JPS6069553A - ヒト単球のｈｌａｄタイプの決定方法 - Google Patents

ヒト単球のｈｌａｄタイプの決定方法

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JPS6069553A
JPS6069553A JP59079330A JP7933084A JPS6069553A JP S6069553 A JPS6069553 A JP S6069553A JP 59079330 A JP59079330 A JP 59079330A JP 7933084 A JP7933084 A JP 7933084A JP S6069553 A JPS6069553 A JP S6069553A
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エライン　シー．デフレイタス
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Wistar Institute of Anatomy and Biology
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明はＨＬＡ　Ｄタイプ抗原の決定法に関する。
本発明の背景 ヒトでは、　ＨＬＡ抗原への応答が、移植組織への強い
免疫反応を支配している。移植組織の拒絶を避けるため
には、提供者のＨＬＡタイプを受容者のＨＬＡタイプに
適合さすのが望ましい。個人のＨＬＡタイプは、ひとつ
の染色体上の遺伝子によりコードされる抗原で決定され
るｇ第６染色体上に４個の主Ｉ（ＬＡ抗原遺伝子座が同
定されＡ％Ｂ％ＣおよびＤ（および非常に類似したＤＲ
座）と命名された。主な淋巴球活性化デテルミナントは
、第４の座りにおける対立遺伝子により調節されている
。受容者および提供者のＤアロタイツ０を適合さすこと
は、移植の拒絶および輸血の反応を減少さすための主要
用となることが分った。
もつともありうることとして、ＨＬＡのＡおよびＢ抗原
に対する細胞毒性Ｔ淋巴球は、Ｄ座の差により生成され
るという事実に帰せられる。
Ｄ座のタイピングは、代表的には、一方向混合淋巴球反
応（ＭＬＲ）で行なう。ＭＬＲでは、遺伝的に異なる淋
巴球の２つの群なあわせて培養する。集団のひとつ（ス
テイミュレータ−）は、照射またはマイトマイシンＣで
免疫的に非応答性とする。他の細胞集団は、照射された
ｉ（Ｉ＋胞集団の表面上の一現型の点で異なるデテルミ
ナントに応答する。タイピングアッセイｒｔＭＬＢを用
いて行なうには、既知のＨＬＡ　Ｄタイ７０７盲する提
供者のヌクリーニングパネルがヌテ・イミュレーターと
して必要である。同型接合性タイピンゲ細胞のこのパネ
ルは、いとこ間の結婚の家族にもつともよく見出だされ
る。未知の提供者１？ＢＬを、タイピングパネルのそれ
ぞれと５から７日培養する。未チＵの提供者のｉ（Ｌ’
Ａ　’Ｄアロタイプがスクリーニング用淋巴球の７０タ
イフ０と異なるなら、提供者のＰＢＬによる免疫的応答
があるであろう。同じＨＬＡ　Ｄタイプのステイミュレ
ート淋巴球を含有する培養中での非反応性により、未知
の提供者アロタイプが示されるであろう。
ＨＬＡＤタイプを決定するのに用いられる別の方法は混
合淋巴球細胞毒試験（ＭＬＣ）である。
ＭＬＣの第１段階では、ＭＬＲについて上記したスクリ
ーニングパネルで提供者の淋巴球ステイミュレートする
必要がある（５−７日）。応答するプライムされた淋巴
球を集め、既知のＨＬＡＤタイプを簀するＢ淋巴芽細胞
ラインのパネルにより細胞毒をアッセイする。これらの
標的細胞には、放射同位元素ｆａ：　３ｙらかじめラベ
ルしておく、よそ者ＨＬＡ　Ｄタイプにプライムされた
、第１段階よりの提供者淋巴球は、プライムされたのと
同じＤタイ−１を有する放射ラベル標的を殺すであろう
。上清中の放射活性により細胞毒反応を検出しりる。
このアッセイ）’！ＭＬＲ１９階のあとさらに６から８
時間を要する。
上記の方法はＨＬＡ　Ｄタイプを決定するのに正確であ
