JPS6054677A - ヒトインタ−フェロン産生細胞の培養方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 以下本発明の詳細な説明する。

本発明にいうヒ）　ＩＦＮ自発産生細胞とはヒ）Ｍ帝血
又は乳ψ児由来のリン／４球をＥｐａｔｅｉｎ−Ｂａｒ
ｒウィルスでトランス７オームした細胞株、ＵＭＣＬＭ
Ｃ中ヒト白血球由来細胞株などを含む。

これらの細胞を培養する培地としては特に限定されない
が、例えばＲＰＭＩ　１６４０培地ダルベツコ変法イー
グル培地、１９９培地、ノ１ムＦ１２培地などの公知の
培地又はこれらの組み合せ培地に５〜１０ｖ／ｖ　％の
胎児牛血清や仔牛血清などを添加した培地を使用するこ
とができる。また、大量培養用としてはこれらの血清を
含まない無崩清培地を使用することが望ましく、例えば
ウシ又はヒトアルゾ’ｌ０ＸＩＯ５／ｍＪ、　３６−３
７℃にて加湿した４〜５ｖ／ｖチの炭酸ガス気流中で培
養する方法が適用できる。

本発明の培養方法では、−緩衝剤と栄養培地成分を培地
体積と培地浸透圧の増加が可及的少量又は低値となるよ
う添加する。

本発明者らはＵＭＣＬＭＣ中例としてこの増殖停止期に
おける培地成分の消長を鋭意検討した結果、まず培地中
の！ミノ酸はＬ−アルギニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−セ
リン、Ｌ−アスパラギン及び糖源トシてグルコース、ピ
ルビン酸が消費されることを見出したが、これらを添加
したのみでは大巾な飽和細胞密度の増大は餡められｋか
った。一方、細胞増殖停止期では一般的に培地−が細胞
増殖至適範囲以下に低下するが、培地ｐｌ（Ｎ要用緩衝
剤として知られている重炭酸ナトリウム、ＨＥＰＥＳ　
（Ｎ−２−ハイドロオキシエチルピペラジン−Ｎ−２こ
れらの成分は濃厚溶液で細胞培養液に補充するのが便利
であるが、添加する総量の最終織度としては声緩衝剤２
．５〜１０ｍＭ、糖類０．５〜４１／／ｉ、アミノ酸０
．０５〜０．８Ｅｌ／Ｉが適当である。これらは適宜組
み合せて各々１００〜２００倍濃度の濃厚溶液とした後
、済過滅菌して使用する。

培養液に添加する濃厚液量は添加時の細胞密度、−の変
動によって異なるが培養液全容量の１１５０〜１／２０
０が適している。

細胞の増殖段階は与えられた培養条件のもとでは、通常
、増殖準備期、対数増殖期、増殖停止期、死滅期に区別
されるが、本発明で示した培地成分を補充添加する時期
は細胞培養対数増殖期の後半から停止期直前までが適し
ており、その他の時期に添加しても大巾な細胞密度増大
線認められない（実施例４）。

らすことができ、工業的にＩＦＮを産生させ精製する際
に有効な手段を与える。

本発明によシ例えばヒ）ＩＦＮを自発産生ずるＵＭＣＬ
細胞を用いる場合には、この分野で通常用いられている
培養方法では細胞飽和密度が２．ＯＸ　１０’７ｆｎｌ
であシ、その培養土清中のＩＦＮは２〜３Ｘ１０’単位
／　ｍｌであるのに対し、本発明方法によれば特別な培
養装置や血清等の高価な培地成分を用いなくとも細胞飽
和密度で約２倍、ＩＦＮ産生で約５倍の増大を達成する
ことができる。しかもその細胞は再使用して培養し、Ｉ
ＦＮｉ生を行わせ得るので、指数関数的に増大したＩＦ
Ｎを得ることができ、大量のＩＦＮ　ｆ：得るのに非常
に有利となる。

