JPS6062991A - Ｌ−アミノ酸の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、微生物起源のアシラーゼ（以下「アシラーゼ
」と称する〕をＮ−アシル−ＤＬ−アミノ酸に作用せし
めてＬ−アミノ酸を製造する方法ｔこ関する。

アミノ酸、特に必須アミノ酸は人及び動物の栄養１こ重
要なアミノ酸であり、従って食品工業や飼料工業にとっ
てきわめて有用なものである。

従来、微生物ｔこよるＮ−アシル−ＤＬ−アミノ酸から
Ｌ−アミノ酸を製造する方法としては、アスペルギルス
属、ペニシリウムＭ、ｔこ属ｔ−ル菌等の生産するアシ
ラーゼを作用させる方法（特公昭４１−２２５８０号公
報パフミコーラ属、ム弓−ル属、ペシロセイセス属、ス
ポロトリウム属、ビソクラミス属、クリソスポリウム属
、ギルマニエラ属、モナスカス属、チェラビア属に属す
る菌の生産するアシラーゼを５０℃以上で作用させる方
法（特公昭５Ｂ−１６８７７号公報〕およびアスペルギ
ルス属、ペニシリウム属、アクロモバクタ′−属、シュ
ードモナス属。

ミクロコツカス属、アルカリ土類金属、ストレプトミセ
ス属に属する菌の生産するアシラーゼを作用させる方法
（特公昭５０−３７２７７号公報〕などが知られている
。

本発明者らは、アシラーゼを生産することが従来知られ
ていなかった微生物が、アシラーゼを生産することを見
出し、かつかかるアシラーゼを作用させることによって
Ｎ−アシル−ＤＬ−アミノ酸からＬ−アミノ酸が収率よ
く生成することを見出し、本発明に到達した。

すなわち本発明は、クリプトコツカス属、キャンデイダ
属、トリコスポロン属、またはプロテウス属に属する微
生物の生産するアシラーゼをＮ−アシル−ＤＬ−アミノ
酸ｔこ作用せしめて、これらをＬ−アミノ酸に転換せし
め採取することを特徴とするｂ−アミノ酸の製造法であ
る。

本発明でアシラーゼを生産する微生物の具体例は次の通
りである。

（１）　クリプトコツカス・ラウレンテイ（Ｃｒｙｐｔ
ｏｏｏｃｃｕｓ　１ａｕｒｅｎｔｉｉ　）微工研菌寄第
７０９号ＴＯＲＡＹ　２００１ （２）　同　微工研菌寄第７１０号ＴＯＲＡＭ２００２ （３）　キャンデイダ・フミコラ（ｃａｎｄｊ−αａｈ
ｕｍｉｃｏｌａ　）微工研菌寄第７１５号ＴＯＥｔＡＹ
２００８ （４）　同　微工研菌寄第７１７号ＴＯＲＡＭ２０１０ （５）　同、ノ微工研菌寄第７１９号ＴＯＲＡ／Ｙ２０
２０ （６）トリコスポン・クタネウム（Ｔｒｊ−ｃｈｏｓｐ
ｏｒｏｎｃｕｔａｎｅｕｍ　）　微工研菌寄第２１４号
ＴＯＲＡＹ　２　０　０　７ ’ｊ７）　同　微工研菌寄第７２５号ＴＯＲＡＭ２　ｏ
　３５ （８）　プロテウス−レトゲリ−（Ｐｒｏｔｅｕｓｒｅ
ｔｔｇｅｒｉ　）　ＡＴＯＣｉ　２９９４４これらのア
シラーゼ生産直は液体培地をこよって培養される。培養
は通常通気攪拌培養ｅこよって行なわれ、温度３０〜３
５℃、ＰＨ６〜８で種培養を２４〜４８時間、主培養を
１０〜２４時間行なうことｔこより培養される。

主培養に８いて一般に用いられる培地、すなわち広素源
、窒素源をそれぞれグルコース、塩化アンモニウムとし
た培地でもアシラーゼは生産されるが、窒素源をＤＬ−
α−アミノ−ε−カプロラクタムｅこしても同様にアク
ラーゼが生産される。