るが、移植操作のために提供者詞よび受容者はタイピン
グするのに時間がかかり適当でない。
一般的に、提供者は、死体でできるだけ早く（２４時間
のうちに〕臓器を移植する必要がある。
それで、ＨＬＡ　Ｄタイプについての便宜な試験が必要
である。
本発明の要約 本発明の目的はヒト単球のＨＬＡ　Ｄタイプを決定する
アッセイ法を提供することである。
本発明の別の目的は、ＨＬＡ　Ｄタイプを決定スる便宜
なアッセイ法を提供することである。
本発明のさらに別の目的は、組織移植のために、提供者
と受容者のＨＬＡ　Ｄタイプを迅速に適合させうるアッ
セイ法を提供することである。
本発明のさらに別の目的は、ヒトＴ細胞ハイプリドーマ
を用いるＨＬＡ　Ｄタイプのアッセイ法を提供すること
である。
本発明の別の目的はヒトＴ細胞ハイプリドーマが抗原特
異性かどうかを決定し５るアッセイ法を提供することで
ある。
これらおよび他の本発明の目的は、（ａ）特定の抗原で
ヒト単球をパルスし；（ｂ）それぞれのスクリーニング
川９［０胞培養が単一のＨＬＡ　Ｄ結合タイプで特定の
該抗原に特異的であるとして、抗原特異的Ｔ淋巴球およ
び抗原特異的Ｔ細胞ハイプリドーマより成立つ群より選
択した少なくとも１種の７クリーニング細胞培養物とパ
ルスされた単球とを接触させ；そして（ｃ）パルスされ
た該単球が該スクリーニング細胞に選択的に結合するか
どうかを決定することを包含する方法により達成される
。
有利な具体例の詳しい記載 本発明は、Ｔ淋巴球かまたはＴ細胞ハイプリドーマであ
る抗原特異的スクリーニング細胞とあわせて、個人より
の抗原パルス単球を培養することによりＨＬＡ　Ｄタイ
プを速くそして信頼性よく決定しうる新規アッセイ法を
目的とする。本発明のアッセイ法はまたＴ細胞ハイプリ
ドーマが抗原特異的かどうかを決定するのに用いうる。
本発明は抗原特異的Ｔ淋巴球またはＴ細胞ハイシリドー
マが、それらスクリーニング用細胞と同じＨＬＡ　Ｄ″
′結合型”である抗原パルス単球に選択的に結合するで
あろうという事実を利用している。
本発明は、本発明と同時出願の“ヒ）Ｔ細胞ハイシリド
ーマ”と題する明＃ｌｌ書に記載のような抗原特異性を
保有する永久的Ｔ細胞ハイプリドーマを利用する。
なは、この明細書を本発明は引用文献として引用する。
本発明により、従来達成されなかったいくつかの独特の
利点が達成される。＠１に、維持容易の永久的Ｔ細胞ハ
イプリドーマは、未知のＨＬＡ　Ｄタイプの単球をスク
リーニングするための永久的細胞供給原として用いうる
。もちろん、明確なＨＬＡ　Ｄタイプの、他の連続的、
抗原特異的Ｔ淋巴球を入手しえれば有利であろう。第２
にアッセイは数時間で実施でき、このことは移植の前に
死体の提供者を受容者にマツチさせ５ることは大いに重
要である。
１１ＬＡ　Ｄ座抗原はＨＬＡ　ＤＲ抗原に非常に近縁で
ある。ある研究者は、ＤおよびＤＲが実際に同じ座であ
ると信じている。ＤおよびＤＲ座は、少なくとも染色体
上で非常に接近してつながっているようである。Ｄ抗原
が抗原特異的淋巴球により定６され、ＤＲ抗原が抗体に
より定義されるところからあいまいさを生ずる。
それで、Ｄ：ｌｔｄよびＤＲに対する抗原サイトが同じ
かどうか決まっていない。本発明方法は抗原型を決定す
るのにＴ淋巴球かまたはＴ細胞ハイプリドーマを用いる
ので、決定される表現型は、ここでＨＬＡ　Ｄタイプと
称する。しかし、本発明はＨＬＡＤＢ本また定義しうろ
ことを理解さるべきである。
本明細鳩記載のアッセイは、抗原パルス迅球に結合する
Ｔ淋巴球かｆたはＴ細胞ハイシリドーマを用いうる。有
利ｌ、ｃ細胞は、ヘルパーＴ淋巴球および親細胞のひと
りがヘルパー′１゛淋巴球であるＴ細胞ノ・イブリドー
マである。節Ｊｌｉのために１木発明すＴ細胞ハメブリ
ＩＳ−マの場合により記載する。
もちろん、下記するＴ細胞ハイプリドーマと同様Ｋ　ヘ
１１７　バー　Ｔ淋巴球も用いうることは理解さるべき
である。
本発明の宵利な具体例では、単球のＨＬＡ　Ｄ表現型を
決定するために、ヒトＴ細胞ハイプリドーマを用いる。
