JPS6070083A - ハイブリツドｄｎａ配列ならびに産生されるハイブリツドポリペプチドおよびｄｎａ配列 - Google Patents
ハイブリツドｄｎａ配列ならびに産生されるハイブリツドポリペプチドおよびｄｎａ配列Info
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- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔発明の要約〕
ハイブリッドＤＮＡ配列の作成方法は、（ａ）ＤＮ人断
片ｔ＊はそのコンカテマーを作成し、このＤＮＡ断片は
ハイブリッドＤＮＡ配列を誘導すべき親ＤＮＡ配列の一
方と、前記ＤＮＡ断片を宿主細胞において複製しうるよ
うな完全レプリコンと、前記ハイブリッドＤＮＡ配列を
誘導すべき他方の親ＤＮ人配列とを配列中に含み、前記
２つの親ＤＮＡ配列はノーイブリッドＤＮＡ配列を形成
しようとする位置にて共通の少なくとも３個、好ましく
は少なくともｊ個のヌクレオチドの配列を有し、かつ前
記２つの親配列におけるコード配列の翻訳方向はＤＮＡ
断片において互いに同方向であり、（ｂ）所望ノーイブ
リッドＤＮＡ配列により形質転換された宿主細胞を選択
しかつそこから前記ノーイブリッドＤＮＡ配列金単離す
ることを特徴とする。本発明の７・イブリッドＤＮＡ配
列は、種々の用途と生物学的活性とを有するノ・イブリ
ッドポリペプチドを産生ずるのに有用である。
片ｔ＊はそのコンカテマーを作成し、このＤＮＡ断片は
ハイブリッドＤＮＡ配列を誘導すべき親ＤＮＡ配列の一
方と、前記ＤＮＡ断片を宿主細胞において複製しうるよ
うな完全レプリコンと、前記ハイブリッドＤＮＡ配列を
誘導すべき他方の親ＤＮ人配列とを配列中に含み、前記
２つの親ＤＮＡ配列はノーイブリッドＤＮＡ配列を形成
しようとする位置にて共通の少なくとも３個、好ましく
は少なくともｊ個のヌクレオチドの配列を有し、かつ前
記２つの親配列におけるコード配列の翻訳方向はＤＮＡ
断片において互いに同方向であり、（ｂ）所望ノーイブ
リッドＤＮＡ配列により形質転換された宿主細胞を選択
しかつそこから前記ノーイブリッドＤＮＡ配列金単離す
ることを特徴とする。本発明の７・イブリッドＤＮＡ配
列は、種々の用途と生物学的活性とを有するノ・イブリ
ッドポリペプチドを産生ずるのに有用である。
本発明はハイブリッドポリペプチド、これをコードする
ＤＮＡ配列、並びにこれらＤＮＡ配列およびポリペプチ
ドの産生方法に関するものである。本発明による方法は
、（ａ）ＤＮＡ断片またはそのコンカテマーを作成し、
このＤＮＡ断片はハイブリッドＤＮＡ配列を誘導すべき
親ＤＮＡ配列の一方と、前記ＤＮＡ断片を宿主細胞にお
いて複製しうるような完全レプリコンと、前記ハイブリ
ッドＤＮＡ配列を誘導すべき他方の親ＤＮＡ配列とを配
列中に含み、前記２つの親ＤＮＡ配列はハイブリッドＤ
ＮＡ配列を形成しようとする位置にて共通の少なくとも
３個、好ましくは少なくともｊ個のヌクレオチドの配列
を有し、かつ前記コづの親配列におけるコード配列の翻
訳方向はＤＮＡ断片において互いに同方向であり、（ｂ
）所望のハイブリッドＤＮＡ配列により形質転換された
宿主細胞を選択しかつそこから前記ハイブリッドＤＮＡ
配列を単離することを特徴とする。所望の宿主細胞の選
択は、異なる抗生物質耐性標識に関連する各親ＤＮＡ配
列を有しかつ形質転換宿主細胞を両抗生物質を含有する
寒天板の上で増殖させることにより容易化することがで
きる。本発明の方法により生成されるハイブリッドＤＮ
Ａ配列は、各種の用途および生物学的活性を有する新規
なハイブリッドポリペプチドの産生を可能にする。
ＤＮＡ配列、並びにこれらＤＮＡ配列およびポリペプチ
ドの産生方法に関するものである。本発明による方法は
、（ａ）ＤＮＡ断片またはそのコンカテマーを作成し、
このＤＮＡ断片はハイブリッドＤＮＡ配列を誘導すべき
親ＤＮＡ配列の一方と、前記ＤＮＡ断片を宿主細胞にお
いて複製しうるような完全レプリコンと、前記ハイブリ
ッドＤＮＡ配列を誘導すべき他方の親ＤＮＡ配列とを配
列中に含み、前記２つの親ＤＮＡ配列はハイブリッドＤ
ＮＡ配列を形成しようとする位置にて共通の少なくとも
３個、好ましくは少なくともｊ個のヌクレオチドの配列
を有し、かつ前記コづの親配列におけるコード配列の翻
訳方向はＤＮＡ断片において互いに同方向であり、（ｂ
）所望のハイブリッドＤＮＡ配列により形質転換された
宿主細胞を選択しかつそこから前記ハイブリッドＤＮＡ
配列を単離することを特徴とする。所望の宿主細胞の選
択は、異なる抗生物質耐性標識に関連する各親ＤＮＡ配
列を有しかつ形質転換宿主細胞を両抗生物質を含有する
寒天板の上で増殖させることにより容易化することがで
きる。本発明の方法により生成されるハイブリッドＤＮ
Ａ配列は、各種の用途および生物学的活性を有する新規
なハイブリッドポリペプチドの産生を可能にする。
組換ＤＮＡ技術および分子生物学における最近の進歩は
、多数の異なるポリペプチドをコードする各種のＤＮＡ
配列および遺伝子の単離および同定を可能にした。たと
えば、７０種もしくはそれ以上のヒトα−インタフエロ
ンをコードするＤＮＡ配列がシー・ワイスマン等により
Ｐｈ１１． Ｊｒａｎｓ、 Ｒ，Ｓｏｅ、 Ｌｏｎｄ、
Ｂ、２タタ、＃！７〜２１！頁（／りｔａ）Ｋ記載さ
れている。さらに、ヒトβ−インタフエロンおよびヒト
γ−インタフエロンをコードするＤＮＡ配列がそれぞれ
アール会プリンク等によりネイチャー、第、２ｇｓ巻、
第ｊＩ／１２〜ｊ弘７頁（／りざＯ）およびアールｅデ
ボス等によりヌクレイツク・アシッド・リサーチ、第１
０巻、第２４ｔと７〜２！０／頁（／りｇコ）に記載さ
れている。
、多数の異なるポリペプチドをコードする各種のＤＮＡ
配列および遺伝子の単離および同定を可能にした。たと
えば、７０種もしくはそれ以上のヒトα−インタフエロ
ンをコードするＤＮＡ配列がシー・ワイスマン等により
Ｐｈ１１． Ｊｒａｎｓ、 Ｒ，Ｓｏｅ、 Ｌｏｎｄ、
Ｂ、２タタ、＃！７〜２１！頁（／りｔａ）Ｋ記載さ
れている。さらに、ヒトβ−インタフエロンおよびヒト
γ−インタフエロンをコードするＤＮＡ配列がそれぞれ
アール会プリンク等によりネイチャー、第、２ｇｓ巻、
第ｊＩ／１２〜ｊ弘７頁（／りざＯ）およびアールｅデ
ボス等によりヌクレイツク・アシッド・リサーチ、第１
０巻、第２４ｔと７〜２！０／頁（／りｇコ）に記載さ
れている。
非インタフエロンボリペプチドをコードするＤＮＡ配列
も得られている。これらは、たとえばヒトインシュリン
〔ディー・ゲデル等、プロシーディング・ナショナル・
アカデミー−サイエンス ＵＳＡ、第７６巻、第１０６
〜／１０頁（／り７り）〕、ラッテインシュリン〔エル
・ビラーコマロフ等、プロシーディング・ナショナル−
アカデミ−・サイエンスＵ Ｓ Ａ 、第７ｓ巻、第３
７．２７−３７３／頁（／り７と）〕、ヒト成長ホルモ
ン〔ディー・ゲデル等、ネイチャー、第、２１’／巻、
第おｔａ−ｓグ♂頁（／り７り）〕および生生成水ルモ
ン〔ダブリュー・ミラー等、ＤＮＡ第１巻、第Ｊ７−６
０頁（／りざ／）；ダブリュー・ミラー等、エンドクリ
ノロジー、第１０７巻、第どｊ／−♂ｊ弘頁（ｔ９１ｏ
））をコードするＤＮＡ配列を包含する。さらに、各種
のウィルス抗原をコードするＤＮＡ配列も得られている
。これらは、たとえばＢ型肝炎ウィルスのウィルス性抗
原〔エム・パセク等、ネイチャー、第η−巻、第１７１
−！７り頁（／り７り）；シーｅバレル等、ネイチャー
、第２７２巻、第７３−４１７頁（／り７り）〕をコー
ドするＤＮＡ配列、および口蹄疫ウィルスのウィルス性
抗原〔エッチ・キュツバ−等、ネイチャー、第２ざり巻
、第！ｊ、ｔ−１１２頁（１９♂ｌ）〕をコードするＤ
ＮＡ配列を包含する。
も得られている。これらは、たとえばヒトインシュリン
〔ディー・ゲデル等、プロシーディング・ナショナル・
アカデミー−サイエンス ＵＳＡ、第７６巻、第１０６
〜／１０頁（／り７り）〕、ラッテインシュリン〔エル
・ビラーコマロフ等、プロシーディング・ナショナル−
アカデミ−・サイエンスＵ Ｓ Ａ 、第７ｓ巻、第３
７．２７−３７３／頁（／り７と）〕、ヒト成長ホルモ
ン〔ディー・ゲデル等、ネイチャー、第、２１’／巻、
第おｔａ−ｓグ♂頁（／り７り）〕および生生成水ルモ
ン〔ダブリュー・ミラー等、ＤＮＡ第１巻、第Ｊ７−６
０頁（／りざ／）；ダブリュー・ミラー等、エンドクリ
ノロジー、第１０７巻、第どｊ／−♂ｊ弘頁（ｔ９１ｏ
））をコードするＤＮＡ配列を包含する。さらに、各種
のウィルス抗原をコードするＤＮＡ配列も得られている
。これらは、たとえばＢ型肝炎ウィルスのウィルス性抗
原〔エム・パセク等、ネイチャー、第η−巻、第１７１
−！７り頁（／り７り）；シーｅバレル等、ネイチャー
、第２７２巻、第７３−４１７頁（／り７り）〕をコー
ドするＤＮＡ配列、および口蹄疫ウィルスのウィルス性
抗原〔エッチ・キュツバ−等、ネイチャー、第２ざり巻
、第！ｊ、ｔ−１１２頁（１９♂ｌ）〕をコードするＤ
ＮＡ配列を包含する。
上記ＤＮＡ配列の２種もしくはそれ以上の部分よりなる
成る種のハイブリッドＤＮＡ配列も得られている。従来
、これらのハイブリッドは、各種ＤＮＡ配列に生ずる制
限部位を使用しかつλつの制限断片を共通制限部位で結
合させることにより、或いは異なる制限断片の鈍端結合
によりハイブリッドＤＮＡ配列を生成させて作成−７λ
− されている。次いで、これらハイブリッドＤＮＡ配列を
使用して、適当な宿主細胞を形質転換させかつそれによ
りコードされるハイブリッドポリペプチドを産生させる
ことができる。たとえば、ヒトαｌおよびαコインタフ
エロンのハイブリッドＤＮＡ配列、ならびにこれらによ
りコードされるハイブリッドインタフエロンが、この制
限および結合法を用いて作成されている〔エム・ストロ
イリ等、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・
サイエンスＵＳＡ、第７１巻、第２１４ｔｌ−，２１ｊ
２頁（／ ＰＪ／ ）、１．、７−ル・ローン等、ヌク
レイツク・アシッド・リサーチ、第２巻、第１０１１６
−１０１λ頁（ｌりざ／）〕。
成る種のハイブリッドＤＮＡ配列も得られている。従来
、これらのハイブリッドは、各種ＤＮＡ配列に生ずる制
限部位を使用しかつλつの制限断片を共通制限部位で結
合させることにより、或いは異なる制限断片の鈍端結合
によりハイブリッドＤＮＡ配列を生成させて作成−７λ
− されている。次いで、これらハイブリッドＤＮＡ配列を
使用して、適当な宿主細胞を形質転換させかつそれによ
りコードされるハイブリッドポリペプチドを産生させる
ことができる。たとえば、ヒトαｌおよびαコインタフ
エロンのハイブリッドＤＮＡ配列、ならびにこれらによ
りコードされるハイブリッドインタフエロンが、この制
限および結合法を用いて作成されている〔エム・ストロ
イリ等、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・
サイエンスＵＳＡ、第７１巻、第２１４ｔｌ−，２１ｊ
２頁（／ ＰＪ／ ）、１．、７−ル・ローン等、ヌク
レイツク・アシッド・リサーチ、第２巻、第１０１１６
−１０１λ頁（ｌりざ／）〕。
特定の構造およびこれらハイブリッドインタフエロンの
成分に応じて、これらはそれが誘導された親ポリペプチ
ドとは著しく異なる或いは同様な特性、活性および性質
を示すことができる。たとえば、ヒトαｌインタフ二ロ
ンの特異活性はヒト細胞において比較的低くかつネズミ
細胞において比較的高いものであるが、αコのＮ−末端
半分を有するａｌとαλとのハイブリッドはヒト細胞に
おいて高活性を有する。
成分に応じて、これらはそれが誘導された親ポリペプチ
ドとは著しく異なる或いは同様な特性、活性および性質
を示すことができる。たとえば、ヒトαｌインタフ二ロ
ンの特異活性はヒト細胞において比較的低くかつネズミ
細胞において比較的高いものであるが、αコのＮ−末端
半分を有するａｌとαλとのハイブリッドはヒト細胞に
おいて高活性を有する。
これら従来の方法は成る種のハイブリッドＤＮＡ配列の
形成および成る種のハイブリッドポリペプチドの合成に
おける使用を可能にしたが、これらはその用途が極めて
制約されている。
形成および成る種のハイブリッドポリペプチドの合成に
おける使用を可能にしたが、これらはその用途が極めて
制約されている。
たとえば、これらの従来法によるハイブリッド形成は、
ハイブリッド形成を所望する個所において両ＤＮＡ配列
に制限部位が存在することを必要とする。より一般的に
は、これら方法は、便利な制限部位からハイブリッド形
成が望まれる個所に到るＤＮＡ配列の切断と、この切断
が正確なヌクレオチドに達した時点の決定とを必要とす
る。これは極めて面倒かつ時間のかかる仕事である。さ
らに、αインタフエロンのように密接に関連するＤＮＡ
配列においては、ＤＮＡ配列の一方もしくは両方におけ
るヌクレオチドの削除または付加を避けるため、制限部
位または切断部をＤＮＡ配列の同質部分に存在させねば
なら々い。このような便利な制限部位、切断および同質
性はしばしば利用することができない。さらに、この種
の制限部位を利用しうる幾つかの場合でさえ、作成しう
る可能なハイブリッドの数は極めて少なく、その製造は
極めて時間がかかる。
ハイブリッド形成を所望する個所において両ＤＮＡ配列
に制限部位が存在することを必要とする。より一般的に
は、これら方法は、便利な制限部位からハイブリッド形
成が望まれる個所に到るＤＮＡ配列の切断と、この切断
が正確なヌクレオチドに達した時点の決定とを必要とす
る。これは極めて面倒かつ時間のかかる仕事である。さ
らに、αインタフエロンのように密接に関連するＤＮＡ
配列においては、ＤＮＡ配列の一方もしくは両方におけ
るヌクレオチドの削除または付加を避けるため、制限部
位または切断部をＤＮＡ配列の同質部分に存在させねば
なら々い。このような便利な制限部位、切断および同質
性はしばしば利用することができない。さらに、この種
の制限部位を利用しうる幾つかの場合でさえ、作成しう
る可能なハイブリッドの数は極めて少なく、その製造は
極めて時間がかかる。
したがって、組換ＤＮＡ技術により、２つのＤＮＡ配列
における適当な制限部位を利用しうる機会に関係なくハ
イブリッドＤＮＡ配列を形成する新規な方法を開発する
必要があり、それによりこれら部位一方または両方を結
合させまたは順次に削除して、親ＤＮＡ配列によりコー
ドされるポリペプチドとは異なる用途、活性および特異
性の生産物を産生ずる必要がある。
における適当な制限部位を利用しうる機会に関係なくハ
イブリッドＤＮＡ配列を形成する新規な方法を開発する
