JPS606199A - 細菌検出用組成物及び細菌検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は検体試料中の細菌の検出に関し、更に詳しくは
、本発明は、生体液、たとえば尿中の細菌検出用組成物
及びそれを用いた細菌検出方法に関する。

従来技術 伝染性疾病の迅速で有効な１診断及び治療には、疾病を
引きおこす細菌をできるだけ速く検出しうろことが望ま
しい。なかでも尿路の感染が最も一般的々細菌性疾病で
あり、次いで気道の感染である。このような尿路感染（
ＵＴＩ−）は通常、尿ｍｌ尚シ１００，００’Ｏ（１０
”　）以上の有機体の数の細菌全件い、これは、有意細
菌尿（５１ｇｎ１ｆｉｃａｎｔｂａｃｔｅｒｉｕｒｉａ
　）と呼ばれる状態である。従って、信顆しうる方法に
よる細菌の迅速な検出は、早期かつ特殊な診断全容易に
する。更に、ある処方された抗生物質が実際に感染を治
療するのに有効であることを確証する為には治療の際の
反復試験が必要である。従って、簡単で、迅速な細菌尿
試験の必要性か明らかである。

微生物培養に基づく現在の実験室方法、たとえば検量ル
ープディレクトストリーク（ｔｏｏｐ−ｄｉｒｅｃｔ　
５ｔｒｅａｋ　）法は結果を得るのにかなシのインキュ
ベート期間（１８〜２４時間）ヲ要する。

これら実験室方法はまた実施に時間がかかシ、そして相
当の臨床訓゛練及び熟練を必要とする。

細菌法を比敦的迅速に検出する公知方法は、”Ａ　Ｓｉ
ｍｐｌｅ　Ｓｅｍ１−ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　Ｄｉ
ａｇｎｏ、ｅｔｉｃＳｃｒｅｅｎｌｎｇ　Ｍｅｔｈｏｄ
　ｆｏｒ　ＰｒｅｓｕｍｐｔｉｖｅＢａｃｔｅｒｉｕｒ
ｌａ″Ｐｆｉｚｅｒにより出版、　Ｄｉａｇ−ｎｏｓ目
ｃｓ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、ニューヨーク、　１９７４年
の小冊子に記載されているＵｒｏｓｃｒｅｅｎＴＭ（）
リフェニルテトラゾリウムクロリド）を用いる。

ＵｒｏｓｃｒｅｅｎＴＭは乾燥した緩衝テトラゾリウム
試薬（無色、可溶性２　、３１５−　トＩＪフェニルテ
トラゾリウムクロリド）を利用する。

有意細菌尿の存在下ではＵｒ　ｏ　ｓ　ｃ　ｒ　ｅ　ｅ
　ｎ　ＴＭは・代謝細菌により４時間以内に還元され、
桃色〜赤色のトリフェニルホルマザンの不溶性沈＃全生
ずる。

この方法にはいくつかの欠点がある。即ち血尿は陽性（
Ｐｏ５ｉｔｉｖｅ　）試験の桃色−赤色沈澱に似た堆積
物を含み、そして着色の強い尿（濃縮、ビリルビンヌは
薬剤摂取による）は結果を不明瞭にするのでこの方法は
不正確である。有意細菌尿検出におけるこの試験の精度
は約６０〜約９０チであると報告されている。

生体液中及び他の流体中の細菌の検出、用の他の診断試
薬は米国特訂第３，４９６，０６６号（Ｂｅｒｇｅｒ等
に１９７０年２月１７日交付）及び同第３．６２１，０
１６号（Ｂｅｒｇｅｒ等に１９７１年１１月１６日交付
）に記載されている。このような試薬は検体試料中に存
在する細菌によシ代謝され検出可能な生成物を生成する
。他の試験はニトライト又はカタラーゼの検出による。

発明の目的 それ故解決すべき問題は、試料中の有意数の微生物の存
在の迅速な検出を提供することである。

言い換えれば、Ｕｒｏｓｃｒｅｅｎ■のような試験に要
する４時間のインキュベート時間を減じることが本発明
の組成物及び方法の目的である。同時に血尿又はその他
の非常に着色された尿によシ引き起こされる妨害を回避
した試験が望まれている。

発明の構成 本発明に従えば、活性成分として、ベンズ〔ｃｄ〕イン
ドール染料、ベンズ〔ｅ〕インドール染料及びベンズＣ
ｇ〕インドール染料から成る群から選んだ染料を含む細
菌検出用組成物が提供される。

本発明に従えば、更に、細菌微生物と混合してインキュ
ベートする時に検出可能な色変化を生成する染料と分析
用検体試料とを接触せしめ、そしてその変化を測定する
ことを含んで成る方法であっテ、前記染料がベンズ〔ｃ
ｄ〕インドール、ベンズ〔ｅ〕インドール又はベンズ〔
ｇ〕インドール染料である細菌検出方法も提供される。

