JPS6226235A - ストレプトコツカス・サンギス感染症処理用ワクチン、抗体および抗体含有組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、川崎病のようなストレプトコッカス・サンイ
ス感染症処理用ワクチン、抗体および抗体含有組成物に
関する。

１９６７年に日本の川崎らによって報告された急性熱性
皮膚粘膜リンパ節症候群（いわゆる川崎病、以下ＭＣＬ
８という）は、ストレプトコッカス・ビョーゲンスのよ
うな溶連菌によって生じる狸紅熱と多少類似しているが
、ＭＣＬＳは、とくに小児（０〜３才児）の冠動脈をお
かし、冠動脈瘤を生じ、心筋こうそくで死亡することが
ある点において狸紅熱と異なる。ＭＣＬＥＩは死亡率が
高く、また最近米国、韓国等で発見されているので最近
極めて注目されている。その原因として、たとえば溶連
菌説、重金塊説、ダニ関連説などいろいろの仮説が唱え
られているが、現在までいずれも確証がない。

従来の技術 ストレプトコッカス・サンギス（以下サンギスという）
は公知の口腔内微生物でおる。本微生物はシュウクロー
スを分解して水溶性および不溶性のデキストラン様多糖
体を産生ずる。その酸産生能はストレプトコッカス・ミ
ュウタンスと類似しているが、サンギスはソルビットお
よびマンニットを分解する点においてミュクタンスと異
なり、またサンギスのう蝕誘発能はミュウタンスよりも
はるかに低い。他方において、ＷｈｉｔｅおよびＮ１Ｖ
ｅｎは、サンギスを亜急性細菌性心内膜炎患者の血液か
ら分離し、一種のＶｉｒｄａｎｓ　’ストレプトコッカ
スであると報告した。［Ｗｈｉｔｅ、　Ｊ、Ｃ，、Ｎ１
ｖｅｎ、　Ｃ，Ｆ、、　Ｊ、　Ｂａｃｔ。

５１　：　７１７−７２２．１９４６　］。

米国特許３．９３１．３９８号記載の歯科用ワクチンは
、サンギスの作用で糖から産生されたポリフルクタンま
たはポリグルカンの精製物を有効成分としている。

日本の研死者鳥居光男は、ヒトのプラークから分類した
サンイス１１３株を調べ、（ａ）すべてのサンギスはグ
ルカンおよび過酸化水素産生能を有し、α溶血性を示す
が、（ｂｌ生物学的には、サリシンおよびイヌリン発酵
能とアルギニンおよびエスクリン加水分解能を有するＡ
型と、有しないＢ型とに分類されることを報告した〔歯
基礎誌２０　：　３４１−３４９．　（１９７８）　’
ｌ。

要するに、サンギスと川崎病との病因論的関係はまだ報
告されていない。

発明が解決しようとする問題点 本発明は、本発明者によってＭＣＬＳおよび紫斑病（Ｐ
ｕｒｐｕｒａ　）の患者から分離され、ＭＣＬＳ型サン
ギすと命名されたサンギス菌株と、ＭＣＬＳならびに紫
斑病との間に有意義な病因論的関係が存在すること、お
よび上記ＭＣＬＳ型菌株由来の抗原および、本抗原に対
する抗体とを用いることにより、ＭＣＬＳ型菌株によっ
て誘発または悪化されるヒトの疾患を効果的に処理し得
るという知見に基いている。

問題点を解決するための手段 本発明により、ＭＣＬＳ型サンギすによって誘発または
悪化されるヒトの疾患を処理するだめのワクチンが提供
される。このワクチンの特徴は、有効成分として、ＭＣ
ＬＳ型菌株の菌体の一部以上およびその培養物から選ば
れた群に由来する抗原を、薬学的に許容し得る担体また
は賦形剤と共に含有することにある。

次に本発明は、上記疾患処理用抗体の製法を提供する。

この方法は、上記ＭＣ：Ｌ８型菌株の細胞の一部以上ま
たはその培養物からなる群に由来する抗原を哨乳動物に
投与し、対応する抗体を動物の体内に産生させ、これを
回収する工程からなっている。

さらに本発明は、前記抗原および抗体からなる群の１′
！ｔｉ以上を有効成分とし、薬学的に許容し得る担体ま
たは賦形剤と共存させてなる、上記疾患処理用組成物を
提供する。