必要があり、それによりこれら部位一方または両方を結
合させまたは順次に削除して、親ＤＮＡ配列によりコー
ドされるポリペプチドとは異なる用途、活性および特異
性の生産物を産生ずる必要がある。
したがって、本発明の目的は、上記問題を解決し、かつ
ハイブリッドＤＮＡ配列の従来の形成方法に伴な、う欠
点を回避し、しかも新規なノ別イブリッドポリペプチド
、それをコードするＤＮＡ配列並びにこれらＤＮＡ配列
およびポリペプチドの産生方法を提供することである。
ハイブリッドＤＮＡ配列の従来の形成方法に伴な、う欠
点を回避し、しかも新規なノ別イブリッドポリペプチド
、それをコードするＤＮＡ配列並びにこれらＤＮＡ配列
およびポリペプチドの産生方法を提供することである。
本発明による新規なハイブリッドＤＮＡ配列は、少々く
ともλつの接続したヌクレオチド配列からなり、第７の
ヌクレオチド配列がその初期読枠における第２のヌクレ
オチド配列に接続されて、少なくとも３個、好ましくは
少なくとも５個のヌクレオチドよりなるＤＮＡ配列を介
し各配列におけるその読枠を一定に保ち、前記ヌクレオ
チドはハイブリッドを形成しようとする個所において両
親ＤＮＡ配列に共通であるか−または挿入される。これ
らの新規なりＮＡ配列は、本発明のハイブリッドポリペ
プチドをコードし、かつ適当な形質転換宿主におけるそ
の産生を可能にする。
ともλつの接続したヌクレオチド配列からなり、第７の
ヌクレオチド配列がその初期読枠における第２のヌクレ
オチド配列に接続されて、少なくとも３個、好ましくは
少なくとも５個のヌクレオチドよりなるＤＮＡ配列を介
し各配列におけるその読枠を一定に保ち、前記ヌクレオ
チドはハイブリッドを形成しようとする個所において両
親ＤＮＡ配列に共通であるか−または挿入される。これ
らの新規なりＮＡ配列は、本発明のハイブリッドポリペ
プチドをコードし、かつ適当な形質転換宿主におけるそ
の産生を可能にする。
本発明による方法は、これらハイブリッド１１ＤＮＡ配
列およびポリペプチドの作成を簡単かつ効率的に可能に
する。
列およびポリペプチドの作成を簡単かつ効率的に可能に
する。
ハイブリッドＤＮＡ配列を誘導すべき２つの親ＤＮＡ配
列が本来少なくとも３個、好ましくは少なくとも５個、
より好ましくは少なくとも？個、特に好ましくは少なく
とも７３個のヌクレオチドよりなる配列をハイブリッド
ＤＮＡ配列を形成しようとする位置に共通して有するよ
うな本発明による方法のｌ具体例において、この方法は
、 （ａｌ Ｄ Ｎ Ａ断片またはそのコンカテマーを
作成し、このＤＮＡ断片はハイブリッドＤＮＡ配列を誘
導すべき親ＤＮＡ配列の一方と、前記ＤＮＡ断片を宿主
細胞において複製しうるような完全レプリコンと、前記
ハイブリッドＤＮＡ配列を誘導すべき他方の親ＤＮ人配
列とを配列中に含み、前記λつの親ＤＮＡ配列はハイブ
リッドＤＮＡ配列を形成しようとする位置にて共通の少
なくとも３個、好ましくは少々くとも３個のヌクレオチ
ドの配列を有し、かつ前記２つの親配列におけるコード
配列の翻訳方向はＤＮＡ断片において互いに同方向であ
り、（ｂ）所望のハイブリッドＤＮＡ配列により形質転
換された宿主細胞を選択しかつそこから前記ハイブリッ
ドＤＮＡ配列を単離することを特徴とする特 ハイブリッドＤＮＡ配列を誘導すべきコつのｆｉＤＮＡ
配列が本来少なくとも３個、好ましくハ少なくとも１個
のヌクレオチドよりなる配列をハイブリッドＤＮＡ配列
を形成しようとする個所に共通して持たないような本発
明による方法の他の具体例において、この方法は、（ａ
）線状ＤＮＡ断片またはそのコンカテマーを作成し、前
記断片はハイブリッドＤＮＡ配列を誘導すべき親ＤＮ人
配列の一方と、この断片を宿主細胞において複製しうる
ような完全レプリコンと、ハイブリッドＤＮＡ配列を誘
導すべき親ＤＮＡ配列の他方とを配列中に含み、前記２
つの親配列におけるコード配列の翻訳方向はＤＮＡ断片
において互いに同方向であり、前記親ＤＮ人配列の一方
において少なくとも３個、好ましくは少なくとも３個の
ヌクレオチドよりなる配列を形成し、前記ヌクレオチド
配列は前記ノ・イブリッドを形成しようとする前記他方
のＤＮＡ配列における位置の前記他方の親ＤＮＡ配列に
おけるＤＮＡ配列と同一であり、かつ同じ読粋に存在し
、（Ｃ）所望のハイブリッドＤＮＡ配列により形質転換
された宿主細胞を選択しかつそこから前記ハイブリッド
ＤＮＡ配列を単離することを特徴とする。
列が本来少なくとも３個、好ましくは少なくとも５個、
より好ましくは少なくとも？個、特に好ましくは少なく
とも７３個のヌクレオチドよりなる配列をハイブリッド
ＤＮＡ配列を形成しようとする位置に共通して有するよ
うな本発明による方法のｌ具体例において、この方法は
、 （ａｌ Ｄ Ｎ Ａ断片またはそのコンカテマーを
作成し、このＤＮＡ断片はハイブリッドＤＮＡ配列を誘
導すべき親ＤＮＡ配列の一方と、前記ＤＮＡ断片を宿主
細胞において複製しうるような完全レプリコンと、前記
ハイブリッドＤＮＡ配列を誘導すべき他方の親ＤＮ人配
列とを配列中に含み、前記λつの親ＤＮＡ配列はハイブ
リッドＤＮＡ配列を形成しようとする位置にて共通の少
なくとも３個、好ましくは少々くとも３個のヌクレオチ
ドの配列を有し、かつ前記２つの親配列におけるコード
配列の翻訳方向はＤＮＡ断片において互いに同方向であ
り、（ｂ）所望のハイブリッドＤＮＡ配列により形質転
換された宿主細胞を選択しかつそこから前記ハイブリッ
ドＤＮＡ配列を単離することを特徴とする特 ハイブリッドＤＮＡ配列を誘導すべきコつのｆｉＤＮＡ
配列が本来少なくとも３個、好ましくハ少なくとも１個
のヌクレオチドよりなる配列をハイブリッドＤＮＡ配列
を形成しようとする個所に共通して持たないような本発
明による方法の他の具体例において、この方法は、（ａ
）線状ＤＮＡ断片またはそのコンカテマーを作成し、前
記断片はハイブリッドＤＮＡ配列を誘導すべき親ＤＮ人
配列の一方と、この断片を宿主細胞において複製しうる
ような完全レプリコンと、ハイブリッドＤＮＡ配列を誘
導すべき親ＤＮＡ配列の他方とを配列中に含み、前記２
つの親配列におけるコード配列の翻訳方向はＤＮＡ断片
において互いに同方向であり、前記親ＤＮ人配列の一方
において少なくとも３個、好ましくは少なくとも３個の
ヌクレオチドよりなる配列を形成し、前記ヌクレオチド
配列は前記ノ・イブリッドを形成しようとする前記他方
のＤＮＡ配列における位置の前記他方の親ＤＮＡ配列に
おけるＤＮＡ配列と同一であり、かつ同じ読粋に存在し
、（Ｃ）所望のハイブリッドＤＮＡ配列により形質転換
された宿主細胞を選択しかつそこから前記ハイブリッド
ＤＮＡ配列を単離することを特徴とする。
勿論、本発明のこの具体例においては、一方または他方
のＤＮＡ配列における共通ヌクレオチド配列の形成を、
ＤＮＡ断片の作成前に行ないうろことを了解すべきであ
る。さらに、２つの親ＤＮＡ配列における必要な同質性
を、両ＤＮＡ配列中に同一または類似の配列を挿入して
ＤＮＡ断片の作成の前または後に両配列中に所要の配列
同質性を組込むことにより与えうろことを了解すべきで
ある。
のＤＮＡ配列における共通ヌクレオチド配列の形成を、
ＤＮＡ断片の作成前に行ないうろことを了解すべきであ
る。さらに、２つの親ＤＮＡ配列における必要な同質性
を、両ＤＮＡ配列中に同一または類似の配列を挿入して
ＤＮＡ断片の作成の前または後に両配列中に所要の配列
同質性を組込むことにより与えうろことを了解すべきで
ある。
本発明の特に好適な具体例において、親ＤＮＡ配列のそ
れぞれは異なる抗生物質耐性標識と関連する。この好適
具体例において、所望の宿主細胞の選択は、形質転換宿
主細胞を両抗生物質を含有する寒天板の上で増殖させて
容易化することができる。この好適な選択方法は実用的
観点から本発明において極めて有用である。何故なら、
所望組換体もしくはハイブリッドＤＮＡ配列の収率が低
いからであり、一方もしくは他方の親ＤＮＡ配列による
またはλつの同−親ＤＮＡ配列の結合から生ずるＤＮＡ
配列による少量の汚染でさえ、高レベルの望ましくない
形質転換体を生じて、前記λつの抗生物質耐性なしには
所望のハイブリッドを選択すべくスクリーニングするの
が困難となるからである。
れぞれは異なる抗生物質耐性標識と関連する。この好適
具体例において、所望の宿主細胞の選択は、形質転換宿
主細胞を両抗生物質を含有する寒天板の上で増殖させて
容易化することができる。この好適な選択方法は実用的
観点から本発明において極めて有用である。何故なら、
所望組換体もしくはハイブリッドＤＮＡ配列の収率が低
いからであり、一方もしくは他方の親ＤＮＡ配列による
またはλつの同−親ＤＮＡ配列の結合から生ずるＤＮＡ
配列による少量の汚染でさえ、高レベルの望ましくない
形質転換体を生じて、前記λつの抗生物質耐性なしには
所望のハイブリッドを選択すべくスクリーニングするの
が困難となるからである。
本発明のさらに他の具体例において、ハイブリッドＤＮ
Ａ配列を形成するための環化および結合工程は試験管内
で行なわれ、ノ・イブリッドＤＮＡ配列による形質転換
の後に宿主細胞中に異質二重鎖のみを残す。この具体例
において、ＤＮＡ断片もしくはそのコンカテマーの末端
は、試験管内での環化および結合の前に単一鎖にされる
。
Ａ配列を形成するための環化および結合工程は試験管内
で行なわれ、ノ・イブリッドＤＮＡ配列による形質転換
の後に宿主細胞中に異質二重鎖のみを残す。この具体例
において、ＤＮＡ断片もしくはそのコンカテマーの末端
は、試験管内での環化および結合の前に単一鎖にされる
。
本発明のＤＮＡ配列は、少なくとも２個の接続されたヌ
クレオチド配列からなり、それぞれ接続されたＤＮＡ配
列は異なる親ＤＮＡ配列から誘導され、ヌクレオチドの
第１配列が初期読枠の第２のヌクレオチド配列に接続さ
れ、その読枠をハイブリッドを形成させようとする位置
にて両親ＤＮＡ配列に対し共通するまたは挿入される少
なくとも３個、好ましくは少なくとも１個のヌクレオチ
ドよりなるＤＮＡ配列を介して各配列において一定に維
持してなることを特徴とする。これらのＤＮＡ配列は、
各種の用途および生物学的活性を有する新規な蛋白質お
よびポリペプチドの産生を可能にする。
クレオチド配列からなり、それぞれ接続されたＤＮＡ配
列は異なる親ＤＮＡ配列から誘導され、ヌクレオチドの
第１配列が初期読枠の第２のヌクレオチド配列に接続さ
れ、その読枠をハイブリッドを形成させようとする位置
にて両親ＤＮＡ配列に対し共通するまたは挿入される少
なくとも３個、好ましくは少なくとも１個のヌクレオチ
ドよりなるＤＮＡ配列を介して各配列において一定に維
持してなることを特徴とする。これらのＤＮＡ配列は、
各種の用途および生物学的活性を有する新規な蛋白質お
よびポリペプチドの産生を可能にする。
本発明を一層よく理解するため、以下詳細に説明する。
第１図は、本発明による新規なハイブリッドＤＮＡ配列
を作成するための本発明による方法の／好適具体例を示
している。第１図に示した一つの新ＤＮＡ配列、すなわ
ちハイブリッドＤＮＡ配列を誘導する配列／およびコは
、少なくとも３個、好ましくは少なくとも１個、より好
ましくは少なくともｒ個、特に好ましくは少なくとも１
３個のヌクレオチドよりなる配列（３）をハイブリッド
ＤＮＡ配列を形成しようとする個所に共通して有する。
を作成するための本発明による方法の／好適具体例を示
している。第１図に示した一つの新ＤＮＡ配列、すなわ
ちハイブリッドＤＮＡ配列を誘導する配列／およびコは
、少なくとも３個、好ましくは少なくとも１個、より好
ましくは少なくともｒ個、特に好ましくは少なくとも１
３個のヌクレオチドよりなる配列（３）をハイブリッド
ＤＮＡ配列を形成しようとする個所に共通して有する。
第１図に示したように、親配列ｌおよびコはプラスミド
またはその他のクローン化ベヒクルの７部である。しか
しながら、本発明の方法に有用な親ＤＮＡ配列は任意の
ＤＮＡ配列源から誘導しうろことを了解すべきであり、
ただし結合の際にこれらはＤＮＡ断片（第１図における
断片夕）またはそのコンカテマーを形成するものとし、
この断片は配列において親ＤＮＡ配列の一方と、宿主細
胞において断片を複製しうるような完全レプリコン（第
１図における４ｔ）と、他方の親ＤＮ人配列とからなり
、これらλつの親ＤＮＡ配列は少なくとも３個、好まし
くは少なくとも３個のヌクレオチドよりなる配列をハイ
ブリッドＤＮＡを形成しようとする個所に共通して有し
、かつこれら２つの親配列におけるコード配列の翻訳方
向はＤＮＡ断片において互いに同方向である。ＤＮＡ配
列のこの種の原料は、たとえば天然源、合成源、半合成
源、ｏＤＮＡ保存物およびその組合せを包含する。
またはその他のクローン化ベヒクルの７部である。しか
しながら、本発明の方法に有用な親ＤＮＡ配列は任意の
ＤＮＡ配列源から誘導しうろことを了解すべきであり、
ただし結合の際にこれらはＤＮＡ断片（第１図における
断片夕）またはそのコンカテマーを形成するものとし、
この断片は配列において親ＤＮＡ配列の一方と、宿主細
胞において断片を複製しうるような完全レプリコン（第
１図における４ｔ）と、他方の親ＤＮ人配列とからなり
、これらλつの親ＤＮＡ配列は少なくとも３個、好まし
くは少なくとも３個のヌクレオチドよりなる配列をハイ
ブリッドＤＮＡを形成しようとする個所に共通して有し
、かつこれら２つの親配列におけるコード配列の翻訳方
向はＤＮＡ断片において互いに同方向である。ＤＮＡ配
列のこの種の原料は、たとえば天然源、合成源、半合成
源、ｏＤＮＡ保存物およびその組合せを包含する。
第１図に示した具体例において、ＤＮＡ断片ｊは、親Ｄ
ＮＡ配列／およびλと完全レプリコン弘とからなってい
る。さらに、これは第１親ＤＮＡ配列に関連する抗生物
質耐性標識Ａと第２親ＤＮ人配列に関連する抗生物質耐
性標識Ｂとからなっている。
ＮＡ配列／およびλと完全レプリコン弘とからなってい
る。さらに、これは第１親ＤＮＡ配列に関連する抗生物
質耐性標識Ａと第２親ＤＮ人配列に関連する抗生物質耐
性標識Ｂとからなっている。
この具体例におけるＤＮＡ断片！は、先ず親ＤＮＡ配列
ｌおよびコを有するプラスミドを各親ＤＮＡ配列の外部
に位置する制限部位を用いて線状化することにより作成
される。この線状化に使用される制限部位は両プラスミ
ドにおいて同一である必要はなく、ただし好ましくは適
当な制限残基を介してλつの断片の結合を容易化するた
めに同じ部位を使用する。しかしながら、同じ制限部位
を必要としないこれらλつの断片を結合させる各種の手
段を本発明の方法に使用しうろことを了解すべきである
。たとえば、これらの手段は、末端処理、鈍端化、充填
および合成リンカ並びに同じ末端部（たとえばμ＜ＩＩ
