JPS6073358A - 17α−ヒドロキシプロゲステロン測定用抗原及び抗血清 - Google Patents
17α−ヒドロキシプロゲステロン測定用抗原及び抗血清Info
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- JPS6073358A JPS6073358A JP18079583A JP18079583A JPS6073358A JP S6073358 A JPS6073358 A JP S6073358A JP 18079583 A JP18079583 A JP 18079583A JP 18079583 A JP18079583 A JP 18079583A JP S6073358 A JPS6073358 A JP S6073358A
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- hydroxyprogesterone
- antigen
- hemisuccinate
- bsa
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
- G01N33/743—Steroid hormones
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は新規なステロイド化合物に関し、さらに詳しく
は77位にヘミサクシネート−抗原性蛋白質を有する/
7α−ヒドロキシプロゲステロン測定用抗原、並びに該
ステロイド化合物から誘導される抗血清に関する。
は77位にヘミサクシネート−抗原性蛋白質を有する/
7α−ヒドロキシプロゲステロン測定用抗原、並びに該
ステロイド化合物から誘導される抗血清に関する。
副腎皮質ホルモンであるコルチゾールは体内でグロゲス
テロンから/7α−ヒドロキシグロゲステロン、//−
デソキシコルチゾールを経て生合成されることが知られ
ている。即ち、/7α−ヒドロキシプロゲステロンから
コルチゾールの生合成においては2/−水藏化酵索の存
在が必要となる。
テロンから/7α−ヒドロキシグロゲステロン、//−
デソキシコルチゾールを経て生合成されることが知られ
ている。即ち、/7α−ヒドロキシプロゲステロンから
コルチゾールの生合成においては2/−水藏化酵索の存
在が必要となる。
先天性副腎過形性(CΔH)は小児に認められる副腎性
器症候群の最も普遍的なものであり、副腎皮質のコルチ
ノ゛−ル産生系酵素の先天的欠損によって起こる疾患で
、副腎性男性ステロイド過剰生成がその生因となってい
る。該CAHの大部分は、2/−水俊化酵素欠撰症であ
ることが知られており、その結果、/2α−ヒドロギシ
プロゲステロンカラ//−デソキシコルチゾールの生合
成が阻害され、!rIL中の/2α−ヒドロキシプロゲ
ステロンが増加する。
器症候群の最も普遍的なものであり、副腎皮質のコルチ
ノ゛−ル産生系酵素の先天的欠損によって起こる疾患で
、副腎性男性ステロイド過剰生成がその生因となってい
る。該CAHの大部分は、2/−水俊化酵素欠撰症であ
ることが知られており、その結果、/2α−ヒドロギシ
プロゲステロンカラ//−デソキシコルチゾールの生合
成が阻害され、!rIL中の/2α−ヒドロキシプロゲ
ステロンが増加する。
カくシて、/7α−ヒドロキシプロゲステロンの測定は
、CAHを診断する上で極めて重要である。
、CAHを診断する上で極めて重要である。
従来、/7α−ヒドロキシプロゲステロンに特異的に反
応する抗血清を製造するだめの抗原として、/7α−ヒ
ドロキシプロゲステロン−3−カルボキシメチルオキシ
ム−BSAあるいは/7α−ヒドロギンプロゲステロン
−乙α−サクソネートーBSAを用いる方法が知られて
いた〔ホルモンと臨床 2ざ蓚773 (/9ざ0)参
照〕。
応する抗血清を製造するだめの抗原として、/7α−ヒ
