JPS6012995A - 発酵法によるｌ―スレオニン及び／又はｌ―イソロイシンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野〕 本発明は発酵法によるＬ−スレオニン及びＬ−インロイ
シンの製造法に関し、詳しくは組換えプラスミドを有す
るコリネホルム細菌を用いた発酵法によるＬ−スレオニ
ン及びＬ−イソロイシンの製造法に関する。

（従来の技ｗｉ） 従来、発酵法によりＬ−スレオニンやＬ−インロイシン
を製造する場合、微生物としては自然界から分離した菌
株または該菌株の人工変異株を用いられている。Ｌ−ス
レオニンを生産する人工変異株は数多く知られており、
その多くはα−アミノ−β−とドロキシ吉草酸（以下、
ＡＨＶと略記する。）に耐性があり、プレビバクテリク
ム属またはコリネバクテリウム属に属している。これら
の微生物は収率１０〜２０％でＬ−スレオニンを生産す
る。例えば、米国特許第３５８２４７１号明細書。

同第３５８０８１０号明細書及び特公昭４７−３４９５
６号公報にはＡＩ（Ｖ耐性を示し、グレビバクテリウム
属、エシェリヒア属及びコリネバクテリウム属に属する
変異株を用いたＬ−スレオニンの製造法が開示されてい
る。また、ブレビバクテリウム属及びコリネバクテリウ
ム属に属する変異株によるＬ−スレオニンの生産につい
て特開昭５１−５４９８４号公報、同５３−１０１５９
１号公報、同５４−３２６９３号公報、同５４−３５２
８５号公報、同５４−３５２８６号公報、同５４−３５
２８８号公報、同５４−３７８８６号公報及び同５４−
９２６９２号公報にも開示されている。

一方、米国特許第４２７８７６５号明細書、特開昭５５
−１３１３９７号公報及び同５６−１５６９６号公報に
は組換えプラスミドＩＪＮＡを用ｔ・て形質転換された
エシェリヒア・コリな用いてＬ−スレオニンを製造する
方法が示されている。

さらに、１９８２年５月１０日に出願された米国特許出
願第３７６３９６号明細書にはＡＨＶに対する耐性をコ
ントロールする染色体ＤＮＡ断片が挿入されているプラ
スミドを有するコリネホルム細菌を使用するＬ−スレオ
ニンの生産について記載されている。

また、Ｌ−インロイシンに関する状況もＬ−スレオニン
の場合と酷似している。Ｌ−イソロイシンを生産する微
生物としてはイソロイシン吉草酸塩に対して耐性を有す
るセラチアの変異株（特公昭５２−３０５９３号公報）
、その生育にＬ−ロイシンを必要とするコリネバクテリ
ウム・グルタミヵムの変異株（特公昭４７−３８９９５
号公報）、ＪＥＴに耐性を有するブレビパフチリウム属
及びコリネバクテリウム属の変異株（特公昭４０−２８
８０号公報）　、　Ａｌ１ｖに耐性を有し、かつその生
育にリジンを必要とするブレビバクテリウム属の変異株
（特公昭５１−６２３７号公報）、）ｍ及びｏ　−メー
ｆｖスレオニンに耐性を有するブレビバクテリウム属の
変異株（％公明５１−２１０７７号公報）、８−（２−
アミノエチル）−システィンに耐性を有するコリネバク
テリウム属の変異株（菅公昭５２−４６２９号公報）、
２−アミノ−３−メチルチオ醋酸に耐性を有するエシェ
リヒア属の変異株（特開昭５３−６９８８１号公報）、
ＡＨＶ及びトリクロロアラニンに耐性を有するブレビバ
クテリウム屈の変異株（特開昭５４−３５２８７号公報
）がある。

そのほか組換えプラスミドＤＮＡを用いて形質転換され
たエシェリヒア・コリはアミノ酸の生産能が高いことが
開示されている（例えば米国特許第４２７８７６５号明
細書参照）。

しかしながら、エシェリヒア・コリに遺伝子組換え技術
を適用１〜て商業的に有用なレースレオニンまたはＬ−
イソロイシン生産菌株を作ることは非常に困難である。

その理由は、本来的にエシェリヒア・コリはＬ−スレオ
ニンおよびＬ−イソロイシン生産能を有しておらず、し
かもこのようなエシェリヒア・コリから得た組換え菌は
いずれのアミノ酸も大量には生産し１．Ｃいからである
。

これに対してブレビバクテリウム属およびコリネバクテ
リウム属にはＬ−スレオニン及びＬ−イソロイシンを多
量に生産する多くの菌株が存在する。したがって、この
ブレビバクテリウム属およびコリネバクテリウム属の微
生物は遺伝子組換え技術によりＬ−スレオニン及びＬ−
イソロイシンの生産菌株を作るための原菌株として適し
て（・る。

