JPS6062994A - 発酵法によるｌ−リジンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は、発酵法によるし一リジンの製造法に関し、
更に詳しくは、組換えプラスミ１をｒｌするコリネ型細
菌を用いる発酵法によるし一リジンの製造法に関する。

飼料として用いられるＩ、−リジンは通常、ブレビバク
テリウム属またはコリネバクテリウム属に属するし一リ
ジン生産変異株を使って発酵法により工業的に生産され
ている。現在知られている種々のし一リシン生産株はブ
レピノ＼クテリウム属またはコリネバクテリウム属の微
生物の野性株の人工変異により作られている。このよう
な人工変異株としては次のようなものがある。Ｓ−（２
−７ミノエチル）−システィン（以下、ＡＢＣと略記す
る）ｉＪ性変異株、その成長にＬ−ホモセリンのような
アミノ酸を必要とする変異株（特公昭４８−２８０７８
号、特公昭５６　６４９９号）。

ＡＢＣに耐性を示し、更にＬ−ロイシン、Ｉ−−；（；
モセリン、Ｌ−ブｌ」リン、■、−セリン、■、−アル
ギニン、Ｌ−アラニン、Ｌ−）＼リン等のアミノ酸を要
求する変異株（米国特許第３７０８３９５号及び第３８
２５４７２−号）、ＤＩ−−α−アミノ−ε−カフ゛ロ
ラクタム、α−アミノ−ラウリルラクタム、アスパラギ
ン酸−アナログ、スルファ剤。

キノイＦ、　Ｎ−ラウロイルロイシンに耐性を示すＬ−
リジン生産変異株、オキザロ酢酸、ノ悦炭酸酵素（デカ
ルボキシラーゼ）または呼吸系酵素ｌ１ｌｌ　”＋４ｆ
剤に耐性を示すし一リジン生産変異株（特開昭５（）−
５３５８８号、特開昭５．０−３１０９３号、特開昭５
２−１０２４９８号、特開昭５３−９３　り　４号、特
開昭５３〜８６０８９号、特開昭５５−９７８３号、特
開昭５５−９７５９月、特開昭５（ｉ−３２９９５号、
特開昭５６〜３９７７８号、４，１公昭５３−４３５９
１号、特公昭５３〜１８３３号）、イノシトールまたは
１１１１酸を要求する１、−リジン生産変異株（特開昭
５５−９７８４υ、　’Ｉ＞　ｌｆｆ１昭５６−８６９
２号）、フルオロピルビン酸マタは３４℃以上の温度に
対して感性を示ずＬ−リジン生産変異株（特開昭５５−
９７８３号、４１冒）ｒ１昭５３−８６０９０号）。そ
の他に米国特許出願第３３３４５５号明細書にはエチレ
ングリコールに耐性ヲ示シ、Ｌ−リジンを生産するブレ
ビバクテリウムまたはコリネバクテリウムの変異株が開
示されている。更に、先行技術には組換えプラスミＦＤ
ＮＡを用いて形質転換したエシェリヒア・コリ株が開示
され、この株はアミノ酸の生産を増加する（例えば米国
特許第４２７８７６５号参照）。

一方、ブレビバクテリウム及びコリネバクテリウム属の
細菌については識別可能な表現型マーカーを持つプラス
ミドが存在することは永い間知られていなかったが（ヨ
ーロッパ特許公開第３３９１号参照）、最近の研究では
スレオニンまたはイソロイシンの生成を支配するプラス
ミドを有するコリネ型細菌の育成の可能性が開示されて
いる（米国特許出願３７６３９６号、及び第３９２１４
５号参照）。更に、米国特許出願３８６９８０号にはコ
リネ型細菌であるグルタミン酸生産菌中で増殖可能な複
合プラスミドが開示されている。

リジン、インロイシン及びスレオニン生合成径路を下記
に概略的に示す。

アスパラギン酸塩 アスパラギン酸セミアルデヒド ゼ Ｌ−リジン 上記径路におけるアスパラギン酸セミアルデヒドの連接
個所にはスレオニン及びイソロイシン・＼の径路の第１
の分岐がある。これら２種のアミノ酸に導く酵素はホモ
セリンデヒトｌコケナーセ（以下、Ｉ（Ｄａｓｅと略記
する）であり、リジンに導く酵素はジヒドロジピコリン
酸シンセターゼ（以下、Ｄ　ＨＤ　Ｐシンセターゼと略
記する）である。