ＩおよびシェＨＩ）を与えるλつの異なる制限部位の使
用を包含する。
ｌおよびコを有するプラスミドを各親ＤＮＡ配列の外部
に位置する制限部位を用いて線状化することにより作成
される。この線状化に使用される制限部位は両プラスミ
ドにおいて同一である必要はなく、ただし好ましくは適
当な制限残基を介してλつの断片の結合を容易化するた
めに同じ部位を使用する。しかしながら、同じ制限部位
を必要としないこれらλつの断片を結合させる各種の手
段を本発明の方法に使用しうろことを了解すべきである
。たとえば、これらの手段は、末端処理、鈍端化、充填
および合成リンカ並びに同じ末端部（たとえばμ＜ＩＩ
ＩおよびシェＨＩ）を与えるλつの異なる制限部位の使
用を包含する。
第１図に示した具体例において、線状化したプラスミド
を次いで゛制限して（制限部位ＢＬ親ＤＮＡ配列ｌの開
始部前に位置する線状化プラスミドの部分と、親ＤＮＡ
配列コの末端部の後に位置する線状化プラスミドの部分
とを除去する。次いで、得られたＤＮＡ断片を結合して
断片ｊｔたはそのコンカテマーを形成させ、この断片は
１個のみのレプリコンを有しかつ親ＤＮＡ配列からの２
つのコード配列の翻訳方向はＤＮＡ断片において互いに
同方向である。さらに、断片！はそれぞれλつの異なる
親ＤＮＡ！ 配列に関連する抗生物質耐性標識Ａおよび
Ｂを有し、所望の断片構造の選択を容易化する。
を次いで゛制限して（制限部位ＢＬ親ＤＮＡ配列ｌの開
始部前に位置する線状化プラスミドの部分と、親ＤＮＡ
配列コの末端部の後に位置する線状化プラスミドの部分
とを除去する。次いで、得られたＤＮＡ断片を結合して
断片ｊｔたはそのコンカテマーを形成させ、この断片は
１個のみのレプリコンを有しかつ親ＤＮＡ配列からの２
つのコード配列の翻訳方向はＤＮＡ断片において互いに
同方向である。さらに、断片！はそれぞれλつの異なる
親ＤＮＡ！ 配列に関連する抗生物質耐性標識Ａおよび
Ｂを有し、所望の断片構造の選択を容易化する。
ここでも、第１図に示した本発明の具体例に使用する特
定の工程順序は、本発明の新規な）・イブリッドＤＮＡ
配列を作成するための本発明に使用するＤＮＡ配列配列
−成するのに必要としないことを了解すべきである。た
とえば、ＤＮＡ配列配列一方の親ＤＮＡ配列につき一端
部で開始しかつ他方の親配列につき他端部で終端させる
のが好適であるが、親ＤＮＡ配列の外部で開始しかつ／
または終端するＤＮＡ配列も本発明の方法に使用するこ
とができ、ただし付加的なヌクレオチド配列が選択配列
中にどこにも生じないものとする。親ＤＮＡ配列内で開
始しおよび／ｌたは終端するＤＮＡ配列も本発明に有用
である。本発明の方法に必要なことは、ＤＮＡ配列夕が
配列中に一方の親ＤＮＡ配列（１）と、完全レプリコン
（４ｔ）と、他方の親ＤＮＡ配列（，２）とを含み、λ
つの親ＤＮＡ配列が少なくとも３個、好ましくは少なく
ともｔ個のヌクレオチドよりなる配列をハイブリッドＤ
ＮＡを形成しようとする個所に共通して有し、かつλつ
の親ＤＮＡ配列におけるコード配列の翻訳方向がＤＮＡ
断片において互いに同方向であることである。
定の工程順序は、本発明の新規な）・イブリッドＤＮＡ
配列を作成するための本発明に使用するＤＮＡ配列配列
−成するのに必要としないことを了解すべきである。た
とえば、ＤＮＡ配列配列一方の親ＤＮＡ配列につき一端
部で開始しかつ他方の親配列につき他端部で終端させる
のが好適であるが、親ＤＮＡ配列の外部で開始しかつ／
または終端するＤＮＡ配列も本発明の方法に使用するこ
とができ、ただし付加的なヌクレオチド配列が選択配列
中にどこにも生じないものとする。親ＤＮＡ配列内で開
始しおよび／ｌたは終端するＤＮＡ配列も本発明に有用
である。本発明の方法に必要なことは、ＤＮＡ配列夕が
配列中に一方の親ＤＮＡ配列（１）と、完全レプリコン
（４ｔ）と、他方の親ＤＮＡ配列（，２）とを含み、λ
つの親ＤＮＡ配列が少なくとも３個、好ましくは少なく
ともｔ個のヌクレオチドよりなる配列をハイブリッドＤ
ＮＡを形成しようとする個所に共通して有し、かつλつ
の親ＤＮＡ配列におけるコード配列の翻訳方向がＤＮＡ
断片において互いに同方向であることである。
第１図に示した具体例において、ＤＮＡ配列配列−化並
びに両親ＤＮＡ配列にてハイブリッドを形成させようと
する位置におけるヌクレオチドの同質配列の重ね合せは
、このＤＮＡ配列により形質転換された宿主細胞により
生体内で行なわれる。この形質転換に使用される宿主細
胞は組換熱達菌とすべきであり、好ましくはｒａｎ Ａ
である。第１図に示した具体例において、宿主細胞は
ＤＮＡ配列同質性の領域内における親ＤＮＡ配列の結合
と異質結合とを行なって、所望のハイブリッドＤＮＡを
含むベクターまたはプラスミドを形成する。
びに両親ＤＮＡ配列にてハイブリッドを形成させようと
する位置におけるヌクレオチドの同質配列の重ね合せは
、このＤＮＡ配列により形質転換された宿主細胞により
生体内で行なわれる。この形質転換に使用される宿主細
胞は組換熱達菌とすべきであり、好ましくはｒａｎ Ａ
である。第１図に示した具体例において、宿主細胞は
ＤＮＡ配列同質性の領域内における親ＤＮＡ配列の結合
と異質結合とを行なって、所望のハイブリッドＤＮＡを
含むベクターまたはプラスミドを形成する。
しかしながら、さらにＤＮＡ配列の再環化および組換は
常法を用いて試験管内で行ない、異質結合を行なうため
にのみ宿主を使用しうろことを了解すべきである（たと
えば、第２図参照）。
常法を用いて試験管内で行ない、異質結合を行なうため
にのみ宿主を使用しうろことを了解すべきである（たと
えば、第２図参照）。
しかしながら、試験管内の結合はより多くの生化学的工
程を含むので、本発明の実施には好適でない。
程を含むので、本発明の実施には好適でない。
第１図に示した本発明の好適具体例において、ｊｉｌｌ
ＪＤＮＡ配列は、ノ・イブリッドＤＮＡ配列の形成が望
まれる個所に予め存在する所要の同質性を有する。この
よう々親ＤＮＡ配列は、たとえば７５個もしくはそれ以
上のヒト白血球インタフエロン、各種の動物白血球イン
タフエロン（たとえばネズミ、牛、豚、馬およびニワ）
ＩＪを含む）、ヒト繊維芽細胞インタフエロン（これ
は白血球インタフエロンと比較して７３個のヌクレオチ
ドまでの同質性範囲を特徴とする）、動物繊維芽細胞イ
ンタフエロン、ヒト免疫インタフェロンおよび動物免疫
インタフェロンｉ含する。さらに、これらは各種の関連
するリンホキン、並びに各種の菌株および口蹄疫ウィル
スの各種血清型に対する抗原を包含する。
ＪＤＮＡ配列は、ノ・イブリッドＤＮＡ配列の形成が望
まれる個所に予め存在する所要の同質性を有する。この
よう々親ＤＮＡ配列は、たとえば７５個もしくはそれ以
上のヒト白血球インタフエロン、各種の動物白血球イン
タフエロン（たとえばネズミ、牛、豚、馬およびニワ）
ＩＪを含む）、ヒト繊維芽細胞インタフエロン（これ
は白血球インタフエロンと比較して７３個のヌクレオチ
ドまでの同質性範囲を特徴とする）、動物繊維芽細胞イ
ンタフエロン、ヒト免疫インタフェロンおよび動物免疫
インタフェロンｉ含する。さらに、これらは各種の関連
するリンホキン、並びに各種の菌株および口蹄疫ウィル
スの各種血清型に対する抗原を包含する。
本発明の／具体例においては、親ＤＮＡ配列は所要の同
質性をもたない、したがって、この具体例においては第
３図に示すように、所要の同質性を親ＤＮＡ配列の一方
または両方に試験管内にて付加し、その際他方のｆｉＤ
ＮＡ配列または成る種の所定の配列におけるヌクレオチ
ド配列に対応したヌクレオチド配列を、ハイブリッドＤ
ＮＡ配列の形成が望まれる個所に付加する。所要の同質
性をλつの親ＤＮＡ配列に与えた後、上記の本発明によ
る方法の工程をこの具体例においても有益に使用して、
本発明による新規なハイブリッドＤＮＡ配列を生成させ
ることができる。したがって１本発明の方法は任意の親
ＤＮＡ配列に応用することができる。
質性をもたない、したがって、この具体例においては第
３図に示すように、所要の同質性を親ＤＮＡ配列の一方
または両方に試験管内にて付加し、その際他方のｆｉＤ
ＮＡ配列または成る種の所定の配列におけるヌクレオチ
ド配列に対応したヌクレオチド配列を、ハイブリッドＤ
ＮＡ配列の形成が望まれる個所に付加する。所要の同質
性をλつの親ＤＮＡ配列に与えた後、上記の本発明によ
る方法の工程をこの具体例においても有益に使用して、
本発明による新規なハイブリッドＤＮＡ配列を生成させ
ることができる。したがって１本発明の方法は任意の親
ＤＮＡ配列に応用することができる。
上記方法により本発明の新規なハイブリッドＤＮＡ配列
を作成した後、これら配列を使用してこれらによりコー
ドされる新規なポリペプチドを産生することができる。
を作成した後、これら配列を使用してこれらによりコー
ドされる新規なポリペプチドを産生することができる。
各種の公知方法および宿主を使用してこれらハイブリッ
ドＤＮＡ配列を発現させ、新規なポリペプチドを産生ず
ることができる。たとえば、このハイブリッドＤＮＡ配
列を上記方法で作成されたプラスミドから単離し、各種
の公知発現制御配列の制御下で各種公知の発現ベクター
中へ挿入し、かつこれを使用して各種の宿主を形質転換
させ、これら宿主を培養して所望のポリペプチドを産生
ずることができる。
ドＤＮＡ配列を発現させ、新規なポリペプチドを産生ず
ることができる。たとえば、このハイブリッドＤＮＡ配
列を上記方法で作成されたプラスミドから単離し、各種
の公知発現制御配列の制御下で各種公知の発現ベクター
中へ挿入し、かつこれを使用して各種の宿主を形質転換
させ、これら宿主を培養して所望のポリペプチドを産生
ずることができる。
発現制御配列は、発現ベクターにおける配列に作用結合
させた場合、ＤＮＡ配列の発現を制御するヌクレオチド
配列である。本発明の新規なハイブリッドＤＮＡ配列を
発現するのに有用なものは、特に限定はしないが世系、
９上系、ファージλのオペレータおよびプロモータ領域
、ｆｄコート蛋白質の制御領域、β−←」系、ＴｉＣ系
、ＴＲＣ系並びにその他の原始核もしくは成熟核細胞ま
たはそのウィルスの遺伝子の発現を制御することが知ら
れた配列、またはその組合せを包含する。
させた場合、ＤＮＡ配列の発現を制御するヌクレオチド
配列である。本発明の新規なハイブリッドＤＮＡ配列を
発現するのに有用なものは、特に限定はしないが世系、
９上系、ファージλのオペレータおよびプロモータ領域
、ｆｄコート蛋白質の制御領域、β−←」系、ＴｉＣ系
、ＴＲＣ系並びにその他の原始核もしくは成熟核細胞ま
たはそのウィルスの遺伝子の発現を制御することが知ら
れた配列、またはその組合せを包含する。
本発明のハイブリッドＤＮＡ配列を生体内で作成しかつ
これらハイブリッドＤＮＡ配列を発現させるため本発明
に有用な宿主はイー・コリの各種菌株、たとえばイー・
コリＨＢ１ｏｉ。
これらハイブリッドＤＮＡ配列を発現させるため本発明
に有用な宿主はイー・コリの各種菌株、たとえばイー・
コリＨＢ１ｏｉ。
イー・コリ／７７Ｊ、イー・コリ、２．２♂２、イー・
コリＭＲＣＩ、イー・コリＳＫ／ＪＰ、２およびイー・
コＩＪ ｒ ＯＪ 、シュードモナス、バチルス属（た
とえばバチルス・ズブチリス およびバチルス・ステア
ロターモフイルスヲ含ム）、酵母並びにその他の真菌類
、動物（支那ハムスター卵細胞）または植物宿主および
ヒト細胞培養物を包含する。ハイブリッドＤＮＡ配列を
生成するよう形質転換させるため、菌株は組換熟達菌と
すべきであり、特に好ましくはｒｅｃＡ＋とすべきであ
る。勿論、特定のハイブリッドＤＮＡ配列の生成または
発現に対し、全ての宿主／発現ベクターの組合せが同等
に有効であるとは限らない。しかしながら、宿主／ベク
ター組合せの特定の選択は、本発明の範囲を逸脱するこ
となく当業者により行なうことができる。
コリＭＲＣＩ、イー・コリＳＫ／ＪＰ、２およびイー・
コＩＪ ｒ ＯＪ 、シュードモナス、バチルス属（た
とえばバチルス・ズブチリス およびバチルス・ステア
ロターモフイルスヲ含ム）、酵母並びにその他の真菌類
、動物（支那ハムスター卵細胞）または植物宿主および
ヒト細胞培養物を包含する。ハイブリッドＤＮＡ配列を
生成するよう形質転換させるため、菌株は組換熟達菌と
すべきであり、特に好ましくはｒｅｃＡ＋とすべきであ
る。勿論、特定のハイブリッドＤＮＡ配列の生成または
発現に対し、全ての宿主／発現ベクターの組合せが同等
に有効であるとは限らない。しかしながら、宿主／ベク
ター組合せの特定の選択は、本発明の範囲を逸脱するこ
となく当業者により行なうことができる。
同様に、上記発現ベクター中へハイブリッドＤＮＡ配列
を挿入し、前記宿主を形質転換させ、またはこれら宿主
を培養する方法は本発明の範囲を逸脱することなく種々
の周知方法から選択することができる。
を挿入し、前記宿主を形質転換させ、またはこれら宿主
を培養する方法は本発明の範囲を逸脱することなく種々
の周知方法から選択することができる。
本発明のハイブリッドＤＮＡ配列を使用して産生される
新規なポリペプチドは各種の用途を有する。たとえば、
本発明により産生されるハイブリッドα−インタフェロ
ンは成る種の細胞において種々の活性を示し、かつ種々
の特異活性も示す。したがって、この種のハイブリッド
ハ、親インタフ二ロンの抗ウィルスおよび抗癌活性を改
変して特定細胞において或いは特定の病気に対して使用
するのに有用である。同様に、口蹄疫の抗原から得られ
るハイブリッド蛋白質は、各種の菌株および口蹄疫ウィ
ルスの各種の血清型に対する二価もしくは多価ワクチン
において有用である。
新規なポリペプチドは各種の用途を有する。たとえば、
本発明により産生されるハイブリッドα−インタフェロ
ンは成る種の細胞において種々の活性を示し、かつ種々
の特異活性も示す。したがって、この種のハイブリッド
ハ、親インタフ二ロンの抗ウィルスおよび抗癌活性を改
変して特定細胞において或いは特定の病気に対して使用
するのに有用である。同様に、口蹄疫の抗原から得られ
るハイブリッド蛋白質は、各種の菌株および口蹄疫ウィ
ルスの各種の血清型に対する二価もしくは多価ワクチン
において有用である。
本発明をより明瞭にするため、以下実施例を示す。これ
らの実施例は説明の目的であって、本発明を限定するも
のではない。
らの実施例は説明の目的であって、本発明を限定するも
のではない。
これら実施例に使用した酵素はニューΦイングランド・
ビオラプス・インコーホレーテッド社から購入した。さ
らに、標識ヌクレオチドはアメルシャム社から購入した
。また、イー・コリ菌株は次のように取得した＝８Ｋｔ
ｒ９２はニス・クシナー博士（ジョージャ大学）から入
手し、ざＣ３はケー・ムレ−博士（ニシンバラ大学）か
