の溶液温度に１０時間）。
ために十分な条件下に加熱した（例えば、６０℃±０．
５℃の溶液温度に１０時間）。
この熱処理後、溶液を２０℃に冷却し、そして０．２ミ
クロンのフィルターで濾過して、低温殺菌から生じたか
も知れない粒状物質を除去した。
クロンのフィルターで濾過して、低温殺菌から生じたか
も知れない粒状物質を除去した。
次いで、濾過装置の洗浄液を含む、濾過した溶液を、０
．０２モルのリン酸ナトリウム、０．１５モルのＮａｃ
ｌ、ｐＨ７，５、中で前もっ−て平衡化した、ヘパリン
−セファロースのカラム（１４Ｘ２１ｃｍ）上に直接適
用し、そしてこの方ラムを試料の適用後回−緩衝液で洗
浄した。基線の水準に到達するまで、溶離した溶液の吸
収を監視しく２８０ｎｍ）、次いでこの方ラムを２モル
のＮａｃｌを含有するリン酸塩緩衝液で溶離した。
．０２モルのリン酸ナトリウム、０．１５モルのＮａｃ
ｌ、ｐＨ７，５、中で前もっ−て平衡化した、ヘパリン
−セファロースのカラム（１４Ｘ２１ｃｍ）上に直接適
用し、そしてこの方ラムを試料の適用後回−緩衝液で洗
浄した。基線の水準に到達するまで、溶離した溶液の吸
収を監視しく２８０ｎｍ）、次いでこの方ラムを２モル
のＮａｃｌを含有するリン酸塩緩衝液で溶離した。
０．０４より大きい吸収で溶離する物質のすべてを、合
計の体積が３．０５リツトルのプールとして集めた。ア
ンチトロンビンの回収の要約を、下表に表わす。
計の体積が３．０５リツトルのプールとして集めた。ア
ンチトロンビンの回収の要約を、下表に表わす。
実施例ＩＩ
実施側光の工程を反復したが、ただし最終の低温殺菌し
たアンチトｏンビン生成物を引続いて安定剤としてアミ
ノ酸（０，１モルのアラニン）と−緒に凍結乾燥した。
たアンチトｏンビン生成物を引続いて安定剤としてアミ
ノ酸（０，１モルのアラニン）と−緒に凍結乾燥した。
実施例ＩＩＩ
実施側光の工程を反復したが、ただしコーンフラクショ
ンＩＶ−１の溶液のパッチ式接触後に、０．０２−ｆニ
ル（７）トリス、０．１５モルのＮａＣ１および１〜２
ｇ／ｌの硫酸デキストランを含有する緩衝液で、ヘパリ
ン−アガロースゲルをさらに洗浄した。
ンＩＶ−１の溶液のパッチ式接触後に、０．０２−ｆニ
ル（７）トリス、０．１５モルのＮａＣ１および１〜２
ｇ／ｌの硫酸デキストランを含有する緩衝液で、ヘパリ
ン−アガロースゲルをさらに洗浄した。
上の実施例はウィルスの不活性化および非常に特定の活
性蛋白質の精製を記載するが、当業者は理解するように
、開示した技術は種々の源（例えば、動物またはヒトの
血漿、遺伝子工学された微生物または細胞系など）から
得られる非常に広範。
性蛋白質の精製を記載するが、当業者は理解するように
、開示した技術は種々の源（例えば、動物またはヒトの
血漿、遺伝子工学された微生物または細胞系など）から
得られる非常に広範。
な種類の活性蛋白質に適用することができる。開示した
技術を使用するための主な要件は、２倍である： （１
）生物学的に活性な蛋白質生成物中のウィルスの不活性
化、および（２）変性されたまたは不活性な形態の活性
蛋白質が、存在する場合、最小である、活性蛋白質生成
物。
技術を使用するための主な要件は、２倍である： （１
）生物学的に活性な蛋白質生成物中のウィルスの不活性
化、および（２）変性されたまたは不活性な形態の活性
蛋白質が、存在する場合、最小である、活性蛋白質生成
物。
使用できる生物学的に不活性な技術は、低温殺菌、化学
的処理（薬剤、例えば、米国特許第４゜５３４．９７２
号などに記載されているよう銅フタロシアニンの使用）
および照射である。活性蛋白質の分離技術の例は、活性
な形態と不活性な形態とを識別するように、蛋白質の生
物学的活性に基づく分離を可能とする方法（例えば、親
和クロマトグラフィーまたは適用結合因子、例えば、生
物学的に活性な形態の蛋白質を認識する抗体の使用）を
包含する。
的処理（薬剤、例えば、米国特許第４゜５３４．９７２
号などに記載されているよう銅フタロシアニンの使用）
および照射である。活性蛋白質の分離技術の例は、活性
な形態と不活性な形態とを識別するように、蛋白質の生
物学的活性に基づく分離を可能とする方法（例えば、親
和クロマトグラフィーまたは適用結合因子、例えば、生
物学的に活性な形態の蛋白質を認識する抗体の使用）を
包含する。
ここで使用するとき、用語「生物学的に活性」は、蛋白
質に適用するとき、（不活性な、変性されたまたは無用
の状態の同一蛋白質と反対に）蛋白質がその意図する機
能を示すか、あるいは意図する結果に有用である蛋白質
の形態または形状を意味する。所定の蛋白質がその意図
する機能を示すか、あるいは意図する結果を達成するた
めの生物学的活性を有するかどうかは、当業者に知られ
た手段（例えば、簡単な機能的活性のアッセイ、免疫学
的手段など）によって決定することができる。
質に適用するとき、（不活性な、変性されたまたは無用
の状態の同一蛋白質と反対に）蛋白質がその意図する機
能を示すか、あるいは意図する結果に有用である蛋白質
の形態または形状を意味する。所定の蛋白質がその意図
する機能を示すか、あるいは意図する結果を達成するた
めの生物学的活性を有するかどうかは、当業者に知られ
た手段（例えば、簡単な機能的活性のアッセイ、免疫学
的手段など）によって決定することができる。
「ウィルスの不活性化または活性ウィルスを実質的に含
有しない」は、存在するウィルスを除去または不活性化
して、供されうるレベルまたは菌株不可能なレベルに安
全にすることを意味する。
有しない」は、存在するウィルスを除去または不活性化
して、供されうるレベルまたは菌株不可能なレベルに安
全にすることを意味する。