詳細な説明 本発明は液体のような検体試料中の細菌、特に有意細菌
尿（即ち約１０５以上の微生物／ｎ１ｌ）の検出に関す
る。本発明によシ、細菌全含有すると思われる任意の検
体試料（たとえは食物、組織、地下水、冷却水、医薬組
成物、下水等）を分析することができるけれども、本発
明は、人間及び動物の体液（たとえば尿、を椎液、血液
等、並びに便分泌物（５ｔｏａｌ　５ｅｃｒｅｔｉｏｎ
ｓ　）’　）のような水性液体、及び人間又は動物の組
織の懸濁液中の細菌の検出に特に有用である。本発明の
実施に用いる好ましい生物流体は人間の尿（希釈又は未
希釈）である。

本発明の実施に有用なベンズインドール染料は、細菌微
生物、たとえば大腸菌と混合してインキ−ベートする時
に検出可能な色変化を生成することができる。このよう
な染料はベンズ［ｃｄ〕インドール染料、ベンズ〔ｅ〕
インドール染料及ヒヘンズ〔ｇ〕インドール染料から成
る群から選択される。世し、ベンズインドール染料のか
ならずしもすべてがこの目的にかなうわけではないこと
全理解されたい。所定のベンズインドール染料が使用可
能でありそして本発明の範囲内であるかどうかの決定は
、染料を特定の微生物の水性懸濁液と混合して３７℃に
おいてインキュベートシ、そして染料が微生物によって
還元されて染料の可視色における検出可能な変化全生成
するかどうか観察することから成る簡単な試験によシ行
うことができる。一般に可視の色変化は４００〜７００
ｎｍの範囲の電磁スペクトルにおいて生じる。一種類の
染料を用いることが好ましいけれども、二側以上の染料
を本発明の組成物に用いることもできる。

本発明の実施に特に有用なベンズインドール染料は前記
色変化を生じ、そして Ｉ・ − 及び （式中、Ａは ■で。

以下余白 から成る群から選ばれる）から成る群から選んだ構造式
を有する。、前記式において、Ｒ、Ｒ４，Ｒ５及びＲ１
，は独立に水素、アルキル、アリール、アルカリール、
アラルキル又はシクロアルキルであｊ９　：　Ｒ，及び
Ｒ２は独立に水素もしくは低級アルキルであるか、又は
−緒になって５〜６員の炭素環式３１ｆｔ−完成し；Ｒ
３はアリールであ、！ｌｌｌ：Ｒ６及びＲ７は独立に水
素、゛アルキル、シクロアルキルもしくはアリールであ
るか、又は共に４〜２０員の複素環式基金完成し：　Ｒ
８，Ｒ，及びＲ４゜は独立に水素、ハロ、アルキル、ア
リール、アルカリール、アラルキル又はシクロアルキル
であシ；Ｇは０Ｒ１２又はＲ６−Ｎ−Ｒ，であ、！７　
：　Ｒ１２は低級アルキルであシ：Ｌ、及びＲ２は独立
に水素であるか又は、Ｌ、はＲ６と共に５もしくは６員
環全完成する原子を表わすか、又は、Ｒ２はＲ７と共に
５もしくは６員猿それぞれ全完成する原子を表わし：Ａ
ｒはアリールであシ；ｍ及びｑは独立にＯ又は１であシ
：ｎは０，１．２又は３であ、！７：ｐはＧがＲ６−Ｎ
−Ｒ。

である時ｐが２又は３である以外け１，２．又け３であ
、９：１に０，１又は２であシ；８はｎが１の時Ｓが１
又は２である以外は０．１又は２であシ：２は復業環式
基を完成するのに必要な炭素、セレン、硫黄又は窒素原
子を表わし：ｚ、及びｚ２は独立に単結合又は複素環式
基金完成するのに必要な炭素、セレン、硫黄又は窒素原
子を表わし；そしてＸ−は−価アニオンである。

前記式１．１及びＩＩＩ　において、染料は、染料の可
溶性特性及び細菌の存在下における色変化生成能（即ち
細菌によシ還元されうる能力）を妨害しない一つ以上の
他の非妨害性置換基を含むことができる。以下に記載の
任意の置換基、即ちＲ２Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３１Ｇ　、　Ａ
等は染料化学に熟達した研究者に知られているように、
同様に一つ以上のこのような非妨害性置換基を自身に結
合して有することができる。

前記式１　、、　Ｉ＋及び■において、Ｒ、Ｒ４，Ｒ５
及びＲ１１は水素、アルギル（Ｎ換もしくは非置換）ア
リール（置換もしくは非置換）、アルカリール、アラル
キル又はシクロアルキルとすることができる。任意のこ
れらの基がアルキルである場合、アルキル鎖は直鉛状で
あっても分枝していてもよく、そして好ましくは（必ず
しもその必要性は々いが）１〜１２個の炭素原子全有す
る（たとえばメチル、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチ
ル、ｎ〜ヘプチル、ｎ−ノニル、ｎ−ウンデシル、ｎ−
ドデシル等、及びそれらの異性体）。より好ましくはこ
れらの基はそれぞれ水素であるか又は炭素数」〜４の低
級アルキル（たとえばメチル、ｎ−プロピル、イソプロ
ピル、ｔ−ブチル等）である。Ｒ，Ｒ４゜Ｒ５又はＲ１
１か置換されている場合、それはハロ、ヒドロキシ、（
アルコキンカルボニルアルキル）カルバモイルオキシ金
倉むことが好ましい。