リジン生合成径路のいくつかの遺伝子を含むハイブリッ
ドプラスミドを有するニジエリ（ア・コリ株が最近開示
されたことは注目すべきことである。リジンのオーバー
プロデューサー（ＴＯＣＲ２１）を形質転換し、別の株
でリジンの合成が研究され漬（例えばＬｅ−Ｒｅｖｅｒ
ｅｎｄ　ｅｔ　ａｌ、　ＥｕｒｏｐｅａｎＪｏｕｒｎａ
ｌ　ｏｆ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ
　ａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　１５　：　２
２７−２３１　（１９８２）及びフランス特許公開第２
５１１０３２号（出願番号第８１／１５３８５号）、１
９８３年２月１１日公開参照）。これらの文献から明ら
かなように、ｄａｐ　Ａ遺伝子（Ｄ　ＨＤ　Ｐシンセタ
ーゼをコードしている）を有するプラスミドのみがリジ
ン生産の増加をもたらすのである。この反応は、リジン
オーバープロデューサー（アスパラギン酸キナーゼ反応
を変える変異株を有する）における限られた生合成段階
である。著者等はこのような遺伝子増幅法は代謝物をオ
ーバープロデユースする株の改質に使用できることを示
唆している。しかしながら、これらの文献には、この作
用をコリネ型細菌に拡張することを示唆する記載は全く
ない。米国特許出願、＄５０４４７１号にはイソロイシ
ン及びスレオニン生合成径路をコントロールする遺伝情
報を有する組換えプラスミドがコリネ型細菌中に存在す
ることが開示されている。

Ｌ−リジンの１．より優れたかつ能率的な発酵生産方法
に対する要求が依然として存在する。

ジアミノピメリン酸デカルボニトシラーゼ（ＤＡＰ　Ｄ
ａｓｅ）をコードする遺伝情報がコリネ型ｊ、１１Ｉ菌
中に増殖可能な特定のビークルに接続し、その結果その
遺伝情報を保持するハイブリッドビークルが特定のコリ
ネ型細菌のボストまたは受容株内で増殖すると、形質転
換されたコリネ型倣生物はし一リジンの優れた生産菌で
あることを本発明、ｈ等は見出した。本発明はＬ−リジ
ンを大量に生産するコリネ型細菌タイプのうちブレビバ
クテリウム属及びコリネバクテリウム属の多くの菌がボ
ッ、トとして利用できるので、特に興味深い。

このように本発明は、Ｌ−リジンの発酵生産力法及びそ
の方法に含まれる種々の遺伝的、微生物学要素に関する
ものである。本発明は、例えばジアミノピメリン酸デカ
ルボ４−シラーゼの遺伝子の分離方法、該遺伝子を含有
し、コリネ型細菌中に複製可能な種々のビークル、この
ようなビークルを含有するコリネ型細菌タイプの種々の
微生物及びＬ−リジン生産のための発酵法に関するもの
である。

リジン、スレオニン及びイソロイシン生産の生合成径路
は前記した通りである。概略図はＬ−ＩＪリジンの径路
の最終段階としてＤＡＰ　Ｄａｓｅが出現することを示
している。口ＡＰ　Ｄａｓｅをコードするのに充分な遺
伝情報を含むＤＮＡは特定のＤＮＡ供与株から得られる
。該供与株は望ましくはコリネ型細菌であり、最も望ま
しくはブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂ
ｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔ
ｕｍ）である。１ｌＡＰＤａｓｅをコードする遺伝情報
は、供与株からのＤＮＡを部分的に切断し、特定のプラ
スミドに遺伝配列を導入し、複数の組換えＤＮＡの混合
物を用いてＤＡＰ　Ｄａｓｅを欠失したコリネ型細菌を
形質転換し、次いでジアミノピメリン＠　（ｄａｐ）に
生育可能な形質転換株を分離することにより得られる。

特に、遺伝配列を含むＤＡＰ　Ｄａｓｅ遺伝情報はブレ
ビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡ　ｉ”　ＣＣ
１３８６９（野性型）から得ることができる。１祐ＩＩ
Ｄａｓｅ遺伝子から成る遺伝情報は分子量約２．９−’
　０．１メガダルトンであり、２個のＩ’５ｔｌ、２個
の５ａｃｌ。

２個のｌ１ｉｎｄｎｌ、１個のＣ１ａ　ｌ制限エンドヌ
クレアーゼサイトを持ち、２個のＰａｔ　Ｉサイトによ
りフランクされているＤＮＡ断片に見出される。

この形質転換に有用な受容株または供与株は所謂コリネ
型細菌である。これらの細菌は好気性。

グラム陽性桿菌。ブト抗酸性であり、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ
Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ口ｅｔｅｒｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌｏｇｙ＋第８版。

