JPS6087792A - 雑種制御領域 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、プロモーターを無傷のままにして転写の開始
を制御する新しいオペレーター領域を提供する制御配列
の構築に関する。この制御配列は、原核細胞遺伝子また
は真核ａｍ遺伝子の転写と翻訳の制御に利用することが
できる。

遺伝子の発現では原核生物上真核生物のいずれにおいて
もまず最初にＤＮＡ鋳型からのＲＮＡの合成が起こりそ
れに引続きＲＮＡからのタンパク質合成が起こる。

ＤＮＡ鋳型からのＲＮＡ合成という遺伝子発現の第一段
階である転写は、ＤＮＡ上に存在するるる信号によシ制
御されている。この信号は転写を開始し任意の時間に生
ずる転写量を制御するヌクレオチド配列で必る。制御信
号は一般にプロモーター領域トオペレーター領域から成
る。プロモーター領域は、ＲＮＡポリメラーゼの特異的
結合部位で転写の開始点である。オペレーターはリプレ
ッサーと共に転写量を制御する機能を果たす。

ＤＮＡ分節の転写はＲＮＡポリメラーゼという酵素によ
り行なわれる。ＲＮＡポリメラーゼは−３５および一１
０認識領域（Ｍ、ローゼンバーグ（Ｒｏｓｅｎｂｃ＋ｒ
ｇ）　、ｌ）＋　コ　−　）　（Ｃｏｕｒｔ）　、Ａｎ
ｎ、Ｒｅｖ、Ｇｅｎｅｔ。

１３巻３１９〜３５３頁（１９７９））のプロモーター
に結合した後、リボゾーム結合部位と翻訳開始信号を暗
号化するヌクレオチドを転写し、次に実際の構造遺伝子
を暗号化するヌクレオチドを七の終末にあるいわゆる停
止信号に達するまで転写する。　ＲＮＡポリメラーゼは
ＤＮＡ分節に沿って移動しつつＤＮＡに相補的な一本鎖
の伝令ＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）を合成する。己凧が合成さ
れると、リボゾーム結合部位（別名８ｈｉｎｓ　−Ｄａ
１ｇａｒｎｏ領域）にリボゾームが結合する。リボゾー
ムは、翻訳開始信号から停止信号までｍＲＮＡを翻訳し
、ＤＮＡにより暗号化されたアミノ酸配列をもつポリペ
プチドを産生ずる。

遺伝子工学の技術の利用によシ、ひとつの生物の遺伝子
をその生物から取シ出して第二の生物の遺伝情報に継ぎ
込み、はじめの遺伝子の暗号化するポリペプチドを第二
の生物により発現させることができる。外来遺伝子の発
現を最大にしこれにより生ずるポリペプチドの収量を高
くすることが望ましい。遺伝子発現を制御するひとつの
方法として、前述の制御信号を選択し操作することによ
る方法のあることが認められていた。

種々のブローモーターの間にはその抑制を効率的にうけ
る能力と強度とにおいて格差がある。容易には抑制でき
ないプロモーターはそのタンパク質産物が少量で細胞に
有毒であった９プラスミドの維持を阻害したりするよう
な遺伝子には、ごく限定的にしか使用できない。このよ
うな状況では、宿主細胞やプラスミドが正常に成長でき
るようにするためには抑制解除が必要となるまでこの遺
伝子を最大限に抑制することが必要となる。

ある種のプロモーターはまた、それらが多複製プラスミ
ド上に存在する場合、適当なリプレッサーもまたそのグ
ラスミド上に位置ししたがって多複製されて存在してい
るのでなければ効率的に抑制することができないという
点で、不利となる。

このようなプロモーターは、ひとつの染色体遺伝子複製
物から作られる量のリプレッサーで十分に抑制すること
のできる他のプロモーターとは対照的でおる。しかしな
がら、これらのプロモーターは別の欠点ももっている。

