ES2236682T5 - Ensayo y modelo para la enfermedad de alzheimer. - Google Patents

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Abstract

SE PRESENTA UN SISTEMA MODELO PARA LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER QUE COMPRENDE UNA SECUENCIA DE DNA QUE CODIFICA UNA ISOFORMA DE UNA PROTEINA PRECURSORA AMILOIDE (APP) O UN FRAGMENTO QUE TIENE UNA SUSTITUCION DE AMINOACIDO. EL AMINOACIDO SUSTITUIDO PUEDE SER DIFENTE A LA VALINA EN LA POSICION DEL AMINOACIDO QUE SE CORRESPONDE CON LA POSICION 717 DEL RESIDUO DE AMINOACIDO DE LA APP 770. TAMBIEN SE PRESENTAN METODOS PARA DETERMINAR LA PREDISPOSICION GENETICA A LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER.

Description

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La enfermedad de Alzheimer es una enfermedad progresiva conocida generalmente como demencia senil. En términos generales, la enfermedad se divide en dos categorías, particularmente de inicio tardío y de inicio 5 temprano. El inicio tardío, que se produce en una edad avanzada (más de 65 años), puede deberse a una atrofía natural del cerebro que se produce a una mayor velocidad y en un grado más severo de lo normal. La enfermedad de Alzheimer de inicio temprano es mucho menos frecuente, pero muestra una demencia patológicamente idéntica con atrofía cerebral difusa que se desarrolla mucho antes del periodo senil, es decir, entre las edades de 35 y 60 años. Hay indicios de que una forma de este tipo de enfermedad de Alzheimer muestra una tendencia a 10 desarrollarse en ciertas familias y, por lo tanto, se conoce como enfermedad de Alzheimer familiar (FAD).
En los dos tipos de enfermedad de Alzheimer la patología es la misma, pero las anormalidades tienden a ser más graves y más extendidas en casos que comienzan en una edad más temprana. La enfermedad se caracteriza por dos tipos de lesiones en el cerebro, éstas son placas seniles y ovillos neurofibrilares.
Las placas seniles son áreas de neuropilo desorganizado de hasta 150 m con depósitos amiloides 15 extracelulares en el centro. Los ovillos neurofibrilares son depósitos intracelulares de proteína amiloide que constan de dos filamentos enrollados entre sí en parejas.
Las subunidad principal de la proteína, proteína -amiloide, de los filamentos amiloides de las placas seniles es un pequeño polipéptido de alta agregación con una masa molecular relativa de aproximadamente 4.500. Esta proteína es un producto de escisión de una proteína precursora mucho mayor denominada proteína precursora 20 de amiloide (APP).
En el momento actual, no se conoce ninguna terapia eficaz para las diversas formas de la enfermedad de Alzheimer (AD). Sin embargo, hay otras formas de demencia para las que se dispone de tratamiento y que producen un deterioro intelectual progresivo que se parece mucho a la demencia asociada con la enfermedad de Alzheimer. Por lo tanto, un ensayo de diagnóstico para la AD proporcionaría una herramienta valiosa en el diagnóstico y 25 tratamiento de estas otras afecciones, al poder excluir la enfermedad de Alzheimer. También sería valioso que estuviera disponible una terapia adecuada.
También es importante el desarrollo de modelos experimentales de enfermedad de Alzheimer que pueden usarse para definir adicionalmente los sucesos bioquímicos subyacentes implicados en la patogénesis de la AD. Supuestamente, tales modelos podrían emplearse, en una aplicación, para seleccionar agentes que alteren el curso 30 degenerativo de la enfermedad de Alzheimer. Por ejemplo, podría usarse un sistema modelo de enfermedad de Alzheimer para investigar factores ambientales que indujeran o aceleraran la patogénesis de la AD. Por el contrario, podría usarse un modelo experimental para seleccionar agentes que inhibieran, previnieran o invirtieran la progresión de la AD. Presumiblemente, tales modelos podrían emplearse para desarrollar agentes farmacéuticos que fueran eficaces para prevenir, detener o invertir la AD. 35
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
En un primer aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un alelo de la proteína precursora de amiloide (APP) humana mutante que se cosegrega con una predisposición genética a la enfermedad de Alzheimer de inicio temprano, donde el alelo de la APP mutante tiene una substitución de aminoácido, o una isoforma o fragmento de APP770 en la posición codificada 40 por el codón 717 como se define en relación con APP770.
En un segundo aspecto, la presente invención proporciona una composición que comprende una sonda polinucleotídica capaz de hibridar específicamente con un alelo de la proteína precursora de amiloide 770 (APP770) que presenta una mutación en el codón 717, de tal forma que puede identificarse una banda correspondiente al alelo de APP770 en una transferencia de Shouthern, mientras que no puede identificarse un alelo de tipo silvestre 45 correspondiente o puede distinguirse del alelo de APP770 basándose en la intensidad de las señales.
En un tercer aspecto, la presente invención proporciona un hospedador transgénico que comprende un polinucleótido recombinante que incluye una secuencia de ácido nucleico que codifica un alelo de la proteína precursora de amiloide (APP) humana mutante que se cosegrega con una predisposición genética a la enfermedad de Alzheimer de inicio temprano, sin que el hospedador sea un ser humano, donde el alelo de APP770 mutante 50 tiene una substitución de aminoácido en la posición codificada por el codón 717 como se define en relación con APP770 y donde, cuando el huésped es un animal, es un ratón.
De acuerdo con protocolos convencionales, ciertas células humanas cultivadas, cultivos primarios o líneas celulares inmortalizadas, pueden transfectarse, de forma transitoria o estable, con un alelo de APP mutante de forma que la célula humana cultivada exprese un polipéptido de APP mutante. Las células típicamente son células de 55
mamífero y preferiblemente células de mamífero del linaje neural, glial o astrocítico.
En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona un método para seleccionar un agente capaz de tratar la enfermedad de Alzheimer de inicio temprano, que comprende:
poner en contacto un hospedador del tercer aspecto con el agente; y
controlar la expresión o el procesamiento de las proteínas codificadas por el alelo mutante. 5
En un quinto aspecto, la presente invención proporciona el uso de un animal transgénico no humano que comprende un gen APP mutante como modelo para la enfermedad de Alzheimer de inicio temprano, donde el gen APP mutante tiene un codón 717 mutante.
En un sexto aspecto, la presente invención proporciona una célula primaria humana cultivada o una célula inmortalizada que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un mutante de la posición 717 de la 10 proteína precursora de amiloide humana 770 (APP770), o una isoforma de APP que tiene la mutación.
En un séptimo aspecto, la invención proporciona un método de diagnóstico para determinar una predisposición heredada a la enfermedad de Alzheimer de inicio temprano en un sujeto, que comprende detectar en el sujeto la presencia de un alelo de la proteína precursora de amiloide (APP), una isoforma o fragmento de la misma, donde dicho alelo, isoforma o fragmento de la misma tiene un polimorfismo de secuencia en una posición 15 que corresponde al codón 717 de APP770, realizándose la etapa de detección sobre un material extraído y no devuelto al cuerpo del sujeto.
En un octavo aspecto, la invención, proporciona un método para el análisis genético de un sujeto humano, que comprende detectar la presencia o ausencia de al menos un polimorfismo en el codón 717 de un gen APP770 de un gen de la proteína precursora de amiloide (APP) en el sujeto, realizándose la etapa de detección sobre un 20 material extraído y no devuelto al cuerpo del sujeto. De esta manera, se proporcionan métodos para localizar la presencia de alteraciones genéticas asociadas con la enfermedad de Alzheimer. Estos métodos de diagnóstico pueden usarse para predecir el desarrollo de la enfermedad antes del inicio, para una investigación genética o para detectar una mutación específica en un animal no humano experimental o en una célula.
En un noveno aspecto, la invención proporciona una composición que comprende un polipéptido sin 25 proteínas humanas, que comprende una secuencia de núcleo:
Ile-Ala-Thr-Val-Ile-X-Ile-Thr-Leu- [SEC ID Nº: 6]
donde X es cualquiera de los 20 aminoácidos convencionales excepto valina.
Características preferidas de la invención se describen aquí en las reivindicaciones dependientes.
En un décimo aspecto, la invención proporciona un método para detectar la presencia, en un ácido nucleico 30 u otra muestra extraída de un sujeto, del gen para la enfermedad de Alzheimer de inicio temprano, que comprende identificar una alteración genética en una secuencia génica que codifica APP, donde la alteración genética es una mutación en el codón 717. Tales alteraciones genéticas pueden incluir mutaciones, inserciones o deleciones.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La fig. 1 ilustra un primer árbol genealógico en el que la AD de inicio temprano aparentemente se hereda 35 como un trastorno dominante autosómico. La edad media del inicio en esta familia es de 57  5 años. Los símbolos negros indican individuos afectados y las líneas oblicuas indican individuos que han fallecido. Los pacientes del sexo femenino se indican por círculos y los del sexo masculino por cuadrados. En la presente generación se usan triángulos para mantener el anonimato. En la generación II, los cónyuges de los dos hermanos afectados eran hermanas. Se disponía de muestras de los trece individuos cuyos haplotipos se ilustran, de 19 niños más, de los 40 cónyuges de estos individuos y de 7 individuos no afectados relacionados de manera más distante. Aparte del árbol genealógico se muestran ideogramas de los dos cromosomas 21 en cada individuo de la tercera generación en cuatro loci en el brazo largo del cromosoma. Los datos del árbol genealógico sugieren que los cromosomas negros se heredaban de los padres afectados.
La fig. 2 muestra una autorradiografía de un gel de secuenciación de parte del exón 17 del gen APP en un 45 individuo normal y en un individuo afectado del árbol genealógico de la fig. 1 que muestra un solo cambio de pares de bases en el par de bases 2149 en el individuo afectado. Esta transición de C a T conduce a una substitución de aminoácido de una valina por una isoleucina en el codón 717.
La fig. 3 muestra parte de la secuencia de aminoácidos codificada por los exones 16 y 17 del gen APP que muestra la mutación de valina a isoleucina (V a I) dentro del dominio transmembrana y la mutación que produce 50 HCHWA-D (E a Q) en el dominio extracelular. La región sombreada del dominio transmembrana y los aminoácidos recuadrados del dominio extracelular representan la secuencia del péptido - amiloide depositado. Adaptado de Kang et al., (1987) Nature 325:733.
La fig. 4 muestra productos de digestión de BclI del producto de PCR del exón 17 de individuos no afectados y afectados en la familia con AD de inicio temprano, que muestran la cosegregación del sitio de restricción y la enfermedad.
La fig. 5 muestra el árbol genealógico de la familia F19, junto con datos de D21S210.
La fig. 6 muestra secuencias del exón 17 de APP en un miembro afectado y no afectado de F19. En el 5 miembro afectado, hay una transición GT en la posición 2150.
La fig. 7 muestra la secuencia de APP695.
La fig. 8 muestra la secuencia de APP751.