５９９頁（１９７４年）に記載されている。本発明にお
いて供与株として有用なコリネ型細菌の野性株の具体例
は下記の通りである。

ブレビバクテリウム・シバリカタム ＡＴＣＣ１４（１２０ ブレビバクテリウム・サソカロリテイクムＡＴＣＣ１４
０６（ｉ ブレビバクテリウム・イマリオフイラムＡＴＣＣ１４０
６８ ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムΔＴＣＣ１
３８６９ ブレビバクテリウム・ロゼラム ＡＴＣ，Ｃ１３８２５ ブレビバクテリウム・フラバム ＡＴＣＣ１３８２６ ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ＡＴＣＣ１９２４０ コリネバクテリウム・アセトアシドフイラムＡＴＣＣ１
３Ｂ’ＩＯ コリネバクテリウム・アセトグルタミカムＡＴＣＣ１５
８０６ コリネバクテリウム・カルルナエ ＡＴＣＣ１５９９１ コリネバクテリウム・グルクミン４ ＡＴＣＣ１３０３２，１３０６０ コリネバクテリウム・リリウム ＡＴＣＣ１５９９０ コリネバクテリウム・メラ・ノセコーラＡＴＣＣ１７９
６５他 望ましい結果は、コリネ型細菌をボス１として利用する
に先立って該細菌を公知の方法で低制限酵素活性に変異
したときに得られる。

コリネ型細菌をＤＡＰ　Ｄａｓｅインリー１−を有する
ビークルで形質転換すると、該細菌は異種遺伝子から得
た遺伝情報を発現する。

ホモセリンデヒドロジナーセの欠１員株（オキソトロフ
）であるかまたはＳ−（２−アミノエチル）−システィ
ン（ＡＥＣ）に剛性を有するボストは特に興味深いもの
である。Ｉ）ＡＰ　ｌ１ａｓｅにおりる非欠損株（プロ
トトロフ）であるボストも望ましいものである。ＤＡＰ
　Ｄａｓｅをコードする遺伝子を１．＋１にマルチコピ
ープラスミドに挿入すると、この酵素に対する遺伝子コ
ピーの数が著るしく増力１１シ、かつ最終Ｌ−リジンの
生産を非常に増加する。事実、ＤＡＰ　Ｄａｓｅ非欠損
（ＤＡＰ　Ｄａｓｅ’　）ポスト中にｌｌＡｌ’　１ｌ
ａｓｅ遺伝子を有するマルチコピープラスミドを使用す
ることにより最高濃度のし一リジンが１５）られる。

ＤＡＰ　Ｄａｓｅの欠損株はＤＡＰ　Ｄａｓｅｉｆｌ伝
子を有するビークルを選択し、分離するためのボストと
じて通常用いられる。し７たかっ−Ｃ１このようにして
分離したビークルをＤＡＰ　Ｄａｓｅの非欠損株の形質
転換に用いることは有利である。

また、アスパートキリ゛−ゼ野性ホストまたはアスパー
トキナーゼ反応を変えることにより変異したポストを用
いることは興味深いものである。アスパラギン酸キナー
ゼ反応を変えることにより変異してホストがリジンをｊ
５剰生産するようにしたポストにおいては、そのバラギ
ン酸キナーゼ反応はもはや速度が制限されない。したが
って、このような変異ホストを利用することにより最大
の効果が得られる。

コリネ型細菌中で増殖可１１旨であるいかなる増殖性の
ビークルもＤＡＰ　１）ａｓｅ遺伝子を運び込むために
利用可能であり、またボストの形質転換のために用いる
ことができる。プラスミド、ファージまたは他のヘクタ
ー等のビークルを利用することができる。米国特許出願
第３８６９８０号に開示されている複合プラスミドは特
に重要である。これらのプラスミドはコリネ型グルタミ
ン酸生産細菌中で増殖可能なプラスミド（ａ）に由来す
るト′ライブユニット部位（Ａ）及びエシェリヒア・ご
１りまたはバチルス・ズブチリス中で増殖ｉｉＪ能で、
かつ少なくとも薬物耐性を示す部位を持つプラスＳ＋（
ｂ）に由来する１個または数個の遺伝子断片（Ｂ）から
成る。遺伝子断片が更にブラスミ１（ｂ）のドライブユ
ニット部位を有するとき、この複合プラスミドはエシェ
リヒア・コリまたはバチルス・ズブチリス中で増１＋Ｉ
ｉ　ａＪ能になり、かくして複合プラスミドはエシェリ
ヒア・コリまたはバチルス・ズブチリス中でスクリーニ
ングされ、あるいは増幅される。