ら入手し、かつＣａＣ１！２処理したＳＫ／ｊ９．２は
エム・ストロイリから寄贈された。
ビオラプス・インコーホレーテッド社から購入した。さ
らに、標識ヌクレオチドはアメルシャム社から購入した
。また、イー・コリ菌株は次のように取得した＝８Ｋｔ
ｒ９２はニス・クシナー博士（ジョージャ大学）から入
手し、ざＣ３はケー・ムレ−博士（ニシンバラ大学）か
ら入手し、かつＣａＣ１！２処理したＳＫ／ｊ９．２は
エム・ストロイリから寄贈された。
親α／およびαコインタフエロン遺伝子を有するプラス
ミドは、公知方法を改変して作成した〔ティー・クリエ
ール等、アナリチカル・バイオケミストリー、第７６巻
、第４ｔ３／−グ４’／頁（ｌり７６）；ディー・ホル
ムス等、アナリチカル・バイオケミストリー、第１／≠
巻、第１り３−ｌり７頁（／！Ｐ♂／））。
ミドは、公知方法を改変して作成した〔ティー・クリエ
ール等、アナリチカル・バイオケミストリー、第７６巻
、第４ｔ３／−グ４’／頁（ｌり７６）；ディー・ホル
ムス等、アナリチカル・バイオケミストリー、第１／≠
巻、第１り３−ｌり７頁（／！Ｐ♂／））。
実施例Ｉ
実施例１は、イー・コリの組換技術を用いたヒトα／／
αコハイブリッドインタフエロンをコードするハイブリ
ッドＤＮＡ配列の生体内における生成、およびこの種の
ハイブリッド蛋白質のイー・コリにおける産生を示して
いる。αｌおよびαλヒトインタフエロンに対するＤＮ
Ａ配列は、たとえばエム・ストロイリ等により「少なく
とも３種のヒトα−インタフエロン：αコの構造」、サ
イエンス、第、２０２巻、第７３≠３−／Ｊ４’７頁（
／り♂Ｏ）に記載されている。さらに、ヨーロッパ特許
出願第３２１３弘号およびこれに関連して寄託されかつ
入手しうるクローンも参照することができる。
αコハイブリッドインタフエロンをコードするハイブリ
ッドＤＮＡ配列の生体内における生成、およびこの種の
ハイブリッド蛋白質のイー・コリにおける産生を示して
いる。αｌおよびαλヒトインタフエロンに対するＤＮ
Ａ配列は、たとえばエム・ストロイリ等により「少なく
とも３種のヒトα−インタフエロン：αコの構造」、サ
イエンス、第、２０２巻、第７３≠３−／Ｊ４’７頁（
／り♂Ｏ）に記載されている。さらに、ヨーロッパ特許
出願第３２１３弘号およびこれに関連して寄託されかつ
入手しうるクローンも参照することができる。
−ＪＪ−、り【
成熟αλインタフエロンをコード−ｉるＤＮＡ配列をプ
ラスミドｐＢＲ３，２，２のβ−ラクタマー □ゼ遺伝
子の開始コドンに融合させることにより、プラスミドｐ
Ｍ−２／ｆｆｉ作成した（イー・コリにおけるαコイン
タフエロンの高発現に関する作成）。この作成において
、インタフエロンコード配列およびその３′非コ一ド配
列によりβ−ラクタマーゼコード配列をＰｓｔ Ｉ部位
まで交換し、この部位においてβ−ラクタマーゼ配列へ
ポリ（ｄ ＧＣ）配列により結合させた。このプラスぐ
ドの残部はｐ Ｂ Ｒ３，２２と同一であって、完全な
テトラサイクリン耐性コード領域を含む（第７図）。さ
らに、ヨーロッパ特許出願第３２／３グ号およびＡＴＣ
ＣＪ／７４りも参照することかできる。
ラスミドｐＢＲ３，２，２のβ−ラクタマー □ゼ遺伝
子の開始コドンに融合させることにより、プラスミドｐ
Ｍ−２／ｆｆｉ作成した（イー・コリにおけるαコイン
タフエロンの高発現に関する作成）。この作成において
、インタフエロンコード配列およびその３′非コ一ド配
列によりβ−ラクタマーゼコード配列をＰｓｔ Ｉ部位
まで交換し、この部位においてβ−ラクタマーゼ配列へ
ポリ（ｄ ＧＣ）配列により結合させた。このプラスぐ
ドの残部はｐ Ｂ Ｒ３，２２と同一であって、完全な
テトラサイクリン耐性コード領域を含む（第７図）。さ
らに、ヨーロッパ特許出願第３２／３グ号およびＡＴＣ
ＣＪ／７４りも参照することかできる。
αコインタフエロン用のコード配列をｐＢＲ３，２λ中
へ挿入してｐＭ２ｔプラスミドを得たとほぼ同じ方法で
α／インタフエロンコード配列をｐＢＲＪｊｊの誘導体
中へ挿入して他方の親プラスミドｐＭｌ／ｋａｎを作成
した（第グーＪ４’ − 図）。さらに詳細には、先ず最初に、下記するようにテ
トラサイタリン、アンピシリンおよびカナマイシンに対
する耐性をコードする遺伝子を含んだｐＢＲＪココの訪
導体を作成し九〔カナマイシン耐性のものはｐＢＲＪ、
２．２ ｋａｎである〕。先ず、ｐＢＲＪ、２．２をｊ
ｏμｇ７Ｒ１の臭化エチジウムの存在下でＨａａｌによ
り部分切断して殆んど全寸法の線状分子を生成させた。
へ挿入してｐＭ２ｔプラスミドを得たとほぼ同じ方法で
α／インタフエロンコード配列をｐＢＲＪｊｊの誘導体
中へ挿入して他方の親プラスミドｐＭｌ／ｋａｎを作成
した（第グーＪ４’ − 図）。さらに詳細には、先ず最初に、下記するようにテ
トラサイタリン、アンピシリンおよびカナマイシンに対
する耐性をコードする遺伝子を含んだｐＢＲＪココの訪
導体を作成し九〔カナマイシン耐性のものはｐＢＲＪ、
２．２ ｋａｎである〕。先ず、ｐＢＲＪ、２．２をｊ
ｏμｇ７Ｒ１の臭化エチジウムの存在下でＨａａｌによ
り部分切断して殆んど全寸法の線状分子を生成させた。
次いで、これら断片を、ｐＣＲＩ（エム・ビレターの寄
贈）の訪導体をＨａｅｌｌ で完全切断して作成した等
量の／１Ｉ３０ｂｐ断片へ結合させた。
贈）の訪導体をＨａｅｌｌ で完全切断して作成した等
量の／１Ｉ３０ｂｐ断片へ結合させた。
この断片はカナマイシン耐性をコードする遺伝子を含有
した。次いで、カナマイシンおよびアンピシリンの耐性
に対する形質転換体を選択し、次いでテトラサイクリン
耐性に対するものを選択した。何らかの理由により、３
種全ての抗生物質に対する耐性につき同時に選択すると
、生存形質転換体が全く生じなかった。
した。次いで、カナマイシンおよびアンピシリンの耐性
に対する形質転換体を選択し、次いでテトラサイクリン
耐性に対するものを選択した。何らかの理由により、３
種全ての抗生物質に対する耐性につき同時に選択すると
、生存形質転換体が全く生じなかった。
選択形質転換体の制限地図は、この作成においてｐｃＲ
ｒの／グ３Ｏｂｐ±」■断片に含まれるカナマイシン耐
性遺伝子がｐ Ｂ Ｒ３ｊ−のＨａａ［部位中に２３１
２位置にて挿入されていることを示した（第参図）。
ｒの／グ３Ｏｂｐ±」■断片に含まれるカナマイシン耐
性遺伝子がｐ Ｂ Ｒ３ｊ−のＨａａ［部位中に２３１
２位置にて挿入されていることを示した（第参図）。
続いて、次のＤＮＡ配列を結合させてＰＭ／／ｋａｎを
作成した＝（１）上記カナマイシン耐性ｐＢＲ３，２２
＠導体（ｐＢＲＪλ、２ｋａｎ）の４ｔａｏ。
作成した＝（１）上記カナマイシン耐性ｐＢＲ３，２２
＠導体（ｐＢＲＪλ、２ｋａｎ）の４ｔａｏ。
ｂｐ −Ｐｓｉ ｌ−８ａｌ Ｉ 断片、（２）インタ
フエロンα／コード配列を含有するｐＭ／／の１０００
ｂｐ堕ニ一旦リエ断片、および（３）ｐＢｌ’１．２コ
銹導体（ｐＢＲＪ−２Ｊ ＲａｍＴＬ）の約ざ００ ｂ
ｐＣｌａ Ｉ ＝ Ｓａｌ Ｉ断片（この銹導体はシ、
ｍＨＩ部位に挿入されたボＩＪ（ｄＧ：ｄＣ））ラクト
により結合されたλＤＮＡ断片を含み、この断片に存在
するテトラサイクリン耐性をコードスル遺伝子は失活さ
れている）。上記３種の断片を低融点アガロースゲル（
シー・プラーク・アガユース、ＦＭＣコーポレーション
社）での電気泳動によって単離し、これらのゲルスライ
スを使用して６Ｊ′℃で溶融させた後に直接に結合させ
た。カナマイシン耐性に対する形質転換コロニーを選択
し、次いでそのテトラサイタリンおよびアンピシリン感
受性に基づいて選択した。
フエロンα／コード配列を含有するｐＭ／／の１０００
ｂｐ堕ニ一旦リエ断片、および（３）ｐＢｌ’１．２コ
銹導体（ｐＢＲＪ−２Ｊ ＲａｍＴＬ）の約ざ００ ｂ
ｐＣｌａ Ｉ ＝ Ｓａｌ Ｉ断片（この銹導体はシ、
ｍＨＩ部位に挿入されたボＩＪ（ｄＧ：ｄＣ））ラクト
により結合されたλＤＮＡ断片を含み、この断片に存在
するテトラサイクリン耐性をコードスル遺伝子は失活さ
れている）。上記３種の断片を低融点アガロースゲル（
シー・プラーク・アガユース、ＦＭＣコーポレーション
社）での電気泳動によって単離し、これらのゲルスライ
スを使用して６Ｊ′℃で溶融させた後に直接に結合させ
た。カナマイシン耐性に対する形質転換コロニーを選択
し、次いでそのテトラサイタリンおよびアンピシリン感
受性に基づいて選択した。
制限地図化により所望のｐ Ｍ ／ ／ ｋａ、ｎの構
造を確認した（第μ図）。
造を確認した（第μ図）。
本発明のハイブリッドＤＮＡ配列を作成するため＊ Ｐ
Ｍ／ ／ ｋａｎとｐＭ２／とを線状化しかつその断片
を結合させてＤＮＡ断片（より一般的にはコンカテマー
）を作成し、この断片は両親ＤＮＡ断片と完全レプリコ
ンとを含有した。
Ｍ／ ／ ｋａｎとｐＭ２／とを線状化しかつその断片
を結合させてＤＮＡ断片（より一般的にはコンカテマー
）を作成し、この断片は両親ＤＮＡ断片と完全レプリコ
ンとを含有した。
この断片はさらに、１つの抗生物質耐性標識（カナマイ
シン）とα／コード配列に関連する他の抗生物質耐性標
識の１部とα２コード領域に関連して断片を完成するテ
トラサイクリン耐性標識の部分とを含有する。その結果
、正確に作成された断片のみが両抗生物質耐性を示すの
で、所望ハイブリッドＤＮ人の選択が容易となる。
シン）とα／コード配列に関連する他の抗生物質耐性標
識の１部とα２コード領域に関連して断片を完成するテ
トラサイクリン耐性標識の部分とを含有する。その結果
、正確に作成された断片のみが両抗生物質耐性を示すの
で、所望ハイブリッドＤＮ人の選択が容易となる。
このＤＮＡ断片を作成するため％ ＰＭコｌを旦ａｌｌ
および旦すエによって制限し、がっｐＭ、２／の／ｊｌ
Ｏｂｐ塾±ニ一旦リエ断片をす離−３７−＾＾ した（第７図）。さらに、 ｐ Ｍ／ ／ ｋａｎを５
ａｌ（およびシ（ｌ ｌによって制限しかつｐＭ／ ／
ｋａｎのゲタ７０ ｂｐ Ｓａｌ ｌ −Ｂｇｌ １
１断片を単離した。これら断片を、１７０ｍＭトリス本
アセテート、ｔ ｍ Ｍ Ｅ Ｄ Ｔ Ａ （ｐＨ７，
１）における低融点アガロースでの電気泳動により切断
物から単離した（それぞれ／、２チおよびＯ１♂チ）。
および旦すエによって制限し、がっｐＭ、２／の／ｊｌ
Ｏｂｐ塾±ニ一旦リエ断片をす離−３７−＾＾ した（第７図）。さらに、 ｐ Ｍ／ ／ ｋａｎを５
ａｌ（およびシ（ｌ ｌによって制限しかつｐＭ／ ／
ｋａｎのゲタ７０ ｂｐ Ｓａｌ ｌ −Ｂｇｌ １
１断片を単離した。これら断片を、１７０ｍＭトリス本
アセテート、ｔ ｍ Ｍ Ｅ Ｄ Ｔ Ａ （ｐＨ７，
１）における低融点アガロースでの電気泳動により切断
物から単離した（それぞれ／、２チおよびＯ１♂チ）。
次いで、これら２つの断片を、、２０ｍＭトリス−ＨＣ
Ｊ （ＰＩ−１７，ｆｆ ）と／ ＯｍＭ ＭｇＣｌ２
と１０ｍＭＤＴＴと（７，、ｔｍＭＡＴＰとアガロース
溶融スライスからの／ ０−２０ ｆｍｏｌのＤＮＡ断
片（Ａｊ”Ｃにて溶融したアガローススライスコ〜ｊμ
１１アガロース最終濃度ｏ、３ｓ ％ ）とＤＮＡリガ
ーゼ（ｔｔｏｏ単位、ニューイングランド・ビオラプス
社から入手）とを含有する反応混合物、２０μｌにおい
て、／Ａ℃で７１時間にわたり結合させた。
Ｊ （ＰＩ−１７，ｆｆ ）と／ ＯｍＭ ＭｇＣｌ２
と１０ｍＭＤＴＴと（７，、ｔｍＭＡＴＰとアガロース
溶融スライスからの／ ０−２０ ｆｍｏｌのＤＮＡ断
片（Ａｊ”Ｃにて溶融したアガローススライスコ〜ｊμ
１１アガロース最終濃度ｏ、３ｓ ％ ）とＤＮＡリガ
ーゼ（ｔｔｏｏ単位、ニューイングランド・ビオラプス
社から入手）とを含有する反応混合物、２０μｌにおい
て、／Ａ℃で７１時間にわたり結合させた。
得られたＤＮＡ断片（第１図）は順次に、成熟αλイン
タフエロンをコードするＤＮＡ配列と、テトラサイクリ
ン耐性およびカナマイシン３ｇ− 耐性をコードするＤＮＡ配列と、ｐＢＲＪ、２．２から
の完全レプリコンと、α／インタフエロンのＣ００Ｈ−
末端部分をコードするＤＮＡ配列とからなっていた。さ
らに、親α／およびαλＤＮＡ配列がＤＮＡ断片中にて
相対的に正確な翻訳方向で存在し、ハイブリッドを形成
しようとする個所において少なくとも３個のヌクレオチ
ドよりなる同質配列の平行な重なりを可能にした。した
がって、本発明の方法によるこのＤＮＡ配列の環化は、
αλのアミノ末端とＣｌのカルボキシ末端とをコードす
るハイブリッドＤＮＡを生成し、ハイブリッド生成の位
置はα／コード領域におけるＢｇｌ［１部位の下流であ
る。
タフエロンをコードするＤＮＡ配列と、テトラサイクリ
ン耐性およびカナマイシン３ｇ− 耐性をコードするＤＮＡ配列と、ｐＢＲＪ、２．２から
の完全レプリコンと、α／インタフエロンのＣ００Ｈ−
末端部分をコードするＤＮＡ配列とからなっていた。さ
らに、親α／およびαλＤＮＡ配列がＤＮＡ断片中にて
相対的に正確な翻訳方向で存在し、ハイブリッドを形成
しようとする個所において少なくとも３個のヌクレオチ
ドよりなる同質配列の平行な重なりを可能にした。した
がって、本発明の方法によるこのＤＮＡ配列の環化は、
αλのアミノ末端とＣｌのカルボキシ末端とをコードす
るハイブリッドＤＮＡを生成し、ハイブリッド生成の位
置はα／コード領域におけるＢｇｌ［１部位の下流であ
る。
ＤＮＡ断片を環化させかつ所望のハイブリッドＤ Ｎ
Ａ配列を生成させるため、このＤＮＡ断片を塩化カルシ
ウム処理されたイー・コリＳＫｌ！タコ〔コーヘン等、
プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエン
スＵＳＡＳｉＥ６を巻、（１第コ／１０−．２／／４’
頁（ｌり７コ）に従って作成しかつ、２ｏ４グリセリン
中の！ＯｍＭＣａＣｊ２の溶液中にて一♂Ｏ℃で貯蔵〕
にトランスフェクトさせた。２．！μｌの結合ＤＮＡ、
！：／ ＯｍＭ ＣａＣｌ！２と／ ＯｍＭ ＭｇＣｌ
２と１０ｍＭトリｘ−ＨＣＩ （ＰＪ（７，６）とＣａ
Ｃｆｚ処理したイー・コリ細胞の懸濁液６３μｌとを含
有するトランスフェクション混合物１００μｌを使用し
た。次いで、得られた懸濁液を０℃にて７５分間かつ次
いで弘λ℃にて１分間維持し、ｔｕｔのＬ−プロスで希
釈し、そして振とうしながら３７℃にてり０分間培養し
た。
Ａ配列を生成させるため、このＤＮＡ断片を塩化カルシ
ウム処理されたイー・コリＳＫｌ！タコ〔コーヘン等、
プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエン
スＵＳＡＳｉＥ６を巻、（１第コ／１０−．２／／４’
頁（ｌり７コ）に従って作成しかつ、２ｏ４グリセリン
中の！ＯｍＭＣａＣｊ２の溶液中にて一♂Ｏ℃で貯蔵〕