Ｒ、Ｒ４，Ｒ５又はＲ１１がアリールである場合、それ
は好ましく１ｌ−１：（必ずしもその必要性はないが）
環系を形成する６〜２０個の炭素原子を有し、前記環系
はよシ好ましくはフェニル又はナフチルであり、そして
所望なら前述のごとく自身に結合した一つ以上の非妨害
性置換基（たとえばハロ、ヒドロキシ、アルキル、オキ
シアルキル等）ヲ有することができる。

Ｒｒ　Ｒ４＊　Ｒ５又はＲ１１がアルカリール又はアラ
ルキルである時、それもまた好ましくけ（必ずしもその
必要性はないが）７〜２０個の炭素原子を有スル（たト
エばペンノル、エチレンフェニル、２−エチレンフェニ
ル等）。好ましくはそれはベンノルである。任意のこれ
らの基もまた好ましくは約６〜約２０個の炭素児子全有
するシクロアルキル（／こト、ｔｆ４シクロヘキシル、
シクロヘプチル等）とすることができる。好ましいシク
ロアルキル基ハシクロヘキシル基である。

前記式■のＲ１及びＲ２は独立に水素であるが又は低級
アルキル（以下にＲ１２に関して記載するように好まし
くけ炭素数１〜４）であるが、又は共に５〜６負の炭素
環式環（たとえばシクロペンチル、シクロヘキシル、フ
ェニル等）全完成する。

Ｒ１及びＲ２が独立に水素又は低級アルギルであるのが
′好ましい。それぞれが低級アルキルである場合、それ
ぞれがメチルであるのが特にクイましい。

前記式１１［おいて、Ｒ５／′ｉＲ、Ｒ４，Ｒ５又はＲ
４゜に関して定義したようにアリールである。好甘しく
はＲ３はフェニル（前述のご吉く非置換又は置換）であ
るのが好ましい。

前記式ＩＩにおけるＧけ−ＯＲ，２とすることができ、
式中Ｒ１２は炭素数１〜４の低級アルキル（たとえばメ
チル、クロロメチル、エチル、イソプロピル、（この場
合並びに基Ａの場合においても）　？”ｊ：　Ｒ。

Ｒ４，Ｒ５及びＲ１１に関して前述したごとぐ独立にア
ルキルもしくはアリールであるが、又ハＲ６及びＲ７は
一緒になって４〜２ｏ員の複素環式基全完成することが
できる。好ましくはＲ６及びＲ７は、Ｒ１２に関して前
述したごとく、独立に炭素数１〜４の低級アルキル基で
ある。最も好ましくけＲ６及びＲ７は共にメチルである
。

Ｒ８，Ｒ９及び”１０は、Ｒｒ　Ｒ４ｒ　Ｒ５及びＲ＋
＋に関して前述したごとく、独立に水素、ハロ（フルオ
ロ、クロロ、ブロモ及びヨード）、アルキル、アリール
、アルカリール、アラルキル又はシクロアルキルである
。

式Ｉ及びＨ中のＬｌ及びＲ２は独立に水素であるか、又
はり、はＲ６と一緒になって５又は６員環を兄成する原
子を表わし、そしてＲ２ばＲ７と一緒になって５又は６
員環をそれぞれ完成する原子を表わす。これらの環は１
０〜１２員の犬猿の一部を成すことができるであろう。

好１しくはＬｌ及びＲ２はそれぞれ水素である。

前記式■のＡｒはアリールであシ、好ましくは（必ずし
もその必要性はないが）、Ｒ３に関して前述したごとく
、炭素数６〜１２のアリールである。よシ好ましくはＡ
ｒはフェニル又はナフチルである。

式■のｚは、ニトロベンゾテアゾール、ニトロベンゾオ
キサゾール、ニトロベンゾセレナゾール、ニトロ−３Ｈ
−インドール、イミダゾＣ４，５−ｂ〕キノキザリン及
びピロロ［２，３−ｂ）ピリジン・のような４〜２０員
の複床環基全完成するのに必要な炭素、セレン、硫黄又
は窒素原子を表わすのが好ましい。

Ｚｌ及びｚ２は独立に単結合（たとえば窒素と炭素原予
きの間の結合）か、又Ｉ′ｉＺに関して定義したごとく
、複素環式基全完成するのに必要な炭素、セレン、硫黄
もしくは窒素原子のいずれかを表わすＯ 前記式ＴにおいてＡは好丑しくけ ２ であシ、そしてｎは少なくとも１である。

前記式■においてｐは好ましくは２又は３である。

すべての曲成においてＸ−は−価のアニオンを表わし、
それはたとえば１）　ｐ　−トルエンスルホネート、２
）ヨーダイト、クロリドもしくはプロミドのようなハラ
イド、３）アセテート又はヰ）ベルクロレイトとするこ
とができる＠ 前記式■、■及びＲ１のすべてにおいてベンズインドー
ル環系は、アルキル、アリール、アルコキシ、シアノ、
ニトロ、ハロ又は染料の可溶性特性又は染料の他の望ま
しい性質全妨害しない当業者に知られた他の基のような
適娼な電子吸引基もしくは電子供与基で置換することが
できる。