たとえば、これらは他のプロモーターはど強くはない。

プロモーターの強さを増強したシ抑制効率を上げたりす
ることを目的に、種々のプロモーター／オペレーター系
を操作するために様々な努力が注がれてきた。ヨーロッ
パ特許申請０６７．５４０（Ｒ，Ｌ、ロドリケス（Ｒｏ
ｄｒｉｑｕｓｚ）　、Ｍ、Ｊ、キャンヘリン（Ｃｈａｍ
’ｂｅｒｌｉｎ）　編集「プロモーター：構造と機能」
Ｐｒａｅｇｅｒ発行（１９８２）４６２〜４８１頁のデ
・ボア（Ｄｅ　Ｂｏｅｒ）ら参照のこと）ではたとえば
雑種プロモーター／オペレーターについて記載り、　ｌ
＋１　許請求している。この雑種は、−３５領域から成
るＤＮＡ断片の後方に６って誘導により抑制解除するこ
との可能なひとつのプロモーター／オペレーター配列を
なす一１Ｏ領域と、このプロモーター／オペレーター配
列よりも強い信号配列をもつ第二のプロモーターの５′
側の隣接領域とを連結することにより作成される。二つ
のＤＮＡ断片は、ＲＮＡポリメラーゼがプロモーター／
オペレーター配列へ結合するための一３５認識配列周辺
と一１Ｏ認識配列周辺の間におる位置で連結される。融
合物は全く新しいプロモーター配列を生ずる。

このような雑種プロモーター／オペレーターハある種の
条件下では有利に使用できるが、他の場合はやはシネ満
足なものでらることがわかる。たとえば、−１０領域に
寄与するプロモーターの翻訳効率は増加できるが、ある
種の条件下ではプロモーターを目的とする程度に厳密に
制御することはできない。

このため、高い効率で抑制することのできる強いプロモ
ーターをもつ制御配列が必要となっている。以上のこと
から、本発明はこのような特性を備えた新しい制御配列
を構築することを目的としている。本発明はさらに、各
種の原核細胞および真核細胞の遺伝子に簡便に連結する
ことのできるような制御配列を作成することも目的とし
ている。

本発明の目的にしたがって、第一のオペレーター／プロ
モーター領域の完全なプロモーター配列を第二のプロモ
ーター／オペレーター領域のオペレーター配列に結合し
たものから成り前記の第二のプロモーター／オペレータ
ー領域のオペレーター配列が第一のプロモーター／オペ
レーター領域由来のプロモーターをその本来の第一のオ
ペレーター配列よりも高い効率で制御することのできる
ような雑種制御領域を開示する。

本発明は、後続の遺伝子配列の転写を指令し制御するこ
とのできる、そのプロモーター自身の本来のオペレータ
ーよりも高い効率で転写の開始を制御することのできる
新しいオペレーター領域へ結合した、完全で強力なプロ
モーターを与える雑種プロモーター／オペレーター領域
に関する。本発明の雑種制御領域は、強いプロモーター
を含む第一領域と効率の高いオペレーターを含む第二領
域の二つのプロモーター／オペレーター領域から形成さ
れる。これらの領域は切り出され、取り出された断片は
生ずる雑種領域が第一の領域の完全なプロモーター配列
と第二の領域の効率の高いオペレーターとから成るよう
に結合される。

この新しい雑種領域を作るには、第一の領域は一般に完
全なプロモーター配列の前方に位置する制限酵素Ｍ識部
位で切断され、第二の領域はそのオペレーター配列の後
方部位で切断される。次いでこの二つの領域それぞれか
ら取り出した適当な断片を従来の方法にしたがって結合
すると本発明の新しい雑種制御領域が構築される。また
これに代わって、生じたプロモーターの部分的配列を含
む断片を第二の領域のオペレーター配列に結合したさい
、オペレーター領域の３′末端のヌクレオチド配列がプ
ロモーターの完全なヌクレオチド配列を回復するような
ものである場合には、第一の領域はプロモーターのヌク
レオチド配列内にある制限酵素認識部位で切断すること
ができる。

二つの領域は、天然に生じた通常のもしくは相補的な制
限酵素認識部位、あるいは片方または両方の領域内に実
験的突然変異により誘導された通常もしくは相補的制限
酵素認識部位において切断される。この代わりに、二つ
の領域から取り出したＤＮＡ断片が非相補的末端をもつ
場合には、ＤＮＡ断片の制限部位に合致するような合成
りＮＡ分節を作成しこれを使用して二つの断片を連結す
ることができる。

、本発明の詳細は後述の本発明の実施例を通して述べる
ことにする。ただし、これはあくまでも例示することを
目的としたものでらり、駆足的な意図をもつものではな
いということ理解されたい。