本発明によるワクチンおよび抗体は、上記のヒトの疾患
を効果的に処理することができる。

本明細誓において「処理する」というのは、上記疾患の
予防、抑制、治療または診断に要するすべての行為を行
なうことである。

ＭＣＬＳ型菌株全菌株のサンギス菌株と明らかに異なっ
ている。たとえばＭＣＬＳ型の病原性はきわめて高く、
血清型は独自である。しかし、ＭＣＬ８型菌株全菌株に
次の特徴によって区別することができる。すなわち、第
３表によると、ＭＣＬＳ型菌株全菌株ィノースとメリビ
オースの分解能を有している。また次の第１表はＭＣＬ
Ｓ　ｌ型、同２型に分類できることを示している。

ＭＣＬＳ型サンギすと、ＭＣＬＢおよび紫斑病との病因
論的関係の例は次の通りである。

（１）　　６る実験において、ＭＣＬＳの急性期患者お
よびその母親４５組の口腔からプラーク（歯垢）を採取
し、ミテス・サリパリウス寒天平板培地（米国、ディフ
コ社製）およびＴＹＣ寒天平板培地［Ａｒｃｈ、０ｒａ
ｌ　Ｂｉｏｌ、　、　１２．１９１１−１２０１　。

（１９６７））で３７°Ｃ１絽時間培養後、室温に冴他
の通常の口腔内ストレプトコとカスの数は少なかった。

数個のコロニーから少数のストレプトコッカス・ミュウ
タンスおよびストレプトコッカス・サリノリウスが検出
されだにすぎなかった。次に、 （２）　　ストレプトコッカス・サンギスＡＴＣＣ１０
５５６（血清型ｌ型）、同ＡＴＣＣ１０５５７（同■型
）、同ＡＴＣＣ１０５５８（同■型）およびＳ’ｒ−７
（同■型）（公知の標準菌株である）で家兎を免疫して
家兎血清をつくった。同様の方法で、上記の４５組のヒ
トの口腔から分離された菌株から試験用抗原をつくった
。得られた抗血清および抗原を用いてゲル内沈降試験（
二重拡散法）を行なった結果、すべての抗血清は試験用
抗原と反応しなかった。次に上記の４５組から分離され
たＭＣＬＳ型菌株全菌株て抗血清を同様な方法でつくり
、同様に試験した結果、ＭＣＬＢ型菌株の血清型を二つ
の型（公知の型と異なる）に分類できることがわかった
。この試験に用いた抗原は浜田の方法（工ｎｆｅｃｔ、
工ｍｍｕｎ。

１４　：　９０３−９１０．１９７６　）でつくった。

結果を第１表に示す。

第　　　１　　　表 抗原 １０５５６　　＋　　　　　　　　　−１０５５７−＋
　　−−−− １０５５８−−＋　　−−− ＢＴ−７−−−＋　　−− ＭＣＬＢ１−　−　−　−　　＋　　−サンギスは、ス
トレプトコッカス・ミチスと多少類似しているといわれ
ている。ミチス（ＡＴ（：Ｃ９８１１、ＡＴＣＣ９８９
５、ＡＴＣＣ１５９１０１Ａ’ｒＣＣ１５９１１、同１
５９１２）　（いずれも周知の標準株である）を用い、
同様の試験方法で、サンギスとミチスとの関係をしらべ
た。

サンギス菌株ＡＴＣＣ１０５５６、同１０５５７　、同
１０５５８、ＢＴ−７（すべて周知の標準株である）な
らびにサンギス８８Ｈ８３（微工研薗を第７３７２号、
ＭＣＬＳ　ｌ型）、同ＭＣＬＳ２　（微工研菌寄第８１
６９号、ＭＣＬＳ　２型）は、すべてのミチスの抗血清
と反応しなかった。以上の事実から、ＭＣＬＳ患者から
分離されたＭＣＬＳ型菌株はミチスと異なることを示し
ている。

第２表は上記４５組から分離されたＭＣＬＳ型菌株の生
物学的性状を公知のサンギス菌株の性状と比較した表で
ある。

第　　　２　　　表 生物型　　　　ＡＢ　　　　Ｂ 血清型　　　　１　　　ｆｉ　　　　＊＊グルカン産生
　　　＋　　＋　　　十 溶血性　　　　　　＋　　＋　　　　ｍ（α型）過量化
水素産生　　＋　　＋　　　＋ 糖分解 サリシン　　　　＋　　−− マンニット　　　−−− ンルビット　　　−−− ラフィノース本　　　　十　　　−＋ メリビオースネ　　　　−−十 セロビオース中　　　　　　　　　　　　　　−エスク
リン傘　　　　＋　　　−− イヌリン　　　　＋　　−− アルギニン加水分解　　　十　　　−−エスクリン加水
分解　　　＋　　　−−傘傘　　公知のサンギス菌株と
異なる（鳥居、歯基礎誌２０　：　３４１−３４９．１
９７８　）。