所謂「薬物耐性」とはポストの細胞の成１４を阻止する
抗生物質のような薬剤に対する耐性を包含するものであ
る。このような抗生物質の例にはペニシリン、カナマイ
シン、クロラムフγ、二一二Ｉ　−／し。

エリスロマイシン、アクチノマイシン等がある。

コリネ型細菌に増殖可能なマルチコピープラスミド（ａ
）の具体例は前述の出願に示され゛（おり、ブレビバク
テリウム・ラクトフアーメンタトＡＴＣＣ１３８６９か
ら分離され、分子量３．０メガダルトン（第１図の制限
地図）のｐＡＭ３３’０゜コリネバクテリウム・グルタ
ミクムＦＥＲＭ　Ｐ−５４８５から分離され、分子量３
．０メガダルトン（第２図の制限地図）のｐＡＭ２８６
．コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０５
８から分離され、分子量１．８メガダルトン（第３図の
制限地図）のｐ　ＨＭ　１５１９等がある。

エシェリヒア・コリに増殖可能なプラスミド（’ｂ）は
マルチコピープラスミドで、薬物耐性という遺伝情報を
有しており、例えばｐＡｃ１０５゜ｐＢＲ３２２，ｐ１
３１ン３２４．　ｐＢＲ３２５等かある。　バチルス・
ズブチリスに増殖可能で、かつ薬物耐性という遺伝情報
を有するプラスミド（ｂ）は、望マしくはマルチコピー
であり、ｐＴ１２７、ｐｃ１９４．ｐｃ’２２１．ｐＣ
２２３゜ｐＵＢｌｌｏ等が含まれる。

プラスミド（ａ）及び（ｂ）から複合プラスミドを調製
するには、制限酵素による切断、リカーゼによる連結等
の常法を採用することができる。

連結反応後、コリネ型細菌中に増殖可能で、かつ該コリ
ネ型細菌を薬物耐性に形質転換可能なプラスミドを分離
して望ましい複合シラスミ１−を県別する。

プラスミド（ａ）に由来するドライブユニット部位、プ
ラスミド（ｂ）に由来する別の１°シイブユニット部位
及びプラスミド中ｂ）の薬物耐性遺伝子を有する複合プ
ラスミドはコリ木型細菌及びエシェリヒア・コリまたは
バチルス・ズブチリス中に増殖可能で、（１）コリネ型
細菌または（２）エシェリヒア・コリ　（この場合はエ
シェリヒア・コリ中に増殖可能なプラスミドを用いた）
またはバチルス・ズブチリス（この場合はバチルス・ズ
ブチリス中に増殖可能なシラスミ１′を用いた）を形質
転換可能で、かつ薬物耐性を４１するプラスミド中に見
出すことができる。

本発明に有用な複合プラスミドは４ろ定の国際寄託機関
に寄託されているホストに存在するものであり、下記の
通りである。

ｐＡＪ６５５　：エシェリヒア・コリＡＪ１　１　８　
８　２、ＦＥＲＭ−ＢＰ １３６　（ＦＥＲＭ−Ｐ６５１７）。

コリネバクテリウム・グルタミ クム５Ｒ８２０，１，ＡＴＣＣ ３９１３５（第４図制限地図） ｐＡ、Ｊβ１１　：エシェリヒア・コリＡＪ１１８８４
、ＦＥＲＭ−ＢＰ ｌ　３　Ｂ　（ＦＥＲＭ−、Ｐ　６５１９）（第５図制
限地図） ｐＡＪ１８４４：エシェリヒア・コリＡＪ１１８８３、
ＦＥＲＭ−ＢＰ ｌ　３７　（ＦＥＲＭ−Ｐ８５１８）　。

コリネバクテリウム・グルタミ ９ムＡＴＣＣ３９１３６ （第６図制限地図） ｐＡＪ４４０　：バチルス・ズブチリスΔＪ１１９０１
、ＦＥＲＭ−ＢＰ １４０（第７図制限地図） ｐＡＪ３１４８　：コリネバクテリウム・グルタミクム
５Ｒ８２０３，ＡＴＣＣ ３９１３７（第８図制限地図） 複合プラスミドは寄託微生物の細胞から次のようにして
得られる。対数増殖期後期に集められた細胞をリゾチー
ムおよびＳＤＳを用いて溶菌し、３００００Ｘｇで遠心
分離して溶解物から得た上澄液にポリエチレングリコー
ルを添加し、セシウムクロライドーエチジウムブし１マ
イト平衡衝度勾配遠心分離を用いて沈澱したＤＮＡを分
別精製する。複合プラスミドは寄託微生物から自然喪失
またはキユアリング（Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ
　Ｒｅｖｉｅｗｓ。