本発明のひとつの実施例では、雑種制御領域は二つのλ
ファージプロモーター／オペレーター領域から構築され
る。λ感染の初期に機能するこの二つのλフアージプロ
モーターはＰＲおよびＰＬとして知られている（Ｈ，ア
イゼン（Ｅｌｓｅｎ）、Ｍ、Ｐｔａｓｈｎｅ　。

「バクテリオファージラムダＪ　Ａ、Ｄ、バージエイ（
Ｈｅｒａｈｅｙ）　ｍ集、：ｒ　−Ａ／　ト・スフリン
グ・ハーバ−研究所にューヨーク）発行（１９７１）２
３９〜２７０頁）。ＰＲ配列は強力なプロモーターを与
えるが、このブロモ・−ターはλプロモーターＰＬはど
効率的には（すなわち低濃度までは）抑制できない（Ｃ
，Ｊ、クイーン（Ｑｕｅｅｎ）　Ｍｏ１．　Ａｐｐｌ、
　Ｇｅｎｅｔ。

２巻１−１０頁（１９８０））。ＰＲプロモーターの第
二の欠点は、多板製プラスミド上に存在する場合λリプ
レッサーも同様にそのプラスミド上にあり、したがって
多板製されて存在するような場合にのみ、効率的に抑制
することができるということである。しかし、λリプレ
ッサーもそのプラスミド上に存在する場合、λＰ凡の完
全な抑制解除は温度を４２℃まで上昇させない限り達成
できない。これに対し、、ｐＬプロモーターはひとつの
染色体遺伝子複製物から作られるリプレッサーの量で完
全に抑制でき、抑制解除は３７〜３８℃で行なわれる。

誘導温度がより低温でおることは４２℃に加熱すると活
性が低下するようなタンパク質に有益である◎ プロモーターＰＲとＰＬヲ含むλゲノムの二つの分節の
構造を第１図に示す。ＲＮＡポリメラーゼは−３５と一
１ｏの領域で各プロモーターに結合する（Ｍ、ｏ−ゼン
バーグ（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ）ら、Ａｎｎ、　Ｒｅｖ。

Ｇｅｎｅｔ、　３１巻、３１９−３５３頁（１９７９）
：Ｄ、に、ホーレー（Ｈａｗｌｅｙ）ら、Ｎｕｃｌ、　
Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。

１１巻２２３７〜２２５５頁（１９８３））。

ＲＮＡポリメラーゼが各プロモーターへ結合する能力は
λリプレッサー（ｃｉタンパク質）と拮抗し、λリプレ
ッサーはオペレータ一部位ｏ、ｔ、ｚ、ａとＯＲ１，２
，３とに結合する（　Ｍ、　Ｐｔａｓｈｎｅ　ら、Ｃｅ
１１１９巻１−ｔｉ頁（１９８０））。

第１図に示すように、ＰＬおよびＰＲｆｉ戦は、天然に
生じた通常の−Ｈ１ｎｃ［部位をもつ。この領域をエン
ドヌクレアーゼＨ１ｎｃｌＩにより切断し、次いで各領
域由来の断片をＨ１ｎｃｌＩ部位より前方の配列（第１
図ではＨｌｎｃ［の左側）がＰＬ断片となりＨｌｎｃ、
［部位より後方の配列（第１図ではＨｌｎｅＩＩの右側
）がＰＲ断片となるように結合する。この雑種領域はＯ
Ｌ／Ｐ□と命名されている。

ＰＬ、！：　ＰＲのμニ一部位は各プロモーターの一３
５領域内に位置する。ｐ、とＰＲの分節を一…ｉｎｃ［
部位で結合すると、新しい制御領域はＰＲの正確で完壁
な配列を再現する。これはＨ１ｎａ■切断部位の前方の
塩基がＰＬとＰＲとで全く同一だからである（ローゼン
バーグら、前掲：ホーレイら、前掲）。