＊　　　Ｈａｍａｄａ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｒｅｖ、
、４４，３３１−３８５゜（３）第３表は、ＭＣＬＳ型
菌株がＭＣＬ！３患者と母親からなる組の８０チ以上の
口腔に生存していることを示している。

第　　　３　　　　表 組　　　　宿主　　　　１型　　　　２型１２０（１０
０チ）　　９８（８２Ｌ％）　　６８（５７チ）　　３
０（２５チ）患者の口腔内のＭＣＬＳ型菌株の濃度は急
性期に最高で、症状の回復に伴ない減少する。次に非患
者幼児と母親からなる４００組以上において、母１１人
と子１人の口腔からＭＣＬＳ型菌株が分離された。この
事実は子の口腔内のＭＣＬＳ型菌株の起源は、おそらく
母であることを示している。

前 （４）本菌株の培養液（各０．１ｍ１）を離乳ｌの砂ネ
ズ　（ｇθ１ｂｉｌｉｓ　）の５匹以上の皮下または腹
腔に投与すると、全動物の腹部の周間の広い範囲に強度
の紅斑（ｅｒｙｔｈｅｍａ　）が発生した。

また培養Ｐ液精製物０．１ｍｌを後肢の末梢に注射する
と、フケ４９フフ２部（工ｎｇｕｉｎａｌ　ｌｙｍ−ｐ
ｈｎｏａｅ　）に強い腫張が生じた。これらの急性症状
は投与から約６時間後に生じ、高い死亡率（約３０チ）
を示した。これらの症状は病因論的にヒトのＭＣＬ８と
類似していた。公知のサンギス菌株では、このことは生
じない。しかし、上記精製物を不活化したものを有効成
分とするワクチン（例、０．１１）を事前に動物に注射
した場合、上記の症状を予防または抑制することが認め
よれた。

上記の所見は、ＭＣＬＳ型サンギすとＭＣＩ、Ｓとの病
因的関係の存在を示している。

（５）　　最近、我々は、紫斑病患者の口腔からＭＣＬ
Ｓ型サンギすを分離した。これらの性状および試験結果
は、ＭＣＬＥＩ患者から分離された菌株の性状および試
験結果と実質的に同様である。

紫斑病の病因はまだ解明されていないが、ＭＣＬＳ型菌
株は紫斑病を誘発または悪化させるものと考えられる。

（６）　　ＭＣＬＳ型菌株の菌体表層の線毛から我々が
分離した抗原性蛋白質は、歯、口腔粘膜等の表面にＭＣ
ＬＳ型菌株が付着することを予防し、少なくとも抑制し
得ることがわかった。抑制された菌株はその居所または
培地を失なうので、たとえば唾液中に存在する。そこで
は増殖できないので死滅する。

ＭＣＬＳ型菌株の菌学的性状は次の通りである。

■、形　態 （１）菌量および大きさ ストレプトコッカス・サンギス　　１μ×１μ■、各培
地における生育状態（指定ｐＨ，３７℃、４８時間）（
１１ＴＹＣ寒大平板培地（前記） 辺縁が滑らかな円形で、かつ培地を喰い込んで発育し、
周囲が溝状に陥凹し、容易に剥離しない集落をつくる。

（２）ミテス・サリパリウス寒天平板培地（米国、ディ
フコ社製） 灰青色ないし濃青色の色調を示す。上記と同様な集落を
つくる。

（３）トッドヒユーイツトブロス寒天平板培地（米国、
ＢＢＬ社製） 正円形、扁平、やや不透明の光沢のある、やや粘性を帯
びる小形の集落をつくる。

上記寒天平板培地の培養は、ガス、Ｑツクシステム（米
国、ＢＢＬ社製）、３７”Ｃ１４８時間行なった。

（４）トリプトケース・ソイブロス（米国、ＢＢＬ社製
） 培地下層部より増殖する。

■、生理学的性質 （１）　　グルカン産生能　　　　　　　十５％シュウ
クロース加トリプトケース・ソイブロス（米国、ＢＢＬ
社製）に３７°ｂ時間培養後、培養液遠心上清に等量の
エタノールを加えて判定。