３６：３．６１−４０５　（１９７２））により１員傷
せずにホストを得て分離することもできる。

ＤＡＰ　Ｄａｓｅ遺伝子を適当な複製ビークルに挿入′
Ｊるには、公知の方法により、適当な制限エン１−ヌク
レアーゼを用いて複製ビークルを切１υ１し、９□一定
の遺伝子配列を連絡することにより可能である。

ＤＡＰ　Ｄａｓｅ遺伝子を有するビークルをコリネ型細
菌のポスト中に取込むには、ＤＮＡ受容株の細胞を塩化
カルシウムで処理してＤＮＡの浸透性を増加する方法（
Ｍａｎｄｅｌｌ、　Ｍｅｔ　ａｌによるエシェリヒア・
コリに−１２に関する報告、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＭ
ｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇＶ　、５３　：　ｌ　５
９　（１９７０）または細胞がＤＮＡを取込み可能な特
定の成長時期に取込む方法（Ｄｕｎｃａｎ＋　ｃ、　Ｉ
ｌ、　ｅＬ　ａｌによるバチルス・ズブチリスに関する
報告）がある。プラスミドはまた、シラスミＦ　Ｉ）　
Ｎ　Ａを容易に取込むＤＮＡ受容体のプロトプラストま
たはスフェロプラストを形成することによって受容体に
取込むことが可能である。これはバチルス・ズブチリス
。

アクチノマイセス及び酵母について知られており、Ｃｈ
ａｎｇ、　Ｓ、　ｅｔ　ａｌによる報告、Ｍｏ１ｅｃ、
　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ。

１６８：１１１　（１９７９）、Ｂｉｂｂｅｔａｌによ
る報告、Ｎａｔｕｒｅ、２７４：３９８　（１９７８）
。

１１ｉｎｎｅｎ、　Ａ、　ｅｔ　ａｌによる報告、ＰＮ
ＡＳ　ＵＳＡ。

７５：１９２９　（１９７８）がある。

複合プラスミドはコリネ型細菌を薬物耐性細菌に形質転
換するので、ＤＡＰ　１ｅａｓｅ遺伝子を挿入されたプ
ラスミドを含む形質転換株はその薬物に対する耐性を試
験することにより容易に同定することができる。遺伝マ
ーカーを持たないビークルを組換えＤＮＡの調製に用い
る場合は、ｌ］Ａｒ’　Ｄａｓｅを挿入したビークルを
有する形質転換株は成長のためのｄａｐ要求性を試験す
ることによってボストの細胞と容易に区別できるので、
１）ＡＩ’　１ｅａｓｅの欠１ノ１株がホストとして望
ましい。

複合プラスミドに挿入したＩＩＡＰ　１ｌａｓｅｉｌｌ
伝子は、必要に応じ常法により容易に他のビークルに転
移することができる。

かくして得られたし一すジン生産菌培養力法は常法であ
り、公知のリジン化産微生物の培養方法に類似している
。用いる培地は炭素源、窒素源。

無機酸イオン、さらに必要に応じビタミン及びアミノ酸
等の微量有機栄養素を含む通常の培地である。適当な炭
素源としてはグルコース、シュークロース、ラクトース
、澱粉加水分解物及び杖１１′Ｍ等がある。気体アンモ
ニア、液体アンモニア、アンモニウム塩及び他の窒素含
有物質が窒素源として使用できる。

ＤＡＰ　Ｄａｓｅ遺伝子を有するビークルを含有する形
質転換された微生物の培養は、培地のｐＨ及び温度を至
適水準に調整した好気的条件下で行われ、Ｌ−リジンの
生成が完了するまで続けられる。培地に蓄積するこのア
ミノ酸は常套手段により回収することができる。

本発明方法によれば、ブレビバクテリウム及びコリネバ
クテリウｌ、の人工変異株を使用する従来知られている
方法より高い収率で１７−リジンを生産することができ
る。

以上本発明を詳述したが、以下の実施例により本発明を
さらに詳しく説明する。但し、実施例は単に例示にすぎ
ず、本発明はこれに限定されるものでないことは勿論で
ある。

実施例１ （１）供与菌からの染色体１）ＮＡの調製ブレビバクテ
リウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９（野
性型）を酵母エキス１％。