La fig. 9 muestra la secuencia de APP770.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA REALIZACIÓN PREFERIDA 10
La acumulación de la proteína -amiloide (A4) en regiones cerebrales particulares es una de las características patológicas principales de la enfermedad de Alzheimer. La proteína -amiloide es una proteína de aproximadamente 4 kD (de 39 a 42 aminoácidos) que procede, como producto de escisión interna, de una o más isoformas de una proteína precursora de amiloide (APP) de mayor tamaño. Hay al menos cinco isoformas distintas de APP que contienen 563, 695, 714, 751 y 770 aminoácidos, respectivamente (Wirak et al. (1991) Science 15 253:323). Estas isoformas de APP se generan por ayuste alternativo de transcritos primarios de un solo gen, denominado el gen APP, que se localiza en el cromosoma humano 21. Se sabe que la mayoría de las isoformas de APP son proteínas transmembrana glicosiladas (Goldgaber et al. (1987) Science 235:877) y que cuatro de las isoformas, AA563, APP714, APP751 y APP770, tienen un dominio inhibidor de proteasa que es homólogo al tipo Kunitz de inhibidores de proteasas de serina. El segmento -amiloide (A4) comprende aproximadamente la mitad del 20 dominio transmembrana y aproximadamente los primeros 28 aminoácidos del dominio extracelular de una isoforma de APP.
El procesamiento proteolítico de APP in vivo es un proceso fisiológico normal. En el cerebro y en el líquido cefalorraquídeo (Palmert et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 86:6338; Weidemann et al. (1989) Cell 57:115) están presentes formas truncadas en el extremo carboxi-terminal de APP695, APP751 y APP770 y 25 proceden de la escisión de la isoforma de APP en un sitio de escisión constitutivo dentro del dominio del péptido A4 de una isoforma de APP (Esch et al. (1990) Science 248:1122). La escisión proteolítica normal en el sitio de escisión constitutiva produce un fragmento N-terminal soluble grande (de aproximadamente 100 kD) que contiene el dominio inhibidor de proteasa en algunas isoformas, y un fragmento C-terminal unido de la membrana de 9-10 kD que incluye la mayor parte del dominio A4. 30
La generación de la proteína -amiloide (A4) patogénica parece ser el resultado del procesamiento proteolítico aberrante o alternativo de APP, de tal forma que no se produzca una escisión normal en el sitio constitutivo dentro del dominio A4, sino que más bien la escisión se produzca en dos sitios específicos que flanquean el dominio A4. Uno de estos sitios de escisión aberrantes está en el dominio transmembrana y el otro sitio de escisión aberrante está localizado aproximadamente en el extremo N de los primeros 28 aminoácidos del dominio 35 extracelular (véase la fig. 3). Tal escisión proteolítica aberrante produce el polipéptido -amiloide A4 que es propenso a formar agregados amiloidogénicos densos que son resistentes a la degradación proteolítica y a la eliminación. Los agregados -amiloides resultantes supuestamente están implicados en la formación de las abundantes placas amiloides y amiloides cerebrovasculares que son las marcas neuropatológicas de la enfermedad de Alzheimer. Sin embargo, los sitios de escisión aberrantes exactos no siempre son precisos; las moléculas -40 amiloides aisladas a partir del cerebro de un paciente con AD muestran heterogeneidad N- y C-terminal. Por lo tanto, la ruta de escisión aberrante puede implicar proteolisis específica de secuencia seguida de actividad exopeptidasa (creando heterogeneidad terminal), o la proteolisis puede no tener especificidad de secuencia.
Se sabe que el gen APP está localizado en el cromosoma humano 21. En el cromosoma 21 se ha localizado un locus que se segrega con la enfermedad de Alzheimer familiar (Hyslop et al. (1987) Science 235:885) 45 próximo al gen APP. Previamente se ha informado sobre recombinantes entre el gen APP y el locus AD (Schellenberg et al. (1988) Science 241:1507). Los datos parecían excluir el gen APP como sitio de mutación que podría causar FAD (Van Broekhoven et al. (1987) Nature 329:153; Tanzi et al. (1987) Nature 329:156).
La tecnología de ADN recombinante proporciona varias técnicas para analizar genes para localizar posibles mutaciones. Por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa (Bell (1989) Immunology Today, 10:351) puede 50 usarse para amplificar secuencias específicas usando cebadores intrónicos, que después pueden analizarse por secuenciación directa.
Los investigadores que trabajaban en el área de la hemorragia cerebral hereditaria con amiloidosis de tipo Dutch ("HCHWA-D") (Levy et al. (1990) Science 248:11224) encontraron una substitución de Glu por Gln en el resto 618 (usando el sistema de numeración de APP695) en APP que se considera que ocasiona la deposición de -55
amiloide en los vasos cerebrales de estos pacientes. Los presentes inventores han identificado una substitución de una sola base, una transición de C a T en el par de bases 2149, que se ha encontrado en parte de la secuencia del gen APP en algunos casos de enfermedad de Alzheimer familiar. Esta transición de pares de bases conduce a una substitución de aminoácido, es decir, de valina a isoleucina en el aminoácido 717 (APP770) (véase Yoshikai et al. (1990) Gene 87:257), próxima al extremo C de la proteína -amiloide. Esto sugiere que algunos casos de la 5 enfermedad de Alzheimer se producen por mutaciones en el gen APP, y específicamente mutaciones que cambian el codón 717 de tal forma que codifique un aminoácido distinto de valina.
Además, se ha encontrado una substitución de una sola base adicional, una transición de T a G en el par de bases adyacente 2150, en parte de la secuencia del gen APP en otros casos de enfermedad de Alzheimer familiar. Esta transición de pares de bases conduce a una substitución de aminoácido diferente, particularmente de 10 valina a glicina, en el aminoácido 717, reforzando de esta manera el argumento de que algunos casos de la enfermedad de Alzheimer se producen por mutaciones en el gen APP, específicamente en el codón 717.
Ahora está claro que una mutación en el locus del gen APP que tiene como resultado una substitución de valina por isoleucina en el codón 717 (resto 642 en APP695) produce AD en algunas familias (Goate et al. (1991) Nature 349: 704). Ahora se ha identificado una segunda variante alélica de APP donde la valina se substituye por 15 glicina en el codón 717, y está tan asociada al fenotipo AD que indica que las variantes alélicas en el codón 717 del gen APP, particularmente las que codifican un aminoácido distinto de valina, y más particularmente las que codifican una isoleucina, glicina o fenilalanina, son alelos patogénicos y/o patognomónicos (Chartier-Harlin et al. (1991) Nature 353:844).
La proteolisis en cualquier lado de la región -amiloide (A4) de APP puede mejorarse o alterarse 20 cualitativamente por las mutaciones específicas en el codón 717, aumentando la velocidad de deposición y agregación de -amiloide. Tales mutaciones del codón 717 pueden aumentar la formación de -amiloide proporcionando un substrato peor para la ruta proteolítica principal (escisión en el sitio constitutivo) o un substrato mejor para una ruta de escisión alternativa competitiva (en sitios de escisión aberrantes).
DEFINICIONES 25
A lo largo de esta memoria descriptiva se usan varios términos y expresiones, y para facilitar su comprensión, se proporcionan las siguientes definiciones:
Como se usa en este documento, "exón" se refiere a cualquier segmento de un gen interrumpido que se representa en el producto de ARN maduro.
Como se usa en este documento, "intrón" se refiere a un segmento de un gen interrumpido que no se 30 representa en el producto de ARN maduro. Los intrones forman parte del transcrito nuclear primario, pero se unen para producir ARNm, que después se transporta al citoplasma.
Como se usa en este documento, la frase "secuencia génica que codifica el precursor de la proteína amiloide" puede interpretarse como la secuencia de ADN y ADNc detallada por Yoshikai et al. (1990) Gene 87:257 y Kang et al, loc. cit., junto con la secuencia de ADN del promotor descrito por Salbaum et al. (1988) EMBO 7(9):2807. 35
Como se usa en este documento, los términos "marcador" o "marcado" se refieren a la incorporación de un marcador detectable (por ejemplo, por la incorporación de un nucleótido radiomarcado o por marcaje terminal con un fosfato radiomarcado terminal). El ADN o el ARN típicamente se marcan por la incorporación de un nucleótido radiomarcado (H3, C14, S35, P32) o un nucleótido biotinilado que puede detectarse por avidina marcada (por ejemplo, avidina que contiene un marcador fluorescente o actividad enzimática) o un nucleótido digoxigeninilado que puede 40 detectarse por un anticuerpo específico marcado.
Como se usan en este documento, "isoforma", "APP" e "isoforma de APP" se refieren a un polipéptido que se codifica por al menos un exón del gen APP (Kitaguchi et al, (1998) Nature 331:530; Ponte et al., ibid, p.525; R.E. Tanzi, ibid, p.528; de Sauvage and Octave (1989) Science 245:651; Golde et al. (1990) Neuron 4:253). Una isoforma de APP puede codificarse por un alelo de APP (o un exón del mismo) que está asociado con una forma de 45 enfermedad de Alzheimer o que no está asociado con un fenotipo de enfermedad AD.
La expresión "gen β-amiloide" se usa en este documento como sinónimo de gen APP, ya que el β-amiloide es un producto proteico producido por una escisión post-traduccional de un producto génico de APP.
Como se usa en este documento, "fragmento" se refiere a un polipéptido de al menos aproximadamente 9 aminoácidos, típicamente de 50 a 75, o más, donde el polipéptido contiene una secuencia nuclear de aminoácidos 50 (indicada en orden en la dirección desde el extremo amino al extremo carboxi):
-Ile-Ala-Thr-Val-Ile-X-IleThr-Leu- [SEC ID Nº: 6]
donde X es cualquiera de los 20 aminoácidos convencionales excepto valina y particularmente donde X es isoleucina, glicina o fenilalanina. Un fragmento puede ser una isoforma de APP truncada, una isoforma de APP
modificada (tal como por substituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos fuera de la secuencia de núcleo) u otra secuencia polipeptídica variante, pero no es una isoforma de APP natural o un polipéptido -amiloide que esté presente en un individuo humano, afectado o no por AD. Si se desea, el fragmento puede fusionarse en cualquier extremo a aminoácidos adicionales, que pueden ser de 1 a 20, típicamente de 50 a 100, pero también hasta 250 a 500 o más. 5
Como se usa en este documento, "APP751" y "APP770" se refieren, respectivamente, a los polipéptidos con 751 y 770 restos aminoacídicos de longitud codificados por el gen APP humano (Ponte et al, loc. cit.; Kitaguchi et al. loc cit.; Tanzi et al. loc. cit).
Como se usa en este documento "codón 717" se refiere al codón (es decir, la secuencia trinucleotídica) que codifica la 717 posición de aminoácidos en APP770, o la posición de aminoácidos en un isoforma o fragmento de 10 APP que corresponde a la 717ª posición en APP770. Por ejemplo, pero sin limitación, un fragmento de 670 restos de longitud que se produce truncando APP770 retirando los 100 aminoácidos N-terminales, tiene su 617ª posición de aminoácidos correspondiente al codón 717. De hecho, como se usa en este documento, codón 717 se refiere al codón que codifica el 698º resto aminoacídico de APP751 [SEC ID Nº: 2] y el 642º resto aminoacídico de APP695 [SEQ ID Nº: 1]. 15
Como se usa en este documento, "isoforma o fragmento de APP humana" se refiere a una isoforma o fragmento de APP que contiene una secuencia de al menos 9 aminoácidos consecutivos que es idéntica a una secuencia en una proteína APP770, APP751 o APP695 humana que existe de forma natural en un individuo humano, y donde en una proteína APP que existe de manera natural en una especie no humana no está presente una secuencia idéntica. 20
Un ácido nucleico está "unido operativamente" cuando se pone en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor o potenciador está unido operativamente a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia. Con respecto a secuencias reguladoras de la transcripción, unido operativamente significa que las secuencias de ADN que se unen son contiguas y, cuando sea necesario unir dos regiones codificantes de proteínas, contiguas y en fase de lectura. 25
La expresión "corresponde a" se usa en este documento para significar que una secuencia es homóloga (es decir, es idéntica, no relacionada evolutivamente de manera estricta) con todo o una porción de una secuencia de referencia. Por el contrario, la expresión "complementario a" se usa en este documento para hacer referencia a que la secuencia complementaria es homóloga a todo o a una porción de una secuencia de referencia. Con fines ilustrativos, la secuencia de nucleótidos "TATAC" corresponde a una secuencia de referencia "TATAC" y es 30 complementaria a una secuencia de referencia "GTATA".