にトランスフェクトさせた。２．！μｌの結合ＤＮＡ、
！：／ ＯｍＭ ＣａＣｌ！２と／ ＯｍＭ ＭｇＣｌ
２と１０ｍＭトリｘ−ＨＣＩ （ＰＪ（７，６）とＣａ
Ｃｆｚ処理したイー・コリ細胞の懸濁液６３μｌとを含
有するトランスフェクション混合物１００μｌを使用し
た。次いで、得られた懸濁液を０℃にて７５分間かつ次
いで弘λ℃にて１分間維持し、ｔｕｔのＬ−プロスで希
釈し、そして振とうしながら３７℃にてり０分間培養し
た。
次いで、形質転換細胞の混合物を、Ｌ−グロスとカナマ
イシン（３０μｇ・／ｍｌ）とテトラサイクリン（，２
０μ（１／ｍｌ）とを含有する寒天板に展延した。この
選択処理により、５ａ１１部位に正確に結合された両親
ＤＮＡ断片の要素を含むＤＮＡ配列で形質転換された細
胞のみが生存コロニーを生ずることが確保された。何故
から、この選択において、テトラサイクリン耐性領域の
近位部はＣｌ含有断片によシ与えられねばならないのに
対し、テトラサイクリン耐性領域およびカナマイシン耐
性遺伝子の遠位部はαｌ含有断片に由来するものでなけ
ればならないからである（第グ図）。
イシン（３０μｇ・／ｍｌ）とテトラサイクリン（，２
０μ（１／ｍｌ）とを含有する寒天板に展延した。この
選択処理により、５ａ１１部位に正確に結合された両親
ＤＮＡ断片の要素を含むＤＮＡ配列で形質転換された細
胞のみが生存コロニーを生ずることが確保された。何故
から、この選択において、テトラサイクリン耐性領域の
近位部はＣｌ含有断片によシ与えられねばならないのに
対し、テトラサイクリン耐性領域およびカナマイシン耐
性遺伝子の遠位部はαｌ含有断片に由来するものでなけ
ればならないからである（第グ図）。
λつの別途の実験において、上記結合混合物の部分（／
〜ｊｆｍｏｌ断片を含有する）のトランスフェクション
により、それぞれ３個および４ｔ７個の陽性コロニーを
得た。第一の実験で得た少数のコロニーは、この実験で
用いたアガロース含有結合混合物が従前にｉｔ’ｃで１
回溶融され、かつ次いで使用前に一、２．ｔ”Ｃで数日
間貯蔵されたという事実に基づいている。次の実験にお
いて、コロニー数はＤＮＡ断片ｐモル尚り／６００〜り
０００の範囲で変化した。
〜ｊｆｍｏｌ断片を含有する）のトランスフェクション
により、それぞれ３個および４ｔ７個の陽性コロニーを
得た。第一の実験で得た少数のコロニーは、この実験で
用いたアガロース含有結合混合物が従前にｉｔ’ｃで１
回溶融され、かつ次いで使用前に一、２．ｔ”Ｃで数日
間貯蔵されたという事実に基づいている。次の実験にお
いて、コロニー数はＤＮＡ断片ｐモル尚り／６００〜り
０００の範囲で変化した。
上記で選択した培養物からプラスミドを周知方法により
単離し、そしてこれらプラスミドを制限分析およびＤＮ
Ａ配列分析によって分析した〔エル・グオ等、ヌクレイ
ツク・アシッド拳リサーチ、第１θ巻、第２０６！−コ
Ｏざ≠頁（／り、ｒ、２））。この分析の結果を第１表
に要約する。
単離し、そしてこれらプラスミドを制限分析およびＤＮ
Ａ配列分析によって分析した〔エル・グオ等、ヌクレイ
ツク・アシッド拳リサーチ、第１θ巻、第２０６！−コ
Ｏざ≠頁（／り、ｒ、２））。この分析の結果を第１表
に要約する。
削除部を有するクローン／２．／を例外として、分析し
たクローンは空隙部も挿入部も伴なわずに正確に組換え
られたハイブリッドＤＮＡ配列を示した。この結論は、
（１）インタフエロン挿入物のｊ′および３′側におけ
るＢｇｌｉ１部位と整列制限部位との間の距離（第≠図
Ｌ（２）−２７個のプラスミドの適切部分の配列決定、
および（３）未試験のクローン／ 、２．／を例外とし
てこれら組換体を含有する細菌培養物はヒ）ｃｃ／、２
Ｊ細胞につき試験した場合、親ＩＦＮ−α２と同様なイ
ンタフェロン活性を示したという事実によって裏付けら
れる。
たクローンは空隙部も挿入部も伴なわずに正確に組換え
られたハイブリッドＤＮＡ配列を示した。この結論は、
（１）インタフエロン挿入物のｊ′および３′側におけ
るＢｇｌｉ１部位と整列制限部位との間の距離（第≠図
Ｌ（２）−２７個のプラスミドの適切部分の配列決定、
および（３）未試験のクローン／ 、２．／を例外とし
てこれら組換体を含有する細菌培養物はヒ）ｃｃ／、２
Ｊ細胞につき試験した場合、親ＩＦＮ−α２と同様なイ
ンタフェロン活性を示したという事実によって裏付けら
れる。
、２７個の配列決定したクローンのうち、α／（３りＡ
−４ｔｊ、２ ｂｐ ）配列とＣ２（３り３−４ｔ４（
Ｐｂｐ）配列との間の中断されてない同質性の最長範囲
に相当する交差領域が７．２回以上示されるような７つ
の異なる交差領域を確認した。さらに、これら７つの配
列はｊ種の異なるαλ−αｌハイブリッドインタフェロ
ンをコードし、そのうち１種のみが慣用の遺伝子工学技
術を用いてストロイリ等（上記）により得られているα
コーαｌハイブリッドインク７二ロ／と同一であった。
−４ｔｊ、２ ｂｐ ）配列とＣ２（３り３−４ｔ４（
Ｐｂｐ）配列との間の中断されてない同質性の最長範囲
に相当する交差領域が７．２回以上示されるような７つ
の異なる交差領域を確認した。さらに、これら７つの配
列はｊ種の異なるαλ−αｌハイブリッドインタフェロ
ンをコードし、そのうち１種のみが慣用の遺伝子工学技
術を用いてストロイリ等（上記）により得られているα
コーαｌハイブリッドインク７二ロ／と同一であった。
選択した６個のコロニー（３，３〜４１，１０２、ｉｏ
、ｔ％１０７および１１０）の培養物から抽出したプラ
スミドＤＮＡは第コのシ＜Ｉ１１部位に対し異質性を示
し、かつこれらコロニーの７つ（ｌＯ７）からのプラス
ミドＤＮＡも旦ｏｏＲＩ部位に対し異質性を示した。こ
れらの異質性は不完全結合の異質二重鎖の分離の結果で
あるか、或いは恐らくコンカテマーに共有結合した組換
競合ＤＮＡの数個のコピーによるトランスフェクション
の結果である。
、ｔ％１０７および１１０）の培養物から抽出したプラ
スミドＤＮＡは第コのシ＜Ｉ１１部位に対し異質性を示
し、かつこれらコロニーの７つ（ｌＯ７）からのプラス
ミドＤＮＡも旦ｏｏＲＩ部位に対し異質性を示した。こ
れらの異質性は不完全結合の異質二重鎖の分離の結果で
あるか、或いは恐らくコンカテマーに共有結合した組換
競合ＤＮＡの数個のコピーによるトランスフェクション
の結果である。
第 ｌ 表９
／、２．／ Ｏｎ、ｄ、 ｎ、ｄ、 ｎ、ｄ。
ｔ２．．２ ｔ ２ ／ ２．ｒＰ−２１３／２．３
２ ２ ／ ４ｔｊグー≠６１／ ／ ２ ／ ３り３
−グｊ、２ ２ Ｊ ２ ０ ｎ、ｄ。
２ ２ ／ ４ｔｊグー≠６１／ ／ ２ ／ ３り３
−グｊ、２ ２ Ｊ ２ ０ ｎ、ｄ。
３−．２ ／ 、２ ／ ３り３−４ｔｊｔ、２１、Ｌ
／ 、２ ／ ３／／−３／どｊ ／ 、２ ／ ３
／／−３／ざ Ａ ／ ２ ／ ３り３−４ｔ３．２ ７ ２ ．２ ｏ ｎ、ｄ。
／ 、２ ／ ３／／−３／どｊ ／ 、２ ／ ３
／／−３／ざ Ａ ／ ２ ／ ３り３−４ｔ３．２ ７ ２ ．２ ｏ ｎ、ｄ。
ｆ ／ ２ ／ Ｊり３−４’、ｔ、２１０コー／／
２ ／ ３り３−μｊ２１０２−２ ．２ ．２ ７
４ｔｔＯ−１／−１２（混合） ｔＯｊ−／ 、２ ２ ／ １１６０−１７ｇ２１０６
２ ．２ Ｏｎ、ｄ。
２ ／ ３り３−μｊ２１０２−２ ．２ ．２ ７
４ｔｔＯ−１／−１２（混合） ｔＯｊ−／ 、２ ２ ／ １１６０−１７ｇ２１０６
２ ．２ Ｏｎ、ｄ。
１０７−／／ ２ ／ ３３ター３５０１０７−’ｌ−
２２０ｎ、ｄ。
２２０ｎ、ｄ。
１０１ ／ コ ／ ３り３−≠６．２ｉｏタ ／ ２
／ ３／／、−３／ざ／１０−／ ／ ２ ／ ３り
３−グｊ、２１／θ−，２，２２／４ｔｔＯ−グざ２／
／／ ／ ２ ／ ３り３−４ｔｊ２／／、２ ／ ２
／ Ｊり３−４＃λ＊ 第１表中、［ｎ、ｄ、 Ｊは
［行なわず−１を意味する。
／ ３／／、−３／ざ／１０−／ ／ ２ ／ ３り
３−グｊ、２１／θ−，２，２２／４ｔｔＯ−グざ２／
／／ ／ ２ ／ ３り３−４ｔｊ２／／、２ ／ ２
／ Ｊり３−４＃λ＊ 第１表中、［ｎ、ｄ、 Ｊは
［行なわず−１を意味する。
この実施例１の方法によシ追加実鋏を行なって、１１個
の異なる交差領域を有する組換αコーαｌコード配列を
単離した（第６図参照）。
の異なる交差領域を有する組換αコーαｌコード配列を
単離した（第６図参照）。
これら１１個の領域は、第６図においてＡ乃至にとして
示されている。これら交差領域の１つ（Ｋ）は僅か３個
のヌクレオチドの同質性を有し、本発明の方法を用いる
組換のためには２つの親ＤＮＡ配列間に３個のヌクレオ
チドだけで充分な同質性が得られることを示している。
示されている。これら交差領域の１つ（Ｋ）は僅か３個
のヌクレオチドの同質性を有し、本発明の方法を用いる
組換のためには２つの親ＤＮＡ配列間に３個のヌクレオ
チドだけで充分な同質性が得られることを示している。
７７種の異なる組換体は、り種の異なるハイブリッドイ
ンタフエロンをコードした。これらは、領域Ａ、Ｄ、Ｅ
、Ｆ、Ｇ、ＨおよびＩ／Ｊに交差を有する組換体から生
じた。領域Ｂ、Ｃ。
ンタフエロンをコードした。これらは、領域Ａ、Ｄ、Ｅ
、Ｆ、Ｇ、ＨおよびＩ／Ｊに交差を有する組換体から生
じた。領域Ｂ、Ｃ。
■およびＪにおける交差は、暗黙ヌクレオチド変化のみ
が異なるＤＮＡ配列を産生じた。
が異なるＤＮＡ配列を産生じた。
これら組換αコーα／ ＤＮＡ配列を用いて宿主細胞を
形質転換古せ、かつこれらによりコードされたハイブリ
ッドインタフエロンを産生させた。次いで、ヒ）（ＷＩ
８Ｈ）細胞、ねずみ（Ｌりλり）細胞および牛（ＭＤＢ
Ｋ）細胞に対するこれらハイブリッドインタ７エロンの
粗製抽出物の抗ウィルス活性につき分析した。これらハ
イブリッドインタフエロンならびに親ＩＦＮ−αｌおよ
びＩＦＮ−αコの抗ウィルス活性を第７図に示す。
形質転換古せ、かつこれらによりコードされたハイブリ
ッドインタフエロンを産生させた。次いで、ヒ）（ＷＩ
８Ｈ）細胞、ねずみ（Ｌりλり）細胞および牛（ＭＤＢ
Ｋ）細胞に対するこれらハイブリッドインタ７エロンの
粗製抽出物の抗ウィルス活性につき分析した。これらハ
イブリッドインタフエロンならびに親ＩＦＮ−αｌおよ
びＩＦＮ−αコの抗ウィルス活性を第７図に示す。
両親とは異なる性質を有するインタフエロンを産生させ
るための本発明による方法の有用性は、ねずみ細胞に対
する抗ウィルス活性に見られる顕著な低下によって例示
され、これはハイブリッドインタ７エロンにおけるＣ０
０Ｈ−末端α／セグメントが２ｊ％以上短縮されるから
である。勿論、他のＩＦＮ−αハイブリッドも同様に本
発明の方法により産生されうろことを了解すべきである
。たとえば、ハイブリッドＤＮＡ配列を生成すべく上記
で使用した線状ＤＮＡ配列の作成につき選択した方法の
みが、αコのアミノ末端とαノのカルボキシ末端とを有
しかつαノのＢｇｌ１１部位の下流に交差領域を有する
ハイブリッドの産生を可能にした。しかしながら、他の
制限および切断パターンにより、任意の位置にまたは他
の２つの所定位置の間に両親ＤＮＡ配列の交差を得るこ
とができる。これら代替法の幾つかを下記実施例■〜Ｖ
に例示する。
るための本発明による方法の有用性は、ねずみ細胞に対
する抗ウィルス活性に見られる顕著な低下によって例示
され、これはハイブリッドインタ７エロンにおけるＣ０
０Ｈ−末端α／セグメントが２ｊ％以上短縮されるから
である。勿論、他のＩＦＮ−αハイブリッドも同様に本
発明の方法により産生されうろことを了解すべきである
。たとえば、ハイブリッドＤＮＡ配列を生成すべく上記
で使用した線状ＤＮＡ配列の作成につき選択した方法の
みが、αコのアミノ末端とαノのカルボキシ末端とを有
しかつαノのＢｇｌ１１部位の下流に交差領域を有する
ハイブリッドの産生を可能にした。しかしながら、他の
制限および切断パターンにより、任意の位置にまたは他
の２つの所定位置の間に両親ＤＮＡ配列の交差を得るこ
とができる。これら代替法の幾つかを下記実施例■〜Ｖ
に例示する。
この実施例においては、任意の位置に交差を有するＣ２
−αｌハイブリッドＤＮＡ配列の代替作成法の１例を示
す。
−αｌハイブリッドＤＮＡ配列の代替作成法の１例を示
す。
この方法においてはプラスミドｐＭＪ／を５ａｌｌおよ
び一巧ｉｔ■により制限して、ＩＦＮ−αｌコード領域
を含む断片を単離した。次いで、ＸｂａｌリンカをｐＭ
／／ｋａｎにおけるＩＦＮ−αｌ遺伝子の上流に導入し
てｐＭ７７ｋａｎ−Ｘｂａを得た。この作成のため、プ
ラスミドｐＧＩからの八りｋｂ旦ａｌ ｌ −Ｅａｏ
ＲＩ断片を使用した。何故なら、これはαｌコード配列
の上流にＸｂａ制限部位を有するからである〔たとえば
、ニー〇ワイドルおよびシー・ワイスマン、「ヒ）ＩＦ
Ｎ−α遺伝子の３′整列領域はウィルスの転写誘発を媒
介する」、ネイチャー、第３０３巻、第１−−グ６頁（
ｌりｒ３）〕。この作成を第５図に示す。次いで、ｐＭ
／ ／ ｋａｎ −Ｘｂａを５ａｌｌおよびＸｂａｌに
よって制限し、ＩＦＮ−αｌコード領域を含むルリ１−
Ｘｂａ７断片を単離した。本発明の範囲を逸脱すること
なく他の制限部位を同等に使用して、この実施例におけ
るαノーまたはαコー含有断片を生成させることができ
る。たとえば、ｐＭ／／ｋａｎの５ａｌＩ−Ｐｓｔｉ断
片を使用してαｌ含有断片を生成させることができる。
び一巧ｉｔ■により制限して、ＩＦＮ−αｌコード領域
を含む断片を単離した。次いで、ＸｂａｌリンカをｐＭ
／／ｋａｎにおけるＩＦＮ−αｌ遺伝子の上流に導入し
てｐＭ７７ｋａｎ−Ｘｂａを得た。この作成のため、プ
ラスミドｐＧＩからの八りｋｂ旦ａｌ ｌ −Ｅａｏ
ＲＩ断片を使用した。何故なら、これはαｌコード配列
の上流にＸｂａ制限部位を有するからである〔たとえば
、ニー〇ワイドルおよびシー・ワイスマン、「ヒ）ＩＦ
Ｎ−α遺伝子の３′整列領域はウィルスの転写誘発を媒
介する」、ネイチャー、第３０３巻、第１−−グ６頁（
ｌりｒ３）〕。この作成を第５図に示す。次いで、ｐＭ
／ ／ ｋａｎ −Ｘｂａを５ａｌｌおよびＸｂａｌに
よって制限し、ＩＦＮ−αｌコード領域を含むルリ１−
Ｘｂａ７断片を単離した。本発明の範囲を逸脱すること
なく他の制限部位を同等に使用して、この実施例におけ
るαノーまたはαコー含有断片を生成させることができ
る。たとえば、ｐＭ／／ｋａｎの５ａｌＩ−Ｐｓｔｉ断
片を使用してαｌ含有断片を生成させることができる。
これらλつの断片の結合によりＤＮＡ配列またはより一
般的にはそのコンカテマーが得られ、これは順次にαｌ
コード領域とｐＢＲ，？ｊ２からの完全レプリコンとα
ｌコード領域とからなっている。さらにＤＮＡ配列は、
カナマイシンに対する耐性標識およびテトラサイクリン
耐性に対する再編標識をも有する。