（２）色素産生　　　　　陰　性 （３）生育の範囲 一３．５〜８．５ 温度　　１０〜３９°Ｃ （４）糖分解（第２表参照） グルコース　　　　　＋ ガラクトース　　　　　＋ マルトース　　　　　　＋ シュウクロース　　　　＋ ラクトース　　　　　　＋ ソルビット　　　　　　　− マンニット　　　　　　− ラフィノース　　　　　＋ サリシン　　　　　　　− メリビオース　　　　　＋ セロビオース　　　　　− エスクリン　　　　　　− ■、諸性状 エスクリン加水分解　　　− アルギニン加水分解　　　− 溶血性　　ヒト　　　　陽性（α） 馬　　　　　陽性（α） 緬羊　　　　陽性（α） 〔トリプトケース・ソイブロス寒天培地（米国、ＢＢＬ
社製）を滅菌後４５°Ｃに冷却し、それぞれの脱せん血
液を１０％になるように加えて平板培地としたものを用
いて測定した。〕病因性　　　非常に強い。

他の性状は公知のサンギスの性状と同様である。

本発明に用いられる菌株の培養法は、公知のストレプト
コッカス・サンギスの野性株の培養法と同様である。す
なわち培養は好気条件下でもよいが、嫌気条件下の培養
が適している。使用培地は天然培地でも合成培地でもよ
いが、大量生産には液体培地が適している。培地の田は
５．０〜９．０、たとえば約７．０で、培養温度は加〜
３９°Ｃ１たとえば３７°Ｃ１時間は２４−７２時間が
適している。

好適な培地の組成の例は次の通りである。

培地Ａ ポリペプトン１．７％、ポリペプトン８０．３チ、酵母
エキス０．５％、リン酸二カリウム０．２５　％、塩化
ナトリウム０．５％、ブドー糖０．２５％（…７．０〜
７．８） 本発明によるワクチンおよび抗体の実用的な例は次の通
りである。

（１）線毛ワクチン 細胞壁表層上の公知の線毛様構造（以下ＰＬＳという）
から分離された抗原を有効成分とするワクチンで、その
農法の例は次の通りである。

培養終了後、常法たとえば遠心処理（例、８０００　ｒ
、　ｐ、　ｍ、　７２０分間）により培養液から菌体を
分離する。この菌体を適当な高張液、たとえば０．２Ｍ
ＩＪン酸塩緩衝ＩＭ塩化ナトリウム液、その他の緩衝液
に浮遊させて、毎分約１〜５回転の低速回転法によるか
、あるいは超音波処理（１０〜２０ｋ）Ｉｚ、５〜２０
分間）して線毛抗原を抽出する。抽出された活性成分を
たとえば公知のカラム分画法、等電点沈降法、冷溶媒分
画沈降法、膜濃縮法、硫酸アンモニウム塩析法およびし
よ糖密度勾配遠心法など単独または適宜組合わせによっ
て分画精製する。

しよ糖密度勾配遠心法はとくに有利である。

Ｎ裂された分画を適当な不活化剤たとえば０．２゛チホ
ルマリンで不活化した後、不活化剤を除くために、たと
えば０．７５ＭＩＪン酸塩緩衝食塩水（…６．０〜７．
５）を用いて、低温（例、１０°Ｃ以下）で透析する。

透析内液をたとえば０゜７５ＭＩＪン酸塩緩衝食塩水（
ｐＨ６，２）でタンパクＮ含有量５〜５０μ？／セ程度
になるように希釈する。希釈液にアジュバントとして水
酸化アルミニウムゲルを最終アルミニウム用量１００μ
ｆ？／１程度になるように加えて抗原成分を吸着する。

所望により防腐剤としてたとえばチメロサール０．０１
　％　（Ｗ／Ｖ　）を加えると所望のワクチンが得られ
る。線毛層から単離された抗原性蛋白質の分子量は約２
〜５Ｘ１０’である。抗原の変性を防ぐために、すべて
の処置は５６”Ｃ以下、たとえば１０゛Ｃで行なわれる
。

線毛ワクチンの投与量は、たとえばヒトに対して１回０
．１〜０．５ｍｌを皮下または筋肉内、好ましくは口腔
粘膜内に注射する。所望により、数回、たとえば２回、
２〜３週間隔で免疫してもよい。