この分野の研究者によって認識されているように、弐■
によ９表わきれる染料は、ｍ及びｑが何であるかに依存
していくつかの互変異性形状で存在することができる。

前記構造はｍ及びｑが共に１である時の染料構造を明確
に示す。ｍ及びｑが共に０である場合、染料構造は式 （式中Ｒ、Ｒ３，Ｒ５，Ｚ及びＸ−は前述の通９）で表
わされる。ｍが１でｑが０である場合、染料構造は式 ％式％ （式中Ｒ、Ｒ５ｉ　Ｒ５，Ｚ及ヒＸ−は前述の通シ）で
表わされる。ｍが０でｑが１である場合、染料構造は式 ［ （式中Ｒ、Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５，Ｚ及びＸ−は前述の通り
）で表わされる。式１１　ｂ及び１１１ｃにおいて、染
料は二個の正の荷電を含みそしてそれ故二個の棹合−価
アニオン（ｂａｌａｎｃｉｎｇ　ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ
ａｎｉｏｎ）　（同一であっても異なっていてもよい）
を含む。

本発明の実施に用いる染料は業界で知られており、そし
てそれらの多くは、たとえばイーストマンオーガニック
ケミカルズ（ロチェスター、ニューヨーク）から入手す
ることができる。これら染料のあるものは、たとえば米
国特許第３，５０１，３１２号（’１９７０年３月１７
日、Ｍｅｅ等に交付）及び同第３，５０５，０７０号（
１９７’Ｏ年４月７日。

Ｌｉｔｚｅｒｍａｎ等に交付）を含む刊行文献に記載さ
れている。染料のあるものは好都合なことに水溶性であ
る。しかしながら以下のρ１に詳述するごとく本発明の
実施の際、染料の吸光率に依存して本発明の組成物中に
染料全豹１０　Ｍまでの濃度、そして好ましくは約１０
−７〜約ｉｏ−２Ｍの範囲の濃度で用いることができる
けれども、すべての染料は調製し、そして１０　Ｍメタ
ノール溶液として貯蔵した。光による影響をできるだけ
低くする為に、例に報告したすべての実験は特にことわ
らない限シ黄色光下で実施し、そしてすべての試験管は
暗所でインキュベートした。本発明の実施に有用な典型
的な染料全以下の表■に掲げる。好ましい染料は Ｃ２Ｈ５ｐ−トルエンスルホネート である。

代謝性基質を含むことは必要ではないけれども、このよ
うな基質の使用は細菌性代謝を刺激するのに好ましく、
そしてその結果検出を容易にする。

当業者に知られているように任意の慣用の代謝性基質を
用いることができる。代矧性基質の他の表現は６エネル
ギー源”及び”炭素源”であり、この後者の表現は、化
合物が細菌の代謝性炭素源であることを示す。適切な基
質は米国特許第４．０３５，２３７号（１９７７年７月
１２日ＫＭａｓｕｒｅｋａｒ　等に交付）に記載され、
そして１）糖、たとえばグルコース、フラクトース、シ
ュークロース、ラクトース、マルトース、ラフ（ノース
等）、２）スターチ、３）カルピン酸の塩、たとえばラ
クテート、シトレート、マレート、サクシネート等、４
）グリコール、たとえばグリセリン、ソルビトール、ズ
ルシトール、マンニトール等、及び５）微生物学におけ
る研究者に知られた他のものを含む。代謝性基質の濃度
は一般に、組成物全溶液分析操作に用いる時組成物総重
量の約０゜０１〜約１重量％の範囲である。

本発明の方法及び組成物は溶液及び乾式要素分析の両方
に適用することができる。それ故、前記ベンズインドー
ル染料と好ましくは一つ以上の代謝性基質とを含む水溶
液もしくけアルコール溶液は好ましく、そして試験すべ
き検体（たとえば尿検体）の試料を所定の体積の染料溶
液と接触させることによシ細菌全検出する。別法上して
は染料を添加するよシ前に代謝性基質全試験試料に存在
させることができる。

溶液分析では一般に染料溶液を、適切な容器（たとえば
試験管、イトリ皿、ビーカー、他の適切な実験室の容器
）中の試験すべき検体試料へ添加する。得られた溶液を
緩徐に混合し、そして比較的短時間（即ち約６０分未満
）３７℃においてインキュベートする。次いでインキュ
ベートした溶液中の染料の色を観察しく必要なら数時間
にもわたって）、そして細菌を含有しない以外は同様に
調製し、そして取シ扱りた対照溶液と比較する。

インキュベートした溶液か微生物を含むなら、溶液中の
染料は可視の色変化、即ち一つの色から別の色への変化
、着色から無色への変化又は無色から着色への変化を示
す。

別法としてはベンズインドール染料を多孔性の単層、即
ち沖紙ストリップのよう々吸収剤材料のマトリックス又
は支持体中へ含浸又は別の方法で組み入れて、その上に
堆積させた検体試料中の細菌検出用の適切な分析要素を
つくる。