般的にはそのコンカテマーが得られ、これは順次にαｌ
コード領域とｐＢＲ，？ｊ２からの完全レプリコンとα
ｌコード領域とからなっている。さらにＤＮＡ配列は、
カナマイシンに対する耐性標識およびテトラサイクリン
耐性に対する再編標識をも有する。
実施例１に実質的に記載したようにカルシウム処理した
イー−コリを形質転換させた後、このＤＮＡ配列は任意
の領域における交差の可能性を有する各種のαコーα／
ハイブリッドの産生を可能にし、ここでαノとαコとの
コード配列間における同質の配列は少なくとも一連のｊ
個のヌクレオチド、好ましくは少なくともｇ〜／３個の
ヌクレオチドである。
イー−コリを形質転換させた後、このＤＮＡ配列は任意
の領域における交差の可能性を有する各種のαコーα／
ハイブリッドの産生を可能にし、ここでαノとαコとの
コード配列間における同質の配列は少なくとも一連のｊ
個のヌクレオチド、好ましくは少なくともｇ〜／３個の
ヌクレオチドである。
実施例■
この実施例においては、コード領域の最初の’Ａに交差
を有するαノーα／ハイブリッドＤＮＡ配列の作成方法
における他の具体例を示す。
を有するαノーα／ハイブリッドＤＮＡ配列の作成方法
における他の具体例を示す。
この方法において、プラスミドｐＭ２／を一線吐■およ
び和す■により制限し、ＩＦＮ−αコのアミノ末端に関
するコード領域を有するシリ■−シ＜Ｉｌｌ断片を単離
した。さらに、ｐＭ／／ｋａｎ−ＸｂａをＸｂａｌおよ
びＰｓｔ ｌにより制限し、ＩＦＮ−αｌのコード領域
を有する菱鴫１−Ｐすｌ断片を単離した。これら断片の
結合は、順次にα２コード領域の最初の約／乃とｐＢＲ
Ｊ２Ｊからの完全レプリコンとα／コード領域とからな
るＤＮＡ配列またはそのコンカテマーを産生じた。ここ
でも、他の制限部位を同等に使用してこれら断片を生成
させることができる。たとえば、ｐＭ／／ｋａｎの旦ａ
ｌ ｌ −Ｐｓｔ ｌ断片を使用してα／含有断片を生
成させることができる。
び和す■により制限し、ＩＦＮ−αコのアミノ末端に関
するコード領域を有するシリ■−シ＜Ｉｌｌ断片を単離
した。さらに、ｐＭ／／ｋａｎ−ＸｂａをＸｂａｌおよ
びＰｓｔ ｌにより制限し、ＩＦＮ−αｌのコード領域
を有する菱鴫１−Ｐすｌ断片を単離した。これら断片の
結合は、順次にα２コード領域の最初の約／乃とｐＢＲ
Ｊ２Ｊからの完全レプリコンとα／コード領域とからな
るＤＮＡ配列またはそのコンカテマーを産生じた。ここ
でも、他の制限部位を同等に使用してこれら断片を生成
させることができる。たとえば、ｐＭ／／ｋａｎの旦ａ
ｌ ｌ −Ｐｓｔ ｌ断片を使用してα／含有断片を生
成させることができる。
実施例１に実質的に記載したと同様にカルシウム処理し
たイー・コリを形質転換した後、このＤＮＡ配列はα／
コード領域の最初の／乃に交差の可能性を有する各種の
Ｃ２−α／ハイブリッドの産生を可能にし、ここでα／
コード領域を有する所要の同質性が存在する。
たイー・コリを形質転換した後、このＤＮＡ配列はα／
コード領域の最初の／乃に交差の可能性を有する各種の
Ｃ２−α／ハイブリッドの産生を可能にし、ここでα／
コード領域を有する所要の同質性が存在する。
この実施例においては、コード領域の中央の／乃に交差
を有するαノーα／ハイブリッドＤＮＡ配列の作成方法
を示す。この方法において、プラスミドｐＭ、２／を５
ａｉｌおよびＰｖｕ １１によって制限し、ＩＦＮ−α
コの最初の約９のコード領域を有する旦悼Ｉ一旦び■断
片を単離した。さらに、ｐＭ／ ／ ｋａｎ ｆ Ｓａ
ｌ ｌおよびＢｇｌＮＫよって市旧涙し、ＩＦＮ−αｌ
コード領域の最後の約伽を有する旦りＩ−馬＜ＩＩＩ断
片を単離した。ここでも、他の制限断片を使用すること
ができる。たとえば、ｐＭ／ ／ ｋａｎ −Ｘｂａの
入胚Ｉ−シ己■断片を使用してαｌ含有断片を生成させ
ることができる。
を有するαノーα／ハイブリッドＤＮＡ配列の作成方法
を示す。この方法において、プラスミドｐＭ、２／を５
ａｉｌおよびＰｖｕ １１によって制限し、ＩＦＮ−α
コの最初の約９のコード領域を有する旦悼Ｉ一旦び■断
片を単離した。さらに、ｐＭ／ ／ ｋａｎ ｆ Ｓａ
ｌ ｌおよびＢｇｌＮＫよって市旧涙し、ＩＦＮ−αｌ
コード領域の最後の約伽を有する旦りＩ−馬＜ＩＩＩ断
片を単離した。ここでも、他の制限断片を使用すること
ができる。たとえば、ｐＭ／ ／ ｋａｎ −Ｘｂａの
入胚Ｉ−シ己■断片を使用してαｌ含有断片を生成させ
ることができる。
これら断片の結合により、順次にα／コード領域の最初
の約例とｐＢＲ３，２２からの完全レプリコンとα／コ
ード領域の最後の約病とからなるＤＮＡ配列またはその
コンカテマーを得た。
の約例とｐＢＲ３，２２からの完全レプリコンとα／コ
ード領域の最後の約病とからなるＤＮＡ配列またはその
コンカテマーを得た。
実施例／に実質的に記載したようにカルシウム処理した
イー・コリを形質転換させた後、このＤＮＡ配列はα／
コード領域の中央の約／乃に交差の可能性を有する各種
のαλ−α／ハイブリッドの産生を可能にし、ここでα
／コード領域を有する所要の同質性が存在する。
イー・コリを形質転換させた後、このＤＮＡ配列はα／
コード領域の中央の約／乃に交差の可能性を有する各種
のαλ−α／ハイブリッドの産生を可能にし、ここでα
／コード領域を有する所要の同質性が存在する。
実施例■
この実施例においては、αｌコード領域のカルボキシ末
端に交差を有するαｌ−αコバイブリッドＤＮＡ配列の
製造方法を示している。この方法において、プラスミド
ＰＭ２／をμすＩおよびシリ田によって制限し、αコの
ＣＯＯ，Ｈ−末端に対するコード領域を有するＳａｔ
Ｔ −μ仕Ｕ断片を単離した。さらに、 ｐ Ｍ／ ／
ｋａｎをシリ■および旦すＩにより制限し、α／に対
する全コード領域を有する短いＳａｌ ７− Ｐｓｔ
１断片を単離した。これら断片の結合により配列中にα
／コード領域のＣ００Ｈ−末端とｐＢＲ３コ２からの完
全レプリコンと全α／コード領域とを含むＤＮＡ配列ま
たはそのコンヵテマーを得た。
端に交差を有するαｌ−αコバイブリッドＤＮＡ配列の
製造方法を示している。この方法において、プラスミド
ＰＭ２／をμすＩおよびシリ田によって制限し、αコの
ＣＯＯ，Ｈ−末端に対するコード領域を有するＳａｔ
Ｔ −μ仕Ｕ断片を単離した。さらに、 ｐ Ｍ／ ／
ｋａｎをシリ■および旦すＩにより制限し、α／に対
する全コード領域を有する短いＳａｌ ７− Ｐｓｔ
１断片を単離した。これら断片の結合により配列中にα
／コード領域のＣ００Ｈ−末端とｐＢＲ３コ２からの完
全レプリコンと全α／コード領域とを含むＤＮＡ配列ま
たはそのコンヵテマーを得た。
上記とほぼ同様にしてカルシウム処理したイー・コリを
形質転換させた後、このＤＮＡ配列はαｌコ〜ド領域の
カルボキシ末端に交差の可能性を有する各種のα／−α
コバイブリッドの産生を可能にし、ここでα２コード領
域を有する所要の同質性が存在する。
形質転換させた後、このＤＮＡ配列はαｌコ〜ド領域の
カルボキシ末端に交差の可能性を有する各種のα／−α
コバイブリッドの産生を可能にし、ここでα２コード領
域を有する所要の同質性が存在する。
抗生物質選択法はこの実施例には適用しない。
実施例■
実施例１−Ｖにおいては線状ＤＮＡ配列の環化工程を生
体内で行なった。これは本発明の最も好適な方法である
。しかしながら、環化は試験管内でも行なうことができ
、異質二重鎖のみが生体内で生ずる。この実施例は本発
明のこの具体例を示している。
体内で行なった。これは本発明の最も好適な方法である
。しかしながら、環化は試験管内でも行なうことができ
、異質二重鎖のみが生体内で生ずる。この実施例は本発
明のこの具体例を示している。
ｐＭ／／ｋａｎを和す■で切断して、これを位置／Ｉり
にて線状化させた。さらにＰＭ、２／をμ（ｌ［で部分
切断した（下流Ｂｇ１１部位（位置Ｈら）で終端する全
長線状化分子の約６０−７０％）。次いで、線状化プラ
スミド調製物のそれぞれをＴ４−ＤＮＡポリメラーゼで
切断して、各線状ＤＮＡ配列の末端３００−≠００ヌク
レオチドを単一鎖型に変換した。これら２つの配列をほ
ぼ同割合で混合した後、この混合物を融合させて残余の
空隙中にＤＮＡポリメラーゼで充填させた。次いで、得
られた生成物をシｓｌｌにより開裂させ、かつこれらを
リガーゼの存在下で標準条件を用いて環化させた。
にて線状化させた。さらにＰＭ、２／をμ（ｌ［で部分
切断した（下流Ｂｇ１１部位（位置Ｈら）で終端する全
長線状化分子の約６０−７０％）。次いで、線状化プラ
スミド調製物のそれぞれをＴ４−ＤＮＡポリメラーゼで
切断して、各線状ＤＮＡ配列の末端３００−≠００ヌク
レオチドを単一鎖型に変換した。これら２つの配列をほ
ぼ同割合で混合した後、この混合物を融合させて残余の
空隙中にＤＮＡポリメラーゼで充填させた。次いで、得
られた生成物をシｓｌｌにより開裂させ、かつこれらを
リガーゼの存在下で標準条件を用いて環化させた。
次いで、カルシウム処理したイーφコリＨＢ／ ０／
（ｒａｎ Ａ−）、イー・コリＪ’（７Ｊ（ｒｅｏ）ま
たはイー・コリＳＫ／！り、２ （ｒｅａ Ａ ５ｂｏ
Ｂ）を得られたＤＮＡで形質転換させた。各菌株からナ
ト２サイクリンとカナマイシンとの両者に対し耐性のコ
ロニーを得たが、さらに分析した２７個のコロニーのう
ち僅か１個のみ（ＨＢ＃）／形質転換体）が削除部また
は他の転位配列をもたなかった。このクローンは２個の
Ｐｖｕ ｉ１部位を有し、１個の旦ａｏＲＩ部位とその
組換領域とは領域Ｃに存在した（第６図）。したがって
、生体内における処理はより効果的かつしたがって好適
であるが、試験管内の処理も本発明のハイブリッドＤＮ
Ａの生成を可能にする。
（ｒａｎ Ａ−）、イー・コリＪ’（７Ｊ（ｒｅｏ）ま
たはイー・コリＳＫ／！り、２ （ｒｅａ Ａ ５ｂｏ
Ｂ）を得られたＤＮＡで形質転換させた。各菌株からナ
ト２サイクリンとカナマイシンとの両者に対し耐性のコ
ロニーを得たが、さらに分析した２７個のコロニーのう
ち僅か１個のみ（ＨＢ＃）／形質転換体）が削除部また
は他の転位配列をもたなかった。このクローンは２個の
Ｐｖｕ ｉ１部位を有し、１個の旦ａｏＲＩ部位とその
組換領域とは領域Ｃに存在した（第６図）。したがって
、生体内における処理はより効果的かつしたがって好適
であるが、試験管内の処理も本発明のハイブリッドＤＮ
Ａの生成を可能にする。
ＩＦＮ−βの組換体を作成した。この方法の概略を第ｒ
図に示す。ＩＦＮ−βをコードするＤＮＡ配列は、たと
えばアール・プリンク等により［ヒト繊維芽細胞インタ
フエロン遺伝子の単離および構造−１１ネイチヤー、第
、２♂！巻、第１−一グ６頁（ｌり１ｒｏ））に記載さ
れている。さらに、ヨーロッパ特許出願第≠／３／３号
並びにそれに関連して寄託しかつ入手しうるクローンを
参照することができる。
図に示す。ＩＦＮ−βをコードするＤＮＡ配列は、たと
えばアール・プリンク等により［ヒト繊維芽細胞インタ
フエロン遺伝子の単離および構造−１１ネイチヤー、第
、２♂！巻、第１−一グ６頁（ｌり１ｒｏ））に記載さ
れている。さらに、ヨーロッパ特許出願第≠／３／３号
並びにそれに関連して寄託しかつ入手しうるクローンを
参照することができる。
次の３個のＤＮＡ断片を結合させることによりプラスミ
ドｐＧＢ（第ｒ図）を作成した：（１）グラスミドｐＢ
Ｒ３，２ｊ ＦＩＦ（ダブ、ツユ。
ドｐＧＢ（第ｒ図）を作成した：（１）グラスミドｐＢ
Ｒ３，２ｊ ＦＩＦ（ダブ、ツユ。
ファイエルスの寄贈）の０．７７ ｋｂ Ｈｉｎｃ １
１ 断片（この断片はＩＦＮ−βに対するコード領域を
含む） １（２）ｐ Ｂ Ｒ７２，２ｋａｎ （上記）
のＬＡｋｂ部分顯止■−ル壮Ｉ断片；および（３） ｐ
Ｂ Ｒ３２２ＢａｍＲ（上記）の／、２ ｋｂ部分Ｈ
ｉｎａｌｌ−ｆｉ、ａ１７１００これらをリガーゼの存
在下で結合させた。次いで、このプラスミドを使用シて
形質転換体を作成し、かつアンピシリン、カナマイシン
およびテトラサイタリンに対する耐性により上記のよう
に陽性クローンを選択した。
１ 断片（この断片はＩＦＮ−βに対するコード領域を
含む） １（２）ｐ Ｂ Ｒ７２，２ｋａｎ （上記）
のＬＡｋｂ部分顯止■−ル壮Ｉ断片；および（３） ｐ
Ｂ Ｒ３２２ＢａｍＲ（上記）の／、２ ｋｂ部分Ｈ
ｉｎａｌｌ−ｆｉ、ａ１７１００これらをリガーゼの存
在下で結合させた。次いで、このプラスミドを使用シて
形質転換体を作成し、かつアンピシリン、カナマイシン
およびテトラサイタリンに対する耐性により上記のよう
に陽性クローンを選択した。
これらの陽性クローンから、第♂図に図示した方向性で
挿入物を有するプラスミドを特徴とした１個のクローン
を選択した。このプラスミドをｐＧＢと命名した。
挿入物を有するプラスミドを特徴とした１個のクローン
を選択した。このプラスミドをｐＧＢと命名した。
次いで、ｐＧＢを死りｒおよび町と」で制限し、かつＩ
ＦＮ−βコード領域を有するｊ、３ｋｂ Ｓａｌ ｉ一
旦むヱｎ断片を単離した。さらに、ｐＭ２／を旦すＩお
よび旦りＩで制限し、ＩＦＮ−αココード領域を有する
７、７ ｋｂ尺す」−蜘す■断片を単離した。次いで、
これら断片をリガーゼの存在下で結合させた。
ＦＮ−βコード領域を有するｊ、３ｋｂ Ｓａｌ ｉ一
旦むヱｎ断片を単離した。さらに、ｐＭ２／を旦すＩお
よび旦りＩで制限し、ＩＦＮ−αココード領域を有する
７、７ ｋｂ尺す」−蜘す■断片を単離した。次いで、
これら断片をリガーゼの存在下で結合させた。
得られたＤＮＡ断片（第ｒ図）はＪＦＮ−βをコードす
るＤＮＡ配列と、カナマイシン耐性およびテトラサイク
リン耐性をコードするＤＮＡ配列と、ＩＦＮ−αλをコ
ードするＤＮＡ配列とからなっていた。さらに、一つの
ＩＦＮコード配列は相対的に同じ翻訳方向性を有し、本
発明の方法によりハイブリッドを生成するための−Ｊに
−へ１噌 同質配列の平行な重なりを可能にする。
るＤＮＡ配列と、カナマイシン耐性およびテトラサイク
リン耐性をコードするＤＮＡ配列と、ＩＦＮ−αλをコ
ードするＤＮＡ配列とからなっていた。さらに、一つの
ＩＦＮコード配列は相対的に同じ翻訳方向性を有し、本
発明の方法によりハイブリッドを生成するための−Ｊに
−へ１噌 同質配列の平行な重なりを可能にする。
上記ＤＮＡ断片を環化させかつ所望のハイブリッドＤＮ
Ａ配列を生成させるため、これをイーーコ＋）ＳＫ／！
９コにトランスフェクトさせ、かつ陽性クローンを前記
と同様に選択した。
Ａ配列を生成させるため、これをイーーコ＋）ＳＫ／！
９コにトランスフェクトさせ、かつ陽性クローンを前記
と同様に選択した。
μつの交差領域、すなわちＦ３＋ ＦＢ 、 Ｆｉ Ｏ
およびＦ１５からハイブリッドを得た（第２図参照）。