（２）全菌体抗原 例 ＭＣＬＳ型サンギすの培養液を遠心処理（ｓｏｏ。

△ ｒ、　ｐ、　ｍ、／　２０分間）して全菌体を分離し、
これを０．６〜１．５％（例、０．９チ）食塩水（ｐＨ
約７．０）で数回遠心洗浄し、次に０．６〜１．５チ食
塩水に浮遊して紫外線照射下で不活化する。

不活化した全菌体を、適当なアンプルに分注して凍結乾
燥する。その際、浮遊液の含有菌数は便用時に０．９％
食塩水（声７．０）で溶解したときの濃度が５５０　ｎ
ｍで０Ｄ＝０．５になるように調整する。

（３）熱処理抗原 例 ＭＣＬＳ型サンギすの培養液を遠心処理（ｓｏｏ。

△ ｒ、ｐ、ｍ、７２０分間）して全菌体を分離し、これを
０．９％食塩水（約≠７．０）で数回遠心洗浄（例、１
２０°Ｃ，２０分間）オートクレーブで処し上清を抗原
とする。

（４）菌体外抗原 ＭＣＬＳ型サンギすの培養上清に適当な金属塩たとえば
１０％塩化亜鉛溶液を最終濃度１％に△ ７５分間）して回収する。この沈殿に、もとの培養液量
のおよそ１１５０〜１　／　２００　ｉの結晶リン酸二
す）　ＩＪウム１２水塩を加えて攪拌する。次にガラス
フィルター等を用いて、生成したリン酸亜鉛を除去し、
たとえば０．７５Ｍ！ｊン酸塩緩衝食塩水（約ｐｉ（７
，０’）で低温（例、４°Ｃ）で透析する。この透析内
液に飽和硫酸アンモニウムを（９）〜６０％飽和になる
ように加えて有効抗原を回収する。これをセロファンチ
ューブに入れ、４°Ｃ，０，７５Ｍ　リン酸塩緩衝液中
で透析し、硫酸アンモニウムを除去すると、菌体外抗原
液が得られる。

タンノ々りＮが約１００〜２００μｆ／ｍＡになるよう
に、たとえは０．７５ＭＩＪン酸塩緩衝食塩水一般に、
これらの抗原液は主として診断用、たとえば対照用抗血
清の製造や、ヒト血清の分析に用いられる。

ＰＬ８ワクチンは、使用の簡単な点や安全性から、ヒト
に直接に投与するのに適しているが、所望により、上記
と同様の目的に用いてもよい。

使用時には、ＰＬ８ワクチンおよび他の抗原液を適当な
アジュバントと混合し、ヒトおよび動物に、たとえば１
回０．１〜０．５ｍｌ常法により投与する。ヒトおよび
動物を数回免疫することもできる。補、乳動物として、
たとえばラット、マウス、砂ネズミ、モルモット、ウサ
ギ、ウマ等を用いることができる。

（５）抗ＰＬＳ抗体 精製したＰＬ８抗原液をたとえば０．７５　Ｍ　リン酸
塩緩衝食塩水（≠約７．０）で蛋白Ｎ　１０〜１００μ
ｆ／ｍｌになるように希釈し、希釈液に最終アルミニウ
ム含、有１００〜５ｏｏμｆ／１１１１１Ｃ々ルヨうに
水酸化アルミニウムゲルを加えて、抗原を吸着する。所
要により、等量のフロイント完全アジュバントを加えて
もよい。この液で哨乳動物を免疫することによシ、動物
の体内に対応する抗体が生成される。これを動物から常
法により回収すると、抗血清の形の抗体が得られる。こ
れを凍結乾燥して、冷所で長期間保存することができる
。得られた抗体は主に工ｇＡからなり、ＭＣＬＳ型菌株
により誘発または悪化されたヒトの疾患の処理に常法に
より用いられる。

（６）　　ｐｂｓ抗体含有組成物 ＭＣＬＢ型菌株により誘発または悪化されたヒトの疾患
の予防または抑制用の抗体含有組成物は、活性成分とし
て、上記のＰＬＳ抗原に対する抗体を含有し、また経口
投与に適当な担体または賦形剤を含有している。冥用的
な組成物は投与単位として形成される。各投与単位中の
抗体含量は、たとえば日量約１〜１０単位（下記）の抗
体を投与できるように定められる。

組成物の実用的な例は、ウガイ剤、歯みがキ、チューイ
ンガム、バッカル、トローチ等である。経口投与に通商
な各種の液体、半液体または固体の担体および賦形剤は
周知である。