更にこの方法は、米国特許第３，９９２，１５８号（１
９７６年１１月１６日にＰｒｚｙｂｙｔｏｗｉ　ｃｚ等
に交付）又は同第４，２５８．００１号（１９８１年３
月２４日にＰｉｅｒｃｅ等に交付）に記載の型の拡散ゾ
ーンと支持体と含有する分析要素において実施する時、
特に有利に用いられる。次いで細菌の存在又は。不存在
を、要素と細菌金倉むと思われる検体試料と全接触（た
とえばス、Ｊ？　ツＦにより）させることによシ測定す
る。本明細畳において検体試料とは通常細菌の液体（た
とえば水性液体）懸濁液である。次いでかなり゛の数の
細菌の存在は要素中に存在するベンズインドール染料の
可視の色変化を引き起こす。

本発明の分析要素は一般にベンズインドール染料を含む
試薬ゾーンと場合によっては代謝性基質とを有する。こ
のゾーンは、自己支持性であシうる〃・又は別法として
ｌ−１′要素が支持体をも含゛むことができる。一つの
ゾーンを用いる場合、それは拡散／試薬ゾーンと呼ばれ
ることがある。要素は好ましくは支持体と多数（少なく
とも第−及び第二の）のゾーンを含む。好ましくは第一
のゾーンは支持体に隣接する。これらのゾーンは互に流
体接触し、このことは流体が隣接ゾーンの載置領域間を
通シうること全意味する。換言すれば、流体接触と（ｄ
、流体の成分を流体接触しているゾーン間を移送しうる
能力のことを言う。一つ以上のゾーンが要素の単層中に
存在しうるけれども、ゾーンは別々の被覆層であること
が好ましい。適切な乾式要素フォーマットは業界で知ら
れており、そしてたとえば前記米国特許第３，９９２，
１５８号、同第４．６４２，３３５号（１９７７年８月
１６日にＣＬｅｍｅｎ　ｔに交付）、同第４．１　’４
４，３０６号（１９７９年３月１３日にＦｉｇｕｅｒａ
ｓに交付）、同第４．１３２，５２８号（１９７９年１
月２日にＥｉｋｅｎｂｅｒｒｇ等に交付）、同第４，０
５０，８９８号（１９７７年９月２７日にＧｏｆｆｅ等
に交付）、及び米国再交付特許第３０．’２６７号（１
９８０年５月６日にＢｒｕｓｃｈｉに再交付）に記載さ
れている。

要素の支持体は任意の寸法的に安定々物質（たとえばポ
リエチレンテレフタレート）から構成することができそ
して透明であることが好ましい。

本発明の実施に用いる為に適合する他の物質及び要素は
たとえば米国特許第３．０９２，４６’５号、同第３，
４１８，０９９号、同第３，４１８，０８３号、同第２
，８９３．８４３号、同第２，８９３，８４４号、同第
２，９１２，３０９号、同第３，００８，８７９号、同
第３，８０２，８４２号、同第３，７９８，０６４号、
同第３，２９８，７３９号、同第３，９１５，６４７号
、同第３，９１７，４５３号、同第３，９９３，５９４
号、同第３，９３６，３５７号、同第４，２７０，９２
０号、同第４，２４８，８２９号、同第４，２５５，３
８４号、同第４，２５６，６９３号、英国特許第２，０
５２，０５７号及びリサーチジスクロージヤー、第１４
６８．１９７６年６月、１４６３８項に記載されている
。

本発明の好ましい態様では要素は、流体接触する試薬ゾ
ーンと拡散ゾーンとを載置含有する支持体を含む。本明
細書に記載のベンズインドール染料は、支持体に隣接し
次試薬層である試薬ゾーン中に存在することが好ましい
。一つ以上の中間層が存在しうるけれども、拡散ゾーン
は拡散層であり、好ましくは試薬層に隣接する。好まし
くはこの拡散層は、チリビニルトルエンーコーｐ　−ｔ
＃プチルスチレンーコーメタクリル酸から成るビーズと
、所望なら適切なバインダとを含んで成る。

本発明の要素中のベンズインドール染料の量は広範囲忙
わたりて変化することができるが、一般に、約５９／ｍ
２までの適用−１（又は被覆量）、そして好ましくは約
ｏ、ｏｊ〜約２９／ｍ　の適用量で存在する。同様に存
在する場合には代謝性基釧の量も広く変ｆ＃Ｓすること
ができるが、一般に約１０−３〜約１ｇ／ｍ２、好まし
くは約０．０１〜約０、５　ｆｉ／ｍ２の適用量で存在
する。基質は要素の任意のゾーン（又は層）に存在する
ことができるが、ベンズインドール染料と同じゾーン（
又は層）中に存在することが好ましい・ 本発明の要素の一つ以上のゾーンは、業界で知られてい
るように、緩衝剤、界面活性剤及びバインダ（典型的に
は親水性）のような種々の他の望ましいしかし任意的な
成分を含むことができる。

要素に関して更に詳しくは、拡散ゾーンの特に適切な成
分は前記米国特許第３．９９．２，１５８号及び同第４
，２５８．００１号、及び英国特許出願第２．０５２，
０５７号（１９８１年１月２１日公ＩＨ）に記載されて
いる。拡散ゾーンはたとえば、繊維性もしくは非繊維性
材料のいずれか、又は両方からセｊｑ成することができ
る。

典型的な要素は以下の例５及び６で例解する。

本発明の効果 本発明から得られる利点の中には次のものがある。１）
細角の迅速な検出、即ち一般には６０分以下での検出、
２）測定する試料中に存在する血液又は他の物質による
色妨害を最小とする（好ましい染料、ベンズ［ｃｄ、］
インドール、６２０ｎｍ領域において最大吸収、及び３
）溶液及び乾式（５学フオーマツトの両方に用いるのに
適する。