ハイプリドーマは抗原特異性を発現すべきである。つま
り１．ひとつの特定の抗原だけでパルスされた単球に選
択的に結合すべきである。
たとへば、破傷風トキソイドに特異的なハイプリドーマ
は、破傷風トキソイドでパルスされてない単球または無
関係の抗原でパルスされている単球でなく、破傷風でパ
ルスされた単球と選択的に結合する。本発明に用いて有
利なハイプリドーマは木明細書と同時提出の６ヒトＴ細
胞ノ・イブリドーマ”と題する同時出願の特許願に記載
されている。
このハイプリドーマは、ヒトリンパ腫細胞と抗原特異的
Ｔ淋巴球たとへばヘルパーＴ淋巴球とを融合させて形成
させた体細胞バイブリドの子孫（クローン化）である。
分析に奮利なのは、Ｔ淋巴球由来のヒ）　ＩＪンパ腫細
胞および抗原特異的Ｔ淋巴球に由来するものである。
抗原特異的Ｔ淋巴球を分離する方法はごの方面の技術で
知られている。Ｋｕｒｎｉｃｋ等の文献をみよ。
Ｔ淋巴球由来のヒトリンパ腫セルラインも知られている
。奮利な親すンパ肺は、本出願と同時出願の６ハイプリ
ｊイゼーシヨンに適当なヒトリンパ腫セルライン”と題
する特許願に記載のヒトリンパ腫セルライ？、　Ｊｕｒ
ｋａｔに由来する選択可能の変異株である。この特許願
の記載を木明細書の参考文献として引用とする。Ｊｕｒ
ｋａｔセルラインは５ｅｚａｒｙ　Ｔ細胞リンパ腫で４
６染色体を有し、ＸＹであ゛る。それは、羊赤血球レセ
プター陽性、０ＫＴ３抗原陽性、Ｆｏレセプター陽性、
○ＫＴ４および０ＫＴ８−陽性（可変性）および表面楡
陰性の表現型を有する。７ｒれはまた、コンカｌ々リン
Ａおよびフィトヘマグルチニンで刺激してｌｌ−２’＆
生ずる。このセルラインに１由来する″細胞は、セルラ
インのクローンでありうる？−１’たはセルう、インの
変異クローンであ１１５る。
ハイブリダイゼーションに適当な２つのセルラインは１
９８３年６月１１日に、’Ｍａｒｙｌａｎｄ２０８５２
　、　ＲｏｃｋｖｉＬｌｅ　、　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄ
ｒｉｖｅ　。
１２３０１　、　ｔ、ｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐ
ｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　（ＡＴＣＣ
）　Ｋ寄託された。Ｊｕｒｋａｔセルラインに由来する
ひとつの適当な選択し与る変異株は、ＡＴＣＣ冨託／１
６．ＣＲＬ　−８２２３を受けてし・る。ＰＰＬＯから
なおった他の選択しうる変異株はＡＴＣＣ寄託４ｃＲＬ
８２２４を受けている。これら（７）　６　択し５る変
異株１１ヒボキＶ−ンチン７１（スフ１−リボシルトラ
ンスフェラーゼ（ＨｐｉｑＴ）　−Ｖａ件で、それゆえ
にヒ４ｖキナンチン、アミノプテリンおよびチミジン含
頁培地（ＨＡＴ　）Ｋ感受性である。
ハイプリドーマ製造の基本方法はこの方面の技術で知ら
れている。たとへはＭｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂ
ｏｄｉｅｓ（Ｒ，Ｋｅｎｎｅｔｔ、１．　Ｐ、　ＭｃＫ
ｅｒａｎ　＆　Ｋ、　Ｂｅｃｈｔｏ１編）をみよ。！Ｆ
！ｉニ有利な方法は、Ｋｏｎｔｉａｎｅｎ　＃　（１９
７Ｂ　）Ｎａｔｕｒｅ２７４．：　４７７−４８０に記
載されている。一般的に、本発明で用いる方法では、正
常の抗原特異的ヒトヘルパーＴ淋巴球どＨＡＴ−感受性
ヒ）　ＩＪンパ腫細胞とを約５対１にあわせてペレット
化することを包含する。ペレット化細胞はついで血清不
含ＲＰＭＬ１６４０中ボ゛リエチレングリコール５０％
溶液中に懸濁させる。予備加温したＲＰＭＩ　１６．４
０をついでゆっくり加え、細胞を再ベレット化し、ＲＰ
Ｍ１１６４０．１５％牛脂児血消およびＨＡＴ−含有培
地中に？ａ濁させる。細胞ｍｌ物には毎週新鮮ＨＡＴ培
地を加える。約１か２週のあと、未融合のＴ淋巴球およ
びリンパ腫細胞は死滅する。
成功した細胞・・イブリドは、一般的に融合後７週で観
察されうる。採取したハイプリドーマはついで１カ・ら