ペプトン１％、グルコース０．５％、ＮａＣｊ！０．５
％を含み、Ｐ　Ｈ７，２のＣＭ−２Ｇ培地Ｉｚ中で３０
℃で培養した。指数増殖期に集めた細胞から常法のフェ
ノール法により染色体Ｄ　Ｎ　Ａ３．５■を抽出し、ジ
アミノピメリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子を含有する
ドナーＤＮＡとして使用した。

（２）ベクタープラスミドＤＮＡ０調覧コリネバクテリ
ウム・グルタミクムＡ　′ＦＣＣ１３０５８の隠性のプ
ラスミド、ｐＨＭ１５１９（第３図参照）とエシェリヒ
ア・コリに−１２の人工ベクタープラスミドｐ　Ｂ　Ｉ
？　３２５とを組合−１ることにより、ベクターとして
ハイブリッドプラスミドｐＡＪ１８４４（第６図参＋＋
＜１　）を作成した。

この新しいハイブリッドプラスミドｐΔ、１１８４４は
エシェリヒア・コリに−１２，ブレビバクテリウム・ラ
クトファーメンタムＡＴＣＣ３９１３４及びコリネバク
テリウム・グルタミクムＡ　′ｒＣＣ１３０３２中で増
殖し、クロラムフェニコールｌｌ１ｉ（性マーカーを示
すシャトルベクターである。

酵母エキス１％、ペプトン１％、Ｎａ（１！（１，５％
及びグルコース０．５％からなりｐ　１１７．０のＣＭ
−２Ｇ１００ｍｊ！中に生育したブレビバクテリウム・
ラクトファーメンタムＡ’ｌ”ＣＣ３９１３４／ｐＡＪ
　１８４４細胞からｐＡＪ１８４４ＤＮＡ８０μｇを抽
出し、ベクターＤＮＡとして使用した。

リゾチーム処理、ＳＤＳ処理、アガロースゲル電気泳動
法及びゲル抽出によりプラスミドＤＮＡの抽出を行なっ
た。

コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０５８
及びエシェリヒア・コリＣ−［ｉｏｏは共にｐＡＪ　１
８４４を担持しており、これらはＡＴＣＣ３９１３６及
びＦ［ＥＲＭ−ＢＰ１３７として寄託されている。

（３）ベクターＤＮＡへσ」色体ＤＮＡ断片の挿入染色
体ＤＮＡｌ０μｇをエンドヌクレアーゼＰｓｔ１５単位
を用いて３７℃、５〜６０分で部分的に切断した。ベク
ターＤＮＡｌ０μｇはＰｓｔＩにより完全に切断された
。加熱し°ζＰｓｔｌを不活化した後、４ＤＮ八を混合
して１゛４　リガーゼを用いて１０℃、２４時間で連結
した。

ＤＡＰデカルボキシラーゼ遺伝子のクローンニングのた
めの受容菌株としてプレビバクテリウム・ラクトファー
メンタムＡＴＣＣ３９１３４（ｌｙｓ　−、ｔｈｒ　−
＊　ｍｅｔ　−）を用いた。オシ１−サノグラフ法によ
り欠失段階の一つはリジン生合成におけるＤＡＰデカル
ボキシラーゼであると決定された。その理由は、この変
異株はＬ−リジンに生育するが、ＤＡＰでは生育しない
カ（らである。

プロＩ・ブラスト形質転換法により上記のキメリックＤ
ＮＡを受容細胞ＡＴＣＣ３９１３４中へ導入した。ＣＭ
−２Ｏ２ｍｊ２の初期指数増殖期においてペニシリンＧ
Ｏ３６単位／　ｒｎ　７！を用いて細胞を１．５時間処
理し、集め、シュークロス５００ｍＭ。

マレイン酸塩２０　ｍＭ、Ｍｇ　Ｃ１２１２０ｍＭ。

Ｄｉｆｃｏ　Ｐｅｎａｓｓａｙブロス３．５％、ｐＨ６
，５のＳＭＶＰ培地で洗浄した。これらの細胞をＳ　Ｍ
　Ｍ　ｌ”８地中にてリゾチーム１０　ｍｇ／　ｒｎ　
７！で３０°Ｃｌ２Ｏ時間処理することによりプロトプ
ラスＩ・を＝ｐ１製した。