以下のρす全本発明の詳細な説明する為に提供する。こ
れらの例においてＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｃｌｏａｃ
ａｅ　（ＡＴＣＣ２３３５５）　ｒ　Ｅｓｃｈｅｒｉ視
杜１４すａ（ＡＴＣＣ２５９２２）　ｒ　Ｋｌｅｂｓｉ
ｅ］−１ａ　ｐｎｅｕｍｏｎｊａｅ　−（ＡＴＣＣ１３
８８３）　ｒ　Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ　（
ＡＴＣＣ１３３１５）　＋　Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　
ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　（ＡＴＣＣ２７８５３）　、５
ｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ　（ＡＴＣＣ８
１００）　＋、　Ｓｔａ　ｈｙｌｏｃｏｃｃｕＥＬａｕ
ｒｅｕｓ−（ＡＴＣＣ２５９２３）　、　５ｔａｐｈｙ
ｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｐＬｄｅｒｍｉｄｉｓ（ＡＴＣＣ
１２２２８）　、及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙ
ｒｏｇｅｎｅｓ　（ＡＴＣＣ１９６］、５）はミシガン
州デトロイトのジフコラボラトリーズから入手した。

すべての培養物は市販の脳−心臓注入培地５０ｒｎｌ　
ｆ含有する１２５ｍ１容フラスコ中でルーチン的で増殖
させ、そして使用に先だって３７℃でインキ−ベートし
゛た。

細胞懸濁液音用いる場合、２４時間の培養物音５０００
Ｘ、９で１０分間遠心分離した。得られた一ξレットは
０．０５Ｍリン酸カリウム懸濁液（ＰＨ７，０）中で２
回洗浄し、そして再懸濁させ（１：４水希駅）、Ｂａｕ
ｓｃｈ　＆　Ｌｏｍｂのスペクトロニック　２０分光光
度計を用いて６２０ｎｍにおいて測定した時最終的な光
学濃度２．０’ｊｉ７示した。

細胞懸濁液各５　ｎｒｌへ１０　％　ｗ／ｖグルコース
０．１ｍｌ全添加した。

例で用いた尿試料はローカルの病院から入手した。微１
三物汚染及び試料中の増殖全最小にする為に、同じ源か
らの５　ｍｌの尿試料２個は、ニューシャーシー州うザ
フォードのＢｅｃｔｏｎ　Ｄｌｃｋｉｎｓｏｎａｎｄ　
Ｃｏｍｐａｎｙから得られるＢ−Ｉ）ウリンカルチャー
キット中に供給する別々の輸送管中に装入した。これら
の管には、安定な細菌集団全保持する保存の３．５　ｍ
ｌホウ酸−グリセリン−ナトリウムフォーマットが含ま
れた。この管は冷蔵し、そしてすべての試料は２４時間
以内に用いた。

尿試料は以下の操作に従って分析した。５ｍｌの尿試料
２個の内容物ｆ　１５　ｍｌ容遠心管中で合せ、そして
１０．０００１７で１０分間遠心分離し、その後透明な
上澄を廃棄した。得られたペレットを０．０５モルリン
酸カリウム緩衝液（ＰＨ７，Ｏ）　１．５μｌ中に再懸
濁させ、そして慣用の高速ミキサーを用いて完全に混合
した。特にことわらない限り、ベンズインドール染料溶
液（メタノール中１０−３モルの染料）２５μ７’ｆｉ
ｌ−各遠心管へ添加した。次いで容管の内容物を緩徐に
振盪し、そして３７　’Ｃ１暗所において３０分間イン
キュベートした。代謝性基質はこのインキ−ベートの間
存在することが好ましい。次いで容管の可視のスペクト
ル金・や−キノ−エルマー５７ｚ分光光度割を用いて走
査した。はとんどの場合、スリット巾１咽で走査速度１
２０ｎｍ／分とした。

０．０５モルリン酸カリウム緩衝液（ｐ’１７．ｏ）及
びベンズインドール染料溶液２５μｌｋ含む対照蓄音す
べての研究に用いた。代謝性基質を用いる場合、それも
対照管中でインキ−ベートした。

以下余白 例１　微生物の存在下における選択的なベンズインドー
ル染料の色変化 尿路細菌、大腸菌の細胞懸濁液を前述のごとく調製した
。細胞懸濁液各５ｍｌへ、以下の表Ｉに示す染料を含む
染料溶液各０．１ｍｌ！ｌ添加した。容易に利用しうる
代謝性基質、１０％取４グルコース０、１　ｍｌを各生
成混合物へ添加した。微生物を含まない対照管を前述の
ごとく調製した。容管の内容物を緩徐に混合し、そして
３７℃、暗所で３０分間インキ−ベートした。細胞懸濁
液を含む各試料管の染料の色に注意し、そして対応する
対照管の色と比較した。表Ｉに要約した結果は本発明の
実施に有用なベンズインドール染料、並びに有用でない
染料を示す。色変化を与えたすべての染料（Ｉ、ｎ、Ｉ
Ｖ、Ｖ、■−■、　ｘｘｕ　−ｘｘｖｎ及びＸ＞■１−
ＸＸＸｖ）は本発明の実施に有用である。しかしながら
これらのあるものは、本明細書に記載の式■、■及び■
で表わされる染料より顕著にすぐれている。染料■は非
常に好ましい。