ところで、表現マーカーを有するブレビバクテリウム属
及びコリネバクゾリウム属の菌株の中にプラスミドが存
在することは永い間知られていなかった（ヨーロッパ特
許公開公報第３３９１号公報参照）。しかし、最近の研
究ではスレオニンまたはインロイシンの生産をコントロ
ールするプラスミドを有するコリネホルム細菌の生成の
可能性が実証されている（１９８２年５月１０日出願の
米国特許出願第３７６３９６号明細書及び１９８２年６
月２５日出願の米国特許出願第３９２１４５号明細書参
照）。さらに、１９８２年６月１０日出願の米国特許出
願第３８６９８０号明細書にはコリネホルム細菌のグル
タミン酸生産菌中に増殖可能な複合プラスミドが開示さ
れている。

（発明が解決しようとする問題点） スレオニンとインロイシンの生合成経路は下記の通りで
ある。

アスパラギン酸塩 アスパルテート ↓ イソロイシ／ 上記生合成経路にはリジンの生合成経路の部分も示され
ている。スレオニンとイソロイシンへの経路の第一の枝
はアスパルテートセミアルデヒドにつながっており、こ
れら２種のアミノ酸に導く酵素はホモセリンデヒドロゲ
ナーゼ（以下、抑ａＳｅと略記する。）であり、一方リ
ジンに導く酵素はジヒドロジビコリネートシンセターゼ
（以下、ＤＩＪＤＰシンセターゼと略記する。）である
。

コリネバクテリウム属の変異株におけるＨＤａＳｅ活性
とＡＩＩＶ耐性との関係は、推量ら、生化学会誌。

ｉ影、ｅｓｃ＋（ｘ９７ｏ）；中介ら、農芸化学会誌。

３７．６５３（１９７３）及び戸板ら、同誌、４３，２
６５（１９７９）Ｋ開示されている。

また、リジンの生合成経路の数種の遺伝子を含むハイブ
リッドプラスミドを有するエシェリヒア・コリ株が最近
開示されたことも注目すべきである。また、リジンのオ
ーバープロデューサー（ＴＯＯＲ２１）が形質転換され
、リジンの合成は色種の菌株で研究された（　Ｌｅ−Ｒ
ｅｖｅｒｅｎｄら、　Ｅｕｒｏｐｅａ、ｎＪｏｕｒｎａ
ｌ　ｏｆ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ
　ａｎｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ−１ｏｇｙ、且、２２７
〜２３１　（１９８２）及びフランス特許公告第２５１
１０３２号明細書参照）。これら文献から明らかな」、
うに、ｄａｐ　Ａ遺伝子（ＤＲＤＰシンセターゼをコー
ドしている）を含むプラスミドのみがリジンの生産を増
加する。この反応はリジンのオーバープロデューサー（
アスパラギン酸キナーゼ反応を変える突然変異を有する
）Ｋおける限られた生合成の段階である。この遺伝子の
増幅方法は代謝産物を過剰生産する微生物の改質に利用
しうると著者らは述べている。しかしながら、これら文
献にはコリネホルム細菌あるいはリジン以外の生成物に
対して該作用を拡張しうろことを示唆する記載は全くな
い。したがって、コリネホルム細菌によりＬ−スレオニ
ン及びＬ−インロイシンを発酵生産する改良された、か
つ能率的方法についての要求は依然として存在している
。

本発明者らは、１１Ｄａｓｅに対する遺伝情報がコリネ
ホルム細菌において複１・４可能な特定のベクターに結
合して生成した該遺伝情報を有するハイブリッドベクタ
ーが特定のコリネホルム細菌ホストまたは受容株中に複
製されると、このようにして形質転換されたコリネホル
ム細菌はＬ−スレオニン及びＬ−インロイシンのすぐれ
た生産菌株であることを見出した。本発明ではコリネホ
ルム細菌の５　チＬ−スレオニン及びＬ−イソロイシン
を多量に生産するプレビパクテリウムハ及びコリネバク
テリウム属の多くの菌株がホストとして利用できる点が
特に興味深い。

（発明の構成） 本発明はホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝
子が′挿入されていてコリネホルム細菌菌体内で増殖で
きるプラスミドベクターを有し、かつＬ−スレオニンま
たはＬ−イソロイシン生産能を有するコリネホルム細菌
を培養し、培地中に生成蓄積されたＬ−スレオニンまた
はＬ−インロイシンを採取することを特徴とするＬ−ス
レオニン及びＬ−イソロイシンの製造法を提供するもの
である。

前記生合成経路において、１ｌＤａｓｅはメチオニンに
向う経路とスレオニン及びイソロイシンに向う経路の間
の分岐点に存在している。ＨＤａｓｐコードの十分な遺
伝情報を含むＤＮＡは適当なりＮＡドナーから得ること
ができる。このドナーはｎＤ、、、ｓｅにおいて変異し
たものであってもＨＤａ　ｓ　ｅにおいて野生のもので
あってもよい。好ましくは、このドナーはコリネホルム
細菌であり、より好ましくはブレビバクテリウム・ラク
ト７アーメンタム（肛鼾七ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌａｃ
ｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ　）である。最も好適なドナー
はＬ−スレオニンによるフィードバック阻害に対して感
応しない（耐性の）　ＨＤａｓｅを有する。