本発明の菌の型は２ｆｉであるから、ワクチン（抗原液
）はＭＣＬ８１型または２型の１種以上に由来するもの
である。従って、２種類の抗体が得られる。

ＭＣＬ８１および２製画株の例は、ストレプトコッカス
番すンギス（５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａａｎｇｕ
ｉｅ　）８８Ｈ８３（微工研菌寄第７３７２号）および
ストレプトコッカス拳すンギ、ｘ、　（５ｔｒｅｐｔｏ
ｃｏｃｃｕｓ　ｓａｎｇｕｉｓ　）ＭＣＬ８２　（微工
研菌寄第８１６９号）で、これらは、ＭＣＬＳ患者の口
腔から本発明者が分離したものである。紫斑病患者の口
腔から分離されたサンギス菌株は、上記の菌株にきわめ
て類似している。

←←÷←ｈ 本発明により、　ＭＣＬＳ型サンギす菌株により誘発ま
たは悪化されたヒトの疾患を効果的に処理することがで
きる。

本明細書において、抗体の力価はゴールドマン等の方法
〔工５ｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｃＬ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒ
ｉｚａｔｉｏｎｏｆ　Ｇ１１ａｌ　Ｆｉｌａｍｅｎｔｓ
　ｆｒｏｍ　Ｈｕｍａｎ　Ｂｒａｉｎ、　Ｊ＋Ｃｅ１ｌ
Ｂｉｏ１．、７８．４２６．１９７８　）により測定し
た。

下記実施例および試験例において、培養はｒｏＣで嫌気
的に行なった。

実施例１ 線毛ワクチンの製造 前記培地Ａの程培地１０００ａｔＡ！　Ｋストレプトコ
ッカス・サンギス変異株５８Ｈ８３（微工研菌寄第７３
７２号）を接種し、３７°Ｃ，２４時間培養後、前記培
地Ａ　４５０００　ｍに１培養５００−を接種し、上記
と同一条件で培養する。培養終了後、培養液に結晶硫酸
アンモニウムを３３％飽和になるように加え溶解後、４
°Ｃに静置して菌体を沈降させる。

上清をサイフオンで除去し、沈降部分を遠心処理（８０
００ｒ、　Ｐ、　ｍ、／　１０分間）して回収し、この
菌体を０．２ＭＩＪン酸塩緩酸塩緩衝塩水（−８，０）
４５０−に浮遊し、毎分１〜５回転の攪拌しなから４°
Ｃで７２時間抽出を行なった。これを遠心処理（８００
０ｒ、　Ｉ）、　ｍ、／　２０分間）を行ナッテ菌体ヲ
除去し、遠心上清に結晶硫酸アンモニウムを６０％飽和
になるように加えて攪拌後、４°Ｃに静置して活性分画
を沈降させる。上清をサイフオンで除去し、生じた沈殿
を遠心処理（８０００ｒ、　ｐ、　ｍ、／Ｉ仕分間して
回収する。この沈殿を０．２ＭＩＪン酸塩緩酸塩緩衝塩
水（ｐＨｓ、ｏ）約１００　ｒＬｌ！に濃厚に浮遊し、
これを４°Ｃで牝時間、５０００　ｍ以上の同緩衝食塩
水中で透析する。透析内液を遠心処理（８０００ｒ、ｐ
、　ｍ、／２０分間）によって不純物を除去し、約１７
５ｍＡ！の上清を回収する。この上清のタンＩす］量は
約８０００μｒ／ｍＪである。

上清をタンノＲりＮ含量２（）θμｆ／ＷＬｌになるよ
うに同様の緩衝液で希釈し、希釈液２００　ＭＪをしよ
糖密度勾配超遠心分離装置〔日立ｔｆＰ型超型心遠心機
−ナルローターＲＰ２３５Ｔ使用、しよ糖濃度５〜３０
％）、３５０００　ｒ、ｐ、ｍ、７１８時間〕で処理し
たところ、しよ糖濃度１０〜１５％付近の分画に所望の
線毛成分が見出された。そのタンパクＮ量は約４２〜５
０μｆ／ｍｌであった。この分画を集めてホルマリンを
０．２％になるように加え、４°Ｃ１１４日間不活化を
行なった。その後４°Ｃで０．７５Ｍリン酸緩衝食塩水
（ｐｉ−１７，０）　５０００ｍＡ’中で透析してホル
マリンを除去した。