ドロキシプロゲステロン−3−カルボキシメチルオキシ
ム−BSAあるいは/7α−ヒドロギンプロゲステロン
−乙α−サクソネートーBSAを用いる方法が知られて
いた〔ホルモンと臨床 2ざ蓚773 (/9ざ0)参
照〕。
しかしながら、上記の方法では、/7α−ヒドロキシプ
ロゲステロンの3位をオキシム化シてBSA(牛血清ア
ルブミン)を結合した化合物、若しくは6位にヘミザク
シネ−)=BSAを結合した化合物を抗原として抗体を
製造しているが、これらの抗体は被検液中に含まれるグ
ロゲステロン、/7α−ヒドロキシプレグネノロン、2
0α−ヒドロキシプロゲステロンなどと反応し特異性が
低いという欠点があった。
ロゲステロンの3位をオキシム化シてBSA(牛血清ア
ルブミン)を結合した化合物、若しくは6位にヘミザク
シネ−)=BSAを結合した化合物を抗原として抗体を
製造しているが、これらの抗体は被検液中に含まれるグ
ロゲステロン、/7α−ヒドロキシプレグネノロン、2
0α−ヒドロキシプロゲステロンなどと反応し特異性が
低いという欠点があった。
本発明者らは上記の如き欠点をもたない/7α−ヒドロ
キシプロゲステロンの検出方法につき鋭意研究を行った
結果、下記式 式中、Yは抗原性蛋白質を示す、 で表わされる新規な/7.α−ヒドロキシプロゲステロ
ン−//−へミサキクシネート−抗原蛋白質結合物を抗
原として使用し、/7α−ヒドロキシプロゲステロンを
免疫学的に測定するようにすれば極めて感度よく且つ特
異的に検出・定量できることを見出した。
キシプロゲステロンの検出方法につき鋭意研究を行った
結果、下記式 式中、Yは抗原性蛋白質を示す、 で表わされる新規な/7.α−ヒドロキシプロゲステロ
ン−//−へミサキクシネート−抗原蛋白質結合物を抗
原として使用し、/7α−ヒドロキシプロゲステロンを
免疫学的に測定するようにすれば極めて感度よく且つ特
異的に検出・定量できることを見出した。
本願発明で使用する/2α−ヒドロキシプロゲステロン
−//−へミザクシネートは公知の方法(例えば、アメ
リカ特許第乞θ/3乙ざざ号公報参照)により製造する
と七ができる。かくして、下記式(1−a)で表わされ
る/7α−ヒドロキシプロゲステロン−//−へミザク
シネートが得られる。
−//−へミザクシネートは公知の方法(例えば、アメ
リカ特許第乞θ/3乙ざざ号公報参照)により製造する
と七ができる。かくして、下記式(1−a)で表わされ
る/7α−ヒドロキシプロゲステロン−//−へミザク
シネートが得られる。
OOH
次いで上記式(1)の/7α−ヒドロキシプロゲステロ
ン−//−へミザクシネートー抗原性蛋白質結合物を得
るには、上記式(1−a)の/7α−ヒドロキシプロゲ
ステロン−//−ヘミサクシネートト抗原性蛋白質を結
合せしめる。
ン−//−へミザクシネートー抗原性蛋白質結合物を得
るには、上記式(1−a)の/7α−ヒドロキシプロゲ
ステロン−//−ヘミサクシネートト抗原性蛋白質を結
合せしめる。
本明細71)において、「抗原性蛋白質」とは、1Qf
i乳動物に免疫せしめた時に、それに対する抗体を形成
せしめる能力のある蛋白質を意味し、例えば、ウシ血清
アルブミン(BOA)、ウサギ血清アルブミン(BSA
)、ヒト血清アルブミン(BSA)、卵アルブミン(E
A)等が挙げられるが、本発明では、中でも、BSA及
びBSAが好適に使用される。
i乳動物に免疫せしめた時に、それに対する抗体を形成
せしめる能力のある蛋白質を意味し、例えば、ウシ血清
アルブミン(BOA)、ウサギ血清アルブミン(BSA
)、ヒト血清アルブミン(BSA)、卵アルブミン(E
A)等が挙げられるが、本発明では、中でも、BSA及
びBSAが好適に使用される。
式(1−a)のステロイド化合物をかがる抗原性蛋白質
に結合する方法は、それ自体公知であり、例えばE、
F、Erlanger et al、 J、 Biol