ｆｔこＮ−アシル−Ｄムーフェニルアラニン、Ｎ−アシ
ル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｎ−７フルーＤＬ−メｆオ
ニン、或いはＮ−アフルーＬ−メチオニンを唯一の窒素
源として主培養を行なうと、生産されるアシラーゼの活
性が数倍ｅこ向上する。

培養が終了すれば、生産されたアシラーゼはほとんど菌
体中に存在する。

このアシラーゼを反応で使用するときｅこは、」二記の
培養物をそのまま、または分離菌体、もしくは菌体を破
砕して得られる無細胞゛抽出液等の処理物、あるいは分
離アシラーゼまたはこれらの酵素もしくは菌体を固定し
て得られる固定化物を酵素源として使用することができ
る。

ここに得られるアシラーゼの性質を示せば以下の通りで
ある。

１、　作用、Ｎ−アシル−ＤＬ−アミノ酸に作用して不
斉加水分解し、Ｌ−アミ ノ酸を生産する ２　基質特異性二Ｎ−アシルーＬ−アミノ酸のみに作用
して分解し、Ｌ−アミ ノ酸を生産するが、Ｎ−ｒアシル− Ｄ−アミノ酸には作用しない。

不斉加水分解反応は６０〜５０℃、好ましくは３５〜４
５℃の加電下でｐＨ６，ｏ〜７．０、好ま゛しくはＰＨ
６，４〜＆８で行なわれる。

酵素反応を行なう場合、基質濃度は通常１〜５０ｗｔ％
であるが好ましくは３〜１５　ｗｔ％である。菌体量は
乾燥菌体換算で基質の１〜５０ｗｔ％、好ましくは５〜
１５ｗｔ％である。培養物を用いる場合も培養物のＯＤ
値から算出した菌体量について上述の通りである。

反応時間は菌体量、基質濃度ｅこよって異なるが１通常
は１０〜１００時間で不斉加水分解反応Ｄ＼゛終了する
。この時、反応液中ｅこ金属イオン例えばコバルト、マ
ンガン、銅など、好ましくはコバルトのイオンを共仔さ
せると１反応が促進され、５〜２０時間で終了する。金
属イオンの添加量は使用する菌体１ｇに対して［１０５
〜０、５　ｍｍｏｌ　、好ましくは１１〜１５　ｍｍｏ
ｌである。

本発明の微生物は、不斉加水分解で生成したＬ−アミノ
酸をラセミ化したり、分解することはない。

不斉加水分解される基質としてのＮ−アシル−Ｌ−アミ
ノ酸としては、Ｎ−アセチル−Ｌ−グリシン、Ｎ−アセ
チル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−メチ
オニン、Ｎ−α−アセチルーＬ−リジン、Ｎ−７セチル
ーＬ−ロイシン、Ｎ−アセチル−Ｌ−イソロイシン、Ｎ
−アセテルーＬ−グルタミン酸、Ｎ−ペンソイル−Ｌ−
グリシン等が挙げられる。特ｔこ好ましく１１Ｎ−７セ
チルーＬ−フェニルアラニン％Ｎ−７セチルーＬ−メチ
オニンが挙げられる。本発明のアシラーゼは、Ｎ−アシ
ル−Ｄ−アミノ従って、本発明の酵素反応の原料として
は。

上記したＮ−アシル−し−アミノ酸（Ｌ体）の他Ｅこ、
対応するＮ−アシル−ＤＬ−アミノ酸（ＤＬ体〕を使用
することができる。

不斉加水分解反応液からのＬ−アミノ酸の採取は、常法
例えばイオン交換樹脂法、＠線法、有機溶媒添加法等で
行なうことができる。

以下実施例によって本発明を説明する。

実施例中、比活性のｉ　ｕｎｉｔは、１時間あたり゛１
μモルのＬ−アミノ酸を生成する活性を示す。ｕｎｉｔ
／ｍｇは不斉加水分解反応に用いた菌体の１ｍｇあたり
の活性を示す。