La expresión "mejora de la transcripción" se usa en ese documento para hacer referencia a la propiedad funcional de producir un aumento en la velocidad de transcripción de secuencias unidas que contienen un promotor funcional.
El término "agente" se usa en este documento para indicar un compuesto químico, una mezcla de 35 compuestos químicos, una macromolécula biológica o un extracto hecho de materiales biológicos tales como bacterias, plantas, hongos o células o tejidos animales (particularmente de mamífero). Los agentes se evalúan con respecto a la actividad biológica potencial por inclusión en ensayos de selección descritos mas adelante.
Como se usa en este documento, el término "mutante" se refiere a alelos de APP que tienen mutaciones de sentido erróneo que son patognomónicas para una predisposición genética para el desarrollo de AD; 40 específicamente, una mutación en el codón 717 (como se indica por la secuencia de aminoácidos en APP770) del gen APP, de tal forma que el codón 717 codifique uno de los 19 aminoácidos que no son valina (es decir, glicina, metionina, alanina, serina, isoleucina, leucina, treonina, prolina, histidina, cisteína, tirosina, fenilalanina, ácido glutámico, triptófano, arginina, ácido aspártico, asparagina, lisina y glutamina), pero preferiblemente isoleucina, glicina o fenilalanina. De esta manera, un polipéptido APP770 mutante es un polipéptido APP770 que tiene un resto 45 aminoacídico en la posición 717 que no es valina. Otras isoformas de APP mutante comprenden un aminoácido que no es valina en la posición del resto aminoacídico que corresponde al codón 717 (es decir, que se codifica por el codón 717). De manera similar, un alelo de APP mutante o un alelo del codón 717 de APP variante es un alelo de APP que codifica un aminoácido distinto de valina en el codón 717 (con referencia a la traducción deducida de APP770 humana como se describe en la definición del "codón 717", supra), preferiblemente, isoleucina, glicina o 50 fenilalanina. Por lo tanto, un alelo de APP que codifica valina en el codón 717 es un alelo de APP de "tipo silvestre".
Será evidente para un especialista en la técnica que en los polinucleótidos de la invención pueden incorporarse substituciones, deleciones y adiciones de nucleótidos. Sin embargo, tales substituciones, deleciones y adiciones de nucleótidos no deben alterar substancialmente la capacidad del polinucleótido de hibridar con una de las secuencias polinucleotídicas mostradas en las figs. 5 y 6 en condiciones de hibridación que sean suficientemente 55 rigurosas como para producir una hibridación específica.
"Hibridación específica" se define en este documento como la formación de híbridos entre un polinucleótido sonda (por ejemplo, un polinucleótido de la invención que puede incluir substituciones, deleciones y/o adiciones) y
un polinucleótido diana específico (por ejemplo, un polinucleótido que tiene la secuencia), donde la sonda preferentemente hibrida con la diana específica de forma que, por ejemplo, pueda identificarse un banda correspondiente a un alelo de APP variante o un fragmento de restricción del mismo, en una transferencia de Southern, mientras que no se identifica un alelo de APP del tipo silvestre correspondiente (es decir, uno que codifica valina en el codón 717) o puede distinguirse de un alelo de APP variante basándose en la intensidad de la señal. 5 Pueden diseñarse sondas de hibridación capaces de hibridar de manera específica para detectar un desacoplamiento de una sola base de acuerdo con métodos conocidos en la técnica y descritos en Maniatis et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., (1989), Cold Spring Harbor, N.Y. y Berger and Kimmel, Methods in Enzymology, Volume 152, Guide to Molecular Cloning Techniques (1987), Academic Press, Inc., San Diego, CA; Gibbs et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:2437; Kwok et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18:999; Miyada et al. (1987) 10 Methods Enzymol. 154:94. En condiciones convencionales (NaCl 1 M), se calcula que la Tm para los oligonucleótidos es [4ºC x (G+C) + 2ºC x (A+T)]. Aunque las condiciones de PCR difieren de las condiciones convencionales, esta Tm se usa como guía para las estabilidades relativas esperadas de los oligonucleótidos. Los cebadores específicos de alelo son típicamente de 13-15 nucleótidos de longitud, algunas veces de 16-21 nucleótidos de longitud o más; cuando se usan cebadores cortos, tales como un cebador de 14 nucleótidos de longitud, se usan temperaturas de 15 templado bajas, típicamente de 44 a 50ºC, ocasionalmente algo mayores o menores dependiendo de la composición básica de la secuencia o secuencias.
DESCRIPCIÓN DE LAS REALIZACIONES PREFERIDAS
Detección de Alelos de APP Mutante en el Codón 717
En una realización de la invención, el método implica identificar una alteración genética en el aminoácido 20 717, que puede hacer que la Val consenso se cambie, por ejemplo, por otro resto hidrófobo. Esto se realizará en una muestra extraída del sujeto. Los restos hidrófobos incluyen Leu, Ala, Ile y Gly, teniendo los tres primeros cadenas laterales alifáticas. Phe también tiene un resto hidrófobo que puede ser apropiado. Como se ha indicado anteriormente, los restos preferidos incluyen Ile, Gly y Phe (Murrell et al, (1991) Science 254:97).
El hecho de que estas mutaciones descritas anteriormente estén en el mismo codón puede ser una 25 coincidencia, pero parece poco probable en una base estadística. Hay dos posibilidades que pueden explicar estos datos. En primer lugar, la substitución del resto de valina en el codón 717 puede producir una mayor deposición de beta-amiloide debido a cambios en el metabolismo de APP. En segundo lugar, la variación en la secuencia alrededor de esta posición puede producir una mayor traducción de ARNm de APP y de esta forma producir AD por una ruta análoga a la ruta por la que se cree que se produce la AD en el síndrome de Down (Tanzi y Hyman (1991) Nature 30 350:564 y Rumble et al. (1989) N. Egl. J. Med. 320:1446). Ciertos estudios de hibridación in situ han demostrado que las mutaciones de APP717 no alteran la expresión de APP (Harrison et al. (1991) Neurorep. 2:152).
Las mutaciones V717I (APP 717 ValIle), V717G (APP 717 ValGly) y V717F (APP 717 ValPhe) desestabilizarían una supuesta estructura de tallo-bucle y destruirían un posible elemento de respuesta al hierro entre los pares de bases 2131 y 2156 (Tanzi y Hyman, loc. cit). Hay otras posibles mutaciones que también podrían 35 romper esta estructura, siendo muchas de ellas silenciosas a nivel de la proteína; aunque estas mutaciones indicadas específicamente han implicado un cambio en el mismo aminoácido, y no se han presentado cambios silenciosos o cambios en otros aminoácidos antes del trabajo descrito en este documento. El examen de los datos de secuencia de otras 10 especies de mamífero (Johnstone et al, (1991) Mol. Brain Res. 10:299) demuestra que aunque en todas ellas se conserva el resto de valina en el codón 717, no se prevería la existencia de la supuesta 40 estructura de tallo-bucle postulada a partir de la secuencia humana (Tanzi y Hyman loc. cit.) en vacas u ovejas; y en cerdos y ratones no está presente la secuencia consenso para los elementos que responden al hierro. Finalmente, se cree que tales estructuras de bucle-lazo modulan la traducción de genes alterando la estabilidad del ARNm (Klausner y Harford (1989) Science 246:870); sin embargo, Harrison y colaboradores (Harrison et al. loc. cit) han demostrado por hibridación in situ que los ARNm de APP no se alteran en gran medida en el cerebro de un individuo 45 con la mutación V717I. Por estas razones, se cree que probablemente las alteraciones en la velocidad de traducción de APP producidas por las mutaciones específicas identificadas no son la clave de su patogenicidad.
El hecho de que las mutaciones específicas descritas impliquen diferentes cambios (ValIle, ValGly y ValPhe) sugiere que ni la hidrofobia de la cadena lateral ni el volumen de la cadena lateral es el punto crucial. Todos los ejemplos de alelos de APP que codifican un aminoácido distinto de valina en el codón 717 se cosegregan 50 con FAD; lo que sugiere que la valina que existe en la posición 717 en APP770 de tipo silvestre o APP751 es un resto aminoacídico crítico para el procesamiento proteolítico de APP no patogénico (es decir, por la ruta de escisión constitutiva.
La ruta metabólica principal para la molécula de APP implica escisión dentro del fragmento beta-amiloide (Esch et al. loc. cit.). Para generar beta-amiloide, debe haber una segunda ruta en la que la APP se escinde fuera de 55 esta secuencia. Tal escisión probablemente dejaría un resto de la molécula de APP que contiene el fragmento beta-amiloide incluido en la membrana. Posiblemente, el fragmento que contiene el beta-amiloide que se genera por la segunda ruta se degrada por la acción de la peptidasa; las mutaciones indicadas pueden ser patogénicas porque los péptidos que las contienen pueden ser más resistentes a las acciones de esta peptidasa. Por lo tanto, las alteraciones genéticas en el gen APP que producen propiedades de degradación alteradas (generalmente 60
reducidas) son particularmente importantes en la aplicación de la invención. Hay varias metodologías disponibles de la tecnología de ADN recombinante que pueden usarse para detectar e identificar una mutación genética responsable de la enfermedad de Alzheimer. Éstas incluyen sondeo directo, metodología de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), análisis de polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) y análisis conformacional de una sola cadena (SSCA). 5
La detección de mutaciones puntuales usando sondeo directo implica el uso de sondas oligonucleotídicas que pueden prepararse sintéticamente o por desplazamiento de mella (nick translation). Las sondas de ADN pueden marcarse de manera adecuada usando, por ejemplo, un radiomarcador, un marcador enzimático, un marcador fluorescente, un marcador de biotina-avidina y similares para una visualización posterior, por ejemplo, en un procedimiento de hibridación de transferencia de Southern. La sonda marcada se hace reaccionar con el ADN de la 10 muestra unido a un substrato de nitrocelulosa o de Nylon 66. Las áreas que llevan secuencias de ADN complementarias a la sonda de ADN marcada se marcan por sí mismas como consecuencia de la reacción de rehibridación. Las áreas del filtro que presentan tal marcaje después pueden visualizarse, por ejemplo, por autorradiografía.
La técnicas de sondeo alternativas, tales como la reacción en cadena de la ligasa (LCR) implican el uso de 15 sondas de desacoplamiento, es decir, sondas que tienen una complementariedad completa con la diana excepto en el punto de la mutación. La secuencia diana después se deja hibridar tanto con oligonucleótidos que tienen complementariedad completa como con oligonucleótidos que contienen un desacoplamiento, en condiciones que distingan entre los dos. Manipulando las condiciones de reacción es posible obtener hibridación sólo cuando hay una complementariedad completa. Si está presente un desacoplamiento, entonces la hibridación se reduce 20 significativamente.