、Chem−わ”l 1090 (/9パ)等の公知文
献に記載の方法に従って行なうことができる。例えば、
(1)混合酸無水物法 式(1−a)のステロイド化合物を先ずハロ炭酸アルキ
ルエステル(例:クロルギ酸イソブチル)で処理して/
/−位の側鎖のカルボキシル基を活性化し、しかる後B
sA、RsA等の抗原性蛋白質の水−有機溶媒溶液中に
滴下することにより行なうことができる。
に結合する方法は、それ自体公知であり、例えばE、
F、Erlanger et al、 J、 Biol
、Chem−わ”l 1090 (/9パ)等の公知文
献に記載の方法に従って行なうことができる。例えば、
(1)混合酸無水物法 式(1−a)のステロイド化合物を先ずハロ炭酸アルキ
ルエステル(例:クロルギ酸イソブチル)で処理して/
/−位の側鎖のカルボキシル基を活性化し、しかる後B
sA、RsA等の抗原性蛋白質の水−有機溶媒溶液中に
滴下することにより行なうことができる。
(,2)カルボジイミド法
式(1−a)のステロイド化合物をジメチルホルムアミ
ド、ジオキサンなどの溶媒に溶解したのち、カルボジイ
ミド化合物(例ニジシクロへキシルヵルボジイミド)及
びBSA、R8A4%の抗原蛋白質を加え、脱水縮合に
よりアミド結合を形成させる。
ド、ジオキサンなどの溶媒に溶解したのち、カルボジイ
ミド化合物(例ニジシクロへキシルヵルボジイミド)及
びBSA、R8A4%の抗原蛋白質を加え、脱水縮合に
よりアミド結合を形成させる。
(3)活性エステル法
式(1−a)のステロイド化合物をジメチルホルムアミ
ド、ジオキサンなどの溶媒に溶解したのち、活性エステ
ル(例:p−二トロフェノール)ヲ加えて//−位の測
鎖のカルボキシル基を活性エステル誘導体にかえた後、
BSA、R8A等の抗原性蛋白質を加え、縮合せしめる
ことにより行うことができる。
ド、ジオキサンなどの溶媒に溶解したのち、活性エステ
ル(例:p−二トロフェノール)ヲ加えて//−位の測
鎖のカルボキシル基を活性エステル誘導体にかえた後、
BSA、R8A等の抗原性蛋白質を加え、縮合せしめる
ことにより行うことができる。
このようにして形成された/7α−ヒドロキシプロゲス
テロン−//−ヘミサクシネート−抗原性蛋白質結合物
は、次いでそれ自体公知の方法に従い、哺乳動物に免疫
して、抗血清を調製することがで炒る1、 免役用の哺乳動物としては、例えば家兎、山羊、めん羊
、モルモット、等が挙げられ、これらpi乳動物の」1
記抗原による免疫は常法に従って行なわれる。その際、
例えばコンプリートフロインドアジ−バンド等のアジ−
パントを併用することにより有効に抗血清をつくること
ができる。
テロン−//−ヘミサクシネート−抗原性蛋白質結合物
は、次いでそれ自体公知の方法に従い、哺乳動物に免疫
して、抗血清を調製することがで炒る1、 免役用の哺乳動物としては、例えば家兎、山羊、めん羊
、モルモット、等が挙げられ、これらpi乳動物の」1
記抗原による免疫は常法に従って行なわれる。その際、
例えばコンプリートフロインドアジ−バンド等のアジ−
パントを併用することにより有効に抗血清をつくること
ができる。
得られた抗血清は、それ自体公知の方法に従い、前記抗
原をつくる際に用いたと同じ抗原性蛋白質で吸収し、ア
ルコール沈殿又は1析等の手段で分画することにより、
精製することができる。
原をつくる際に用いたと同じ抗原性蛋白質で吸収し、ア
ルコール沈殿又は1析等の手段で分画することにより、
精製することができる。
本発明においては、特に、前記式(1)の抗原を家兎又
は山羊にノルタケ月間追加免疫をすることにより得られ
る、抗体力価が/l12θθθ〜J゛4θθθ倍、好ま
しくは、2名θ00〜夕Qθθθ倍の範囲内で且つ抗体
の結合親和定数が/θ7〜10 l/mol、好ましく
は10″〜70″l / m o 上の範囲の抗体が好
適である。