かかるドナーは通常、ＡＪｔＶ耐性である。ＨＤａｓｅ
コードの遺伝情報はドナーからのＤＮＡの部分切断。

特定プラスミドへの遺伝子配列の導入、　ＨＤａｓｅを
欠失したコリネホルム細菌及び引続きホモセリン栄養要
求株（）］、Ｄａｓｅ−）のその結果得られる複数の組
換え型ＤＮＡの混合物による形質転換ならびにホモセリ
ンを要求しない形質転換株の分離によって得ることかで
きる。

特に、遺伝子配列を含む１ＩＤａｓｅ遺伝情報はブレビ
バクテリウム・ラクトファーメンタムＡＪ１１１８８（
ＦＥＲＭ　Ｐ−４１９０）から得られ、この菌株ではＨ
ＤａｓｅはＬ−スレオニンによるフィードバック１ｓｆ
ｌ’ｌＫ対して耐性である。ＩＩＤａｓｅ遺伝子からな
る遺伝情報は分子月が２．２４メガダルトン（Ｍａ）で
、２個のｐｓｔ　Ｉ制限エンドヌクレアーゼ切断個所を
持ち、２個のＰｓｔの切断個所によりフランクされてい
るＤＮＡ断片中に見出すことができる。このＤＮＡ断片
は３つの部分を有しており、これら３つの部分のサイズ
（２個のＰ、ｓｔｌ切断個所によりフランクされ、分割
されている）は０．７　Ｍｄ　、　０．４４　Ｍｄ及び
３．１０Ｍｄである。

形質転換に有用なホストまたは受容法は、いわゆるコリ
ネホルム細菌である。これら細菌は好気性、グラム陽性
桿菌であり、非抗酸性であり、バーシーズ・マニュアル
・オブ・ディターミナティプ・バクテリオロジー、第８
版、５９９頁（１９７４）に記載されている。本発明に
おけるホストとして有用なコリネホルム細菌の野生株の
例は次の通りである。

ブレビバクテリウム・ロゼラム　ＡＴＯＯ１３８２５（
Ｅ、−をニー見） コリネホルム細菌をホストとして使用するに先立ち、既
知の方法で制限酵素活性を低下せしめる変異を施せば好
適な結果が得られる。

コリネホルム細菌がＨＤａｓ、挿入を有するベクターを
用いて形質転換される際に該コリネホルム細菌は外来遺
伝子によって保持された遺伝情報を発現する。

特に興味深いホストは、ＨＤａｓｅの欠損株またはその
非欠損株である。後者の場合、ホスト自体がＬ−スレオ
ニンとＬ−インロイシンを生産する。

とりわけ、マルチコピープラスミド中にＨＤａｓｅをコ
ードする遺伝子を挿入することによりこの酵素の遺伝子
コピーの数が著しく増加し、また最終アミノ酸類の生産
が非常に増大する。事実、ＨＤａ　ｓ　ｅ非欠損株性（
ｌｉＤａｓｅ　）ホスト中にＨＤａｓｅを有するマルチ
コピーグラスミドを使用することにより非常に高濃度の
Ｌ−スレオニン及びＬ−インロイシンが得られる。Ｈｌ
）ａｓ８の欠損株は通常、ＩＩＤａｓｅ遺伝子を保有す
るベクターの選択及び分離のためのホストとして用いら
れる。このようにして分離されたベクターをＨＤａ　ｓ
　ｅの非欠損株の形質転換に使用すると良い結果が得ら
れる。

アスパラギン酸キナーゼ野生ホストまたはアスパラギン
酸キナーゼ反応を変えることにより変異させたホストの
いずれかを使用することもまた興味深いことである。ホ
ストがスレオニン及び／またはイソロイシンを過剰生産
するようにアスパラギン酸キナーゼ反応を変異されてい
るホストにおいては、該アスパラギン酸キナーゼ反応は
最早や速度に制限がない。したがって、最大の効果はこ
のように変異されたホストを用いることにより得られる
。

さらに、ＡＲＭ耐性のないホストは形質転換に利用する
ことができる。Ｌ−メチオニン、Ｌ−リジン及び／また
はＬ−ロイシンの欠損株は好適なホストである。最も好
ましいホストはＭ■耐性を有し、かつＬ−スレオニンに
よるフィードバック阻害に対してＨＤａｓθ耐性を有す
るものである。