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica que amplifica secuencias de ADN específicas con una eficacia notable. Los ciclos repetidos de desnaturalización, templado con cebadores y extensión realizados con un enzima Taq polimerasa estable térmicamente produce aumentos exponenciales en la concentración de secuencias de ADN deseadas. 25
Como se conoce la secuencia de nucleótidos que codifica el precursor de la proteína amiloide de AD (Kang et al. loc. cit., y Yoshikai, anteriormente), es posible preparar oligonucleótidos sintéticos complementarios a secuencias que flanquean el ADN de interés. Cada oligonucleótido es complementario a una de las dos cadenas. El ADN después se desnaturaliza a altas temperaturas (por ejemplo, a 95ºC) y después se rehibrida en presencia de un gran exceso molar de oligonucleótidos. Los oligonucleótidos, orientados con sus extremos 3' dirigidos entre sí, 30 hibridan con cadenas opuestas de la secuencia diana y ceban una extensión enzimática a lo largo de la plantilla de ácido nucleico en presencia de los cuatro desoxirribonucleótido trifosfato. El producto terminal después se desnaturaliza de nuevo para otro ciclo. Después de haber repetido este ciclo de 3 etapas varias veces, puede conseguirse la amplificación de un segmento de ADN en más de un millón de veces. El ADN resultante después puede secuenciarse directamente para localizar cualquier alteración genética. Como alternativa, es posible preparar 35 oligonucleótidos que sólo se unan al ADN alterado, de forma que la PCR sólo produzca la multiplicación del ADN si está presente la mutación. Después de la PCR, puede usarse una hibridación de oligonucleótidos específica de alelo (Dihella et al. (1988) Lancet 1:497) para detectar la mutación puntual de AD. Como alternativa, puede emplearse una adaptación de la amplificación denominada por PCR de alelos específicos (PASA); esto usa una amplificación diferencial para una distinción rápida y fiable entre alelos que difieren en un solo par de bases. 40
En aún otro método, la PCR puede continuarse por digestión con endonucleasas de restricción con un análisis posterior de los productos resultantes. La substitución de C por T en el par de bases 2149, encontrada como resultado de la secuenciación del exón 17, crea un sitio de restricción BclI. La creación de este sitio de reconocimiento por endonucleasas de restricción facilita la detección de la mutación de AD usando análisis de RFLP o por detección de la presencia o ausencia de un sitio BclI polimórfico en un producto de PCR que incluye el codón 45 717.
Para el análisis de RFLP, se obtiene ADN, por ejemplo, a partir de la sangre del sujeto que se sospecha que tiene AD y a partir de un sujeto normal, se digiere con la endonucleasa de restricción BclI y posteriormente se separa basándose en el tamaño usando electroforesis en gel de agarosa. Después puede usarse la técnica de transferencia de Southern para detectar, por hibridación con sondas marcadas, los productos de digestión por 50 endonucleasas. Después pueden compararse los patrones obtenidos a partir de la transferencia de Southern. Usando tal estrategia, se detecta el ADN que incluye una mutación de Alzheimer que crea o elimina un sitio de restricción en el codón 717, tal como el sitio BclI, determinando el número de bandas detectadas y comparando este número con un alelo de referencia que tiene un alelo del codón 717 que codifica valina.
De forma correspondiente, la substitución de T por G en el par de bases 2150 crea un sitio de restricción 55 SfaNI (GCATC), que puede explotarse de una manera similar a la descrita anteriormente, mutatis mutandis. La creación similar de sitios de restricción adicionales por substituciones de nucleótidos dentro del codón 717, donde el codón 717 codifica un aminoácido distinto de valina, puede calcularse fácilmente haciendo referencia al código genético y una lista de secuencias de nucleótidos reconocidas por endonucleasas de restricción (Promega Protocols and Applications Guide, (1991) Promega Corporation, Madison, Wisconsin). 60
El análisis conformacional de una sola cadena (SSCA) (Orita et al. (1989) Genomics 5:874 y Orita et al. (1990) Genomics 6:271) ofrece un método relativamente rápido para detectar cambios de secuencia que pueden ser apropiados al menos en algunos casos.
La amplificación por PCR de alelos específicos (PASA) es un método rápido para detectar mutaciones de una sola base o polimorfismos (Newton et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:2503; Nichols et al. (1989) Genomics 5 5:535; Okayama et al. (1989) J. Lab. Clin. Med. 114:105; Sarkar et al. (1990) Anal. Biochem. 186:64; Sommer et al. (1989) Mayo Clin. Proc. 64:1361; Wu (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:2757; y Dutton et al. (1991) Biotechniques 11:700). PASA (también conocido como amplificación específica de alelo) implica la amplificación con dos cebadores oligonucleotídicos de tal forma que uno sea específico de alelo. El alelo deseado se amplifica eficazmente, mientras que el otro alelo o alelos se amplifican de forma deficiente porque no se acopla con una base 10 en o cerca del extremo 3' del cebador específico de alelo. De esta manera, puede usarse PASA o el método relacionado de PAMSA para amplificar específicamente uno o más alelos del codón 717 de APP variante. Cuando tal amplificación se realiza en el material genético (o ARN) obtenido a partir de un individuo, puede servir como un método para detectar la presencia de uno o mas alelos del codón 717 de APP variante en un individuo.
De manera similar, se ha usado un método conocido como reacción en cadena de la ligasa (LCR) para 15 detectar satisfactoriamente una substitución de una sola base en un alelo de hemoglobina que produce anemia de células falciformes (Barany et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:189; Weiss (1991) Science 254:1292). Las sondas de LCR pueden combinarse o formar múltiplex para la selección simultánea de múltiples mutaciones diferentes. De esta manera, un método para seleccionar alelos del codón 717 de APP variante es formar múltiplex de al menos dos, y preferiblemente todas, las sondas de LCR que detectarán un alelo de APP que tiene un codón 20 717 que no codifica valina, pero que codifica un aminoácido. El código genético universal proporciona las secuencias degeneradas de todos los aminoácidos que no son valina codificados, de forma que el diseño de la sonda de LCR para detectar cualquier alelo del codón 717 de una variante particular sea sencillo, y se pueden seleccionar grupos de múltiplex de tales sondas de LCR a la discreción del especialista para su uso deseado particular.
Cuando se realizan diagnósticos usando cualquiera de las técnicas anteriores o variaciones de las mismas, 25 es preferible examinar varios individuos. Estos pueden incluir un progenitor no afectado, un progenitor afectado, un hermano afectado, un hermano no afectado así como quizás otros miembros de la familia más lejanos.
Animales y Líneas Celulares Modelo
Habiendo identificado las mutaciones específicas en el codón 717 del gen β-amiloide como causa de la enfermedad de Alzheimer familiar (FAD), es posible, usando manipulación genética, desarrollar sistemas modelo 30 transgénicos y/o sistemas de células enteras que contengan el gen FAD mutado (o una porción del mismo) para uso, por ejemplo, como sistemas modelo para seleccionar fármacos y evaluar la eficacia de los fármacos. Además, tales sistemas modelo proporcionan una herramienta para definir la bioquímica subyacente de APP y el metabolismo β-amiloide, que de esta manera proporciona una base para un diseño racional de fármacos.
Un tipo de sistema celular puede tener origen natural. Para esto, deben obtenerse muestras de sangre del 35 sujeto afectado para proporcionar las células necesarias que pueden transformarse permanentemente en una línea celular linfoblastoide usando, por ejemplo, virus de Epstein-Barr.
Una vez establecidas, tales líneas celulares pueden cultivarse de manera continua en cultivos en suspensión y pueden usarse para una diversidad de experimentos in vitro para estudiar la expresión y el procesamiento de APP. 40
Como la mutación FAD es dominante, un método alternativo para construir una línea celular es obtener por ingeniería genética un gen mutado, o una porción del mismo que incluye el codón 717, en una línea celular establecida (de manera estable o transitoria) elegida. Sisodia (1990) (Science 248:492) ha descrito la inserción de un gen APP normal, por transfección, en células de mamífero. Oltersdorf et al. ((1990) J. Biol. Chem. 265:4492) describen la inserción de APP en líneas de células eucariotas inmortalizadas. 45
Los sistemas de expresión de baculovirus son útiles para la expresión de alto nivel de genes heterólogos en células eucariotas. Knops et al. (1991) J. Biol. Chem. 266(11):7285 describen la expresión de APP usando tal sistema.
En otro uso del presente método, es posible escindir el gen mutado (es decir, un gen del codón 717 de APP variante) para uso en la creación de animales transgénicos que contengan el gen mutado. Por ejemplo, puede 50 clonarse un alelo 717 del codón APP de la variante humana entera y aislarse, en partes o en su totalidad, en un vector de clonación (por ejemplo, λCharon35, cósmido o cromosoma artificial de levadura). El gen del codón 717 de la APP variante humana, en partes o en su totalidad, puede trasferirse a un animal hospedador no humano, tal como un ratón. Como resultado de la transferencia, el animal no humano transgénico resultante preferiblemente expresará uno o más polipéptidos del codón 717 de APP variante. Más preferiblemente, un animal no humano transgénico de 55 la invención expresará uno o más polipéptidos del codón 717 de APP variante de una manera específica de neuronas (Wirak et al (1991) EMBO 10:289). Esto puede conseguirse trasfiriendo substancialmente el gen APP humano entero (que codifica un mutante del codón 717) que incluye la secuencia de 4,5 kilobases que está
adyacente y cadena arriba del primer sitio de inicio de la transcripción principal de APP.
Como alternativa, se pueden diseñar minigenes que codifiquen polipéptidos del codón 717 de APP variante. Tales minigenes pueden contener una secuencia de ADNc que codifica un polipéptido del codón 717 de APP variante, preferiblemente de longitud completa, una combinación de exones del gen de APP, o una combinación de los mismos, unida a una secuencia señal de poliadenilación cadena abajo y un promotor cadena arriba (y 5 preferiblemente un potenciador). Tal construcción de minigenes, cuando se introduzca en un hospedador transgénico apropiado (por ejemplo un ratón o rata), expresará un polipéptido del codón 717 de APP variante codificado, mas preferiblemente un polipéptido del codón 717 de APP variante que contiene un resto de isoleucina, glicina o fenilalanina en el codón 717 de APP770 o la posición correspondiente en una isoforma o fragmento de APP. 10
Una estrategia para crear animales transgénicos es dirigir una mutación al gen deseado por recombinación homóloga en una línea de células madre embrionarias (ES) in vitro seguido de microinyección de la línea celular ES modificada en un blastocisto del hospedador y la posterior incubación en una madre de acogida (véase Frohman y Martin (1989) Cell 56:145). Como alternativa, puede usarse la técnica de microinyección del gen mutado, o una porción del mismo, en un embrión de una célula seguido de incubación en una madre de acogida. En Wirak et al. 15 (1991) EMBO, 10(2):289; Schilling et al. (1991) Gene 98(2):225; Quon et al. (1991) Nature 352:239; Wirak et al. (1991) Science 253:323; y Kawabata et al. (1991) Nature 354:476 se describen diversos usos de animales transgénicos, particularmente animales transgénicos que expresan una isoforma o fragmento de APP de tipo silvestre. En la técnica se conocen otros métodos para producir animales transgénicos.