は山羊にノルタケ月間追加免疫をすることにより得られ
る、抗体力価が/l12θθθ〜J゛4θθθ倍、好ま
しくは、2名θ00〜夕Qθθθ倍の範囲内で且つ抗体
の結合親和定数が/θ7〜10 l/mol、好ましく
は10″〜70″l / m o 上の範囲の抗体が好
適である。
ここで1−抗体力価」とは、得られた抗体を使用したR
IA法において、最適な種部曲線が得られる至適倍数を
表わし、まだ、[抗体の結合親和定数」は、抗原と抗体
とが結合した時の親和力を一般に結合親和性と呼び、実
験的には結合した抗原と非結合抗原との比率が/の時の
抗原の濃度をに値で示したものである。
IA法において、最適な種部曲線が得られる至適倍数を
表わし、まだ、[抗体の結合親和定数」は、抗原と抗体
とが結合した時の親和力を一般に結合親和性と呼び、実
験的には結合した抗原と非結合抗原との比率が/の時の
抗原の濃度をに値で示したものである。
本発明により提供される上記抗体は、後記実施例に示す
如く、それぞれの鋭化合物との交叉反応率がほぼ10θ
チで且つ他の代謝物あるいは構造類似物との交叉反応率
は大体3チ以下であって、極めて特異性の高い抗血性で
ありこれはそのまま或いは適当な担体に感作乃至結合さ
せた後、ラジオ・イムノアッセイ、免疫学的凝集阻止反
応、フォトイムノアッセイによる/7α−ヒドロキシプ
ロゲステロンの検出・定量のだめの試薬として極めて有
利に使用することができる。
如く、それぞれの鋭化合物との交叉反応率がほぼ10θ
チで且つ他の代謝物あるいは構造類似物との交叉反応率
は大体3チ以下であって、極めて特異性の高い抗血性で
ありこれはそのまま或いは適当な担体に感作乃至結合さ
せた後、ラジオ・イムノアッセイ、免疫学的凝集阻止反
応、フォトイムノアッセイによる/7α−ヒドロキシプ
ロゲステロンの検出・定量のだめの試薬として極めて有
利に使用することができる。
これらラジオイムノアッセイ、免疫学的凝集阻止反応、
フォトイムノアッセイの操作それ自体はいずれも周知の
ものであり、例えば、栃木式−ら、ホルモンと臨床−、
;名1.9 (797乙);花田芳部ら、ホルモンと臨
床ゼ−,f9(/97乙);特公昭タt−//、3j、
3’号公報等の文献に記載されており、これらの方法は
本発明の抗体に対してもそのまま適用することができる
。
フォトイムノアッセイの操作それ自体はいずれも周知の
ものであり、例えば、栃木式−ら、ホルモンと臨床−、
;名1.9 (797乙);花田芳部ら、ホルモンと臨
床ゼ−,f9(/97乙);特公昭タt−//、3j、
3’号公報等の文献に記載されており、これらの方法は
本発明の抗体に対してもそのまま適用することができる
。
次に実施例を掲げて本発明をさらに説明する。
実癩例/
/7α−ヒドロキシプロゲステロン−//−ヘミサクシ
ネート−BSAの製造 /7α−ヒドロキシプロゲステロン−//−へミザクシ
ネート30r1をN、N−ジメグール月二ルムアミド0
,73m1に溶解し、これにグ°C以丁−で1.1ノー
n−ブチルアミン/ごμlを添加したのち、イソフ゛チ
ルクロロカーボネートと、グμlを加え30分[司攪拌
を続けた。該溶液に予めBSA (牛血清アル〕゛ミン
)ざ79.μl>1qを2./lnlの精製水にて溶解
し、/N水r’fl化ナトリウム液//、23μl及び
ジメチルホルムアミド/、j肩tを順次加え、ざ°Cと
した溶液を添加混合した。次いでこれをざ°Cで撹拌し
、7時間後に/N水酸化ナトリウム((y 7.J−p
(lを加え、さらに33時間攪拌した。次し)でセファ
デックスG−,2J’によるゲルiM過を行い、未反応
の/7α−ヒドロキシプロゲステロン−//−ヘミサク
シネート及びトリーn−ブチルアミン等のイ氏分子試薬
を分離した。次いで該溶液を精製水に対し透析17たの
ち、凍結乾燥して/7α−ヒドロキシプロゲステロン−
//−ヘミサクシネート−BSAを粉末として得た。