この細胞を遠心分離により集め、Ｓ　’Ｍ　Ｍ　Ｉ）培
地で洗い、ＳＭＭＰ培地０．５ｍｌ中に再懸濁した。こ
のプロトプラスト懸濁液にキメｌリックＤＮＡを混合し
、ＥＤＴＡ５ｍＭ、カルボキシメチルセルロース２％の
存在下に２分間インキュベートし、ＳＭＭＰで洗い、Ｓ
ＭＭＰ中で３０℃、２時間培養してクロラムフェニコー
ル耐性を充分発現させ、最後にトリス緩衝液１．２％、
ＫＣｉ、０５％、グルコース１％、ＭｇＣＮｚ　・６１
１２００．８１％。

０．０２％、こはく酸すトリウム１３．５％、寒天０．
８％及びフロラＬ　７　ｒ−二：７−ル３　ｐ　ｇ　／
ｌｎ　ｊ！　、　ｐＨ７、０の再生培地に接種した。

３０℃で２週間培養後、平板上に表われたクロラムフェ
ニコール耐性コロニーをグルコース０．５％、（ＮＨ４
）２ＳＯ４０，１５％、尿素０．１５％。

Ｋ　ＨｚＰ　Ｏａ　０．１％、　Ｍｇ５ｏ、・７　Ｈ２
Ｏ０，０１％、　ＣａＣｊ！ｚ　・２＋ＩｚΩ０．００
０１％、ｄ−ビオチン３０μｇ／β、す゛イアミソ塩酸
塩１００μチオ、ニン５００μｇ／ｌ！及び寒天１，５
％，　ｐＨ７、　０の最小培地に複製した。

表われたコロニーを純化し、クロラムフェニコール耐性
，リジン原栄養性を確認し、この形質転換株をＡＪ１２
０３１と命名し、微工研にＦＥ　Ｒ　ＭＢＰ−２　７　
７として寄託した。

（５）キメリンクプラスミドのノ析 ２項に記載した手段と同じ手段でＡＪ １２０３１１からプラスミドＤＮＡを抽出した。

このＤＮＡ１μｇをＰｓｔｌで切断し、アガＩＪ　−ス
ゲルミ気泳動法で分析した。ｐＡＪｌ．０１と命名され
たキメリンクプラスミ１−は５．４メガダルＩ・ンのｐ
ＡＪ１８４４及びＤ　Ａ　Ｉ）デカルボキシラーゼ遺伝
子を有する２．９メガダルＩ・ンの異種プラスミドから
構成されていた。２．９メガダルトンのＤＮＡをＰｓｉ
；’１．５ａｊ２１及びｌ１ｉｎｄｌｌｌを用い°Ｃ完
全に切断して１．９メガダルトン、０．７メガダルトン
及び０．３メガダルトンの３つの部分に切断した。

Ｃβａｌもまたこの染色体ＤＮＡを切断した（第９図）
。

（６）？　転換　のＤＡＰシカノリ（剌２ーシーニー＝
ｐ　７＋１し性形質転換株としてブレビバクテリウム・
ラクトファーメンタムＡＪ１２０３１　（１”ＥＲＭ　
Ｂｌ）−２７７）、受容株としてＡＴＣＣ３　９　１　
３　４株、供与株としてＡＴＣＣ１３８６９株をＣＭ−
２Ｇ培地中で一夜培養して集め、洗浄し、１００ｍＭＫ
−フォスフェート（リン酸カリウム）バ・ノファ−（ｐ
Ｈ７．５）を用いて再懸濁し、音波処理し、遠心分離し
た。上澄液を粗酵素溶液として使用した。ＤＡＰデカル
ボキシラーゼ反応混合物は粗酵素液ｌＯ％．酵素基質と
してのｄａｐＨＩｗ／ｍ＃及びリン酸カリウムバッファ
ー（ｐＨ７．５）よりなる。３７℃で３時間培凝後、反
応混合物を液クロマトグラフイーにかけ、反応基質とし
てのｄ’ａｐ及び生産物としてのリジンの量を概算した
。第１表に示す如く、形質転換株のＤＡＰデカルボキシ
ラーゼはＤＮＡ供与株のそれの約２倍であった。

（７）ＤＡＰ−デカルボー１−シラーゼ遺伝子クローン
二種のリジン生産変異株、ブレビバクテリウム・ラクト
ファーメンタムＡＪ　１２０１９　（ＮＲＲＬ１３−１
５３４６）、ホモセリン欠損性変異株およびＡＪ３７８
９　（ＦＥＲＭ　Ｐ−２６４７）、リジン−アナログ、
Ｓ−（２−アミノエチル）−り一システィン耐性変異株
をｐＡＪ　１０１　ＤＮＡにより形質転換した。りＵラ
ムフェニコール耐性及びアガロース−ゲルＤＮＡ分析に
より形質転換株を確認した後、ＡＪ１２０３２　（ｐＡ
Ｊｌｏｌにより形質転換されたＡＪＩ２０１９）及びＡ
Ｊ１２０３３　（ｐＡＪｌｏｌにより形質転換されたＡ
Ｊ　３７８９）を代表的な形質転換株として選んだ。