コリネホルム細菌において複製可能な、どのようなベク
ターもホストへＩ（Ｄａｓｅを持込み、その形質転換に
使用するために利用することができる。

プラスミド、ファージ、その他のベクター等の色種のベ
クターを利用することができ、特に重要なものは米国特
許願第３８６９８０号ゆ」細書（１９８２年６月１０日
出願）に記載されている複合グラスミドである。これら
のグラスミドは、コリネホルムのグルタミン酸生産菌中
で生殖可能なプラスミド（ａ）から得られるドライブユ
ニット領域（４）及びエシェリヒア・コリまたはバチル
ス−ズブチリス中で生殖可能であり、かつ少なくとも薬
物耐性を示す領域を有するプラスミド（ｂ）から得られ
る１個または複数の遺伝子断片（１３）からなっている
。遺伝子断片がさらにグラスミド（ｂ）のドライブユニ
ット領域を保持している場合、複合プラスミドはエシェ
リヒア・コリまたはバチルス・ズブチリス中で生殖可能
になり、かくして該複合プラスミドをエシェリヒア・コ
リまたはバチルス・ズブチリス中で篩別または増幅する
ことができる。

ここで「薬物耐性」とはホスト細胞の生育を阻止する抗
生物質のような薬剤に対する耐性を意味する。このよう
な抗生物質の例としてはペニシリン、カナマイシン、ク
ロラムフェニコール、エリスロマイシン、アクチノマイ
シン等がある。

コリネホルム細菌中で生殖可能なマルチコピープラスミ
ド（ａ）の具体例は前述の米国特許願第３８０９８０号
明細書に開示されており、かつブレビバクテリウム・２
クト７アーメンタムＡＴＯＯ１３８６９から分離され、
分子量３．ＯＭｄのｐＡＭ３３０　（第１図に示した制
限地図参照）、コリネバクテリウム・グルタミクムＦＥ
ＢＭ　Ｐ−５４から分離され、分子量３．ＯＭｄのｐＡ
Ｍ２８６　（第２図に示した制限地図参照）及びブレビ
バクテリウム・グルタミクムＡ’ｌ”ＯＯ１３０５８か
ら分離され、分子量１．８Ｍｃｌのｐ出ｎ５ｔ９　（第
３図に示した制限地図参照）が含まれる。

エシェリヒア・コリ中で生殖可能なプラスミド（ｂ）　
ハマルチコピープラスミドであり、薬物耐性の遺伝情報
を有している。これらには例えばｐＡｃ！１０５゜ｐＢ
Ｒ３２２、ｐＥＲ３２４、ｐＢＲ３２５等がある。バチ
ルス・ズブチリス中で生殖可能で、薬物耐性の遺伝情報
を有するプラスミド（ｂ）は好ましくはマルチコピーで
あり、ｐ’１１２７　、ｐ０１９４　、ｐ０２２１　、
ｐ０２２３　、　ｐＵＢｌｌｏ等が含まれる。

これらプラスミド（ａ）及び（ｂ）から複合プラスミド
を作るには、制限酵素による切断、リガーゼによる連結
のような常法を用いることができる。

連結反応後、所望の複合プラスミドをコリネホルム細菌
中に生殖可能なプラスミドを分離することにより篩別し
、これを用いてコリネホルム細菌を薬物耐性に形質転換
することができる。プラスミドら）から得られるドライ
ブユニット領域とプラスミド（ｂ）から得られる他のド
ライブユニット領域を有し、プラスミド（ｂ）の薬物耐
性遺伝子を有する複合プラスミドは、コリネホルム細菌
及びエシェリヒア・コリまたはバチルス・ズブチリス中
に生殖可能であり、（１）コリネホルム細菌または（２
）エシェリヒア・コリ（プラスミドがエシェリヒア・コ
リ中に生殖可能なものを使用する場合）またはバチルス
・ズブチリス（プラスミドがバチルス・ズブチリス中に
生殖可能なものを使用する場合）を形質転換することが
可能であり、かつ薬物剛性を有するグラスミド類の中に
見出すことができる。

本発明に有用な複合プラスミドの例の中には適当な国際
寄託機関に寄託されている下記のポスト中に存在するプ
ラスミドがある。

ｐＡＪ６５５　：エシエリヒア・コリＡＪ１１８８２．
ＦＢＲＭ　ＢＰ−１３６（ＦＢｉｔΔ１　、Ｐ−６５１
７） コリネバクテリウム・グルタミクムＳＲ８２０１。

ＡＴＣＯ３９１３５（第４図に示した制限地図参照〕ｐ
ＡＪ６１１　：エシエリヒア・コリＡＪ１１８８４．　
ＥＦＪＬＭ　ＢＰ−１３８（ＦＥＩＩＭ　Ｐ−６５１９
）　（第５図に示した制限地図参照） ｐＡＪ１８４４　：エシエリヒア・コリＡＪ１１８８３
．　ＦＢｌｌｌ、Ｍ　ＥＰ−１３７（ＦＢｌｌ、Ｍ　Ｐ
−８５１８） コリネバクテリウム・グルタミクム、、　ＡＴＣＣ３９
１３６（第６図に示した制限地図参照） ｐＡＪ４４（ｌバチルス・ズブチリスＡ、Ｔ１１９０１
　、　ＦＥＩｔＭ　ＢＰ−１４０（第７図に示した制限
地図参照） ｐＡＪ３１４８　：コリネバクテリウム・グルタミクム
５Ｒ８２０３。