実施例１ 次の種培養培地１０ｍ１を試験管に入れ、殺菌冷却後、
クリプトコツカス・ラウレンテイ微工研菌寄第７０９号
（ＴＯＲＡＭ　２００　＋　）を１白金目−植菌し、３
０〜３５℃で２４時間往復振とうし、種培養を行Ｉχつ
だ。

種培養培地組成ニゲルコース２９６、ポリペプトン１ｌ
Ｌ５９６．酵母エキス １１％、水溶液（ＰＨ７，０） 次に１４三角フラスコに次記組成よりなる主培養培地を
ＩＧＱｍｊｉ分注して殺菌した。この培地に上記の種培
養液を全部加え、３０〜３５℃で１０時間、約２０　Ｏ
ｒｐｍで回転振とうし、主培養した。

主培養培地組成ニゲルコース１．２％、ＫＨ２ＰＯ４０
２％＋Ｍｇ５Ｏｓ　ｌ　Ｑ　２％、 ＭｎＱｌｇ　−４ｆ（ｇ　００．０２％、コーンスチー
プリカ−０２％、 ＤＬ−α−アミノ−ε−力 プロラクタム１％、水溶液 （ＰＨ７，０〕 培養終了後、培養液を約＋　ＤＯＤＯＧで遠心分離し、
得られた菌体なイオン交換水で約１０記希釈菌体３　Ｂ
　ｍｌ　、　００（ｉ１１６Ｈ２０ｏ、　４８　ｇを加
え、ＰＨを６．９　ｔ！−調整役、全量をｓｏｏｍｌｔ
こした。３８℃で振とうし、２４時間後、生成したＬ−
メチオニン量は２ｓｑｓｇｃ収率９１％）であった。

実施例２ Ｎ−アセチル−ＤＬ−フェニルアラニン１０８ｔこイオ
ン交換水１００　ｍｌを加え、ＫＯＨでＰＨ６，８ｔこ
調整し、ｃｏｃ１２・６Ｈ２００，０６０ｇを加え、基
質溶液とした。この基質溶液ｔこ実施例１と同様の希釈
菌体１０ｍｄを加えて、４０℃で２４時間振とうした。

゛反応終了後、反応液と菌体とを戸別したのち、反応液
をイオン交換樹脂５ＫＩＢ　ＣＨ型〕カラム（三菱化成
製Ｊｉこ導通した。この流出液を濃縮し、得られた残渣
を水から再結晶し°（Ｎ−アセチル−Ｄ−フェニルアラ
ニン４．１５　ｇ　（収率８３％）を得た。旋光度は次
のとおりであった。

５ （α）、＝−３７，１７’　ＣＣ＝［１，６０Ｈｘｏ）
次にカラムｔこ３％ＮＨ４ＯＨ水溶液を流し、流出液を
濃縮して得られた残渣を水から再結晶し。

Ｌ−フェニルアラニン５．２ｇ（収率ａ　５９６）を得
た。旋光度は次のとおりであった。

（α）　＝−３５＠（０＝１．５９　ＦＩｚＯ）実施例
３ Ｎ−アセチル−ＤＬ−フェニルアラニン２０ｇにイオン
交換水２００　ｍＪｉ’を加え、　ＫＯ＋（でＰＨ６，
８に調整し、基質溶液とした。この基質溶液に実施例１
と同様の希釈菌体２０　ｍ４を加えて４０℃で振とうし
た。９０時間反応後のＬ−７工＝　＃アラニン生成ｔバ
ー６、ｑ　ｑ　ｇ　（収、１９２．６４％）であった。

実施例４ 実施例１の培養条件のうち、主培養培地組成分のＤＬ−
α−アミノ−ε−カプロラクタム１％を、Ｎ−アセチル
−ＤＬ−メチオニン１．４％ｔこ変え、他は全く同条件
で培養を行ない、１（］％ノ希釈菌体を得た。Ｎ−アセ
−ｆ　Ａ、　−Ｄ　Ｌ　−フェニルアラニン１０ｇにイ
オン交換水１ｏｏｍｌを加え、にＯＨ″′ＱＰｔ（＆８
ｉこ調整し、ｃｏａｌｌ　６６Ｈ２００，０６ｇを加え
基質溶液とした。この基質溶液に上記希釈菌体１０ｍ４
を加え、４０℃で振とウシた。８時間後、Ｌ−フェニル
アラニン生成量は五４ｇ（９０％）であった。