ネート−BSAの製造 /7α−ヒドロキシプロゲステロン−//−へミザクシ
ネート30r1をN、N−ジメグール月二ルムアミド0
,73m1に溶解し、これにグ°C以丁−で1.1ノー
n−ブチルアミン/ごμlを添加したのち、イソフ゛チ
ルクロロカーボネートと、グμlを加え30分[司攪拌
を続けた。該溶液に予めBSA (牛血清アル〕゛ミン
)ざ79.μl>1qを2./lnlの精製水にて溶解
し、/N水r’fl化ナトリウム液//、23μl及び
ジメチルホルムアミド/、j肩tを順次加え、ざ°Cと
した溶液を添加混合した。次いでこれをざ°Cで撹拌し
、7時間後に/N水酸化ナトリウム((y 7.J−p
(lを加え、さらに33時間攪拌した。次し)でセファ
デックスG−,2J’によるゲルiM過を行い、未反応
の/7α−ヒドロキシプロゲステロン−//−ヘミサク
シネート及びトリーn−ブチルアミン等のイ氏分子試薬
を分離した。次いで該溶液を精製水に対し透析17たの
ち、凍結乾燥して/7α−ヒドロキシプロゲステロン−
//−ヘミサクシネート−BSAを粉末として得た。
BEIA1モル当すの/7α−ヒドロキシプロゲステロ
ン−//−へミザクシネートの結合モル数 は/7α−
ヒドロキシプロゲステロン−//−ヘミサクシネート−
BSA、/7α−ヒドロキシプロゲステロン−//−ヘ
ミサクシネート及びBSAそれぞれの一定濃度溶液の紫
外部吸収スペクトルからめた結果2ざモルであった。
ン−//−へミザクシネートの結合モル数 は/7α−
ヒドロキシプロゲステロン−//−ヘミサクシネート−
BSA、/7α−ヒドロキシプロゲステロン−//−ヘ
ミサクシネート及びBSAそれぞれの一定濃度溶液の紫
外部吸収スペクトルからめた結果2ざモルであった。
実施例−
抗/7α−ビトロキシプロゲステロン−//−ヘミサク
シネート抗体の製造 実施例/で製造した/7α−ヒドロキシプロゲステロン
−//−へミザクシネー)−BSA、3*yを/ゴの生
理&塩水に浴解し、同量のコンプリートフロインドアジ
ュバントで乳化し、成熟家兎の皮下及び足踵に注射した
。この注射を/ケ月間隔で行ない、It体価の一ヒ昇を
確認後金採血を行ない抗血fnを得た1、この抗血清を
56℃30分間非働化後BSAで吸収し、抗/7α−ヒ
ドロキシプロゲスゾロン−//−ヘミサクシネート抗体
を得た。
シネート抗体の製造 実施例/で製造した/7α−ヒドロキシプロゲステロン
−//−へミザクシネー)−BSA、3*yを/ゴの生
理&塩水に浴解し、同量のコンプリートフロインドアジ
ュバントで乳化し、成熟家兎の皮下及び足踵に注射した
。この注射を/ケ月間隔で行ない、It体価の一ヒ昇を
確認後金採血を行ない抗血fnを得た1、この抗血清を
56℃30分間非働化後BSAで吸収し、抗/7α−ヒ
ドロキシプロゲスゾロン−//−ヘミサクシネート抗体
を得た。
上記で得られた抗/7α−ヒドロキミプロゲステロン−
//−ヘミサクシネート抗体は/7α−ヒドロキシプロ
ゲステロンとの交叉反応を/θ0(lyとした時、他の
ステロイドホルモンとは交叉反応がほとんどなく、極め
て特異性の高いものである。
//−ヘミサクシネート抗体は/7α−ヒドロキシプロ
ゲステロンとの交叉反応を/θ0(lyとした時、他の
ステロイドホルモンとは交叉反応がほとんどなく、極め
て特異性の高いものである。
その交叉反応率を下記第1表に示す。壕だ、上記抗体の
特異性を、神戸用ら(ホルモンと臨床2と巻723貞、
/9とθ年)の製造した/7α−ヒドロキシプロゲステ
ロン−3−カルボキシメチルオキシム−BSA及び/7
α−ヒドロキシプロゲステロン−乙α−ヘミサクシネー
ト−BSAを抗原とし抗血清と比較した。その結果を第
1表に併せて表示する。
特異性を、神戸用ら(ホルモンと臨床2と巻723貞、
/9とθ年)の製造した/7α−ヒドロキシプロゲステ
ロン−3−カルボキシメチルオキシム−BSA及び/7