４ケ月クローニングすべきで、その時点で染色体数なら
びに抗原特異的の表現型は安定するはづである。木明細
書記載のアッセイの変法も、バイブドーマが抗原特異的
を保留しているかどうかを決めるのに用いうる。６抗原
特異的”または７抗原特異性”は、Ｔ細胞ノ・イブリド
ーマまたはＴ淋巴球が、ひとつだけの特定の抗原でパル
スされた単球に選択的に結合することを意味する。
選択的結合があれば、ハイプリドーマまたは淋巴球はそ
の抗原に″特異的”である。
現在、組織移植に重要な１２個のＨＬＡ　Ｄアロタイプ
があると信ぜられている。しかしさらにより多く！１に
徴づげられ５るかもし牙１ない。それで、本発明での６
スクリーニング細胞″として抗原特異的Ｔ細胞ハイプリ
ドーマまたはＴ淋巴球を用いるためには、スクリーニン
グ細胞の゛結合タイプ”、つまり、抗原パルス単球を結
合する時にヌクリー　′ニング細胞が選択的に認識しう
るＤアロタイプを決定する必要がある。
Ｔ淋巴球はしばしば異質接合件で、Ｔ細胞ハイブリドー
マは２つより多くのＨＬＡ、’Ｄ表現型さえも発現しう
る。しかし、アロタイプのひとつだけが、抗原パルス単
球に対するスクリーニング細胞の抗原特異的結合を決定
するのである。それで、単球が抗原パルスされていない
時には、単球により発現される３ｆ４の異なるＤアロタ
イプに結合しへるけれども、蛍球が抗原パルスされるな
らば、ハイプリドーマはひとつだけのアロタイプを選択
的に認識するであろう。この理論により拘束されるつも
りはないが、出願人は、Ｔ淋巴球またはそれらのハイプ
リドーマ上で、抗原とＨＬＡ　Ｄ認識ナイトは、非常に
接近して連合しているためと信する。しかし、この現象
は単球には観察されない。
異質接合性の単球は、単球アロタイプのいずれかに同じ
の１結合タイプ”を有するＴ淋巴球またはハイプリドー
マに選択的に結合しうる。それは、アロタイプのそれぞ
れが単球の表現に発現されるからである。
それで、有利な具体例において、それぞれに異なるＨＬ
Ａ　Ｄアロタイプへの抗原特異的結合（つまり、異なる
６結合タイゾ″）を・示す、１２個の、保存Ｔ淋巴球ま
たはＴ細胞ハイプリドーマスクリーニング用培養物を用
いる。ひどつだけの培養物中においての入結合が認めら
れたら、その単球は子のスクリーニング用培養物の６結
合タイプについて同質接合的となる。２つのスクリーニ
ング用培養物が選択的結合を示すなら５．ｊＩｉ球は異
質接合的である。
一般的に、本発明の実際上のアッセイでは、抗原パルス
単球を、その単球にパルストた抗原に特異的の既知のＨ
ＬＡ　Ｄ結合タイプのＴ細胞ハイプリドーマとあわせて
培養する。アッセイの目的が、移植を提供する大または
受ける人のＨＬＡ　Ｄタイプを決定することであるなら
ば、代表的操作は、提供者または受容者の末梢血液の淋
巴球（ＰＢＬ）の試料を採取し、セしてＰＢＬによるス
クリーニング用培養物に対する免疫応答を防ぐために、
ｐＢＬＫｊｆンマー線を照射することを包含しよう。
ＰＢＬ中に単球が存在するであろう。照射されＰＢＬは
、ついで、スクリーニング用Ｔ細胞ハイプリドーマが特
異的である抗原で、２から６時間パルスする、つまり接
触させる。パルスＰＢＬはついで棟々のスクリーニング
用培養物に加える。抗原パルスＰＢＬとスクリーニング
用培養物とをあわ−せインキュベート後、どの培養物中
でＰＢＬとスクリーニング用細胞とが選択的に結合する
かを測定することによりＰＢＬのＨＬＡ　Ｄタイプは容
易に明らかになろう。
抗原パルスＰＢＬまたは単球とＴ淋巴球またはＴ細胞ハ
イプリドーマとのあいだの選択的結合を測定する他の方
法を用いうるなら（たとへば顕鏡測定）、有利な方法は
Ｔ淋巴球ｆたはＴ細胞ノルイブリド−マスクリーニング
用培養物を放射ラベルし、ついでスクリーニング用細胞
を固体担体に固定した抗原パルス単球と培養する。吸着
しない細胞は容易に洗い去ることかでき、Ｔ淋巴球また
はＴ細胞ハイプリドーマの結合の程度は液体シンチレー
ションカウントで測定する。３Ｈ−Ｔｄ［（含有培地中
で１夜細胞を培養することによりＴ淋巴球またはＴ細ハ