ＨｉｎｃＩ［ Ｍｉｎｅ、［ 同様に、Ｈｌｎｅ、［部位での結合によ！Ｊ　ＯＬ２　
（その一部を前記に示す）が再現されるが、これは１ｉ
ｎｅ［の右側のＯＬ２のＧ残基がＯＲ２にも見出される
からである。ＯＬ／ＰＲ雑種はＰＬのりプレツザー結合
特性をもつ。第一のリプレッサー結合部位ＯＲ１とＯＬ
ｌのＤＮＡ配列は同−Ｃある（ｖ、ピロツタ（Ｐｉｒｒ
ｏｔｔａ）、Ｎａｔｕｒｅ　２５４巻１１４頁（１９７
５）、フマユン（Ｈｕｍａｙｕｎ）ら、Ｊ、Ｍｏ１．　
Ｂｉｏｌ、１１２巻２６７頁（ｘｃ＋７７））；したが
って抑制される能力のＰＲと九との間の差は明らかに残
りのリプレッサ一部位の間の差によるものである。前述
の方法にしたがって作られたＯ　Ｌ／ＰＨ雑種はＯＬ２
とＯＬ３リプレッサ一部位を含み九のリプレッサー結合
特性を備えている。ＯＬ／ＰＲ雑種はしたがってＯＬの
ように低塩基レベルまで抑制することができる。さらに
、ＯＬ／ＰＲ制御領域はλリプレッサー遺伝子（ｅＩ）
が細菌宿主の染色体上に存在する場合には効率的に抑制
することができ、また４２℃以下の温度で効率的に抑制
解除することができる。

本発明の実施例では、ＰＬ断片はλゲ、ツムの分節を含
むプラスミドｐＧＷ７　（Ｇｅｏｆｆｒａｙ　Ｗｉｌｓ
ｏｎ　により提供された）に由来する。Ｐ８断片はプラ
スミドｐｃＱＶ２　（Ｃ，クイーン、Ｊ、　Ｍｏ１．　
Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、２巻１−１０頁、（１９８３
））Ｋ由来する。ｐＣＱＶ２はλＤＮＡ配列の分節を９
ａｍＨＩ部位がｐＲの直後に続（ｅｒａ遺伝子のＡＴＧ
部分と重複するように変更したものを含む。ＢａｍＨ１
部位を切断し生ずる一本鎖領域を取除くと、ＡＴＧコド
ンは雑種プロモーター／オペレーター領域の末端に存在
することになる生じた雑種ＯＬ／ＦＢ制御配列はｐＧＸ
２６０６と命名されたプラスミド内にクローン化した（
第２図参照）。

このプラスミドにより形質転換された大腸菌培養細胞は
ＧＸ３１２３と命名し、イリノイ州ビオリアの北部地方
調査研究所（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｒａｇｉｏｎａｌ　Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）にＮＲＲＬ　Ｎ
ｏ、　Ｂ−１５５５１として供託したＯ 本実施例では、プロモーターは染色体上に野性型λリプ
レッサーの遺伝子をもつ大腸菌細胞内にプラスミドを維
持することにより、抑制することがで龜る。この代わり
に、ＯＬ／ＰＲ領域を持つプラスミドを温度感受性のλ
リプレッサー変異体Ｃｌ８５７を指定する遺伝子をもつ
細胞内に導入した場合は、抑制は３０℃で維持される。

ｃＩ８５７溶原体の誘導は、望ましい時間に温度を３７
〜４２℃に上昇させて発現させることにより行なうこと
ができる（Ａ、キャンプベ／ｌ／　（Ｃａｍｐｂｅ　１
１　）、「バタテリオファージ・ラムダ」前掲Ｐ１３〜
４４）。ＯＬ／ＰＢに連結された目的の遺伝子の非制御
的発現も、プラスミドを非情原体内におくことにより行
なうことができる。この変異体では遺伝子発現は恒常的
であり、温度は大腸菌の至適成長温度である３７℃に維
持することができる。

本発明の雑種制御領域は、その起源のプラスミド内ノプ
ロモーターとプロモーターに後続する第一番目の遺伝子
との間にある領域に由来する翻訳開始領域を提供し、こ
の領域は遺伝子配列に結合することにより大腸菌に対す
るあらゆる必要な翻訳開始信号を与えることができる。

本領域はンヤイン・ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａ
ｒｎｏ）　領域として知られるリボゾーム結合部位（Ｊ
、シャイン、Ｌ、ダルガノ、Ｐｒｏｃｓ　Ｎａｔｌ、　
Ａｃａｄ、　Ｓｃ１．　ＵＳＡ、７１巻１３４２〜４６
頁（１９７４））とＡＴＧ配列を含む。たとえば前述の
ように、ＰＲプロモーターに近い方のＯＬ　／ＰＢ領域
末端を分解することによシ終末にＡＴＧ配列（翻訳開始
コドン）をもつプラント末端を提供することができる。