およびＦ１５からハイブリッドを得た（第２図参照）。
それぞれはＩＦＮ−α２の５７部分とＩＦＮ−βの３′
部分とを有した。交差領域Ｆ５゜Ｆ’＋ｏおよびＦｉ５
における組換体は「相内」にあシ、すなわちこれらは同
質位置に生ずる。交差領域Ｆ６における組換体は、ＩＦ
Ｎ−βコード領域におけるλつの位置に反復Ｔ Ｇ Ａ
Ｇ Ａ 同質性を有するため「異質Ｊ組換体である。
部分とを有した。交差領域Ｆ５゜Ｆ’＋ｏおよびＦｉ５
における組換体は「相内」にあシ、すなわちこれらは同
質位置に生ずる。交差領域Ｆ６における組換体は、ＩＦ
Ｎ−βコード領域におけるλつの位置に反復Ｔ Ｇ Ａ
Ｇ Ａ 同質性を有するため「異質Ｊ組換体である。
これらαλ−β組換体を使用して宿主細胞を形質転換さ
せ、かつこれらによりコードされたαコーβハイブリッ
ドインタフェロンを産生させた。次いで、ヒト細胞およ
び生細胞の両者に対するαコーβハイブリッドインタフ
ェロンの抗ウィルス活性を粗製抽出物および常法を用い
５７− て分析した。得られた結果を第１表に示す。
せ、かつこれらによりコードされたαコーβハイブリッ
ドインタフェロンを産生させた。次いで、ヒト細胞およ
び生細胞の両者に対するαコーβハイブリッドインタフ
ェロンの抗ウィルス活性を粗製抽出物および常法を用い
５７− て分析した。得られた結果を第１表に示す。
第■表
ヒト（ＷＩＳＨ）細胞 −−−／６０
牛（ＭＤＢＫ）細胞 −−１０，２６００したがって、
交差領域ＦＮＩおよびＦ１５からのハイブリッドα２−
βインタフエロンは抗ウィルス活性を有する。さらに、
ヒト細胞および牛細胞に対するこの活性の比は約／；ｌ
！である。
交差領域ＦＮＩおよびＦ１５からのハイブリッドα２−
βインタフエロンは抗ウィルス活性を有する。さらに、
ヒト細胞および牛細胞に対するこの活性の比は約／；ｌ
！である。
これに対校し、ＩＦＮ−αコはヒト細胞および牛細胞に
対し約／１／の抗ウィルス活性の比を有する。
対し約／１／の抗ウィルス活性の比を有する。
ここでも、上記の例は単に例示に過ぎないことを了解す
べきである。ＩＦＮ−αコとＩＦＮ−βとの間の他の交
差領域を使用し、かつ他のハイブリッドα−βもしくは
β−αインタフエロンを本発明の教示にしたがって作成
することができる。
べきである。ＩＦＮ−αコとＩＦＮ−βとの間の他の交
差領域を使用し、かつ他のハイブリッドα−βもしくは
β−αインタフエロンを本発明の教示にしたがって作成
することができる。
実施例Ｖｌｌｌ
この実施例においては、ヒト■ＦＮ−αコおよびネズミ
ＩＦＮ−αコの組換体を作成した。
ＩＦＮ−αコの組換体を作成した。
この方法の概略を第７θ図に示す。
第７０図に示したように、次の３種のＤＮＡ断片を結合
してプラスミドｐＭ／／ｋａｎ−ネズミを作成した：（
１）ｐＭＩＦαコの０．７ ｋｂ当■−Ｐｓｔ ｌ断片
〔ジー・ディー・ショウ等、ヌクレイツク・アシッド・
リサーチ、第１／巻、第６６６−７３頁（／りにＪ））
；（２）ｐＭＩｒαコの０．７ ｋｂヰｉ−リ■一旦す
−■断片；（３）ｐＭ／／ｋａｎのＬ７ ｋｂΔｈａ
ｌ −Ｈｉｎｄ Ｉｌｌ （部分）断片。
してプラスミドｐＭ／／ｋａｎ−ネズミを作成した：（
１）ｐＭＩＦαコの０．７ ｋｂ当■−Ｐｓｔ ｌ断片
〔ジー・ディー・ショウ等、ヌクレイツク・アシッド・
リサーチ、第１／巻、第６６６−７３頁（／りにＪ））
；（２）ｐＭＩｒαコの０．７ ｋｂヰｉ−リ■一旦す
−■断片；（３）ｐＭ／／ｋａｎのＬ７ ｋｂΔｈａ
ｌ −Ｈｉｎｄ Ｉｌｌ （部分）断片。
次いで、ｐＭ／／ｋａｎ−ネズミをＰｓｔ （およびｐ
ａｌ ｌで制限して、ネズミＩＦＮ−α２コード領域を
有するグ、７ ｋｂ ＰすＩ−生ｔｌＪ断片を作成した
。次いで、この断片をヒ）ＩＦＮαコのコード領域のア
ミン末端部分を有するｐＭ、２／カラ（Ｄ １．１．
ｋｂ 、Ａｌす１ｌ−ｐａｌｌ断片と結合させた。前記
と同様に宿主細胞中へ形質転換させると、ヒトーネズミ
ハイプリツドインタフエロンを産生ずるのに有用な各種
の組換ヒトαλ−ネズミα、２ＤＮＡ配列を生成させる
ことができた。
ａｌ ｌで制限して、ネズミＩＦＮ−α２コード領域を
有するグ、７ ｋｂ ＰすＩ−生ｔｌＪ断片を作成した
。次いで、この断片をヒ）ＩＦＮαコのコード領域のア
ミン末端部分を有するｐＭ、２／カラ（Ｄ １．１．
ｋｂ 、Ａｌす１ｌ−ｐａｌｌ断片と結合させた。前記
と同様に宿主細胞中へ形質転換させると、ヒトーネズミ
ハイプリツドインタフエロンを産生ずるのに有用な各種
の組換ヒトαλ−ネズミα、２ＤＮＡ配列を生成させる
ことができた。
ここでも、他の制限部位およびＴＦＮ−α遺伝子を使用
して、本発明の方法にしたがい、この種のヒトーネズミ
ハイブリッドＤＮＡ配列およびインタフエｐンを生成さ
せることができる。
して、本発明の方法にしたがい、この種のヒトーネズミ
ハイブリッドＤＮＡ配列およびインタフエｐンを生成さ
せることができる。
本発明の上記構成により、新規なハイブリッドポリペプ
チド、これらをコードするＤＮＡ配列並びにこれら新規
なハイブリッドＤＮＡ配列およびポリペプチドの産生方
法が得られる。
チド、これらをコードするＤＮＡ配列並びにこれら新規
なハイブリッドＤＮＡ配列およびポリペプチドの産生方
法が得られる。
第１図は本発明のハイブリッドＤＮＡ配列の作成方法を
示すｌ具体例の略図であり、第２図は本発明のハイブリ
ッドＤＮＡ配列を作成する試験管内の方法を示す他の具
体例の略図であり、 第３図は本発明のハイブリッドＤＮＡ配列の作成方法を
示す第３具体例の略図であり、第グ図は前記実施例／に
説明する本発明の具体例の略図であり、 第５図はｐ Ｍ ／ ／ ｋａｎ −Ｘｂａの作成を示
す略図であり、 第６図は本発明による方法の７具体例を用いてハイブリ
ッドを単離するＩＦＮ−α／およびＩＦＮ−α−並びに
１１個の交差領域Ａ−Ｋを有するヌクレオチド配列を示
し、 第７図は異なる目標細胞に対する各種のαλ−α／ハイ
ブリッドインタフエロンの抗ウィルス活性を示すグラフ
でアリ、 第ｒ図はα２−βハイブリッドインタフエロンを作成す
るための本発明による方法のｌ具体例を示す略図であり
、 第り図は「最大配列同質性」およびグ個の交差領域Ｆ３
．Ｆ♂、Ｆ１０およびＦｌｊにつきコンピュータで整列
させたＩＦＮ−βおよびＩＦＮ−αコのヌクレオチド配
列を示し、ここでハイブリッドは本発明による方法のｌ
具体例を用いて単離され。 第１Ｏ図はヒトαλ−ネズミαλハイブリットインタフ
エロンを作成するための本発明による方法の／具体例を
示す略図である。 特許出願人 バイオジエン ナームローズペンノットシ
ャップ ーｔコ− ６４３− １− ｕｕ ｕ ｔ− ｕ 」−Ｃｊ Ｔ網口九０−７００８３ （２０） ０ （Ｊ ＞ ＞ｕ ＋−（ ぬ （ｊＪ ＪＯ０ＬＪ− ＋−１−（ＪＯじ ロロ へ−Φく へ 置 に９１日 −一 トη （Ｊ Ｏ０（Ｊ Ｑ乙 乙。 り訓 ■α αＱ 寵あ 深 ＬＯＺ 口（（ＣＬＤ 、（ｊＬ。 呂−Ｉ匠訓 １講旨品 −。 一 １５屈１１！−（犀ｄ 口〉 １−（ｔＱｌ− Ｈω ωヒ ３１雪訓 ■Ｌ１．ｌ ｕＪＣＪ くロ ロく ＜＜＜＜ 層側 冒訓 Ｉ澗ゴ 己；１ −〜〜 １；Ｊｌ トー← Ｎ） 乙←−（） ２ ψ＜＜」 くロ ｔＪＬ。 層； “−°゛ １眠１ く← 〉Ｃ １ゑ臣 みピχ ｗＵ くい 一←０ く（ −く＋■ く」 １コ葺 −・ ＣＪ乙 りく ＝ ＡＢ− 【 ロ Ｃコ （Ｉ／Ｖ＋←田 コト／）１ｗ− （Ｎ α■Ｏく く ０ １ひ−１０、く÷０ φ＜３１− ＋い １３コ１ °°°３ トー ＬＩＪ ｕＪ←− トー」」 ト一 〇 コ！ ００−１）−Ｏ！：ｌ ０ １ ＬＯ＜に； −
定図冒 ＩＪ罐 ０ ０ ０χ＋−＋σ く＝ ０ コく＋■ Ｎ’ｌ ＞＜ ｆ （Ｊ ｔＤ −（ζ−ヒｌ−コロ
１＋ｌ ロリ コＵ（！： Ｚ Ｚ ｇＣ Ｕｌ−（Ｊ Ｊ（ 」Ｑ ＱＣロＱ α）−００コ コロ ＝■ Ｎ−１−ＬＬＩ ｕ、ｌ ）− ←く ３ ←−」ヒ ｕＪ（Ｊ ０ ＣＪＺ ＺＬＪ ０ −Ｉ＋■ くψ ψ（＋に −くｈ くく くくζ Φ（（ｃｔｃｔ（ αＣｊ （Ｊ−工Ｑ ＜＜＜１− ←く αく ｌ肝・ ８、コ澗 −− ＬｕＣｊ ｌす＝ コくＩ ：ｌ：ｌ−０Ｊ −““。 ユ１−＋ＮＩ−−−Ｉ−＋■ ○ Ｍ ζ ）−α α→ −庄だ １ 巳屓 屓と ６４８− く く Ｑ ■ ヘー ＦＩＧ。 ・・ 入と＋ 十Ｇと 入Ａ占 ＡＡ入 Ｇｒ＋ ＴＡ
Ａ Ｇ大入 ＧＴ。 ＡＡＧ ＧＡＡ 手続補正書（凪） 昭和５９年 ９月６１１ 特許庁長官 志 賀 学 殿 １、事件の表示 昭和５９年 特許願 第１１７４８５号２、発明の名称 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 オランダ領アンチル、クラカオ、ウイルムシュタ
ソト、ピーターマーイ １５番 名称 バイオジエン ナームローズ ベンノソトシャノ
プ代表者 ペー、ゲー、シビンガ 同 ペー、ツェー、アー、パン ザンビークーＬ１ンダ
申牝酌（オランダ領アンチル） ４、代理人 ６、補正の内容 ｔ４＋ ）３１用頃Ｍ号 手続補正書（方力 昭和５９年１０月２．＋ｆ日 特許庁長官 志 賀 学 殿 ■、事件の表示 昭和５９年特許願第１１７４８５号 ２、発明の名称 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 オランダ領アンチル、クラカオ、ウィルムシュタ
ソト、ピーターマーイ １５番 名称 バイオジエン ナームローズ ベンノソトシャソ
プ代表者 ペー、ゲー、シビンガ 同 ぺ−、ツェー、アー、パン ザンビークーロンダ■
面）（オランダ領アンチル） ４、代理人
示すｌ具体例の略図であり、第２図は本発明のハイブリ
ッドＤＮＡ配列を作成する試験管内の方法を示す他の具
体例の略図であり、 第３図は本発明のハイブリッドＤＮＡ配列の作成方法を
示す第３具体例の略図であり、第グ図は前記実施例／に
説明する本発明の具体例の略図であり、 第５図はｐ Ｍ ／ ／ ｋａｎ −Ｘｂａの作成を示
す略図であり、 第６図は本発明による方法の７具体例を用いてハイブリ
ッドを単離するＩＦＮ−α／およびＩＦＮ−α−並びに
１１個の交差領域Ａ−Ｋを有するヌクレオチド配列を示
し、 第７図は異なる目標細胞に対する各種のαλ−α／ハイ
ブリッドインタフエロンの抗ウィルス活性を示すグラフ
でアリ、 第ｒ図はα２−βハイブリッドインタフエロンを作成す
るための本発明による方法のｌ具体例を示す略図であり
、 第り図は「最大配列同質性」およびグ個の交差領域Ｆ３
．Ｆ♂、Ｆ１０およびＦｌｊにつきコンピュータで整列
させたＩＦＮ−βおよびＩＦＮ−αコのヌクレオチド配
列を示し、ここでハイブリッドは本発明による方法のｌ
具体例を用いて単離され。 第１Ｏ図はヒトαλ−ネズミαλハイブリットインタフ
エロンを作成するための本発明による方法の／具体例を
示す略図である。 特許出願人 バイオジエン ナームローズペンノットシ
ャップ ーｔコ− ６４３− １− ｕｕ ｕ ｔ− ｕ 」−Ｃｊ Ｔ網口九０−７００８３ （２０） ０ （Ｊ ＞ ＞ｕ ＋−（ ぬ （ｊＪ ＪＯ０ＬＪ− ＋−１−（ＪＯじ ロロ へ−Φく へ 置 に９１日 −一 トη （Ｊ Ｏ０（Ｊ Ｑ乙 乙。 り訓 ■α αＱ 寵あ 深 ＬＯＺ 口（（ＣＬＤ 、（ｊＬ。 呂−Ｉ匠訓 １講旨品 −。 一 １５屈１１！−（犀ｄ 口〉 １−（ｔＱｌ− Ｈω ωヒ ３１雪訓 ■Ｌ１．ｌ ｕＪＣＪ くロ ロく ＜＜＜＜ 層側 冒訓 Ｉ澗ゴ 己；１ −〜〜 １；Ｊｌ トー← Ｎ） 乙←−（） ２ ψ＜＜」 くロ ｔＪＬ。 層； “−°゛ １眠１ く← 〉Ｃ １ゑ臣 みピχ ｗＵ くい 一←０ く（ −く＋■ く」 １コ葺 −・ ＣＪ乙 りく ＝ ＡＢ− 【 ロ Ｃコ （Ｉ／Ｖ＋←田 コト／）１ｗ− （Ｎ α■Ｏく く ０ １ひ−１０、く÷０ φ＜３１− ＋い １３コ１ °°°３ トー ＬＩＪ ｕＪ←− トー」」 ト一 〇 コ！ ００−１）−Ｏ！：ｌ ０ １ ＬＯ＜に； −
定図冒 ＩＪ罐 ０ ０ ０χ＋−＋σ く＝ ０ コく＋■ Ｎ’ｌ ＞＜ ｆ （Ｊ ｔＤ −（ζ−ヒｌ−コロ
１＋ｌ ロリ コＵ（！： Ｚ Ｚ ｇＣ Ｕｌ−（Ｊ Ｊ（ 」Ｑ ＱＣロＱ α）−００コ コロ ＝■ Ｎ−１−ＬＬＩ ｕ、ｌ ）− ←く ３ ←−」ヒ ｕＪ（Ｊ ０ ＣＪＺ ＺＬＪ ０ −Ｉ＋■ くψ ψ（＋に −くｈ くく くくζ Φ（（ｃｔｃｔ（ αＣｊ （Ｊ−工Ｑ ＜＜＜１− ←く αく ｌ肝・ ８、コ澗 −− ＬｕＣｊ ｌす＝ コくＩ ：ｌ：ｌ−０Ｊ −““。 ユ１−＋ＮＩ−−−Ｉ−＋■ ○ Ｍ ζ ）−α α→ −庄だ １ 巳屓 屓と ６４８− く く Ｑ ■ ヘー ＦＩＧ。 ・・ 入と＋ 十Ｇと 入Ａ占 ＡＡ入 Ｇｒ＋ ＴＡ
Ａ Ｇ大入 ＧＴ。 ＡＡＧ ＧＡＡ 手続補正書（凪） 昭和５９年 ９月６１１ 特許庁長官 志 賀 学 殿 １、事件の表示 昭和５９年 特許願 第１１７４８５号２、発明の名称 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 オランダ領アンチル、クラカオ、ウイルムシュタ
ソト、ピーターマーイ １５番 名称 バイオジエン ナームローズ ベンノソトシャノ
プ代表者 ペー、ゲー、シビンガ 同 ペー、ツェー、アー、パン ザンビークーＬ１ンダ
申牝酌（オランダ領アンチル） ４、代理人 ６、補正の内容 ｔ４＋ ）３１用頃Ｍ号 手続補正書（方力 昭和５９年１０月２．＋ｆ日 特許庁長官 志 賀 学 殿 ■、事件の表示 昭和５９年特許願第１１７４８５号 ２、発明の名称 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 オランダ領アンチル、クラカオ、ウィルムシュタ
ソト、ピーターマーイ １５番 名称 バイオジエン ナームローズ ベンノソトシャソ
プ代表者 ペー、ゲー、シビンガ 同 ぺ−、ツェー、アー、パン ザンビークーロンダ■
面）（オランダ領アンチル） ４、代理人
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （Ｉｌａｌ Ｄ Ｎ Ａ断片またはそのコンカテマーを
作成し、このＤＮＡ断片はハイブリッドＤＮＡ配列を誘
導すべき一方の親ＤＮＡ配列と、前記ＤＮＡ断片を宿主
細胞において複製しうるような完全レプリコンと、前記
ハイブリッドＤＮＡ配列を誘導すべき他方の親ＤＮＡ配
列とを配列中に含み、前記λつの親ＤＮＡ配列はハイブ
リッドＤＮＡ配列を形成しようとする位置に共通の少な
くとも３個のヌクレオチドの配列を有し、かつ前記λつ
の親配列におけるコード配列の翻訳方向はＤＮＡ断片に
おいて互いに同方向であり、 （ｌリ 所望ハイブリッドＤＮＡ配列により形質転換さ
れた宿主細胞を選択しかつそこから前記ハイブリッドＤ