Como alternativa, puede usarse mutagénesis de localización dirigida y/o conversión génica para mutar un 20 alelo de un gen APP murino (o de otro animal no humano), endógeno o transfectado, de tal forma que el alelo mutado no codifique valina en la posición del codón en el gen APP de ratón que corresponde al codón 717 (de APP770) del gen APP humano (tal posición se identifica fácilmente por acoplamiento de homología del gen APP murino o la proteína APP al gen APP o la proteína APP770 humana). Preferiblemente, tal alelo murino mutado codificaría isoleucina o glicina o fenilalanina en la posición del codón correspondiente. 25
Agentes Terapéuticos
Habiendo detectado la mutación genética en la secuencia génica que codifica la proteína β-amiloide en un individuo que aún no presenta signos evidentes de AD familiar, usando el método de la presente invención, es posible emplear terapia génica, en forma de implantes génicos, para prevenir el desarrollo de la enfermedad.
Otras realizaciones dirigidas al la modulación de la producción de proteínas APP variantes incluyen 30 métodos que emplean polinucleótidos antisentido específicos complementarios a todo o parte de una secuencia de APP variante, o para algunas realizaciones una secuencia de APP de tipo silvestre. Tales polinucleótidos antisentido de complementariedad pueden incluir substituciones, adiciones, deleciones o transposiciones de nucleótidos, siempre que se mantenga la hibridación específica con la secuencia diana relevante, es decir, una secuencia del codón 717 de la APP variante, como una propiedad del polinucleótido. De esta manera, un polinucleótido antisentido 35 preferiblemente debe unirse a una secuencia de APP variante (es decir, el codón 717 no codifica valina) en comparación con una APP de tipo silvestre (es decir, el codón 717 codifica valina). Es evidente que el polinucleótido antisentido debe reflejar la secuencia de nucleótidos exacta del alelo variante (o el alelo de tipo silvestre cuando se desee) y no una secuencia degenerada.
Los polinucleótidos antisentido complementarios incluyen oligonucleótidos de ARN o ADN antisentido 40 solubles que pueden hibridar específicamente con una especie de ARNm de APP variante e impedir la transcripción de la especie de ARNm y/o la traducción del polipéptido codificado (Ching et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:10006; Broder et al. (1990) Ann. Int. Med. 113:604; Loreau et al. (1990) FEBS Letters 274:53-56); Holcenberg et al., documento WO91/11535; documento U.S. Nº 7.530.165 ("New human CRIPTO gene" - disponible para el público a través de Derwent Publications Ltd., Rochdale House, 128 Theobalds Road, Londres, Reino Unido); documentos 45 WO91/09865; WO91/04753; WO90/13641; y EP 386563. Por lo tanto, los polinucleótidos antisentido inhiben la producción de los polipéptidos de APP variante. Los polinucleótidos antisentido preferiblemente pueden inhibir la transcripción y/o la traducción de un ARNm correspondiente a un polipéptido variante (o de tipo silvestre) puede inhibir la activación de linfocitos T.
Pueden producirse polinucleótidos antisentido a partir de un cassette de expresión heterólogo en una célula 50 transfectante o célula o animal transgénico, tal como una célula neural, glial o astrocítica transgénica, preferiblemente cuando el cassette de expresión contiene una secuencia que promueve la expresión específica del tipo celular (Wirak et al. loc. cit.). Como alternativa, los polinucleótidos antisentido pueden comprender oligonucleótidos solubles que se administran al medio externo, en el medio de cultivo in vitro o en el sistema circulatorio o fluido intersticial in vivo. Se ha demostrado que los polinucleótidos antisentido solubles presentes en el 55 medio externo consiguen entrar en el citoplasma e inhiben la traducción de especies de ARNm específicas. En algunas realizaciones, los polinucleótidos antisentido comprenden restos de metilfosfonato. En relación con métodos generales relacionados con polinucleótidos antisentido, véase Antisense RNA and DNA, (1988), D.A. Melton, Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
Antígenos de APP Mutante y Anticuerpos Monoclonales
En aún otro aspecto de la invención, habiendo detectado una alteración genética en una secuencia génica que codifica APP, es posible obtener muestras de la proteína β-amiloide alterada a partir de la misma fuente. Esta proteína puede proceder del tejido cerebral del un sujeto al que se le ha diagnosticado enfermedad de Alzheimer o, mas preferiblemente, se produce por métodos de ADN recombinante o se sintetiza por síntesis química directa en un soporte sólido. Tales polipéptidos contendrán una secuencia de aminoácidos de un alelo variante de APP que 5 incluye el codón 717. Son ejemplos de tales secuencias:
(a) -Ile-Ala-Thr-Val-Ile-Gly-Ile-Thr-Leu- [SEC ID Nº: 7]
(b) -Ile-Ala-Thr-Val-Ile-Met-Ile-Thr-Leu- [SEC ID Nº: 8]
(c) -Ile-Ala-Thr-Val-Ile-Ala-Ile-Thr-Leu- [SEC ID Nº: 9]
(d) -Ile-Ala-Thr-Val-Ile-Ser-Ile-Thr-Leu- [SEC ID Nº: 10] 10
(e) -Ile-Ala-Thr-Val-Ile-Ile-Ile-Thr-Leu- [SEC ID Nº: 11]
(f) -Ile-Ala-Thr-Val-Ile-Leu-Ile-Thr-Leu- [SEC ID Nº: 12]
(g) -Ile-Ala-Thr-Val-Ile-Thr-Ile-Thr-Leu- [SEC ID Nº: 13]
(h) -Ile-Ala-Thr-Val-Ile-Pro-Ile-Thr-Leu- [SEC ID Nº: 14]
(i) -Ile-Ala-Thr-Val-Ile-His-Ile-Thr-Leu- [SEC ID Nº: 15] 15
(j) -Ile-Ala-Thr-Val-Ile-Cys-Ile-Thr-Leu- [SEC ID Nº: 16]
(k) -Ile-Ala-Thr-Val-Ile-Tyr-Ile-Thr-Leu- [SEC ID Nº: 17]
(l) -Ile-Ala-Thr-Val-Ile-Phe-Ile-Thr-Leu- [SEC ID Nº: 18]
(m) -Ile-Ala-Thr-Val-Ile-Glu-Ile-Thr-Leu- [SEC ID Nº: 19]
(n) -Ile-Ala-Thr-Val-Ile-Trp-Ile-Thr-Leu- [SEC ID Nº: 20] 20
(o) -Ile-Ala-Thr-Val-Ile-Arg-Ile-Thr-Leu- [SEC ID Nº: 21]
(p) -Ile-Ala-Thr-Val-Ile-Asp-Ile-Thr-Leu- [SEC ID Nº: 22]
(q) -Ile-Ala-Thr-Val-Ile-Asn-Ile-Thr-Leu- [SEC ID Nº: 23]
(r) -Ile-Ala-Thr-Val-Ile-Lys-Ile-Thr-Leu- [SEC ID Nº: 24]
(s) -Ile-Ala-Thr-Val-Ile-Gln-Ile-Thr-Leu- [SEC ID Nº: 25] 25
Usando tal material polipeptídico, es posible preparar antisueros y anticuerpos monoclonales usando, por ejemplo, el método de Kohler y Milstein ((1975) Nature 256:495). Después, tales anticuerpos monoclonales pueden constituir la base de un ensayo de diagnóstico.
Tales polipéptidos de APP variante pueden usarse para inmunizar a un animal para la producción de anticuerpos específicos. Estos anticuerpos pueden comprender un antisuero policlonal o pueden comprenden un 30 anticuerpo monoclonal producido por células de hibridoma. Como métodos generales para preparar anticuerpos, véase Antibodies: A Laboratory Manual, (1988) E. Harlow y D. Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.
Por ejemplo, pero sin limitación, un fragmento producido de forma recombinante de un polipéptido del codón 717 de APP variante puede inyectarse en un ratón junto con un adyuvante para generar una respuesta 35 inmune. Pueden recogerse inmunoglobulinas murinas que se unen al fragmento recombinante con una afinidad de unión de al menos 1 X 107 M-1 a partir del ratón inmunizado como antisuero y pueden purificarse adicionalmente por cromatografía de afinidad u otros medios. Además, se recogen células de bazo del ratón y se fusionan con células de mieloma para producir un banco de células de hibridoma secretoras de anticuerpo. En el banco de hibridomas pueden seleccionarse clones que se secreten inmunoglobulinas que se unan al fragmento producido de forma 40 recombinante con una afinidad de al menos 1 x 106 M-1. Más específicamente, se seleccionan inmunoglobulinas que se unen al polipéptido del codón 717 de APP variante pero que tienen una reactividad cruzada limitada con un polipéptido APP de tipo silvestre (es decir, el codón 717 codifica valina), por preabsorción con APP de tipo silvestre o por selección en líneas de células de hibridoma idiotipos específicos que preferentemente se unen a la variante en comparación con el tipo silvestre. 45
Las secuencias de ácido nucleico de la presente invención capaces de expresar finalmente los polipéptidos de APP variante deseados pueden formarse a partir de una diversidad de polinucleótidos diferentes (ADN genómico o ADNc, ARN, oligonucleótidos sintéticos etc.), así como por una diversidad de técnicas diferentes.
Como se ha indicado previamente, las secuencias de ADN se expresarán en hospedadores después de que las secuencias se hayan unido operativamente a (es decir, colocado par asegurar el funcionamiento de) una 5 secuencia de control de la expresión. Estos vectores de expresión típicamente se pueden replicar en los organismos hospedadotes como episomas o como una parte integral del ADN cromosómico del hospedador. Comúnmente, los vectores de expresión contendrán marcadores de selección, por ejemplo, resistencia a tetraciclina o resistencia a higromicina, para permitir la detección y/o selección de las células transformadas con las secuencias de ADN deseadas (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos 4.704.362). 10
Los polinucleótidos que codifican un polipéptido del codón 717 de la APP variante pueden incluir secuencias que faciliten la transcripción (secuencias de expresión) y la traducción de las secuencias codificantes, de tal forma que se produzca el producto polipeptídico codificado. La construcción de tales polinucleótidos es bien conocida en la técnica y se describe adicionalmente en Maniatis et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Ed. (1989), Cold Spring Harbor, N,Y. Por ejemplo, pero sin limitación, tales polinucleótidos pueden incluir un 15 promotor, un sitio de terminación de la transcripción (sitio de poliadenilación en hospedadores de expresión eucariotas), un sitio de unión a ribosomas y, opcionalmente, un potenciador para uso en hospedadores de expresión eucariotas y, opcionalmente, secuencias necesarias para replicación de un vector.
E. coli es un hospedador procariota útil particularmente para clonar las secuencias de ADN de la presente invención. Otros hospedadores microbianos adecuados para uso incluyen bacilos, tales como Bacillus subtilis, y 20 otras enterobacterias, tales como Salmonella, Serratia, y diversas especies de Pseudomonas. En estos hospedadores procariotas, también se pueden realizar vectores de expresión, que típicamente contendrán secuencias de control de la expresión compatibles con la célula hospedadora (por ejemplo, un origen de replicación). Además, estará presente cualquier número de una diversidad de promotores bien conocidos, tales como el sistema promotor de lactosa, un sistema promotor de triptófano (trp), un sistema promotor de beta-lactamasa, o un sistema 25 promotor del fago lambda. Los promotores típicamente controlarán la expresión, opcionalmente con una secuencia operadora, y tendrán secuencias de sitio de unión a ribosomas y similares, para iniciar y completar la transcripción y la traducción.