α−ヒドロキシプロゲステロン−乙α−ヘミサクシネー
ト−BSAを抗原とし抗血清と比較した。その結果を第
1表に併せて表示する。
上記第1表から、77位にヘミサクシネート−抗原性蛋
白結合体を用いて製造した抗血清の方が3位又は6位に
抗原性蛋白質をつけだものより交叉反応性が低い。特に
77α−ヒドロキシプレグネノロン及びグロゲステロン
に対しては従来法と較べ交叉反応が約′/〜′/と極め
て低い。よって認 グ 本発明による抗血清は極めて特異性の高いものでアリ、
被検液中の/2α−ヒドロキシプロゲステロンを正確に
測定することができる。
白結合体を用いて製造した抗血清の方が3位又は6位に
抗原性蛋白質をつけだものより交叉反応性が低い。特に
77α−ヒドロキシプレグネノロン及びグロゲステロン
に対しては従来法と較べ交叉反応が約′/〜′/と極め
て低い。よって認 グ 本発明による抗血清は極めて特異性の高いものでアリ、
被検液中の/2α−ヒドロキシプロゲステロンを正確に
測定することができる。
出願人 帝国臓器製薬株式会社
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 7式 式中、Yは抗原性蛋白質を示す、 で表わされるステロイド化合物から成る/7α−ヒドロ
キシグロゲステロン測定用抗原。 式中、Yは抗原性蛋白質を示す、 で表わされるステロイド化合物を哺乳動物に免疫して得
られる、/7α−ヒドロキシプロゲステロンに対して特
異的に反応しうる抗血清。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18079583A JPS6073358A (ja) | 1983-09-30 | 1983-09-30 | 17α−ヒドロキシプロゲステロン測定用抗原及び抗血清 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18079583A JPS6073358A (ja) | 1983-09-30 | 1983-09-30 | 17α−ヒドロキシプロゲステロン測定用抗原及び抗血清 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6073358A true JPS6073358A (ja) | 1985-04-25 |
Family
ID=16089466
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18079583A Pending JPS6073358A (ja) | 1983-09-30 | 1983-09-30 | 17α−ヒドロキシプロゲステロン測定用抗原及び抗血清 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6073358A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62119457A (ja) * | 1985-11-19 | 1987-05-30 | Sapporo Imuno Diagnostic Lab:Kk | 先天性副腎皮質過形成のマススクリ−ニング用診断薬キツト |
-
1983
- 1983-09-30 JP JP18079583A patent/JPS6073358A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62119457A (ja) * | 1985-11-19 | 1987-05-30 | Sapporo Imuno Diagnostic Lab:Kk | 先天性副腎皮質過形成のマススクリ−ニング用診断薬キツト |
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