所定の活性蛋白質の調製物の「低温殺菌した形態」は、
存在するかも知れないウィルスを不活性化するために十
分な低温殺菌または熱処理（例えば、６０℃における少
なくとも１０時間の加熱）にかけた調製物を意味する。
存在するかも知れないウィルスを不活性化するために十
分な低温殺菌または熱処理（例えば、６０℃における少
なくとも１０時間の加熱）にかけた調製物を意味する。
所定の蛋白質の「変性されたまたは不活性な形態を含ま
ない」は、所定の蛋白質生成物が生物学的に活性な蛋白
質から主として含み、かつ変性されたまたは不活性な形
態が存在しないか、あるいは検出できない少量で存在す
る（例えば、交差免疫電気泳動により決定して、一般に
約１０重量％より少ないか、あるいは、アンチトロンビ
ンの場合において、アンチトロンビンの不活性種が約１
０重量％より少ない）ことを意味する。
ない」は、所定の蛋白質生成物が生物学的に活性な蛋白
質から主として含み、かつ変性されたまたは不活性な形
態が存在しないか、あるいは検出できない少量で存在す
る（例えば、交差免疫電気泳動により決定して、一般に
約１０重量％より少ないか、あるいは、アンチトロンビ
ンの場合において、アンチトロンビンの不活性種が約１
０重量％より少ない）ことを意味する。
上に与えた開示から種々の形態が、当業者にとって明ら
かであろう、したがって、上の実施例は例示をのみ目的
とし、そして本発明の範囲は特許請求の範囲によっての
み限定される。
かであろう、したがって、上の実施例は例示をのみ目的
とし、そして本発明の範囲は特許請求の範囲によっての
み限定される。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、工程： （ａ）所定の生物学的に活性な蛋白質のための源を、存
在するかも知れないウィルスを不活性化するために十分
な条件下に、ウィルス不活性化工程にかけ、そして （ｂ）工程（ａ）の生成物を、生物学的に不活性な形態
の蛋白質を除去するために十分な条件下に、蛋白質分離
工程にかける、 を含んでなることを特徴とする活性ウィルスを実質的に
含有しない生物学的に活性な蛋白質生成物を製造する方
法。 ２、生物学的に活性な蛋白質は、血漿蛋白質および前記
蛋白質を発現することのできる微生物または細胞系から
誘導された蛋白質から選択される特許請求の範囲第１項
記載の方法。 ３、工程（ａ）の生成物を、溶液中に存在するかも知れ
ないウィルスの不活性化を確実にするために十分な条件
下に、低温殺菌する特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４、低温殺菌工程は、少なくとも約６０℃の温度におい
て少なくとも約１０時間、溶液を加熱することを含む特
許請求の範囲第３項記載の方法。 ５、蛋白質はアンチトロンビンである特許請求の範囲第
１項記載の方法。 ６、工程（ｂ）の分離は、生成物の溶液を固定化された
ヘパリンと接触することを含む特許請求の範囲第５項記
載の方法。 ７、固定化されたヘパリンは炭水化物の支持体へ結合さ
れたヘパリンからなる特許請求の範囲第６項記載の方法
。 ８、（ａ）ヒト血漿溶液または誘導体のヒト血漿分画を
、前記溶液中に存在するアンチトロンビンを複合化する
ために十分な条件下に、固定化されたヘパリンと接触さ
せ、（ｂ）固定化されたヘパリンからアンチトロンビン
を溶離してアンチトロンビンの溶液を形成し、（ｃ）工
程（ｂ）の溶液を低温殺菌し、（ｄ）工程（ｃ）の溶液
を、アンチトロンビンを固定化されたヘパリンと複合化
するために十分な条件下に、固定化されたヘパリンと接
触させ、そして（ｅ）工程（ｄ）の固定化されたヘパリ
ンからアンチトロンビンを溶離する工程を含んでなるこ
とを特徴とするヒト血漿溶液または誘導体のヒト血漿分
画からアンチトロンビンを調製する方法。 ９、工程（ｂ）の溶液を、溶液中に存在するかも知れな
いウィルスの不活性化を確実にするために十分な条件下
に、低温殺菌する特許請求の範囲第８項記載の方法。 １０、低温殺菌工程は、少なくとも約６０℃の温度にお
いて少なくとも約１０時間、溶液を加熱することを含む
特許請求の範囲第９項記載の方法。 １１、工程（ａ）の分離はパッチ型接触であり、そして
工程（ｄ）は固定化されたヘパリンを含有するカラムに
溶液を通過させることを含む特許請求の範囲第８項記載
の方法。 １２、固定化されたヘパリンは炭水化物の支持体へ結合
されたヘパリンからなる特許請求の範囲 第８項記載の
方法。 １３、アンチトロンビンをコーンフラクションIV−１ペ
ーストとして知られている誘導体のヒト血漿から精製す
る特許請求の範囲第８項記載の方法。 １４、活性ウィルスを実質的に含有せず、不活性化され
たアンチトロンビンを実質的に含有せず、そして合計の
アンチトロンビン蛋白質の１ｍｇにつき少なくとも約６
国際単位の活性アンチトロンビンの活性を有する活性ア
ンチトロンビンを含むことを特徴とする高度に精製され
たアンチトロンビン調製物。 １５、アラニン安定剤を含む凍結乾燥された形態の特許
請求の範囲第８項記載の調製物。 １６、アラニン安定剤を含む特許請求の範囲第１５項記
載の調製物。 １７、製薬学的に許容された形態の特許請求の範囲第８
項記載の調製物。 １８、低温殺菌された形態の特許請求の範囲第１４項記
載の調製物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US884446 | 1986-07-11 | ||
| US06/884,446 US4749783A (en) | 1986-07-11 | 1986-07-11 | Viral inactivation and purification of active proteins |