イプリドーマは容易に放射ラベルしうる。
スクリーニング用培養物はまた、この方面でよく知られ
ている方法で酵素ラベルしへる。放射ラベルが便宜でな
いならＢＣＬＩＳＡアッセイを用いうる。
単球の懸濁液を担体に数時間接触さすだけで単球はガラ
ス、プラスチックなどの担体に吸着させうる。有利な固
体担体はポリスチレンミクロタイタープレートである。
等張食塩水中にトリプシンおよび０．０１ＭのＥＤＴＡ
を含有する溶液で処理して固体担体より組体を容易に剥
がしうる。
つぎの実施例は単に説明のためで、本発明範囲を限定し
ない。
例１ ひとつだけのＨＬＡ、Ｄアロタイプの抗原パルス単球へ
のＴ細胞ハイプリドーマによる抗原特異的結合を示す。
”　Ｈｕｍａｎ　Ｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ
”と称する木明細書と同時出願の特許−に記載の方法で
Ｔ細胞ハイプリドーマを調製した。ＳＨ２と称するハイ
プリドーマは破傷風（Ｔｅｔ　）　）キソイド抗原に特
異的である。ＤＲ−タイプのハイプリドーマはＤＲ−特
異的アロ抗血清で確立された／４／７である。
ハイプリドーマは、まず、破傷風トキソイドを含萱する
Ｔ−７５フラスコより採取した。細胞＆を無菌食塩水中
で２度洗い、牛胎児血清および２ｕＣｉ　／　ｍｌ”Ｈ
−ＴｄＲ含傅新鮮ＲＦＭＩ６４０中５　Ｘ　ＩＱ５釧胞
／ｍ１に再懸濁させた。細胞は新しいＴ−７５フラスコ
中に入れ６７°Ｇで５％Ｃｏ２で１夜インキユベートし
た。翌朝細胞を採取し、無菌食塩水中で２度洗い、新鮮
培地中に１　ｘ　１０’細胞／　ｍｌに再懸濁させた。
アッセイの日に、５人の患者から２０ｍ１の血液ケ採血
した。特異的アロ抗血清を用いるＤＲ−タイピングは、
提供者が次のＤＲタイプニア／２．５／２．２／２．５
１５および３／４を有することを示した。市販Ｌｙｍｐ
ｈｏｐｒｅｐ　（Ｎｙ＋４ｕａｒｄ　、　０ｓｌｏ　、
　Ｎｏｒｗａｙ）を用いる密度遠心により血液試料より
ＰＢＬを調製した。ＰＢＬは無菌食塩水で２度洗い、４
０００Ｒを照射し、２０％ヒ）ＡＢ血清を含有する新鮮
培地中に、１０×１０８細胞／ｍ１に再懸濁させた。
９６−ウェルミクロタイタープレート（Ｃｏｓ　ｔａｒ
　。
Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　、　Ｍａｓｓ、　）に約１００ａ
１／ウエルのＰＢＬＮ濁液を接種した。４８ウェルに破
傷風トキソイドを加えて最終濃度１００μ９７ｍ１−と
じた。
ウェルのすべてに、上記ノ・イブリドーマの最終懸濁液
１００μｍを加えた。プレートは５％（’０２中約３７
°（、Ｃ−３時間インキュベートした。未吸着細胞を除
くために、アスピレーションおよび温（６７°Ｇ）無菌
食塩水の添加を６度くり返しおだヤカＶｃ　洗ツｔ、ニ
ー。０．０１　Ｍ　（Ｄ　ＥＤＴＡ　０．２５　％　（
ｗ／）トリジシンを含有する２００μｍ０食塩水をウェ
ルに加え、３７℃で１５分インキュベートし℃吸着細胞
をはがした。自動的セルノーーペスターでウェルの内容
物をガラスファイバーディ２りに採取した。液体シンチ
レーションカウンターでティスフをカウントした。
破傷風トキンイドパルス種々の単球に結合したハイプリ
ドーマの数を表１に示す。このデータは、ハイプリドー
マがＤ２　（Ｄ−タイプはＤＢ−タイプと同じと仮定す
る）の６結合タイプ”を有することを示す。単球のアロ
タイプのいずれもＤＢ２でない時、結合はいちじるしく
低下した。データは、Ｄ２への選択的結合を明瞭に示す
。表２は、ハイプリドーマと抗原パルスされてない曝球
とのあいだの結合を示す。タイデフの単球Ｖｃｆ、、る
程度の選択的結合のあったことは明らかである。しかし
結合は、単球が抗原パルスされた時はどには選択的でな
い。
表１ 単球Ｄ□タイプ＊　プレパルス＋された単球に結合した
Ｔｅｔ特異的Ｔ−Ｔバイブリド数 培地７　Ｔ　ｅ　ｔ。
７／２　６．乙ｉ３　１１．５８２ ５／２　６，２２１　１３．０７１ ２／２　５．５４８　６．９５９ ５１５　１．６１２　２．６６４ ３／４　２．６５２　２．７３９ ”ｐＰ％異的アロ抗血清でタイピングした＋５０，０Ｏ