（８）形質転換株によるリジン生産 形質転換株及びその他の株をグルコース１０％。

（Ｎ　Ｈ４）　２Ｓ　Ｏｓ　４％、ＫＨ□ＰＯ４ｏ、１
％、Ｍｇ５ｏ４・７ＨｚＯＯ，０４％、Ｆｅ５Ｏｎ・７
Ｈ，００，００１％、ＭｎＣｊ！ｚ’４Ｈｚｏ０．００
０７％。

ｄ−ビオチン３００μｇ／Ｉ１．ザイアミン塩酸塩２０
０μｇ／ｊ！、大豆蛋白加水分解物０．２％、Ｉ−−ス
レオニン０．０６％、Ｌ−メチオニン０．０２％及びｃ
ａｃＯｚ５％、ｐＨ７，５の合成培地に３０℃で７２時
間培養し、そのリジン生産能を試験した。リジンはＨＬ
ＰＣより４Ｐ：１′Ｒシた。その結果を第２表に示す。

実施例２ ＤＡＰデカルボキシラーゼ遺伝子をｔｒするキメリンク
・プラスミドｐＡＪ　ｌ　０１を実施例１第２項に記載
した方法によりブレビバクテリウム・ラクトファーメン
タムＡＪ　ｌ　２０３　Ｌ　（Ｆ１７．ＲＭＢＰ−２７
７）から抽出し、これを用い一〇：ｌす不バクテリウム
・グＪレタミカムへＴＣＣｌ　３２８　Ｔ。

ホモセリン欠損株を実施例１第４項に記載しノ、二ノＪ
法により形質転換した。形質転換株をりｌ：１−７Ｊ、
ソエニコール耐性により選別し、５Ｒ８３０１と命名し
、ＮＲＲＬ　Ｂ−１５３４１１として寄託した。

（２）形　転換株によるりンＺＪ−近（実施例１第８項
に記載した方法で培養を行った。

その結果を第３表に示す。

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミドｐＡＭ：１３０の制限地し１を示す
。 第２図はプラスミドｐＡＭ２８Ｇの制御Ｂ地図を示す。 第３図はプラスミドｐＨＭ１５］９の制限地１２１を示
す。 第４図は複合プラスミドｐΔＪ６５５σ）制限地図を示
す。 第５図は複合プラスミドｐＡＪ６１１の制限地図を示す
。 第６図は複合プラスミドｐＡ、Ｊ１８４４の制限地図を
示す。 第７図は複合プラスミドｐΔＪ４４０の制限地図を示す
。 第８図は複合プラスミＦｐＡ、Ｊ３１４Ｂの制限地図を
示す。 第９図はプラスミドｐＡＪ　１０１の制限地図を示す。 第１図 第２図 Ａｖａ　Ｉ　Ｈｉｎｄ　ｍ 第３図 ′Ｂａｔ　Ｔ 第４１・・Ｔ 第５図 第６　口 第７図 Ｈ・Ｈａｅ　ＩＩ Ｕ　：　Ｈｉｎｄｕ ＩＩＩ　：　ＨｒｎｄＮ 第８図 Ｈ：Ｈｒｎｄｌｌ ｍ　：　Ｈｉｎｄ　ＴＥ Ｓ　：　Ｓａｃｌ

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ジアミノピメリン酸脱炭＃酵素活性を有する（１（白質
   を生産する情報をコードする竜伝配列を含め、分子量２
   ．９±０．５メガダル（・ンであり、２　（＋１．ｌ　
   ｏｒ　ｐ　ｓ　ｔ　ｔザイト、２個の５ａ１１サイト、
   ２＋ｌｌ；Ｉの１ｌｉｒ＋ｔｌｌｌｌす・イト及び１個
   のＣ１ａ　Ｉサイ１へがあり、がっＰｓＬＩでりＪ断し
   たときに１．９メガダルトン、０．７メガダルトン及び
   ０．３メガダルトンの小断片を生じるＬ）Ｎ△断片が挿
   入されている組換えプラスミドをイＪするコリネ型細菌
   を培養し、培養物からし一リジンを採取することを特徴
   とする発酵法によるＩ、−リジンの製造法。