以下余白 ｊ　嗜 々ン 譚相 駆恥 目　≧ ？　ｊ 〉　Σ ＪＦ３３　謬 噺　恒 ？？ １８］　翅 恥メ タ　ツ と　× ａ　（ 解　メ ２　間 ｊ　ｊ 目　≧ ×　× ｊ　ｊ 、＝：ｍｌ ｊ　ｊ （侵 駆　駆 Φ ｊ　ｊ 史　Ｑ 属　駆 ｊ　ｊ ぐ　喪 駆　暉 Δ　Ｖ ・Ｋ −Ｖ　診　Ｖ Ｔ　開 国　Ｑ （口　駆 ｊ　］ 婆　舒 駆　暉 相　− べ　Ｑ 渚　０　肛　Ｖ 公 、４　１−Ｉ Ｑ　○ 例２　相当数の大腸菌を含む及び含まない尿試料を用い
た好ましい染料溶液において生成する色変化 相当数の一般的な尿路細菌（大腸菌）を含む及び含まな
い尿試料の、好ましい染料の可視ス４クトルに及ぼす影
響を以下の操作によシ比較した。

二つの尿試料、（５）ローカルの病院での測定により大
腸菌ｌＯ５以上／　ｍｌを含む尿、及び（Ｂ）はとんど
細菌を含まない正常尿を集めそして前述のごとく調製し
た。前述のごとく調製した表１のベンズ〔ｃｄ〕インド
ール染料の溶液２５μｔを各試験管へ添加した。容管の
内容物を緩徐に混合し、そして３７℃、暗所で約３０分
間インキュベートし、その後容管の可視スペクトルを３
００　ｎｍから７００　ｎｍまで走査した。前述のごと
く調製した対照試験管（Ｃ）も走査した。ポジテプ試料
（Ａ）の染料ピーク（６００〜６２０ｎｍ）の大巾な減
少及び紫外領域のスペクトルの付随する増大が、正常尿
試料（Ｂ）及び対照染料溶液（Ｃ）のスペクトルと比較
して、認められた。

例３　尿路感染で見られることの多い微生物の純粋な培
養物と共にインキュベートした染料溶液中に生成する色
変化 尿路感染（ＵＴＩ）に見られることの多い細菌微生物８
種と表■の染料■を用いて例１の操作を反３７℃で約３
０分間インキュベートした後、細胞懸濁液を含む容管の
可視の色変化に注意した。

例４　本発明の迅速なスクリーニング方法と標準的な平
板培養操作との比較 有意細菌尿を検出する為の迅速なスクリーニング操作と
して利用される本発明方法を、慣用のスクリーニング操
作即ち較正ルーズディレクトストリーク法によって測定
した結果と比較した。

ローカルの病院から得た尿試料は、ループ方法及び本発
明方法の両方を用いて測定した。試験した尿試料９６個
のうち、１８個は慣用の検量ループ方法に基づき陽性（
即ち微生物１００．１０００個以上／ｍｌ！を含む）で
あると測定された。これら”′陽性”試料のうち１６個
は本発明方法によシ陽性である表考えられた。検量ルー
プ方法により”陽性”、そして本発明方法によりパ陰性
”であると測定された二つの試料は、長期間抗生物質治
療を受けている患者から得たものであった。抗生物質が
長期間尿に存在すると細菌細胞の生理学的状態に影響し
、そして本発明の実姉に有用なベンズインドール染料と
の反応が阻止されるものと思われる。

前述の゛′陽性″試料１６個に加えて、更に７個の試料
が本発明方法によシ゛陽性”な結果を示した。以下の表
■に示すように７個の試料のうち５個は検量ループス）
　ＩＪ−クジレート上で幾分細菌の増殖を示したけれど
も、しかしながらこれら７個の試料は検量ループ方法に
より°゛陰性″な結果を与えた。検量ループ法のパ偽陽
性“は更なる細胞の増殖、又は試験の間の細胞の生理学
的状態の変化、又は輸送の間の汚染に帰因する。一方そ
れらはまた標準的な検量ループ操作に固有な誤差に帰因
する。

しかしながら全体的な結果はこれら二つの方法の間に良
好な相関関係があることを示し、そして適切で迅速なス
クリーニング操作としての本発明の方法の使用を実証す
る。

表■ 奇怪変形菌　ｓｏ、ｏｏ。

大腸菌　６０，０００ 混合菌相　５０．０００ 大腸菌　３０，０００ 二つの試料は顕著な細菌増殖を示さなかった。

例５　ベンズインドール染料を用いた細菌活性検出用多
層要素 以下の操作に従って分析要素を調製した。

ポリエチレンフィルム支持体を被覆して、Ｉす（ビニル
トルエンーコーｐ−ｔ−プチルスチレン−コーメタクリ
ル酸）（６１８３７：２：重量比）ビーズ（１７，２？
／ｍ２）、ポリ（ｎ−プチルアクリレートーコースチレ
ンーコ−２−”＃’ｌＪルーアミドー２−メチルプロノ
ぐンスルホン酸）（５０：４０：１０：重量比）バイン
ダ（ビーズ重量の４重量％）及びトウィーン８０界面活
性剤（ＤｅｌａｗａｒｅのＷ目ｍｌｎｇｔｏｎＫｈるア
トラスケミカルから入手）−滴から成る拡散／試薬層を
提供した。被覆に先だってビーズを、表Ｉのベンズ（ｃ
ｄ）インドール染料の過剰のメタノール溶液（，１０＝
モル）中に浸し、遠心分離し、そしてホスフェート緩衝
液で数回洗浄して非吸着染料を除いた。