ＯＴ−Ｔバイブリド（３Ｈ−ＴｄＲで）０ララベル）を
、プレパルスしないか（培地）または１１００Ｉｔ／ｍ
ｌのＴｅｔ、でプレパルスした４０−．５０Ｘ１０３単
球の拒層に加えた。
４８ＥＭ平均の１Ｄ％ 表２ ７／Ｉ　Ｂ、１２１ ７／７　５，０５０ ７／３　６．［１０１ ７／ろ　５．４８４ ７／２　６，３１３ ５１５　１　、／１１１２ ３／４　２．６５２ ＊　ＤＲ特異的アロ抗血清でタイピング１曽に加えた。
ＳＥＭは平均の１０％より小側２ つぎの実施例は、特定のハイプリドーマが抗原特異的か
どうかを定めるために本発明のアッセイを用いる例であ
る。
木出願と同時ＶＣ出願する”　Ｈｕ、ｍａｎ　’１”　
ＣｅｌｌＨｙｂｒｉｄｏｍａｓ″と題する特許願に記載
の）〜イブリドーマを破傷風トキソイド特異性について
調べた。
Ｔ細胞ハイプリドーマおよびＪｕｒｋａｔ　−６’−Ｔ
Ｇ　−６細胞を、ＲＰＭ１１６４０中１ｕＣｉ　／　ｍ
ｌの３Ｈ−Ｔｄ／Ｒおよび１５％牛脂児血７６と６７°
０１夜インキユベートしプレラベルした。細胞は十分に
洗い、カウントし、ミクロタイタープレートに同じ数だ
け加えた。プレートは、ハイプリドーマの正常のＴ淋巴
球の親にオートロガスであった、５ｘ１０５ＰＢＬの懸
濁液よりの、ガンマ−線照射（４０００Ｒ）を受けた吸
着細胞を含有した。この吸着細胞は、無処理か、２０μ
、ｌｉ’　／　ｍ　ｌの破傷風トキソイド、８ＫＳＤ　
（２０μｌ／　／　ｍｌ　）で６７℃で６時間あらかじ
めパルスしたものである。ラベルされた淋巴球は６７℃
で６時間インキュベートし、七のあと非吸着細胞は洗っ
た。吸着細胞はＥＤＴＡの０．１Ｍ水溶液中１１２５　
（”／　）　）リゾシンを用いてはがした。そして、ｔ
ｉｔｅｒｔｅｋを用いがラスせんい−ξ−パーＩＣ採取
した。フィルターは乾燥し、液体ンンチレーションコッ
クティル中でカウントした。破傷風でプレパルスされた
オートロガス牟球にはＳＨ２の５０％以上が結合したが
、破傷風の有無にかかわらずＪｕｒｋａｔ　−６−’Ｉ
’Ｇ　−３の１−２％だけが結合した。単球なしのウェ
ルまたは破傷風トキソイドのみでパルスした空のウェル
の付着したハイプリドーマは１％以下であった。結果は
表６に示１″。
上記は本発明の具体例で、専門家には種々の変法も容易
であろう。それで、本発明は特許請求の範囲により限定
されるものとする。
代理人　浅　村　皓 手続補正書（睦） 昭和５９年６月ｌｑ１．１ 特許庁長官殿 １、事件の表示 昭和５９年特ｒ１願第７９３５０　号 ２、発明の名称 ヒト単球のＨＬＡ　Ｄタイプの決定方法３、補正をする
者 事件との関係　特７１出願人 ４、代理人 昭和　年　月　（１ ８、補正の内容　別紙のとおり 明細書の浄書（内容に変更なし） 手続補正書（自発） 昭和５９年７月７２０ 特許庁長官殿 １、事件の表示 ＋１ｒＪ和５９年特許願第７９３３０　号２、発明の名
称 ヒト単球のＨＬＡ　Ｄタイプの決定方法３、補正をする
者 ｉＪｉ件との関係　特′：１出願人 住　所 氏　名　デ　ウィスター　インスチチュート（名　杓０ ４、代理人 ５、補正命令の日イ］ 昭和　年　月　日 ６、補正により増加する発明の数 ８、　ｈｌｉ正の内容　別紙のとおり （１）　明細書、８頁１４行の「主要用」をｒ主要因子
」に訂正する。
（２）同書、１２頁下から５〜４行の「、本発明と同時
出願・・・・・・・・・記載のような」を、および下か
ら２〜１行の「なは、この明細書・・・・・・・・・引
用する。」を削除する。
（３）同書、１５頁１〜６行の「本発明に用いて・・・
・・・・・・記載されている。」を、１６〜１５行の「
、本出願と同時出願・・・・・・・・・に記載の」を、
および下から４〜６行の「この特許願の・・・・・・・
・・引用とする。」を削除する。
（４）同書、１５頁１１行の「知られている。・・・・
・・・・・みよ。」を「知られている（　Ｋｕｒｎｉｃ
ｋ等のＪ、工ｍｍｕｎａ：ｔ、１２２：１２５５〜１２
６０（１９７９年）〕。」に訂正する。