次いでこの領域はＡＴＣ配列を欠く遺伝子へ結合するこ
とができる。

他方、本雑種中の３′末端プロモーターに近い方の領域
はプロモーターが翻訳開始のためのＡＴＧコドンをもた
ないように変えて自身の開始コドンをもっている遺伝子
へ結合することができる。このＯＨ，／ＰＨ雑種の利用
の実施例は生体外での部位特異性突然変異誘発によｊｌ
　ＢａｍｒｉＩ部位をＣ１ａ　Ｉ　部位へ変えることに
よって示される（Ｍ、Ｊ、シラー（Ｚｏｌｌｅｒ）ら、
Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　（印刷
中））。

↓ｍｕｔａｇｏｎｅｓｌｓ突然変異誘発↓Ｃ１ａｊ ↓ｎｕｃｌｅａａｅ　ヌクレアーゼ 、、、ＴＴＧＴＡＴ 本発明の三番目の実施例では、試験管内での突然変異誘
発により生じたー塩基変異を利用して雑種制御領域の−
１０ＲＮＡポリメラーゼ認識部位よシ後万の抑制部位を
作り出すことができる。このような切断により雑種プロ
モーター／オペレーターを後続の第一番目の遺伝子の前
にあるシャイン−ダルガノ領域から分離し、別の天然あ
るいは合成のシャイン−ダルガノ配列を挿入できるよう
になる。これらの置換によシ発現効率をさらに高められ
る可能性が生ずる。その−例は、部位特異性突然変異誘
発により５ｐｈ１部位をＯＬ／ＰＢの前述のような部位
へ挿入することでらる（下図参照）。

↓ｍｕｔａｇｅｎｅ目１Ｂ 雑種プロモーター／オペレーター領域は、制御形態また
は非制御形態のいずれの形でも種々の原核細胞または真
核細胞の遺伝子の転写と翻訳に利用することができる。

このような雑種により得られる効率的な抑制は、そのタ
ンパク質産物が少量で細胞に対し有毒であったりプラス
ミドの維持を阻害したりするような遺伝子への結合に特
に有効である。このような遺伝子の発現を最大限に抑制
することにより抑制解除すべき時まで細胞を正常に成長
させプラスミドを維持させることが可能となる。遺伝子
の発現は細胞の生存がもはや重要でなくなった時に誘導
することができる。

以下の実施例は本発明をさらにわかりゃすくするための
ものであり限定的意図をもつものではない。

実施例Ｉ　λＰＬ断片とλＰＲ断片の媒介ベクター内へ
のクローン化 Ａ、ｐＧＷ７由来ノＰＬのｐｔｒｃｓ内へ＋７）りｏ−
ｙ化（第３図） プラスミドｐＧＷ７（８００７塩基対、Ｇｅｏｆｆｒｅ
ｙ　Ｗｉｌｇｏｎから入手）は、ヌクレオチド３４４９
８から３９１７３までの間に（欠損部３８１０４〜３８
７５４　を除く）バクテリオファージλのＤＮＡ分節３
９８７塩基対を含む。λＤＮＡの残基の番号はＦ、ザン
ガー（Ｓａｎｇｅｒ）ら、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、
　１６２巻７２９〜７７３頁（１９８２）による。この
領域はエンドヌクレアーゼ部位Ｂｇｌ［からＨｌｎｄｌ
Ｉ（Ｈ１ｎｃ■）　（３５６１５〜３５７１１の塩基）
までの断片が分離されたλプロモーターＰＬＯ前端部を
含む。

プラスミドｐＧＷ７　ＤＮＡ（１０ｊｊｔ）は、１１．
２単位のエンドヌクレアーゼＢａ１ｌｌ　にューイング
ランドバイオラブ社）で３時間、３７℃において東媒質
塩〃制限緩衝液（５０ｍＭＮａｃｌ　、　１０　ｍＭ　
Ｔｒｌａ　、　ｐＨ７、４、１０ｍＭ　ＭｇＳＯ４、１
ｍＭジチオスレイタール）中で分解した。Ｅ緩衝液（５
０ｍ！ｉ！　Ｔｒｉｍ　、　ｐＨ７，５。

３０ｍＭ酢酸ナトリウム、３　ｙｎＭ　ＥＤＴＡ）に溶
かした１チ低濃度寒天（ペテスタ研究所社）ゲルで電気
泳動することによｊ）５５６６塩基対断片を分解し、ラ
ングリッジ（Ｌａｎｇｒｉｄｇｅ）ら（Ａｎａｌ、　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ。