ＡＴＣＣ３９１３７（第８図に示した制限地図参照）複
合プラスミドは寄託微生物の細胞から、リリチウム及び
ＳＤＲを用いて対数増殖期後期に予め集めた細胞を溶菌
し、溶菌物から遠心分離（３０，０００×ｇ）して得た
上澄液にポリエチレングリコールを添加し、沈でんした
ＤＮＡをセシウムクロライド−エチジウムブロマイド平
衡密度勾配遠心分離により分画して精製することにより
得ることができる。この複合プラスミドは寄託微生物か
ら損傷を与えずに自然消失、すなわち「キユアリング」
（バクテリオロジカルレビューズ、３６．．３６１〜４
０５（１９７２））によりホスト菌株を得るために追い
出すことができる。

適当な複製ベクターの１つにＨＤａｓｅ遺伝子を挿入す
るには、適当な制限エンドヌクレアーゼにより複製ベク
ターを切断し、常法によりその中へ適当な遺伝子配列を
連結することによって行なうことができる。

ＨＤａｓｅ遺伝子を有するベクターをコリネホルム細菌
のホストに取込むには、ＤＮＡ受容株の細胞を塩化カル
シウムで処理してＤＮＡの透過性を増加すること（Ｍａ
ｎｄｅｌｌ、　Ｍらによるエシエリヒ：・コリに−１２
に関する報告、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイ
オロジー、ガ、、１５９（１９７０））または細胞がＤ
ＮＡを取込めるようになる特定の生長段階で取込ませる
こと（Ｄｕｎｃａｎ　、Ｏ，Ｈ，らによるバチルス・ズ
ブチリスに関する報告、ジーン。

１５３（１９７７））によって行なうことができる。

バチルス・ズブチリス、アクチノミセス及び酵母につい
て知られており、Ｏｈａ、ｎｇ、　Ｓ、ら−６Ｍｏ１ｅ
ｃ。

Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、、　１６８　、１１１　（１９７
９）、　、Ｂｊｂｂら。

Ｎａｔｕｒｅ、　２７ｊ、　３９Ｒ（１９７Ｂ　）　、
　Ｈｌｎｎｅｎ、　Ａら。

ＰＮＡＳ　ＵＳＡ、ハ、１９２９（１９７８）に報告さ
れているように、プラスミドＤＮＡを容易に取込むＤＮ
Ａ受容株のプロトプラストあるいはスフェロプラストを
形成することによりプラスミドを該受容株に取込ませる
こともできる。

複合プラスミドはコリネホルム細菌を薬物耐性菌に形質
転換するので、ＪＩＤａｓｅ遺伝子を挿入したグラスミ
ドを含む形質転換株はその薬物耐性を試験することＫよ
って容易に同定することができる。

ＨＤａＳｅを挿入したベクターを有する形質転換株は生
育のためのホモセリン要求性を試験することによりホス
ト細胞から容易に区別することができるので、遺伝標識
を持たないベクターを組換えＤＮＡの製造に用いる場合
、ＨＤａＳｅの欠損株はホストとして好適である。

複合プラスミドに挿入されたＨＤａｓｅ遺伝子は、必要
に応じて常法により他のベクターへ容易に転移すること
ができる。

このようにして得られたＬ−スレオニン及びＬ−インロ
イシン生産菌を培養する方法は常法で良く、既知のスレ
オニン及びイソロイシン生産菌の培養方法と同様である
。培地は炭棄源、窒素源および有機イオン、さらに必要
に応じてビタミン類。

アミノ酸類などの有機栄養源の少憚を含有する通常の培
地を使用することができる。適当な炭素源の例としては
グルコース、シュークロース、ラクトース、でん粉加水
分解物、廃糖蜜などがある。

窒素源としてはガス状アンモニア、液状アンモニア、ア
ンモニウム壌及び他の窒素含有物質を用いることができ
る。

ＨＤａｓｅ遺伝子を有するベクターを含む形質転換され
た微生物の培養は好気的条件下に行ない、培養液の田と
温度を適当な水準に調整し、Ｌ−スレオニンとＬ−イン
ロイシンの生成が止むまで培養を続ける。

培養液に蓄積されたアミノ酸は常法によって回収するこ
とができる。

（本発明の効果） 本発明の方法によれば、ブレビパフチリウムやコリネバ
クテリウムの人工変異株を使用する既知の方法よりも高
い収率でＬ−スレオニン及びＬ　−イソロイシンを製造
することができる。

（実施例） 次に、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれ
らにより制限されるものではない。

実施例１ ［１１Ｌ−スレオニンによるフィードバック阻害に対し
て耐性のＨＤａｓｅ　（ＡＩＩＶ耐性）を有するＬ−ス
レオニン生産菌、ブレビバクテリウム・ラクトンア−メ
ｙ　タＡ　ＡＪ１１１８８　（ＦＦ１Ｍ　Ｐ−４１９０
）　（戸板う。