（５）同書、２０頁下かも５〜２行の「照射されＰＢＬ
は」を「照射されたＰＢＩ＋は」に訂正する。
（６）同書、２２頁１５〜１６’行の「”　Ｈｕｍａｎ
　ＴＯｅｌｌ−ｔ・・・・・・・特許願に」をｒ　Ｋｏ
ｎｔｉａｎｅｎ等のｎａｔｕｒｓ２７４：４７７〜４８
８（１９７８年）に」に訂正する。
（７）同省、２８頁５〜６行の「本出願と同時に・・・
・・・・・・に記載の」を削除する。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 ｆｉｌ（ａｔ特定の抗原でヒト拒球をパルスし：（ｂｌ
    ヌクリーニング用細胞培養物のそれぞれが実１．質的に
    単一のＩ（ＬＡ　Ｄ結合タイプで該特定抗原に特異的で
    あるとして、抗原特異的Ｔ淋巴球および抗原特異的Ｔ細
    胞ハイプリドーマより成立つ群より選択した少なくとも
    ひとつのスクリーニング用細胞培養物に、該パルス単球
    を接触させ；そして、 （ｃｌ該パルス単球が該スクリーニング細胞に選択的に
    結合するかどうかを測定する ことを包含する、ヒト単球のＨＬＡ　Ｄタイプの決定方
    法。 （２）　それぞれのスクリーニング培養物に接触さす該
    パルス単球の量を大体等しくシ、セして該スクリーニン
    グ用培養物がほぼ等しい数の細胞を有すニング用培養物
    の１種より多くて該パルス華球と接触さす、上記（１）
    項記載の方法。 （３）該パルスされた思球な固体担体に付着さす、上記
    （１１項記載の方法。 （４）該パルスされた単球を固体担体に付着さす、上記
    （２１項記載の方法。 （５）該スクリーニング用培養物を放射ラベルする、上
    記（１）項記載の方法。 （６）該ヌクリーニング用培養物、を放射ラベルする、
    上記（２）項記載の方法。 （７）該スクリーニング用培養物を放射ラベルする、上
    記（３）項記載の方法。 （８）該スクリーニング用培養物を放射ラベルする、上
    記（４）項記載の方法。 （９）　該スクリーニング用培養物を酵素ラベル−ｉ”
    る、上記（１）項記載の方法。 ａα　該スクリーニング用培養物を酵素ラベルする、上
    記（２）項記載の方法。 （Ｉｌｌ　該ヌクリーニング用培養物を酵素ラベルする
    、上記（３）項記載の方法。 ｉ＋２１　該スクリーニング用培養物を酵素ラベルする
    、上記（４）項記載の方法。 （１３）　ヒトリンパ腫セルラインに由来する第１の親
    細胞と、該特定抗原に特異的へ正常の、ヒ）Ｔ淋巴球で
    ある第２の親細胞との体細胞バイブリドよりクローン化
    されたヒトＴ細胞ハイプリドーマの培養物を、該スクリ
    ーニング用培養物とする、上記（１）項記載の方法。 （１４１ヒトリンパ腫セルラインに由来する第１の親細
    胞と、該特定抗原に特異的の、正常の、ヒトＴ淋巴球で
    ある第２の親細胞との体細胞バイブリドよりクローン化
    されたヒトＴ細胞ハイシリドーマの培養物を、該スクリ
    ーニング用培養物とする、上記（２）項記載の方法。 （１５）　ヒトリンパ腫セルラインに由来する第１の親
    細胞と、該特定抗原に特異的の、正常の、ヒトＴ淋巴球
    である第２の親細胞との体細胞バイブリドよりクローン
    化されたヒトＴ細胞ハイプリドーマの培養物を、該スク
    リーニング用培養物とする、上記（３）項記載の方法。 （１６）　ヒトリンパ腫セルラインに由来する第１の親
    細胞と、該特定抗原に特異的の、正常の、ヒトＴ淋巴球
    である第２の親細胞との体細胞バイブリドよりクローン
    化されたヒトＴ　１Ｂ胞ハイプリドーマの培養物を、該
    スクリーニング用培養物とする、上記（４）項記載の方
    法。 （１７１ヒ）　ＩＪンパ腫セルラインに由来する第１の
    親細胞と、該特定抗原に特異的の、正常の、ヒ）Ｔ淋巴
    球である第２の親細胞との体細胞バイブリドよりクロー
    ン化されたヒトＴ細胞ハイプリドーマの培養物を、該ス