Related Child Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6119509A Division JPH07116236B2 (ja) | 1986-07-11 | 1994-05-09 | アンチトロンビン調製物およびその調製方法 |
| JP7023347A Division JPH083197A (ja) | 1986-07-11 | 1995-01-19 | ウイルスの不活性化および活性蛋白質の精製 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6323896A true JPS6323896A (ja) | 1988-02-01 |
| JPH0768275B2 JPH0768275B2 (ja) | 1995-07-26 |
Family
ID=25384645
Family Applications (3)
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|---|---|---|---|
| JP62171330A Expired - Lifetime JPH0768275B2 (ja) | 1986-07-11 | 1987-07-10 | ウイルスの不活性化および活性蛋白質の精製 |
| JP6119509A Expired - Lifetime JPH07116236B2 (ja) | 1986-07-11 | 1994-05-09 | アンチトロンビン調製物およびその調製方法 |
| JP7023347A Pending JPH083197A (ja) | 1986-07-11 | 1995-01-19 | ウイルスの不活性化および活性蛋白質の精製 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6119509A Expired - Lifetime JPH07116236B2 (ja) | 1986-07-11 | 1994-05-09 | アンチトロンビン調製物およびその調製方法 |
| JP7023347A Pending JPH083197A (ja) | 1986-07-11 | 1995-01-19 | ウイルスの不活性化および活性蛋白質の精製 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4749783A (ja) |
| EP (1) | EP0252392B1 (ja) |
| JP (3) | JPH0768275B2 (ja) |
| AU (1) | AU589868B2 (ja) |
| CA (1) | CA1341269C (ja) |
| DE (1) | DE3751576T2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH024717A (ja) * | 1988-06-22 | 1990-01-09 | Green Cross Corp:The | アンチトロンビン−３製剤 |
| EP0682949A1 (en) | 1988-04-28 | 1995-11-22 | The Green Cross Corporation | Virus inactivated antithrombin-III preparation free from pyrogen and thermally denatured protein |
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| US6632648B1 (en) | 1996-05-14 | 2003-10-14 | Elan Drug Delivery Limited | Methods of terminal sterilization of fibrinogen |
| AT405739B (de) * | 1997-09-19 | 1999-11-25 | Immuno Ag | Verfahren zur reinigung von antithrombin iii |
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| WO2005121163A2 (en) | 2004-06-07 | 2005-12-22 | Upfront Chromatography A/S | Isolation of plasma or serum proteins |
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-
1987
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- 1987-06-27 DE DE3751576T patent/DE3751576T2/de not_active Expired - Fee Related
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-
1994
- 1994-05-09 JP JP6119509A patent/JPH07116236B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-01-19 JP JP7023347A patent/JPH083197A/ja active Pending
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