１０３巻２６４〜２７１頁（１９８０））の方法にした
がってブタノールによシ寒天から抽出した。

このＤＮＡを２．５容のエタノールを加えて沈殿させ、
５Ｗ４０ベックマン超遠心機により４℃、３５．００Ｏ
ｒｐｍで１時間遠心することにより沈殿させた。沈殿は
真空乾燥し２００μｔの水に懸濁した。

分離した５５６６塩基対断片（１０μλ）を８単位のエ
ンドヌクレアーゼＨ１ｎｄｌＩ　（ベリンガー・マンハ
イム社）により媒質塩緩衝液中で２０．５時間、３７℃
で分解した。分解物をフェノールとエーテルで抽出し、
ＴＨＥ緩衝液（９０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　、　ｐＨ８，３。

９０ｍＭホウ酸、　４　ｍＭ　ＢＤＴＡ　）に溶かした
６％ポリアクリルアミドゲル（アクリルアミド：ビスア
クリルアミド＝３０：１）上での電気泳動にかけた。

ゲルを臭化エチジウムで染色後、目的の１１０塩基対断
片を切出し４００μｔの０．　Ｉ　Ｘ　ＴＢＥ中で電気
溶出することによシゲルから取出した。０．２　Ｍ　Ｎ
ａＣ１゜２０　ｍＭ　Ｔｒｉｍ　、　ＰＨ７，４、１ｍ
Ｍ　ＥＤＴＡを１−加え、ＤＮＡをエリューチップ（Ｅ
ｌｕｔｉｐ）にュー・ハンプシャー州キー／にあるシュ
ライヒヤーーシュエル社）に製造者の指示にしたがって
通過させる仁とにより精製した。このＤＮＡをエタノー
ルで前述のように沈殿させベックマンＳＷ２８超遠心機
によシ２５．００　Ｏｒｐｍで１時間、４℃で遠心する
ことによシ沈殿させた。沈殿物を真空乾燥し２０μｔの
水に懸濁した。

プラスミドｐＵＣ８（Ｊ、グイエイラ（Ｖｊｅｉｒａ）
、　Ｊ−メツラング（Ｍｅａｓｉｎｇ）、　Ｇｏｎｏ、
　１９巻２５９〜２６８頁（１９８２））１０μｆを９
．１単位のエンドヌクレアーゼＨ１ｎｄｌＩ　（ベリ／
ガー・マンハイム社）により３７℃で６０分間分解し、
さらに９．１単位の酵素を加えて３７℃で１５分間保温
した。ＤＮＡを０．３Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５，５中で
２．５容のエタノールにより沈殿させた・乾燥した沈殿
瞼を１６−の水に懸濁し、ここに媒質塩緩衝液と２０単
位のエンドヌクレアーゼＢａｍＨＩを全容積が２０μＬ
トｆｚるようにしたものを加えた。反応液を３５℃で２
時間保温後、フェノールで抽出し、エタノールで沈殿さ
せた後、１０／ｊｔの水に再び懸濁した。

ＰＬ断片をｐＵＣ８へ連結するために、２００単位のＴ
４　ＤＮＡリガーゼ（二ニーｅイングランド　バイオラ
ボ社）、１０μｔｉｍｅのウシ血清アルブミン（ペテス
タ研究所社）、０．５　ｍＭ　ＡＴＰ　、　５０　ｍＭ
　Ｔｒｉｍ。

ｐＨ７，８、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２　、２０　ｙｎＭ　
ジチオスレイタールを含む反応液２０μを中で、約５ｎ
ｔの断片を約３０ｎｆのｐＣＵ８へ結合させた。反応は
１２℃で２３時間行なった。

大腸菌に１２　ＪＭ１０３　：　（Ｆ’　狂す３６シＡ
十Ｂ”　ｌｅ二ｌ９１ａｃ　ＺΔＭ１５／Δ（ｌａｃ　
ｐｒｏ）　ｓｕｐ　Ｅ　ｔｈｉ　ｒｐｓ　Ｌ４ｓｂｃ　
Ｂ１５　ａｎｄ　Ａ　）　ｆ　Ｙ　Ｔ培養液（水ｌｔ中
酵母抽出物５ｔ１　トリプトン３　ｔ、　ＮｕＣＬ５ｔ
　）中で生育し、ＣａＣｔ２処理による形質転換に適合
した状態にした（Ｓ、Ｎ、　：ｙ−ｘ　ｙ　（Ｃｏｈｅ
ｎ）ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｅｌ　ＵＳＡ、　６９巻２１１０〜２１１４頁（１９
７２））。