    クリーニング用培養物とする、上記（５）項記載の方法
    。 叫　ヒトリンパ腫セルラインに由来する第１の親細胞と
    、該特定抗原に特異的の、正常の、ヒトＴ淋巴球である
    第２の親細胞との体細胞バイブリドよりクローン化され
    たヒトＴ細胞ハイシリドーマの培養物を、該スクリーニ
    ング用培養物とする、上記（６）項記載の方法。 （［！ｌ　ヒトリンパ腫セルラインに由来する第１の親
    細胞と、該特定抗原に特異的の、正常の、ヒトＴ淋巴球
    でｋ）る第２の親細胞との体細胞バイブリドよりクロー
    ン化されたヒトＴ１［１胞ハイプリドーマの培養物を、
    該スクリーニング用培養物とする、上記（７）項記載の
    方法。 （２（刀　ヒトリンパ腫セルラインに由来する第１の親
    細胞と、該特定抗原に特異的の、正常の、ヒトＴ淋巴球
    である第２の親細胞との体細胞バイブリドよりクローン
    化されたヒトＴ細胞ハイプリドーマの培養物を、該スク
    リーニング用培養物とする、上記（８）項記載の方法。 （２１）　ヒトリンパ腫セルラインに由来する第１の親
    細胞と、該特定抗原に特異的の、正常の、ヒトＴ淋巴球
    である第２の親細胞との体細胞バイブリドよりクローン
    化されたヒトＴ組１胞ハイプリドーマの培養物を、該ス
    クリーニグ用培養物とする、上記（９）項記載の方法。 シ２　ヒトリンパ１匝セルラインに由来する第１の親細
    胞と、該特定抗原に％異的の、正常の、ヒトＴ淋巴球で
    ある第２の親細胞との体細胞バイブリドよりクローン化
    されたヒトＴ細胞ノへイブリドーマの培養物を該スクリ
    ーニング用培養物とする、上記（１［１１項記載の方法
    。 （２３）　ヒトリンパ腫セルラインに由来する第１の親
    細胞と、該特定抗原に特異的の、正常の、とトＴ淋巴球
    である第２の親細胞との体細胞バイブリドよりクローン
    化されたヒトＴ細胞ハイプリドーマの培養物を、該スク
    リーニング用培養物とする、上記０９項記載の方法。 （２（イ）　ヒトリンパ腫セルラインに由来する第１の
    親細胞と、該特定抗原に特異的の、正常の、ヒトＴ淋巴
    球である第２の親細胞との体細胞バイブリドよりクロー
    ン化されたヒトＴ細胞ハイプリドーマの培養物を、該そ
    クリーニング用培養物とする、上記ａ々項記載の方法。 （２ツ　該第１の親細胞がヒトリンパ腫セルラインＪｕ
    ｒｋａｔに由来する上記Ｌ１３１　ｒＪＡ８ｅ載の方法
    ・。 （２６）該第１の親細胞がヒトリンパ腫セルラインＪｕ
    ｒｋａｔに由来する上記（１滲項記載の方法。 （２η　該第１の親細胞がヒトリンパ腫セルラインＪｕ
    ｒｋａｔに由来する上記（１５１項記載の方法。 （２８）　該第１の観、細胞がヒトリンパ腫セルライン
    Ｊｕｒｋａｔ　Ｋ由来する上ｇａ　ｕｓ項記載の方法。 （２！］）　該第１の親細胞がヒトリンパ腫セルライン
    Ｊｕｒｋａｔ　Ｋ由来する上記（１７１項記載の方法。 （３１Ｒｅ第１の親細胞がヒトリンパ１１・■セルライ
    ンＪｕｒｋａｔ　Ｋ由来する上記０υ項記載の方法。 （：３υ　該第１の親細胞がヒトリンパ腫セルラインＪ
    ｕｒｋａｔ　Ｋ由来する上装置１項記載の方法。 ６２）　該第１の親細胞がヒトリンパ腫セルラインＪｕ
    ｒｋａｔ　Ｋ由来する上８己伽）項記載の方法。 （３３）　該第１の親細胞がヒトリンパ腫セルラインＪ
    ｕｒｋａｔ　Ｋ由来する上記（２１１項記載の方法。 Ｇａ　該第１の親細胞がヒトリンパ腫セルラインＪｕｒ
    ｋａｔに由来する上記（２２１項記載の方法。 いつ　該第１の親細胞がヒトリンパ腫セルライ′ンＪｕ
    ｒｋａｔ　Ｋ由来する上記（ハ）項記載の方法。 Ｇ；）該第１の親細胞がヒトリンフ′？腫セルラインＪ
    ｕｒｋａ、ｔに由来する上記０４１項記載の方法。
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