Para la expresión también pueden usarse otros microbios, tales como levaduras. Saccharomyces es un hospedador preferido, teniendo los vectores adecuados secuencias de control de la expresión, tales como 30 promotores, incluyendo 3-fosfogliceratoquinasa u otras enzimas glicolíticas, y un origen de replicación, secuencias de terminación y similares, cuando se desee.
Además de microorganismos, también pueden usarse cultivos de células de tejidos de mamífero para expresar y producir los polipéptidos de la presente invención (véase Winnacker, "From Genes to Clones," VCH Publishers, N.Y., N.Y. (1987). Actualmente se prefieren células eucariotas, porque en la técnica se han desarrollado 35 varias líneas de células hospedadoras adecuadas capaces de secretar proteínas humanas intactas e incluyen las líneas de células CHO, diversas líneas de células COS, células HeLa, líneas de células de mieloma, células Jurkat, etc. Los vectores de expresión para estas células pueden incluir secuencias de control de la expresión tales como un origen de replicación, un promotor, un potenciador (Queen et al. (1986) Immuno. Rev. 89:49, y sitios de información del procesamiento necesario, tales como sitios de unión a ribosomas, sitios de ayuste de ARN, sitios de 40 poliadenilación y secuencias terminadoras de la transcripción. Son secuencias de control de la expresión preferidas promotores derivados de genes de inmunoglobulinas, SV40, adenovirus, papilomavirus bovino y similares. Los vectores que contienen los segmentos de ADN de interés (por ejemplo, polipéptidos que codifican un polipéptido APP variante) pueden transferirse a la célula hospedadora por métodos bien conocidos, que varían dependiendo del tipo de hospedador celular. Por ejemplo, comúnmente se utiliza transfección con cloruro cálcico para células 45 procariotas, mientras que para otros hospedadores celulares puede usarse tratamiento con fosfato cálcico o electroporación. (Véase, en general, Maniatis, et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, (1982).
Como alternativa, puede usarse recombinación homóloga para insertar una secuencia mutante de APP en el genoma de un hospedador en un sitio específico, por ejemplo, en un locus APP del hospedador. En un tipo de 50 recombinación homóloga, se reemplazan una o mas secuencias del hospedador; por ejemplo, se reemplaza un alelo de APP del hospedador (o porción del mismo) por un alelo de APP mutante (o porción del mismo). Además de tales métodos de reemplazo de genes, puede usarse recombinación homóloga para dirigir un alelo de APP mutante a un sitio específico distinto de un locus APP del hospedador. Puede usarse recombinación homóloga para producir animales no humanos transgénicos y/o células que incorporen alelos de APP mutante. 55
El método se presta fácilmente a la formulación de kits de ensayo que pueden utilizarse en diagnóstico. Tal kit comprendería un soporte compartimentalizado para recibir uno o mas recipientes, donde un primer recipiente puede contener sondas de ADN marcadas convenientemente. Otros recipientes pueden contener reactivos útiles en la localización de las sondas marcadas, tales como substratos enzimáticos. Otros recipientes pueden contener un enzima de restricción (tal como BclI), tampones y similares, junto con instrucciones para su uso. 60
EJEMPLOS EXPERIMENTALES
Los siguientes ejemplos se proporcionan con fines ilustrativos y no pretenden limitar la invención al ejemplo específico proporcionado.
EJEMPLO I - Detección de la mutación ValIle en el gen β-amiloide (APP)
Se examinó la segregación de AD y marcadores a lo largo del brazo largo del cromosoma 21 en una sola familia con enfermedad de Alzheimer confirmada por autopsia (véase la fig 1). Se disponía de muestras de ADN de 5 un total de 6 individuos afectados y 33 individuos no afectados y con riesgo.
El gen APP en un miembro de la familia afectado se analizó por secuenciación directa por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores intrónicos (Gyllensten, U. en PCR Technology, Ed. Erlich, H.A., Stockton Press, 45-60, 1989; Yoshikai et al. (1990) Gene 87:257). (Fig. 2). Los cebadores se realizaron de acuerdo con el protocolo del fabricante usando un Gene Assembler Plus (Pharmacia LKB). 10
La PCR se realizó usando los siguientes cebadores intrónicos para amplificar el exón 17 del gen APP:
[A] 5'-CCTCATCCAAATGTCCCCGTCATT-3' [SEC ID Nº: 26] y
[B] 5'-GCCTAATTCTCTCATAGTCTTAATTCCCAC-3' [SEC ID Nº: 27]
Las condiciones de PCR fueron 94ºC durante 10 minutos para la desnaturalización; después 35 ciclos de 60ºC durante 1 minuto, 72ºC durante 3 minutos, 94ºC durante 1,5 minutos; y un solo ciclo de 72ºC durante 10 15 minutos. La reacción se realizó usando tris-HCl 10 mM pH 8,3, cloruro potásico 50 mM, gelatina al 0,01%, cloruro de magnesio 1,5 mM, una concentración 200 µM de dNTP, 50 pmoles de cada cebador de PCR y una unidad de Taq polimerasa. El volumen de reacción final total fue de 25 µl.
Después se realizó una segunda reacción de PCR con una concentración final de 50 pmol de cebador [A] y 0,5 pmol de cebador [B]. El producto de PCR se purificó en un microconcentrador centricon 100 (Amicon) y se usó 20 directamente para la secuenciación con el kit SEQUENASE (versión 2.0, United States Biochemical Corp; la palabra SEQUENASE es una marca comercial) siguiendo el protocolo del fabricante.
Primero se secuenció el exón 17 porque codifica parte del péptido β-amiloide y es el sitio de la mutación (en APP693) que conduce a hemorragia cerebral hereditaria con amiloidosis de tipo Dutch (HCHWA-D).
La secuenciación del exón 17 reveló una transición de C a T en el par de bases 2149, que producía un 25 cambio de valina a isoleucina en el aminoácido 717 (fig 2 y fig 3).
Esta transición de C a T crea un sitio de restricción BclI que permite la detección dentro del producto de PCR (fig 4). Se realizaron digestiones con BclI a 50ºC durante 2-4 horas, como se recomienda por el fabricante, y después se sometieron a electroforesis en agarosa al 3%.
La selección por PCR 100 individuos normales no relacionados y 14 casos (9 familias) de enfermedad 30 familiar de inicio tardío no pudo demostrar esta substitución. La selección de 11 casos (9 familias) de enfermedad familiar de inicio temprano reveló el sitio de restricción BclI en dos individuos afectados de una familia no relacionada. Los datos genéticos demuestran que los loci de la enfermedad están asociados a la mutación de sentido erróneo. Además, la incapacidad de detectar este polimorfismo en 200 cromosomas normales confirma la opinión de que es una mutación patógena. 35
La substitución de valina por isoleucina se produce dentro del domino transmembrana a una distancia de dos restos del extremo C-terminal del péptido β-amiloide. El análisis informático predice que la substitución hace que el dominio transmembrana sea más hidrófobo y, de esta forma, podría anclar la proteína más firmemente dentro de la membrana. La posición de la substitución, a una distancia de 2 restos del extremo C del péptido β-amiloide, puede tener significado con respecto al origen del péptido depositado. Este hallazgo asocia la enfermedad de Alzheimer a 40 HCHWA-D, una enfermedad en la que la deposición amiloide se debe a una mutación mas próxima al extremo N-terminal pero dentro del péptido β-amiloide (Levy et al. loc. cit.)
EJEMPLO 2 - Preparación de una línea celular que contiene un gen β-amiloide (APP) defectuoso
Se recogen 10 ml de sangre reciente de cada individuo que padece enfermedad de Alzheimer familiar. Se purifican los linfocitos a partir de la sangre en un gradiente de Percoll y se mezclan con virus de Epstein-Barr (EBV). 45 Las células después se cultivan en placas con medio suplementado con un 10% de suero de ternero fetal, antibióticos, glutamina y ciclosporina A para destruir los linfocitos T. Los linfocitos B que se infectan por EBV se inmortalizan y establecen una línea celular permanente derivada de las células B del paciente.
Se ha depositado una línea de células linfoblastoides, AC21, en la European Collection of Animal Cell Cultures, Porton Down. 50
EJEMPLO 3 - Detección de una mutación ValGly en el gen β-amiloide (APP)
Se identificó una genealogía, denominada F19 y mostrada en la fig 5, que tiene AD confirmada por autopsia con un inicio temprano de 59 ± 4 años observando que un alelo del marcador de repetición dinucleotídico de alto polimorfismo GT12 (D21S210), que está localizado cerca del gen APP, se co-segregaba con la enfermedad. El análisis de asociación proporcionó una puntuación máxima de lod entre el marcador y la enfermedad de 3,02 a una 5 fracción de recombinación de cero, como muestra la siguiente tabla:
Theta 0 0,01 0,05 0,1 0,2 0,3 0,4
Lod 3,02 2,97 2,75 2,47 1,86 1,22 0,6
Las puntuaciones de lod se calcularon con 7 clases de responsabilidad que modelaban penetrancias dependientes de la edad de 0,01 a 0,95 con una proporción de fenocopia de 0,001 y una frecuencia génica de 0,001 10 usando MLINK del paquete LINKAGE (Lathrop et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3443).
Se determinaron 17 secuencias de exones de APP en un miembro afectado y en un miembro no afectado de F19. En el miembro afectado, hubo una transición de GT en la posición 2150, como puede verse en la fig. 6.
La amplificación del exón 17 se realizó como se ha descrito en el ejemplo 1 anterior y Chartier-Harlin et al. (1991) Neurosci. Letts. 129:134, con las siguientes modificaciones: (a) las secuencias de los cebadores de 15 amplificación fueron:
ATA-ACC-TCA-TCC-AAA-TGT-CCC-C [SEQ ID Nº: 28] y
GTA-ACC-CAA-GCA-TCA-TGG-AAG-C [SEQ ID Nº: 29] y
(b) las condiciones de PCR fueron 94ºC/10 minutos y después 35 ciclos de 60ºC/1 minuto, 72ºC/1 minuto, 94ºC/1 minuto, seguido de 72ºC/5 minutos. 20
Se usaron 50 pmol del segundo cebador para generar un producto monocatenario, que después se purificó (Chartier-Harlin et al. loc. cit). El producto purificado se secuenció con el kit SEQUENASE (2.0) (Trade mark; USB) usando un cebador de secuencia:
AAA-TGA-AAT-TCT-TCT-AAT-TGC-G [SEQ ID Nº: 30].
La presencia de la transición TC crea artefactos de gel que se resolvieron por la inclusión de inosina (kit 25 SEQUENASE) en la reacción de secuenciación.
La secuenciación directa de los exones 7 y 16 de individuos afectados de F19 (Chartier-Harlin et al. loc. cit) demuestra que tenían una secuencia normal y SSCA (Orita et al. loc. cit) y Orita et al.) no pudieron identificar cambios en los exones 2, 3, 7, 9, 12, 13 o 15. La técnica SSCA del exón 17 detecta ValIle de APP693 (Levy, et al. loc. cit. y Hardy et al. (1991) Lancet 337:1342-1343) y APP717 en condiciones de selección convencionales y, 30 cuando se modifica APP717, ValGly.