不活化液を０．７５　Ｍリン酸緩衝液（聞６．２〜６．
５）を含有タンパクＮ５〜１０μｐ／’ｍ／に希釈し、
アジュバントとして水酸化アルミニウムをアルミニウム
量最終濃度１００μＶ／−になるように加えて吸着し、
防腐剤としてチメロサールを０．０１％（Ｗ／Ｖ　）加
えた。

実施例２ 混合ワクチンの製造 実施例１の方法に準じ、ストレプトコッカス・サンギス
ＭＣＬＳ　２　（微工研菌寄第８１６９号）の培養菌体
から得られた不活化液と実施例１で得られた不活化液を
夫々タンパクＮ　１０μｍ／ゴに混合し、これにアジュ
バントとして水酸化アルミニウムをアルミニウム量最終
濃度１００μｆ／ｖｔＡになるように加えて吸着し、防
腐剤としてチ・メロサールヲ０．０１　％　（Ｗ／”　
）加えた。

実施例３ 菌体外抗原液の製造 実施例１の培養上清に１０％塩化亜鉛溶液を最終濃度１
％になるように攪拌しながら加え、−６，０に補正して
４°Ｃに静置して有効分画を沈降させる。上清を除去し
沈降部分を遠心処理（８０００ｒ、　ｐ９ｍ、７５分間
）して回収する。この沈殿に、もとの培讐液量のおよそ
１１５０〜ｌ／２００量の結晶リン酸二ナトリウム１２
水塩を加えて攪拌する。次にガラスフィルター等を用い
て、生成したリン酸亜鉛を除去し、残液を０．７５１ン
酸塩緩衝食塩水（ｐＨ７，０）で低温（４°Ｃ）で透析
する。この透析内液に飽和硫酸アンモニウムを（イ）チ
飽和になるように加えて有効抗原を回収する。

回収された溶液を４°Ｃ１０，７５ＭＩＪン酸塩緩衝液
中で透析し、硫酸アンモニウムを除去すると、菌体外抗
原液（培養物代謝抗原液）（約２００＋＋＋Ａ’）が得
られる。

実施例４ 抗ＰＬＳ抗体の製造 実施例１記載の抗原５ゴを完全フロインドアジュバント
（米国、ディフコ社製）５ゴと混和して、これを３鴎の
家兎背部皮下に０．ＩＴｎｌ、１０個所に接塊し、１ケ
月飼育して常法により全採血した。血清は３３％飽和硫
酸アンモニウムを用いる常法により分画し、次に前記実
施例のように４°Ｃで透析して硫酸アンモニウムを除去
した。

１羽当り約ω〜８０ｒｎｌのプラズマが得られた。

実施例５ 抗体含有組成物（歯みがき剤）の製造 実施例４記載の抗血清を用いて歯みがき剤を次の方法で
作った。

リン酸水素カルシウム微粉末６０％、グリセリン３０％
、　　ＣＭＣナトリウム１０％および／ｑラベン（防腐
剤）０．２５％を混合し、抗体を加え、抗体の力価は４
ゲル内沈降価１５０１になるように調製した。

試験例 下記試験において、特記しない限り、サンギスＳ８Ｈ８
３（ＦＥＲＭ　Ｐ　−７３７２ｉ　ＭＣＬＢ　１型）°
を用いた。

ＭＣＬＳ　２型菌株サンギスＭＣＬＳ　２　（ＦＥＲＭ
　Ｐ−８１６９）を用いた結果も同様であった。試験動
物として授乳期の砂ネズミ幼児（各群は同腹の子５匹以
上からなる）を用いた。

試験例１ 実施例１記載の線毛ワクチン（各０．２　ｄ　）を１週
間間隔で２回皮下注射して免疫した雌から生れた同腹の
子に、生後１０日令に上記ワクチン０．２計を皮下注射
して免疫したものを用いた。

対照群は母子共に非免疫のものである。

ストレプトコッカス・サンイス変異株８ｓＨ８３株をト
ッドヒユーイツトブロス（米国、ＢＢＬ　社製）で３７
°Ｃ，２４時間培養した培養液（生菌数約１０８個／鯰
）を生後７日令より０．１〜０．２ｍｊ！／日を両群に
７日間口腔に連続投与し、離乳後ダイ二ツ）　２０００
　（船橋農場製）と脱イオン水を与えて飼育した。培養
液投与後は経時的に各個体から口腔被検材料を採取し、
３７°Ｃ，２４時間ＴＹＣ寒天平板培地上に培養してス
トレプトコッカス・サンギス変異株８８Ｈ８３株の定着
を調べた。試験期間は（９）日であった。結果を第４表
に示す。