２００μｔの適合細胞試料（約２　Ｘ　１０９　：／帽
を２本用意しそれぞれに８μｔの連結反応液を加え、氷
上に４０分間静置した。反応液に４２℃で２分間加熱衝
撃を与え、ＹＴ培養液で１５倍希釈し、３７℃で１時間
保温した後、分離培地（１，５％のディ７コ寒天、２μ
ｒ／＋１！のアンピリジン、２　ｍｅ／Ｌの０．１Ｍイ
ソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド〔ＩＰＴＧＩ、
２　ｍｌ、／ｌの５−ブロモ−４−クロロ−３−インド
リル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘｇａｌ）を含むＹＴ培
養液）上で平板培養した。挿入物を含むプラスミドを生
ずる連結体は培地上のコロニーの色の変化で同定された
。この挿入体検出方法はＪ。

グイエイラ、Ｊ、スプリング、Ｇｅｎｅ　１９巻２５９
〜２６９頁（１９８２）により詳此に説明されている。

３７℃で１５時間保温後、８５このコロニーが得られた
。白色コロニーからり、Ｓ、ポルメス（Ｉｌｏｌｍｅｓ
）、Ｍ、キグレイ（Ｑｕゑｇｌｅｙ）Ａｎａｌ、　Ｂｌ
ｏｃｈｅｍ、１１４巻１９３〜１９７頁（１９８１）の
方法にしたがりて小型調製ＤＮＡを調製した。

９６塩基対の断片がｐＵＣＪ３に挿入されているがどう
かを確認するために、小型調製ＤＮＡを切断部位が挿入
物の両側に接しているような２種のエンドヌクレアーゼ
で分解した。０．５μｆのＤＮＡの全容が２０μｔとな
るようにして８単位のエンドヌクレアーゼＨ１ｎｄｌＩ
［（ベリンガー・マンハイム社）トトモに媒質塩緩衝液
中で３７℃１時間保温し、さらに８単位の酵素を加えて
３７℃４時間保温した。反応を６５℃で５分間加熱する
ことにより停止させた。これを５０ｍＭＴｒ１ｇ　、　
ｐＨ７，４、１００ｍＭＮａＣＬ　３５μｔに移し、さ
らに２０単位のエンドヌクレアーゼ辷ＲＩ　にュー・イ
ングランド　バイオラボ社）によって３７℃で１５分間
分解した。

試料５μＬをＴＢｇ緩衝液に溶がした５チポリアクリル
アミドゲル上の電気泳動により分析した・Ｅｃ。

ＲＩとＨｌ　ｎｄ　ｍによる分解で、９６塩基対のλＰ
ＬＰＬ断片しく挿入されているならば１１８塩基対の断
片が得られるはずである。１１９塩基対マーカーととも
に移動する断片があることで、１１８塩基対の断片の存
在が同定された。挿入体の内容は、界面活性剤溶菌法（
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　、　Ｔ、　・マ
ニアテイス（Ｍａｎｉａｔｌｇ）　、　Ｅ、Ｆ、フリッ
チュ（Ｆｒｉｔａｃｈ）。

Ｊ、サンプルツク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）編集、コールド
・スプリングハーバ−研究ｆｆｒにューヨーク）発行、
９２頁（１９８２））に類似の方法で細胞から抽出した
ＤＮＡのＤＮＡ配列決定（Ａ、　Ｍ、マクサム（Ｍａｘ
ａｍ）　、　Ｗ、ギルバー）　（Ｇｉｌｂｅｒｔ）　Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　、　Ｌ、グ
ロスマｙ　（Ｇｒｏｓｓｍａｎ）　、　Ｋ、モルダ７　
（Ｍｏｌｄａｖｅ）　ｉｉｉ集、アカデミッｙ−プレス
にューヨーク）発行、６５巻４９９〜５５９頁（１９８
０））により確認された。ＤＮＡを規定の方法にしたが
って２本のＣｓＣ４−臭化エチジウム勾配上で精製し、
Ｂｉｏｇｅｌ　Ａ−５０（バイオラド研究所）のカラム
に通過させた・ Ｂ、ｐＣＱＶ２由来のＰＲのｐＵＣＱ内へのクローン化
（第４図） この各操作はＡ項で説明したものと類似の方法で行なっ
た。それゆえ、ここでは特に変えた点のみを記すことに
する。その他の全ての詳細は、Ａ項と同じものと仮定し
てよい。