実施例５ 実施例１と同条件で培養を行ない、培養終了後、培養液
を約１００００Ｇで遠心分離し、得られた菌体をイオン
交換水で約５９６に希釈した。

Ｎ−アセチル−ＤＬ−フェニルアラニン１ｇをイオン交
換水に溶かし、上記希釈菌体２ｍｌを加え、ＫＯＨでＰ
ＨをＺＯに調整して全量１０ｍ４にした。この反応液を
４０℃で振とうし、７２２時間振うした。結果を表１に
示す。

実施例６ 実施例１の培養条件のうち主培養培地組成分のＤＬ−α
−アミノ−ε−カプロラクタム１％をＮＨ４０１（Ｌ　
４２　％に変え、他は同条件で培養を行ない、培養終了
昔、実施例５と同様ｔこして５％希釈菌体を得た。この
希釈菌体を用いて、実施例５と同様の反応を行なった。

結果を表１に示す。

実施例７ 実施例６ｔこおいてＮＨ４０１ＩＩＬ　４２％をＮ−ア
セｆ　＃　−Ｄ　Ｌ−フェニルアラニン１，６％に変工
、他は同条件で培養し、同条件の反応を行なった。結果
を表１に示す。

表　１ 実施例８〜１３ 表２？こ示す微生物について実施例４と同様の培養を行
ンよった。培養終了後、培養液１ｍ１！にＮ−アセチル
ーＤＬ−フェニルアラニン１０％水溶液２　ｍＪ　、　
０ｏＣ１１１１６ＦＩｚ　ＯＯ，２５％水溶液α５ｍＩ
Ｉを加え、ＫＯＥ！’′ＱＰＨ４８に調整後。

５０℃、１時間振とうし、比活性を測定した。

結果を表２に示す。

表　２ 実施例１４ 次の大腸菌用最少（Ｄａｖｉｓ　）培地’Ｅｒｍ１を試
験管ｅこ入れ、殺菌冷却後プロテウス・レトゲリ−ＡＴ
ＯＣ２９９４４を１白金目植菌し、３０〜３５℃で２４
時間往復振とうし、種培養を行なった。

大腸菌用最少（Ｄａｖｉ８　）培地１種培養培地組成：
　ＫＨ２ｐｏ４（１，７％、に１１（２Ｐ○４０２％、
ＭｇＳＯ４７Ｆ１２００．０１１Ｎ、（ＮＨ４）２８０
４　０．１％、クエン酸３ナトリウム２水和物０，０５
％。

グルコース１１２％ 菌した。この培地に上記の種培養液を全部加え、３０〜
５５℃で２４時間約２０　Ｏｒｐｍ″′Ｑ回転振とうし
、主培養した。

培養終了後、培養液１ｍ１１１こＮ−アセチル−ＤＩＬ
−フェニルアラ＝ｙ、１０９６水溶液２　ｍｌ　。

０ｏ０１１−６Ｈ２００，２５％水溶液０．５　ｍ／を
加えＫＯ＋（’１１”ＰＥｌ７．Ｏに調整後５０℃、１
時間振２８４　＆？　ｕｎｉｔ／ｍｇであった。

特許出願人　東　し　株　式　会　社

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）　クリプトコツカス属、キャンデイダ属、トリコ
   スポロン属、またはプロテウス属ｅこ属する微生物の生
   産するアシラーゼをＮ　−アシル−ＤＬ−アミノ酸に作
   用せしめて、これらをＬ−アミノ酸１こ転換せしめ採取
   することを特徴とするＬ−アミノ酸の製造、法。
2. （２）Ｎ−アシル−ＤＬ−アミノ酸がＮ−アシルフェニ
   ルアラニンである特許請求の範囲第１項記載の方法。
3. （３）Ｎ−アシル−ＤＬ−アミノ酸がＮ−アシルメチオ
   ニンである特許請求の範囲第１項記載の方法。