Ａｇｒｉｃ、　Ｅｉｏｌ、　Ｏｈｅｍ、＋　４３．２６
５　（１９７９）　）をＤＮＡドナーとして使用した。

ＡＪ１１１８８菌を１４の（ＴｌｄＧ培地（ペプトン１
０ｇ。

酵母エキス１０　ｊｊ、　ＮａＣｊｌ　５ｆｌ　、グル
コース５．＋９゜蒸留水１０００ｍ１）　（Ｎ（７，０
，ＮａＯＨで調整）で３０℃にて１０時間培養し、対数
増殖期に遠心分離にて細胞を集めた。この細胞から常法
の７エノール法によりＤＮＡ約３．６ｍｇを抽出した。

（２）プラスミドＡＪ１８４４は、プラスミドｐＥＭｌ
　５１９とｐＥ几３２５から作られた複合プラスミドで
ある。プラスミドｐｌｉＭ１５１ｇ及びＴ）ＡＪ１８４
４の制限地図は米国特許願第３８６９８０号明細書に示
されている。

プラスミドＡＪ１８４４は下記の方法にて調製したつｐ
ＡＪ１８４４を保有するエシェリヒア・コリＡＪ１１８
８３の細胞を対数増殖期に遠心分離により集め、リリチ
ウム及び８ＤＳにより溶菌した。溶解物の上清からエタ
ノール化でんによってｐＡＪ１８４４のＤＮＡ約８０μ
ｌを得た。

（３）染色体ＤＮ、Ａ試料４μｇを制限酵素Ｐｓｔｌ（
ボーリ：／カー°？　７”イム、ｉ　リｆｌｆｌｆｆ人
）　０．１２４ユニツトにて３０℃で１２０分処理して
部分的に切断した。

上記（２）で得たプラスミドｐＡＪ１８４４　ＤＮＡ　
（２、Ｏｔｔｇ）も制限酵素Ｐｓｔ　Ｉ　５．０　ユニ
’／　）にて３０　℃で１２０分処理して切断した。切
断したこれらのＤＮＡを混合し、〒４ファージＤＮＡリ
ガーゼ０．２ユニットを用いて２２℃で１５時間処理し
て連結し、組換えＤＮＡの混合物を得た。

（４）ホモセリン栄養要求株であるブレビバクテリウム
・ラクトファーメンタＡ　ＡＪ１２０１９　（ＮｎＴＬ
ＬＥ−１５３４６）を５　ｍｅ　Ｏ）　（７ＭＧ培地に
培養シ、その初期対数増殖期に培養液にペニシリンｎ　
ｏ、６　ユニット／ｍｔを加え、さらに培養を１．５時
間続げた。細胞を遠心分離により集め、シュークロース
０．５％／ｌ／、　−ｒレイン酸２０ミリモル、　Ｍｇ
０ＩＱ２０ミリモル及び３．５％「ベンアラ士イ　ブロ
ス」（ディ７コ社製）（ｍｌ　６．５　）からなる８Ｍ
ＭＰ培地０．５ｍｌを用いて洗浄した。この細胞を８Ｍ
ＭＰ培地中でリゾデーム１０ダ／　Ｉｎｔ　Ｋて３０℃
で２０時間処理しく次いで６０ｏｏＸ、９．ｉ　ｏ分間
の遠心分離）、ＳＭＭＰ培地にて洗浄し、ＳＮＭＰ培地
０．５ｍｇに再懸濁することによりプロトプラストを調
製した。

このようにして得たプロトプラストを上記の組換え体Ｄ
ＮＡ　１０　ｔｔＬと混合し、混合物に３０％ポリエチ
レングリコールな加え、室温で２分間保持してＤＮＡを
プロトプラストに導入した。ＳＭＭＰ培地ｌ　ｍｌで洗
浄した後、プロトプラストを８ＭＭＰ培地ｌ　ｍｌに再
懸濁し、３０　’Ｃで３時間培養した。

得られた培養液を「プロトプラスト再生培地」（４７，
０、蒸留水１４当りトリス（ヒドロキシメチル）アミノ
メタン１２１　、　ＫＯＩ　Ｏ，５９、クルコース１０
　ｆｌ　、　ＭＰ、Ｏ１ａ’６Ｈ＊０８．１　ｇ　、Ｏ
ａＯ／２・２Ｈ４Ｑ２．２　ｇ、ベグトン４１．酵母エ
キス４ｙ、「カザミノ酸」（ディフコ社製）　Ｉ　Ｊ、
Ｋ２ＪＩＰＯ４０，２，９゜コハク酸ナトリウム１３５
．ｊ９．寒天１８ｇおよびクロラムフェニコール３μｌ
／　７ｍｇを含む）上に展開した。３０℃で培養して１
ｏ日後に現れた５個のコｏ　ニー　＋７）中から形質転
換株ＡＪ１２０２０　（ＦＢＲＭ　ＥＰ−２６９）をさ
らに￥験するための利料として選択した。