第　　　４　　　表 免疫群２７１５．６　０　　０　　０　　０試験例２ 実施例５のワクチンを試験例１と同様な方法により、ス
トレプトコッカス・サンギスＭＣＬ８２株（ＰＫＲＭ　
Ｐ−８１６９）の定着様態を調べたが、結果は第５表に
示した如く線毛ワクチンによる定着の阻害が認められた
。

第　　　５　　　表 等 る線毛ワクチンは、動物の歯にＭＣＬＳ型サンギす△ の付着することを効果的に抑制する。これに対して非処
理群における付着は全期間を通じて４０チ以上でおった
。生後１０日目間菌を投与した他、上記と同様に試験し
た結果、抑制率はわずかに低かった。次の試験において
、ｓｓｎ　Ｂ３またはＭＣＬＢ　２の付着後に線毛ワク
チンを投与した。付層率は微減し、比較的短期間にＭＣ
ＬＢ型サンギすは口腔内から消失したが、非処理群では
付着率は約４０％以上であ、つた。

試験例３ 実施例５記載の歯みがきを４組のヒト（幼児とその母、
サンギス８８Ｈ８３の宿主）に、毎日２回、朝と夕食後
に１回１ｆ投与した。試験期間中、毎週各人の口腔から
試料を採取し、ミチス・サリバリウム寒天平板培地（米
国、ディフコ社）およびＴＹＣ寒天平板培地で３７°Ｃ
１４８時間嫌気培養して、口腔内のＭＣＬＳ型菌株の増
減を調べた。

結果を第６表に示す。投与前全員からＭＣＬＳ型苗株が
検出された。投与開始後８週目には全員から検出されな
かった。

第　　　６　　　表

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）高い病原性を有しかつラフィノースおよびメリビ
   オース分解能を有するストレプトコッカス・サンギスに
   属する微生物の菌体の一部以上および培養物からなる群
   に由来する抗原を有効成分とし、薬学的に許容し得る担
   体と共存させてなることを特徴とする、上記微生物によ
   つて誘発または悪化されるヒトの疾患を処理するための
   ワクチン。
2. （２）上記抗原が、上記微生物由来の抗体と反応するが
   、それ以外の微生物由来の抗体とは反応しない抗原であ
   る特許請求の範囲第１項記載のワクチン。
3. （３）上記微生物がストレプトコッカス・サンギスＳＳ
   Ｈ８３（微工研菌寄第７３７２号）およびストレプトコ
   ッカス・サンギスＭＣＬＳ２（微工研菌寄第８１６９号
   ）から選ばれた１種以上である特許請求の範囲第１項記
   載のワクチン。
4. （４）抗原が細胞壁表層の線毛様構造由来の抗原である
   特許請求の範囲第１項記載のワクチン。
5. （５）高い病原性を有しかつラフィノースおよびメリビ
   オース分解能を有するストレプトコッカス・サンギスに
   属する微生物の菌体の一部以上および培養物からなる群
   に由来する抗原で哺乳動物を免疫することにより動物の
   体内に抗体を産生させ、産生された抗体を動物から回収
   する工程からなる、上記微生物によつて誘発または悪化
   されたヒトの疾患を処理するための抗体の製造法。
6. （６）抗原が細胞壁表層の線毛様構造由来の抗原である
   特許請求の範囲第５項記載の方法。
7. （７）抗体が抗血清である特許請求の範囲第５項記載の
   方法。
8. （８）高い病原性を有しかつラフィノースおよびメリビ
   オース分解能を有するストレプトコッカス・サンギスに
   属する微生物の菌体の一部以上および培養物からなる群
   に由来する抗原で哺乳動物を免疫することに より動物の体に抗体を産生させ、産生された抗体を動物
   から回収する方法で得られた抗体の有効量を、経口投与 に適する担体または賦形剤と共存させてなる、上記微生
   物によつて誘発または悪化されるヒトの疾患を予防また
   は抑制するための組成物。
9. （９）上記微生物の表層の線毛様構造由来の抗原または
   前記抗原由来の抗体を含有する特許請求の範囲第９項記
   載の組成物。
10. （１０）微生物学的に純粋培養されたストレプトコッカ
    ス・サンギス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓａｎｇ
    ｕｉｓ）ＳＳＨ８３（微工研菌寄第７３７２号）または
    ストレプトコッカス・サンギス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃ
    ｃｕｓ　ｓａｎｇｕｉｓ）ＭＣＬＳ２（微工研菌寄第８
    １６９号）。