大腸菌の細胞懸濁液を前述のごとく調製した。

細胞の測定は２ｃがの要素試料を２個の試験管のそれぞ
れへ装入することにより行なった。一つの試験管には大
ｉ菌懸濁液５ｄが含まれ、そして他の試験管にはホスフ
ェート緩衝液５ｍｌのみ（対照）が含まれた。これら試
験管を３７℃で３５分間インキ−ベートした。次いで要
素試料を試験管から取シ出し、乾燥させ、そしてＺｅｉ
ｓｓ　ＤＭＣ２６分光光度計を用いて各試料の反射率測
定を行なった。

６００〜６５０　ｎｍ間の測定にょシ高い反射濃、度が
、対照試料からよυも微生物にさらした要素試料から得
られた。

但　多層要素を用いた微生物／染料反応に及ばず嫌気的
培養上杵の影響 表１のベンズ（ａｄ　）インドール染料■（１ｏ−３モ
ルメタノール溶液の４７．２　Ｐ／ｍ”　）　、ポリ（
アクリルアミド−ニー２−アセトアセトキシエチルメタ
クリレ−）　）（９０：　１０　：重量比）及びＺｏｎ
ｙｌ　ＦＳＮ　界面活性剤（Ｄｅ　１ａｖａｒｅのＷｉ
ｌ−ｍｉｎｇｔｏｎにあるジェポンから入手）から成る
試薬層及び染料を含まない以外は例５に記載のものと同
様の拡散層でポリエチレンテレフタレート支持体を被覆
した。

要素試料１ｄを４個のゴム栓小瓶中に装入した。

水中に飽和させた窒素ガスを２（１”−ジヵニ！−しに
よ、！１）１０分間小瓶中に発泡させた。１６ダーゾ針
はガス出口として働いた。

大腸菌細胞の懸濁液１０マイクロリツトルを２個の小瓶
中に注入しそして同量のリン酸カリウム緩衝液を、対照
として働くことが示された残９の２個の小瓶中へ注入し
た。すべての小瓶をＮ２Ｎ−スで３０分間連続的にパー
ツした。要素試料を次いでこれら小瓶から取り出し、空
気乾燥し、そしてそれぞれの反射濃度を６２０ｎｍにお
いて測定した。大腸菌にさらした二つの要素は、以下に
示すごとく対照に比べて高い反射濃度を示した。

大腸菌　１，８５ 大腸菌　１．８３ 対照　１．５０ 対照　１．５２ 例７　種々のベンズインドール染料の比較これは本発明
の範囲外のベンズインドール染料を用いた場合色変化を
生成しないことを示す比較例である。これら染料（ＸＸ
ＸＭ［−ＸＬ■）は以下の表■に示し、そして米国特許
第４２３２１２１号（１９８０年１１月４日＋　Ｇｉ’
１ｍａｎ　、　Ｊｒ等に交付）に記載されている。これ
ら染料を本発明の範囲内の表■のベンズ（ａｄ　）イン
ドール染料と比較する。

試験酸大腸菌を含む細胞懸濁液５ｒｎｌを試験管に添加
することによｐ実施した。光学濃度を６２０ｎｍにおい
てｌに合せた後、各染料の１０　モルメタノール溶液１
００μを及び１０優η４グルコース１００μｔを細胞懸
濁液へ添加した。微生物を含まない対照試験管も前述の
ごとく調製した。各試験管の内容物を緩徐に混合しそし
て３７℃で４時間インキエペートした。色変化の観察を
インキ−ベート期間の始まシの後３０分、１時間そして
インキ−ベート期間の終ｐＶｃ行なった。結果は以下の
表■に示す。

以下余白 ｊ　ｊ　剋 介　Ｑ ｊ’　ｊ 侵　侵 属　駆 転　］ 侵 サ　」 咋　駆 １＋ ｊ　ｊ ぐ　ぐ 休　暉 ７ 間　〇

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、活性成分として、ベンズ［ｃｄ　］インドール染料
   、ベンズ〔ｅ〕インドール染料及びベンズ［ｇｌｌイン
   ドール染料から成る群から選ばれた染料全音む細菌検出
   用組成物。 ２、細菌微生物と混合してインキュベートする時に検出
   可能な色変化全生成する染料と分析用検体試料と全接触
   せしめ、そしてその変化全測定することを含んで成る方
   法であって、前記染料がベンズ〔ｃｄ〕インドール、ベ
   ンズ〔ｅ〕インドール又はベンズ〔ｇ〕インドール染相
   である細菌検出方法。