EJEMPLO 4 - Producción de Animales Transgénicos con el Alelo de APP Mutante
Generación de las construcciones: El vector plink se construyó por clonación de un poliengarce entre los sitios PvuII y EcoRI de pBR322, de tal forma que el extremo HindIII del poliengarce fuera adyacente al sitio PvuII. La unión destruyó los sitios EcoRI y PvuII asociados con los segmentos de pBR322. El fragmento HpaI-EcoRI de 700 35 pb de pSV2neo (Southern y Berg (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1:327) que contiene la señal de poliadenilación de SV40 se clonó en los sitios HpaI-EcoRI de plink para generar pNotSV. El fragmento XhoI-PstI de 200 pb de pL2 que contenía el sitio de ayuste 16S/1gS de SV40 (Okayama y Berg (1983) Mol. Cell Biol. 3:280) se aisló, los extremos se hicieron romos con Klenow, y después se clonó en el sitio HpaI de pNotSV para generar pSplice. El fragmento Nru1-SpeI de 2,3 kb de pAPP695 que contenía la región codificante del ADNc para APP (Tanzi et al. (1987) Science 40 235:880) se clonó en el sitio NruI-SpeI de pSplice para generar pd695. Se usó la misma estrategia para generar pd751 usando el ADNc para APP751 (Tanzi et al. (1988) Nature 331:528). En los vectores pd695 y pd751 se han insertado diversos promotores usando el sitio único NruI o los sitios HindIII y NruI.
Generación de pshAPP695 & pshAPP751: La construcción pAmyproBam se generó por clonación del fragmento BamHI de 1,5 kb del ADNc de APP en el sitio BamHI de puc19 xHamy. El fragmento HindIII-Asp718 de 45 700 pb del pAmyproBam (similar al fragmento BamHI-Asp718 de 700 pb descrito en Salbaum et al. (1988) EMBO 7:2807) se clonó en los sitios HindIII-Asp718 de pd695 y pd751 para producir pshAPP695 y pshAPP751.
pAPP695 y pAPP751: Los vectores pAPP695 y Papp751 se generaron por una unión de 3 vías del fragmento EcoRI-XhoI de 3,0 kb de pAmyProBam, el fragmento XhoI-SpeI de 1,5 kb del ADNc de APP751, y el sitio SpeI-EcoRI de pd751. 50
Generación de pNSE751 (+47): El pNSE751 (+47) se construyó usando una unión de 3 vías del
fragmento HindIII-KpnI de pNSE6 (Forss-Petter et al. (1990) Neuron 5:187). El fragmento KpnI-BstYI de pNSE6 y un fragmento parcial BamHI (-47 nucleótidos con respecto al ATG)-HindIII de pAPP751. Esto ocasionó la generación de un fragmento KpnI que se clonó en los sitos KpnI de pNSE751 (+47). La fusión BstYI/Bam produce la perdida de los dos sitios.
Generación de pNSE751: Este vector se generó usando un protocolo de PCR de dos etapas de 4 5 cebadores (Higuchi et al. (1988) Nucl. Acids Res. 16:7351) que produjo una fusión directa del codón de iniciación de NSE a la región codificante de APP. Se usaron oligonucleótidos C2, 1072, 1073 y A2 (véanse las secuencias de nucleótidos, mas adelante) para generar el producto de PCR. El fragmento KpnI se generó por digestión con el enzima de restricción. El fragmento KpnI se usó para reemplazar un fragmento similar en pNSE751 (+47).
Generación de pNSE751-Hardy y pNSE751-Dutch: Las mutaciones Hardy (APP642 ValIle de APP695) y 10 Dutch (APP618 GlnGlu de APP695) se introdujeron usando un protocolo de dos PCR de cuatro cebadores. Las dos series de reacciones usaron los mismos "cebadores exteriores", conteniendo los "cebadores interiores" las mutaciones apropiadas. Esto tuvo como resultado la generación de un fragmento BglII-SpeI después de la digestión, que contenía la mutación Dutch o Hardy. El fragmento BglII-SpeI de pNSE751 se reemplazó por el fragmento mutado para generar el vector apropiado. La presencia de la mutación se confirmó por análisis de secuencia de los 15 vectores.
Generación de pNSE751-Hardy y pNSE751-Dutch: Las mutaciones Hardy VI (APP642 V a I), y Hardy VG (APP642 V a G), y Dutch (APP618 E a Q) se introdujeron usando el protocolo de PCR de dos etapas de 4 cebadores (Higuchi et al. (1988)). El mutante Hardy VI se generó usando cebadores 117/738, 922, 923 y 785; el mutante Hardy VG se generó usando los cebadores 117/738, 1105, 1106 y 785; el mutante Dutch se generó usando 20 los cebadores 117/738, 1010, 1011 y 785. En todas estas mutaciones, el fragmento BglII-SpeI de 700 pb se aisló por digestión del producto de PCR con enzimas de restricción, y después se clonó en los mismos sitios de pNSE751. Las mutaciones se confirmaron por análisis de secuencia.
Generación de pNFH751: El gen NFH humano (Lees et al. (1988) EMBO 7(7):1947) se aisló a partir de una biblioteca genómica usando un ADNc de NFH de rata como sonda (Lieberburg et al. (1989) Proc. Natl. Acids. Res. 25 USA 86:2463). Se subclonó un fragmento SstI en el vector pSK. Se generó un par de cebadores de PCR para poner un sitio NruI en el extremo 3' del fragmento amplificado de 150 pb inmediatamente cadena arriba del codón de iniciación del gen NFH. El extremo 5' contiene un sitio KpnI a 150 nucleótidos cadena arriba del codón de iniciación. La construcción final de pNFH751 se generó por una unión de 3 vías del fragmento HindIII-KpnI de 5,5 b de pNFH8.8, el fragmento KpnI-NruI generado por PRC y el fragmento HindIII-NruI de pd751. La secuencia que 30 rodeaba a la fusión generada por PCR en el codón de iniciación se confirmó por análisis de secuencia. Las variantes Dutch y Hardy de pNFH751 se generaron por substitución del fragmento BglII-SpeI de 600 pb desde un vector mutado con la secuencia confirmada para el mismo fragmento de pNFH751. La presencia de la mutación se confirmó por hibridación con el oligómero mutado o por análisis de la secuencia.
Generación de pThy751: El vector pThy751 se generó por una unión de 3 vías. El fragmento Hind III-Bam 35 HI de pThy8.2 que se aisló a partir de una biblioteca genómica humana (Chang et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3819), el fragmento sintético ThyAPP, y el fragmento HindIII-NruI de pd751.
ThyAPP:
CAGACTGAGATCCCAGAACCCTAGGTCTGACTCTAGGGTCTTGG [SEC ID Nº: 31]
Generación de pThyC100: Esta construcción pThyC100 se generó por una unión de tres vías. El fragmento 40 HindIII-BamHI de 3,6 kb de pThy8.2, el fragmento sintético ThyAPP2, y el fragmento HindIII-BglII de pd751 o pNSE751 Ducht o pNSE751 Hardy se unieron para producir PThyC100.
ThyAPP2:
CAGACTGAGATCCCAGAACCGATCCTAGGTCTGACTCTAGGGTCTTGG [SEC ID Nº: 32]
La región alrededor del codón de iniciación se confirmó por análisis de la secuencia. 45
Preparación de ADN para inyección: El transgen para inyección se aisló a partir del vector correspondiente de interés para la digestión con NotI y electroforesis en gel. El transgen se purificó usando el kit Gene Clean (Bio101), y después se purificó adicionalmente en un Elutip o se purificó por HPCL en una columna Nucleogen 4000.
Microinyección: El transgen se inyectó a 2-20 mcg/ml en el pronúcleo mas conveniente (normalmente el pronúcleo masculino) de embriones de una célula FBV o B6D2F2 (Manipulating the Mouse Embryo, B. Hogan, F. 50 Constantini, E. Lacy, Cold Spring Harbor, 1986). Los embriones inyectados se cultivaron durante una noche. Se implantaron embriones que se dividieron hasta la fase de 2 células en ratones CD1 hembra pseudopreñadas. Los ratones se destetaron a aproximadamente 21 días. Se obtuvieron muestras de ADN a partir de biopsias de la cola y se analizaron por transferencia de Southern usando una sonda específica del transgen (normalmente la secuencia señal de poliadenilación y de ayuste 3' de SV40). Se identificaron los ratones transgénicos que llevaban al menos 55
una copia del transgen.
Uso de ratones transgénicos: Puede usarse un ratón que exprese el gen hAPP o sus variantes para ensayar la patogénesis de la deposición amiloide y la intervención terapéutica diseñada para modular la deposición amiloide.
El análisis bioquímico de los ratones transgénicos revela posibles intermedios en el catabolismo de APP 5 que son precursores probables de la proteína beta-amiloide. Este análisis puede realizarse en el animal o en cultivos de tejido primarios de las células de expresión.
El animal puede usarse para ensayar agentes terapéuticos potenciales. El grupo de ensayo de ratones se trata con el compuesto de ensayo administrado de una forma apropiada para un periodo establecido. Al final del periodo de ensayo, se evalúa el comportamiento de los animales, su bioquímica y su histología para detectar 10 cualquier posible efecto del compuesto de ensayo. El protocolo exacto depende del mecanismo previsto de acción del compuesto de ensayo. Usando esta estrategia pueden identificarse compuestos que pueden tener utilidad en el tratamiento de la AD.