受容法ＡＪ１２０１９はその生育にＬ−ホモセリンを要
求し、一方形性転換株ＡＪ１２０２０はその生育にＬ−
ホモセリンを必要としない。この受容法はクロラムフェ
ニコール３μ９７ｍ１を補充したＯＭ［）培地にハ生育
シナイカ、形質転換株はクロラムフェニコール３あるい
は１０μ９７ｍ１を加えたＯＭＧ培地に生育できた。受
容法はプラスミドを持ってぃ１１いが、形質転換株はＪ
）ＡＪ２１０と呼ばれるプラスミドを有していた。

プラスミドｐＡＪ２１０　（７）　ＤＮＡ　＆−！、　
ＡＪ１２０２０の細胞溶解物から以下の方法により分離
した。

ＯＭＧ培地で培養稜得たＡＪ１２０２０の細胞を常法（
日中ら、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　１２１．３５
４　（１９７９））Ｋより溶菌し、溶解物をアガロース
ゲルに支持して電気泳動（５ｈａｒｐら、　Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔ、ｒｙ、　１２　ｒ３０５５　（１９７３）
　）を行ない、このプラスミドの分子量が７．６’４Ｍ
ｄであると決定した。

これらの事実は染色体ＤＮＡの２．２４Ｍｄの断片はグ
ラスミドｐＡＪ１８４４のｐｔ、ｔｌ切断個所にクロー
ンされたことを示している。この２．２４　Ｍｄ断片は
さら１ｃＰｓｔｉで切断され、この切断により１．１Ｍ
ｄ。

０．７Ｍｄ及び０．４４　Ｍｄの３断片が得られ、２．
２４Ｍｄの断片は２個のｐｓｔｉ切断個所を有すること
を示している。

（５）形質転換株によるＬ−スレオニンの生産用＞−表
はＡＪ１２０２０によるＬ−スレオニンの発酵生産の実
験結果を示している。

発酵培地ＰＭ−１は蒸留水１４当りグルコース１００　
Ｊｉ’　−（ＮＨ４）１１８０４３０　ｇ　、Ｋ）Ｉ＋
ＰＯ４１Ｊｉ’　、轟舅ＳＯ，・ｒｘｘ２ｏ　Ｏ，４１
１、「味液」（大豆蛋白の加水分解物）１０＃Ｉ／、ビ
オチン２００μＩ、サイアミン塩酸塩３００１１９、０
ａｋ（１１５０Ｊｉｍ、　Ｆｅ８０４７Ｉ（Ｑｏ　１０
ｍ９及びＭｎＳＯ４・５Ｈ＊０１０ｍｇを含んでいる。

この培地のＵ４＋　ヲＫＯＨで７．０ＫＦ、１１整した
。この培地のバッチ２９ｍ１を５００　ｍｌ容フラスコ
に入れ、ＡＪ１２０２０を接種し、３０℃で７時間振と
うした。得られたＬ−スレオニン量ヲロイコノストック
・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ　ｍｅｓ
ｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ　）によるミクロバイオアッセイ
で測定した。受容様ＡＪ１２０１９を、前記培地にＬ−
ホモセリンｓ　ｏ　ｏ　ｍｙを加えたこと以外は同様の
方法により培養した。

第１表 菌　株　Ｌ−スレオニン生産側：（ｇ／ｌ　）ＡＪ１２
０２０　１．１０ ＡＪ１２０１９　０．００１ 実施例２ ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＪ１１１
８８　（ＩＩＤａｓｅ　）を実施例１（４）で得たプラ
スミドｐＡＪ２１０　ＤＮＡで形質転換し、実施例１（
４）に示した方法と同様の方法によりクロラムフェニコ
ール耐性形質転換株ＡＪ１２０２１　（ＦＥＲＭ　ＢＰ
−２７０）を選抜した。

これらの形質転換株はｐＡ、ｙ　２１０と同じ分子量を
もつハーバ−グラスミドであることが確認された。

培地（ＰＭ−１）にＬ−インロイシン３００ダ及びＬ−
ロイシン３００ダを加えたこと以外は実施例１（５）と
同様の方法により該形質転換株を培養してＬ−スレオニ
ンを生産した。

第２表はＡＪ１２０２１によるＬ−スレオニンの発酵生
産の結果を示している。なお、ＡＪ１１１８８を用いた
場合の結果も併記した。

ｇ２表 ＡＪ１２０２１　１７．８０ ＡＪ１１１８８　１０．９０ 形質転換株ＡＪ１２０２１のＨＤａｓｅ活性を宮島らの
方法（Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｓ　６８　、３
１１　（１９７０））Ｋより測定した。その結果、ＡＪ
１２０２１のＨＤａｓｅ活性はＡＪ１１１８８のＨＤａ
ｎｅ活性の約２倍であった。