また、本発明によれば、経費のかかる無閉的培地の調製
、管理の節減のみならず、大量の培養槽や細胞を回収す
る遠心分離装置の使用（ロ）数を減ずＳｔｏｍａｔｉｔ
ｉｓ　Ｖｉｒｕｓ）を用いる細胞変性抑制法により測定
した。

実施例１ ダルベツコ変法イーグル培地（日永製薬０＠製）に表１
に示す成分を加えて調製したＲＩＴＣ５７−１培地１０
０ｍＡ！に、屓帯血すンノ臂球由来でＲＩＴＣ５７−！
培地にて継代培養したＵＭＣＬ細胞を初発細胞密度２Ｘ
　１０５／ｍｌとなるよう２基のペルコ社ガラス・スピ
ンナー・ジャーに張シ込み、３７℃、スピンナー回転数
１０　Ｏｒ、ｐｏｍ、にて、加湿した５　ｖ／ｖ％炭酸
ガス含有空気中で培養した。その−基はそのまま培養し
、他の一基では培養４日目、に表２に示した培地成分及
び−緩衝剤、濾過滅藺液をｌ　ｍｌ添加し、さらに４日
間培養しそれぞれの培養日に少ｌをサンプリングし細胞
密度とＩＦＮ濃度を測定した。

第１図にそれらの結果を示す。図中黒丸は生細胞密度、
白丸はＩＦＮ産生量を示し、実線は培養４Ｌ−アスパラ
ギン　５６ グルコース　１０００ マンノース　５００ グルタチオン　１．０ グトレツシン２塩酸塩　０．１ ヒポキサンチン　４ ＮａＨＣＯ３４２１１／’７ グルコース　１００ ピルビン酸ナトリウム　１０ Ｌ−アルギニ７　１０ Ｌ−セリン　５ Ｌ−アスパラギン　５ 実施例２ 実施例１と同様にＲＩＴＣ５７−１培地２０ｍ１ｆ用い
ファルコン社ｙ培ｓフラスコ（３０２４）にてＵＭＣＬ
細胞を初発細胞密度５Ｘ１０５／ａｔで培養した。培養
４日目に嚢３に示すＰＨ緩衝剤及びＬ−アルギニン１０
０ダ／ｉ、Ｌ−セリ；ｙ　５０　ｌＩｖ／７．　Ｌ−ア
スパラギン５０？ダ／、ｌ、グルコース１１／Ｚ　、ピ
ルビン酸ナトリウムｏ１ｙ７ｉの最終濃度の１００倍濃
度液を０．２２μｍのヂ過滅菌後、各フラスコに０．２
ｄ添加した。培養を７日目まで継続し、細胞密度を測定
した結果が表３である。−緩衝剤又はアミノ酸、糖単独
の添加では無効であるのに対し、併用補添することによ
υ生細胞密度の増大が得られる。

表　３ ２．５　１５．２　２４．１ ５　１６．１　２７．８ １０　１４．８　２５．０ ２０　１０．１　２４．７ β−グリセロリン削り一トリウム ２．５　１７．２　２０．４ ５　、　１６．１　２５．８ １０　１５．２　２４．２ ２０　１１．６　２０．３ 実施例３ 実施例２と同様に培養したＵＭＣＬ　ＮＩ胞の培養４日
目に各々の添加最終濃度をＮａＨＣｏ、　５ｍＭ　、グ
ルコース１１／／１．ビルヒン酸ナトリウＡ　Ｏ，１１
／Ｊ　、　Ｌ−７スＡラキン５０ｍｙ／Ｚ、ｔ　−＊リ
ン５０ｍｇ／ｉ１．Ｌ−グルタミン４００キ／！、Ｌ−
ア゛ルギニン１００キ／！ンの組み合せが著効を示した
。