ＮＡ配列を単離することを特徴とするハイブリッドＤＮ
Ａ配列の作成方法。 （２）親ＤＮＡ配列が少なくとも５個のヌクレオチドよ
りなる同質配列を有する特許請求の範囲第１項記載の方
法。 （３）親ＤＮＡ配列が少なくともｇ個のヌクレオチドよ
りなる同質配列を有する特許請求の範囲第１項記載の方
法。 （４）親ＤＮＡ配列が少なくとも７３個のヌクレオチド
よりなる同質配列を有する特許請求の範囲第１項記載の
方法。 （５１ＤＮＡ断片がさらに少なくとも７個の抗生物質耐
性標識を含む特許請求の範囲第１項乃至第弘項のいずれ
かに記載の方法。 （（３）ＤＮＡ断片が、親ＤＮＡ配列のそれぞれに関連
する異なる抗生物質耐性標識を含む特許請求の範囲第ｊ
項記載の方法。 （力 ＤＮＡ断片が７つの抗生物質耐性標識と、親ＤＮ
Ａ配列の一方に関連する異なる抗生物質耐性標識の７部
とを含み、かつ前記異なる抗生物質耐性標識の１部は前
記親ＤＮＡ配列の他方と関連してこれを完成する特許請
求の範囲第５項記載の方法。 （８）ｔＫＩ ＤＮＡ断片またはそのコンカテマーを作
成し、この断片はハイブリッドＤＮＡ配列を誘導すべき
一方の親ＤＮＡ配列と、この断片を宿主細胞において複
製しうるような完全レプリコンと、ハイブリッドＤＮＡ
配列を誘導すべき他方の親ＤＮＡ配列とを配列中に含み
、前記λつの親配列におけるコード配列の翻訳方法はＤ
ＮＡ断片において互いに同方向であり、 ｌｂ） 前記親ＤＮＡ配列の一方において少なくとも３
個のヌクレオチドよりなる配列を形成し、前記ヌクレオ
チド配列は前記ハイブリッドを形成しようとする前記他
方のＤＮＡ配列における位置にて前記他方の親ＤＮＡ配
列におけるＤＮＡ配列と同一であり。 ｔｏ＋ 所望のハイブリッドＤＮＡ配列により形質転換
された宿主細胞を選択しかつそこから前記ハイブリッド
ＤＮＡ配列を単離することを特徴とするノ・イブリッド
ＤＮＡ配列の作成方法。 （９）少なくともｊ個の共通ヌクレオチドよりなる配列
を親ＤＮＡ配列の一方に形成させる特許請求の範囲第ｒ
項記載の方法。 （Ｌｌ 少なくとも７３個の共通ヌクレオチドよりなる
配列を親ＤＮＡ配列の一方に形成させる特許請求の範囲
第ｇ項記載の方法。 ０υ 親ＤＮＡ配列の一方において共通ヌクレオチド配
列を形成する工程を、線状ＤＮＡ断片の作成工程の前に
行なう特許請求の範囲第ｒ項乃至第１０項のいずれかに
記載の方法。 Ｑ２ＤＮＡ断片がさらに少なくとも７つの抗生物質耐性
標識を含む特許請求の範囲第１項乃至第１／項のいずれ
かに記載の方法。 ０□□□ＤＮＡ断片が親ＤＮＡ配列のそれぞれに関連す
る異なる抗生物質耐性標識を含む特許請求の範囲第７２
項記載の方法。 （１４）ＤＮＡ断片が、１つの抗生物質耐性標識と親Ｄ
ＮＡ配列の一方に関連する異なる抗生物質耐性標識の１
部とを含み、かつ前記異なる抗生物質耐性標識の１部が
前記親ＤＮＡ配列の他方と関連してこれを完成する特許
請求の範囲第１．２項記載の方法。 α［有］ ＤＮＡ断片を、この断片により宿主を形質転
換させる工程の前に、その端部にて部分的に単一鎖とな
しかつ融合させる特許請求の範囲第１項または第ｒ項記
載の方法。 αＱ 親ＤＮ人配列をヒトαインタフエロン、動物αイ
ンタフエロン、ヒトβインタフエロン、動物βインタフ
エロン、ヒトγインタフエロンおよび動物γインタフエ
ロンをコードするＤＮＡ配列よりなる群から選択する特
許請求の範囲第１項乃至第１！項のいずれかに記載の方
法。 αＤ 親ＤＮＡ配列をヒトおよび動物のりンホキンをコ
ードするＤＮＡ配列よりなる群から選択する特許請求の
範囲第１項乃至第７６項のいずれかに記載の方法。 αＢ 親ＤＮＡ配列を口蹄疫ウィルスの抗原の７種もし
くはそれ以上をコードするＤＮＡ配列よりなる群から選
択する特許請求の範囲第１項乃至第１６項のいずれかに
記載の方法。 （ｌＩ 宿主細胞を選択する工程が形質転換宿主細胞を
両抗生物質を含有する寒天板の上で増殖させる工程から
なる特許請求の範囲第６項、第７項、第１３項または第
１グ項記載の方法。 ■ 特許請求の範囲第１項乃至第１り項のいずれかの方
法により作成されるハイブリッドＤＮＡ配列。 （２１）少なくとも２個の接続されたヌクレオチド配列
からなり、それぞれ接続されたＤＮＡ配列が異なる親Ｄ
ＮＡ配列から誘導され、ヌクレオチドの第７配列を同じ
読粋の第２のヌクレオチド配列に接続して、その読枠を
ハイブリッドを形成させようとする位置における両親Ｄ
ＮＡ配列に対し共通する少なくとも３個のヌクレオチド
よりなるＤＮＡ配列を介して各配列において一定に維持
してなるハイブリッドＤＮＡ配列。 （２２）両親ＤＮＡ配列に対し共通である少なくとも５
個のヌクレオチドからなる特許請求の範囲第、２／項記
載のハイブリッドＤＮＡ配列。 （２３） ｆｉＤ Ｎ Ａ配列がヒトαインタフエロン
、動物αインタフエロン、ヒトβインタフエロン、動物
βインタフエロン、ヒトγインタ７エロンおよび動物γ
インタフエロンをコードするＤＮＡ配列よりなる群から
選択される特許請求の範囲第２／ｉたは第２２項記載の
ハイブリッドＤＮＡ配列。 （２４）親ＤＮＡ配列がヒトおよび動物のリンホキンを
コードするＤＮＡ配列よりなる群から選択される特許請
求の範囲第、２７項または第、２．２項記載のハイブリ
ッドＤＮＡ配列。 （２５）親ＤＮＡ配列が口蹄疫ウィルスの抗原の７種も
しくはそれ以上をコードするＤＮＡ配列よりなる群から
選択される特許請求の範囲第一７項または第、２２項記
載のノ・イブリッドＤＮＡ配列。 （２、特許請求の範囲第１項乃至第、２０項のいずれか
に記載の方法により作成された）・イブリッドＤＮＡ配
列および特許請求の範囲第２１項乃至第２ｊ項のいずれ
かに記載のノ・イブリッドＤＮＡ配列よりなる群から選
択されるノーイブリッドＤＮＡ配列により形質転換され
た宿主を培養し、かつポリペプチドを回収することを特
徴とする方法により産生されるノ・イブリッドポリペプ
チド。 （２７）少なくともλつの接続されたアミノ酸の配列か
らなり、それぞれ接続されたアミノ酸配列が異々る親ポ
リペプチドから誘導され、第１のアミノ酸配列がノ・イ
ブリッドを形成させようとする位置で両親ポリペプチド
に対し共通である少なくとも１個のアミノ酸のアミノ酸
配列を介して第Ｊのアミノ酸配列に接続してなるハイブ
リッドポリペプチド。 （２８）少なくとも２個のアミノ酸が、ハイブリッドを
形成させようとする位置にて両親ポリペプチドに対し共
通である特許請求の範囲第２７項記載のン１イブリッド
ポリペプチド。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB8315980 | 1983-06-10 | ||
| GB838315980A GB8315980D0 (en) | 1983-06-10 | 1983-06-10 | Producing hybrid dna sequences |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6070083A true JPS6070083A (ja) | 1985-04-20 |
Family
ID=10544105
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59117485A Pending JPS6070083A (ja) | 1983-06-10 | 1984-06-09 | ハイブリツドｄｎａ配列ならびに産生されるハイブリツドポリペプチドおよびｄｎａ配列 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0141484A3 (ja) |
| JP (1) | JPS6070083A (ja) |
| GB (1) | GB8315980D0 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62282593A (ja) * | 1985-12-02 | 1987-12-08 | ジ−．デイ−．サ−ル アンド カンパニ− | 共有結合した細胞調節ポリペプチド |
Families Citing this family (15)
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|---|---|---|---|---|
| EP0205404B1 (en) * | 1985-06-11 | 1992-07-15 | Ciba-Geigy Ag | Hybrid interferons |
| EP0237019A3 (en) * | 1986-03-14 | 1988-03-09 | Toray Industries, Inc. | Interferon conjugate and production thereof using recombinant gene |
| US5089406A (en) * | 1987-01-07 | 1992-02-18 | Allied-Signal Inc. | Method of producing a gene cassette coding for polypeptides with repeating amino acid sequences |
| KR920703114A (ko) * | 1989-07-14 | 1992-12-17 | 원본미기재 | 접합체 백신을 위한 시토킨 및 호르몬 운반체 |
| IT1231157B (it) * | 1989-07-20 | 1991-11-19 | Crc Ricerca Chim | Nuovi geni ibridi funzionali di bacillus thuringiensis ottenuti mediante ricombinazione in vivo. |
| DE69620766T2 (de) * | 1995-08-11 | 2004-11-18 | Novozymes A/S | Verfahren zur herstellung von polypeptidabkömmlingen |
| CA2303401A1 (en) * | 1997-10-01 | 1999-04-08 | G.D. Searle & Co. | Fusion proteins comprising an angiostatin moiety and their use in anti-tumor treatment |
| JP2002510709A (ja) * | 1998-04-08 | 2002-04-09 | ジー・ディー・サール・アンド・カンパニー | 二重Ａｖｂ３及び転移関連受容体リガンド |
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| US7959910B2 (en) | 2000-07-31 | 2011-06-14 | Biolex Therapeutics, Inc. | C-terminally truncated interferon alpha variants |
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| US8022270B2 (en) | 2000-07-31 | 2011-09-20 | Biolex Therapeutics, Inc. | Expression of biologically active polypeptides in duckweed |
| FR2823220B1 (fr) | 2001-04-04 | 2003-12-12 | Genodyssee | Nouveaux polynucleotides et polypeptides de l'erythropoietine (epo) |
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Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES8308534A1 (es) * | 1980-01-08 | 1983-09-01 | Biogen Nv | Un metodo de producir un polipeptido que exhibe actividad inmunologica o biologica del interferon de leucocitos humanos. |
| DK207681A (da) * | 1980-05-12 | 1981-11-13 | Biogen Nv | Dna-sekvenser rekombinations-dna-molekyler og fremgangsmaade klovsyge virale antigener til fremstilling af polypeptider med specificitet som mund og |
| ES506955A0 (es) * | 1980-11-10 | 1983-02-01 | Genentech Inc | Un procedimiento para producir un polipeptido antiviral. |
| WO1983002461A1 (en) * | 1982-01-19 | 1983-07-21 | Cetus Corp | Multiclass hybrid interferons |
-
1983
- 1983-06-10 GB GB838315980A patent/GB8315980D0/en active Pending
-
1984
- 1984-06-05 EP EP84303787A patent/EP0141484A3/en not_active Withdrawn
- 1984-06-09 JP JP59117485A patent/JPS6070083A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62282593A (ja) * | 1985-12-02 | 1987-12-08 | ジ−．デイ−．サ−ル アンド カンパニ− | 共有結合した細胞調節ポリペプチド |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0141484A3 (en) | 1986-08-20 |
| GB8315980D0 (en) | 1983-07-13 |
| EP0141484A2 (en) | 1985-05-15 |
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