実施例３ コリネバクテリウム・グルタミクムムＴＯ０１３２８７
（ホモセリン栄養素要求変異株）を実施例１（４）で得
たプラスミドｐＡＪ２１０　ＤＮＡで形質転換し、実施
例１１４）と同様の方法によりクロ２ムフエニコール耐
性のグロトトロフ型形質転換株Ｓ几８３０１　（Ｎ１（
ＪＬＬＢ−１５３４８）を選抜した。この形質転換株を
＃！ｉ養し、生産されたＬ−スレオニン量をペーパーク
ロマトグラフィーとニンヒドリン反応により測定した。

第３表は８Ｒ８３０１によるＬ−スレオニン生ａの結果
を示している。また、培地にＬ−ホモセリン８００１ｎ
ｇ／ｌを加えて受容様Ａ’ｌ’００１３２８７を培養し
た。

第３表 菌　株−−Ｌ１乙どオニン住亀員（！／／ｌ　）８Ｒ８
３０１（形質転換株）１．５ ＡＴＯＯ１３２８７（受容様）０．０ 実施例４ 実施例１（力で得た形質転換株ブレビバクテリウム・ラ
クトファーメンタムＡＪ１２０２０は、Ｌ−インロイシ
ンを生産した。第４表は実施例１（５１で得た培養液の
分析結果を示している。

生産すれたＬ−インロイシン量をロイコノストツク・メ
センテロイデスによるミクロバイオアッセイで測定した
。

第４表 菌　株　Ｌ−イソロイシン生産ｉ（ｇ／１）ＡＪ１２０
２０　（形質転換株）　３．１０ＡＪ１２０１９　（受
容株）　０．０１ＡＪ１１１８８（ドナー）　０．００ 実施例５ ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＪ１２０
２８　（ＦＥＲＭ　ＥＦ−２７２）はＬ−イソロイシン
生産菌であり、５−（２−アミノエチル）−システィン
、　ＡＩＩＶ及びβ−ヒドロキシロイシン耐性で、ロイ
シン栄養要求株として選抜されたものである。

この菌株を実施、例１（４）で得たプラスミドｐＡＪ２
１０ＤＮＡで形質転換し、実施例１（４）と同様の方法
によりクロラムフェニコール耐性形質転換株ＡＪ１２０
２７（ＦＥＲＭ　１３Ｆ−２７１）を選抜した。

培地にＬ−ロイシン３０ｏ　ｍｙ　／ｍｌを加えたこと
以外は実施例１（５）の方法により形質転換株を培養し
、生産されたＬ−インロイシン量を実施例４と同様の方
法により測定した。

第５表 ＡＪ１２０２７　１０．２０ ＡＪ１２０２８　７．６０ ＡＪ１１１８８　０．００ 実施例６ 第６表は実施例３で得たコリネバクテリウム・グルタミ
クムＳ几８３０１　（ＮＲ几Ｌ１５３４８）及び受容株
としてＡＴＯＧ　１３２８７によるＬ−インロイシンの
発酵生産の結果を示すものである。Ｊ７−イソロイシン
の生産量はペーパークロマトグラフィーにより測定した
。

第６表 ＮＲＩｔＬ　１５３４８　１．０ ＡＴＣＣ１３２８７０，０

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミドｐＡＭ３３０の制限地図、第２図は
プラスミドｐＡＭ２８６の制限地図、第３図はｐＥＭ　
１５１９の制限地図、第４図は複合プラスミドｐＡＪ　
６５５の制限地図、第５図は複合プラスミドｐＡＪ６１
１の制限地図、第６図は複合プラスミドｐＡＪ１８４４
の制限地図、第７図は複合プラスミドｐＡＪ　４４０の
制限地図、第８図は複合プラスミドｐＡＪ３１４８の制
限地図である。 特許出願人　味の素株式会社 第１図 第１頁の続き ■Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号（Ｃ１
２Ｐ　１３１０８ Ｃ１２Ｒ１：１５　） ０発　明　者　石田雅昭 川崎市川崎区観音２−２０−８ ０発　明　者　高木博史 川崎市川崎区観音２−２０−８ ０発　明　者　三輪情意 松戸市岩瀬５３１ ０発　明　者　伊藤宏− 川崎市中原区中丸子１１５５−２ ０発　明　者　佐野孝之輔 東京都渋谷区上原１−３５−９ −ζ４１−

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）　ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝
   子が挿入されていてコリネホルム細菌菌体内で増殖でき
   るプラスミドベクターを有し、かつＬ−スレオニンまた
   はＬ−イソロイシン生産能を有するコリネホルム細菌を
   培養し、培地中に生成蓄積されたＬ−スレオニンまたは
   Ｌ−イソロイシンを採取することを特徴とする発酵法に
   よるＬ−スレオニン及びＬ−イソロイシンの製造法。
2. （２）　ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝
   子が、分子量２．２４　Ｍｄであり、Ｐｓｔ（によって
   ２個所において切断され、Ｐｓｔ　ｌにより切断したと
   きに０．７　Ｍｄ　、　０．４４　Ｍｄ及び１．１０　
   Ｍ（１の断片を生じるものである特許請求の範囲第１項
   記載の製造法。