実施例４ 実施例３と同様にＵＭＣＬ細胞を初発細胞密度４×１０
５７ｍ１で培養し、第３図に示す培養日に実施例３と同
様にＮａＨＣＯ３＋グルコースピルビン酸す）　ＩＪウ
ム、Ｌ−アルギニン、Ｌ−セリン、Ｌ−７スノｆライン
を添加し、細胞密度を測定した。

図中の黒丸は添加なし、白丸は添加ありの場合を示す。

これらの結果よシ明らかなように培養初期にこれらの培
地成分を添加しても無効であるのに対して増殖停止期直
前に添加すれば著効を示した０

【図面の簡単な説明】

第１図は培養日数と細胞密度及びｒｒＮ一度との関係を
示すグラフである。 縦軸は細胞密度（Ｘ１０５Ｃａｌｌｓ／ＭＬ）、　ＩＦ
Ｎ濃度（Ｘ１０５ＵＮＩＴ８／ＭＬ　）を示し、横軸は
添加物を示す・黒丸は細胞密度、自律はＩＦＮ　濃度を
示す。 第３図は培養開始ｎ日後（ｎは０≦ｎ≦５の整数）に培
地栄養成分等を培地に添加した場合の培養日数と細１１
Ｗ、　ｍ度との関係を示すグラフでおる。 縦軸は細胞密度（ｘｌｏ５ｃｇｔＬ８／ＭＬ）　、横軸
は培養日数（日）を示す。 黒丸は栄養成分等を培地に添加しない場合、白丸は添カ
ロした場合を示す。 特許出願人　工業技術院長 第１図 ０１２３４　５６７８ ０２４６８　０２４６８ ０２４６８ ０２　４１５８

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 増殖停止期直前に声緩衝剤と消費された培地栄養成分の
   凝厚液を培養液に補充添加することを特徴とするヒトイ
   ンターフェロン自発産生細胞の培認められている。 しかしながら、ＩＦＮをそれらの予防あるいは治療に用
   いる際にはＩＦＮには種特異性が高いことから、ヒト細
   胞又はヒ）ＩＦＮ遺伝子を発現する微生物が産生ずる大
   量のヒトＩＦＮが必要である。 これまでのＩＦＮ生産方法としては成人新鮮血よ少分離
   した白血球を用いる方法や、ヒト由来の繊維芽細胞や、
   白血球、リンパ由来のりンノヤ系細胞などを培養する方
   法、並びにこれらのＩＦＮ遺伝子を発現する微生物を用
   い本方法などが知られているＯ しかしながらこれらの方法で大量のＩＦＮを得る際には
   ＩＦＮ誘起剤としてのウィルスや微生物由来の異種高分
   子の微量混入の問題があシ、精製工程が煩雑になる。 一方、と）　ＩＦＮ自発産生細胞株培養によって例えば
   、スピン・フィルターとよばれる回転攪１ 繊維膜や平面膜の片側で細胞を培養し、他方に新鮮培地
   を循環させて低分子培地成分を補添し、老廃物を除去す
   る方法（特開昭５５−１３１３８６）などである。 しかしながらこれらの方法で大量の細胞を培養するには
   特殊の装置やその制御方法の開発が必要であシ、かつ高
   価な胎児牛崩清を多量含む新鮮な培地を連続又は断続的
   に交換することが必要なため多大なランニングコストが
   かかるという大きな問題点を持っている。 本発明者らは、通常の培養装置を用いて細胞密度を増大
   させる方法及び細胞を培養した古い培養液を交換させる
   ことなく効率よく高単位のＩＦＮを産生させる方法を鋭
   意検討し、細胞増殖停止期において、細胞によって消費
   される栄養成分の解析に基き、細胞増殖の停止期又はそ
   の直前に培養液′李″量の交換培地を使用することなく
   単に消費される栄養成分を少量添加するのみで、細胞飽
   和密度を増大させ、ＩＦＮ産生景を増大させる方法に関
   するものである。