LISTA DE SECUENCIAS 15
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
(i) SOLICITANTE:
(A) NOMBRE: Imperial College of Science, Technology & Medicine (no US)
(B) CALLE: Sherfield Building, Exhibition Road,
(C) CIUDAD: Londres 20
(E) PAÍS: GB
(F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): SW7 2AZ
(A) NOMBRE: HARDY, John Anthony (sólo US)
(B) CALLE: 187 Drakefell Road
(C) CIUDAD: Londres 25
(E) PAÍS: GB
(F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): SE4
(A) NOMBRE: GOATE, Alison Mary (sólo US)
(B) CALLE: 100 High Street, Hampton Wick,
(C) CIUDAD: Kingston-on-Thames 30
(D) ESTADO: Surrey
(E) PAÍS: GB
(F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): KT1 4DQ
(A) NOMBRE: MULLAN, Michael John (sólo US)
(B) CALLE: Suncoast Gerontology Ctr, 12901 Bruce B. Downs Blvd. MDC 50, 35
(C) CIUDAD: Tampa
(D) ESTADO: Florida
(E) PAÍS: US
(F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): 33612
(A) NOMBRE: CHARTIER-HARLIN, Marie-Christine (sólo US) 40
(B) CALLE: 63 Francis Road
(C) CIUDAD: Londres
(E) PAÍS: GB
(F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): E10 6PN
(A) NOMBRE: OWEN, Michael John (solo US)
(B) CALLE: Four Hedges, Castlehill, Llanblethian, 5
(C) CIUDAD: Cowbridge
(D) ESTADO: South Glamorgan
(E) PAÍS: GB
(ii) TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Ensayo y Modelo para la Enfermedad de Alzheimer
(iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 44 10
(iv) FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR: No aplicable
(v) DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
NÚMERO DE SOLICITUD: WO PCT/GB92/_______
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 15
(A) LONGITUD: 695 aminoácidos
(B) TIPO: aminoácido
(C) CADENA: sencilla
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína 20
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 751 aminoácidos
(B) TIPO: aminoácido
(C) CADENA: sencilla 5
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 3:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 770 aminoácidos
(B) TIPO: aminoácidos 5
(C) CADENA: sencilla
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 2088 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico 5
(C) CADENA: sencilla
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4:
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 5:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 2265 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico 5
(C) CADENA: sencilla
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 5:
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 6:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 9 aminoácidos
(B) TIPO: aminoácido 5
(C) CADENA: sencilla
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 6:
10
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 7:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 9 aminoácidos
(B) TIPO: aminoácido
(C) CADENA: sencilla 15
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 7:
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 8:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 9 aminoácidos
(B) TIPO: aminoácido 5
(C) CADENA: sencilla
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 8:
10
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 9:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 9 aminoácidos
(B) TIPO: aminoácido
(C) CADENA: sencilla 15
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 9:
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 10: 20
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 9 aminoácidos
(B) TIPO: aminoácido
(C) CADENA: sencilla
(D) TOPOLOGÍA: lineal 25
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 10:
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 11:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 30
(A) LONGITUD: 9 aminoácidos
(B) TIPO: aminoácido
(C) CADENA: sencilla
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína 5
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 11:
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 12:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 9 aminoácidos 10
(B) TIPO: aminoácido
(C) CADENA: sencilla
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 12: 15
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 13:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 9 aminoácidos
(B) TIPO: aminoácido 20
(C) CADENA: sencilla
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 13:
25
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 14:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 9 aminoácidos
(B) TIPO: aminoácido
(C) CADENA: sencilla 30
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 14:
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 15:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 9 aminoácidos 5
(B) TIPO: aminoácido
(C) CADENA: sencilla
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 15: 10
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 16:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 9 aminoácidos
(B) TIPO: aminoácido 15
(C) CADENA: sencilla
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 16:
20
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 17:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 9 aminoácidos
(B) TIPO: aminoácido
(C) CADENA: sencilla 25
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 17:
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 18: 30
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 9 aminoácidos
(B) TIPO: aminoácido
(C) CADENA: sencilla
(D) TOPOLOGÍA: lineal 5
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 18:
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 19
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 10
(A) LONGITUD: 9 aminoácidos
(B) TIPO: aminoácido
(C) CADENA: sencilla
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína 15
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 19:
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 20:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 9 aminoácidos 20
(B) TIPO: aminoácido
(C) CADENA: sencilla
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 20: 25
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 21:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 9 aminoácidos
(B) TIPO: aminoácido 30
(C) CADENA: sencilla
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 21:
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 22:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 5
(A) LONGITUD: 9 aminoácidos
(B) TIPO: aminoácido
(C) CADENA: sencilla
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína 10
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 22:
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 23:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 15
(A) LONGITUD: 9 aminoácidos
(B) TIPO: aminoácido
(C) CADENA: sencilla
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína 20
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 23:
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 24:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 9 aminoácidos 25
(B) TIPO: aminoácido
(C) CADENA: sencilla
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 24: 30
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 25:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 9 aminoácidos
(B) TIPO: aminoácido 5
(C) CADENA: sencilla
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 25:
10
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 26:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 24 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) CADENA: sencilla 15
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (Cebador)
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 26:
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 27: 20
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 30 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) CADENA: sencilla
(D) TOPOLOGÍA: lineal 25
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (Cebador)
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 27:
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 28:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 30
(A) LONGITUD: 22 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) CADENA: sencilla
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (Cebador)
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 28:
5
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 29:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 22 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) CADENA: sencilla 10
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (Cebador)
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 29:
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 30: 15
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 22 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) CADENA: sencilla
(D) TOPOLOGÍA: lineal 20
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (Cebador)
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 30:
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 31:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 25
(A) LONGITUD: 44 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) CADENA: sencilla
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN 30
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 31:
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 32:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 48 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) CADENA: sencilla
(D) TOPOLOGÍA: lineal 5
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (Cebador)
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 32:
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 33:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 10
(A) LONGITUD: 25 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) CADENA: sencilla
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) 15
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 33:
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 34:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 29 pares de bases 20
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) CADENA: sencilla
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 34: 25
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 35:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 21 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico 30
(C) CADENA: sencilla
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 35:
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 36:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 21 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico 5
(C) CADENA: sencilla
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 36:
10
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 37:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 28 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) CADENA: sencilla 15
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 37:
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 38: 20
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 28 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) CADENA: sencilla
(D) TOPOLOGÍA: lineal 25
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 38:
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 39:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 30
(A) LONGITUD: 24 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) CADENA: sencilla
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 39:
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 40: 5
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 24 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) CADENA: sencilla
(D) TOPOLOGÍA: lineal 10
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 40:
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 41:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 15
(A) LONGITUD: 27 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) CADENA: sencilla
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) 20
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 41:
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 42:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 32 pares de bases 25
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) CADENA: sencilla
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 42: 30
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 43:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 21 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) CADENA: sencilla
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 43: 5
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 44:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 21 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico 10
(C) CADENA: sencilla
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 44:
15

Claims (25)

  1. REIVINDICACIONES
  2. 1.- Un proceso para preparar un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un alelo de la proteína precursora de amiloide (APP) humana mutante que se cosegrega con una predisposición genética a la enfermedad de Alzheimer de inicio temprano, comprendiendo el proceso el acoplamiento de sucesivos nucleótidos entre sí, donde el alelo de APP mutante tiene una substitución de aminoácidos en la posición codificada por el codón 717 definido en relación con APP770, comprendiendo el proceso 5 el acoplamiento de nucleótidos sucesivos entre sí.
  3. 2.- Un polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 1, donde la APP es APP770.
  4. 3.- Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, donde el aminoácido en la posición codificada por el codón 717 es una isoleucina.
  5. 4.- Un proceso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, donde la secuencia de ácido nucleico 10 es un ADNc.
  6. 5.- Un proceso para preparar una sonda polinucleotídica capaz de hibridar específicamente con un alelo de la proteína precursora de amiloide 770 (APP770) que presenta una mutación en el codón 717, de tal forma que puede identificarse una banda correspondiente al alelo de APP 770 en una transferencia de Southern, mientras que no puede identificarse un alelo de tipo silvestre correspondiente o puede discriminarse del alelo de APP770 15 basándose en la intensidad de la señal, comprendiendo el proceso el acoplamiento de sucesivos nucleótidos entre sí.
  7. 6.- Un proceso de acuerdo con la reivindicación 5, donde el codón 717 del alelo mutante codifica una isoleucina.
  8. 7.- Un proceso de acuerdo con la reivindicación 5 o 6, donde la sonda está marcada. 20
  9. 8.- Un hospedador transgénico que comprende un polinucleótido recombinante que incluye una secuencia de ácido nucleico que codifica un alelo de la proteína precursora de amiloide (APP) humana mutante que se cosegrega con una predisposición genética a la enfermedad de Alzheimer de inicio temprano, sin que el hospedador sea un ser humano, donde el alelo de APP mutante tiene una substitución de aminoácidos en la posición codificada por el codón 717 como se define en relación con APP770 y donde, cuando el huésped es un 25 animal el huésped es un ratón.
  10. 9.- Un hospedador de acuerdo con la reivindicación 8, donde el aminoácido en la posición codificada por el codón 717 es una isoleucina.
  11. 10.- Un hospedador de acuerdo con la reivindicación 8 o 9, que es una línea celular eucariota primaria o inmortalizada. 30
  12. 11.- Un hospedador de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, donde el alelo mutante APP es APP770.
  13. 12.- Uso de un animal transgénico no humano que comprende un gen de APP mutante como modelo para la enfermedad de Alzheimer, donde el gen APP mutante tiene un codón 717 mutante.
  14. 13.- Una célula primaria o inmortalizada humana cultivada, que comprende un segmento de ácido 35 nucleico que codifica un mutante de la posición 717 de la proteína precursora de amiloide (APP770) humana o una isoforma de APP que tiene la mutación.
  15. 14.- Un método para seleccionar un agente capaz de tratar la enfermedad de Alzheimer de inicio temprano, que comprende:
    poner en contacto un hospedador de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11 con el 40 agente; y controlar la expresión o procesar las proteínas codificadas por el gen mutante.
  16. 15.- Un método para detectar la presencia, en un ácido nucleico u otra muestra extraída de un sujeto, del gen para la enfermedad de Alzheimer de inicio temprano, que comprende identificar una alteración genética en una secuencia génica que codifica la proteína precursora de amiloide (APP), donde la alteración genética es una mutación en el codón 717. 45
  17. 16.- Un método de acuerdo con la reivindicación 15, donde el aminoácido en la posición codificada por el codón 717 es una isoleucina.
  18. 17.- Un método de acuerdo con la reivindicación 15 o la reivindicación 16, donde el APP es APP770.
  19. 18.- Un método de diagnóstico para determinar una predisposición heredada a la enfermedad de
    Alzheimer de inicio temprano en un sujeto, que comprende detectar en el sujeto la presencia de un alelo de la proteína precursora de amiloide (APP), donde dicho alelo tiene un polimorfismo de secuencia en una posición correspondiente al codón 717 de APP770, realizándose la etapa de detección sobre el material extraído y no devuelto al cuerpo del sujeto.
  20. 19.- Un método de acuerdo con la reivindicación 18, donde el polimorfismo de secuencia es una 5 substitución de nucleótidos, donde en el codón 717 de APP770 está substituida una isoleucina.
  21. 20.- Un método de acuerdo con la reivindicación 18 o 19, donde el polimorfismo de secuencia es una substitución de un solo nucleótido.
  22. 21.- Un método de acuerdo con la reivindicación 18, 19 o 20, donde la etapa de detección comprende secuenciar un segmento de ADN genómico del cromosoma 21 del sujeto, que codifica dicho alelo. 10
  23. 22.- Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 25, donde la etapa de detección comprende (i) mezclar una muestra de ácido nucleico del sujeto con una o mas sondas polinucleotídicas capaces de hibridar selectivamente con un alelo del gen APP en una reacción tal que puede identificarse una banda correspondiente al alelo de APP770 en una transferencia de Southern, mientras que no puede identificarse un alelo de tipo silvestre correspondiente o puede distinguirse del alelo de APP770 basándose en la intensidad de la señal, y 15 (ii) controlar la reacción para determinar la presencia del alelo del gen en la muestra, indicando de esta manera si el sujeto tiene riesgo de padecer la enfermedad de Alzheimer.
  24. 23.- Un método para el análisis genético de un ser humano que comprende detectar la presencia o ausencia de al menos un polimorfismo en el codón 717 de un gen APP770 de un gen de la proteína precursora de amiloide (APP) en el sujeto, realizándose la etapa de detección sobre un material extraído y no devuelto al cuerpo 20 del sujeto.
  25. 24.- Un proceso para preparar una composición que comprende un polipéptido sin proteínas humanas, comprendiendo el polipéptido una secuencia de núcleo:
    IIe-Ala-Thr-Val-Ile-X-Ile-Thr-Leu- [SEC ID Nº: 6]
    donde X es cualquiera de los 20 aminoácidos convencionales excepto valina, comprendiendo el proceso el 25 acoplamiento de aminoácidos sucesivos entre sí.
    Siguen 29 páginas de dibujos
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