プラスミドｐＣＱＶ２　（Ｃ，／　イー　ｙ　、　Ｊ、
　Ｍｏ１．　Ａｐｐｌ。

Ｇｅｎ５ｔ、　２巻、１〜１０頁（１９８３））はλＤ
ＮＡを塩基番号３７１６９から３８０４３まで含み、こ
れをλｃｒｏ遺伝子のＡＴＧ配列と重複するエンドヌク
レアーゼ１３ａｍＨＩ部位を含むように修飾した。ｐＣ
ＱＶ２からＰｉｔの大部分とλｅｒｏ遺伝子に先行する
Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ　領域を含むＨｉｎｄｍ
からＢａｍＨＩまでの断片を分離した。

ｐＣＱＶ２　（５０μ２）を５０単位のエンドヌクレア
ーゼＢａｍＨＩ　（ベテスタ研究所）により媒質塩緩衝
液中で３７℃、１時間分解した。エンドヌクレアー　−
ｈ’　Ｈｌ　ｎｄｌＩ　（ベリンガー・マンノ１クム社
）ｅ次々に加え（８０単位）３７℃で２０．５時間分解
を続けた。分解物をフェノールとエーテルで抽出し、調
製用の６％ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動にか
けた。５０塩基対のＢａｍＨＩ　−Ｈ１ｎｄｌＩ断片を
ゲルから電気溶出により溶離させ、シュライヒヤーーシ
ュエル社のエリニーチツプに通した後、エタノールで沈
殿させた。

ベクターｐＵＣ９は、Ｂｃ　ｏＲＩからＨｉｎｄｍまで
のクローン化部位の方向性が反対である点を除きｐＵＣ
８に類似している（　Ｊ、ヴイエイラ、Ｊ、メッシング
。

Ｇｅｎｅ１９巻、２５９〜２６９頁（１９８２））。

ｐＵＣ９（１０μ２）をエンドヌクレアーゼＢａｍ）（
ＩとＨｌ　ｎｄＩＩで前述のように分解した。分解した
ｐＵＣ９約１５　ｎｔ　（ｉ”　ＰＨ断片約０．２ｎｆ
へ、２００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを含む全容２０μ
ｔの反応液中で１２℃、２３時間反応させることにより
結合した。

適合状態の大腸菌に１２　ＪＭ１０３細胞を連結体８μ
ｔで形質転換し、ＩＰＩＧ−Ｘ−ｇａｌ−アンヒリシン
添加ＹＴ寒天上で平板培養した。１５時間保温後、３２
にの白色コロニーが得られた。このうちのいくつかから
小型調製ＤＮＡをとり出し、挿入体の両側のＥｃｏＲ）
とＨ１ｎｄｌ１１部位を切断した。このようにして挿入
体（５０塩基対）を取出したところ７２塩基対の診査断
片が得られた０正しい大きさの挿入体を含む分離物から
のＤＮＡを精製し、マクサム−ギルバート法により配列
を決定しその内容を確認した。

ＰＬ断片とＰＲ断片のｐＵＣ８およびｐＵＣ９内へのク
ローン化の結果、断片は同一方向に配向し、挿入体の両
側に有用なエンドヌクレアーゼ切断部位が位置するよう
になった。ＰＬを含むｐＵＣ８は今後ｐＧＸ２６０２と
し、ＰＲを含むｐＵＣ９はｐＧＸ２６０３とする。

Ｃ３ＰＬ断片とＰＲ断片の結合と結合物のり關−ン化（
第５図） 精製したｐＧＸ２６０２とｐＧＸ２６０３のＤＮＡ　（
各２５μｍ）を２４単位のエンドヌクレアーゼＨｉｎｃ
ＩＩ　（ＨｉｎｄｌＩと同じ、二ニー〇イングランド　
バイオラボ社）によシ媒質塩緩衝液中で２時間３７℃で
分解した。

さらに２４単位の酵素を加え、３７℃でｐＧＸ２６０２
の場合は１時間、ｐＧＸ２６０３の場合は４時間保温を
継続した。分解したＤＮＡをエタノールで沈殿させ、媒
質塩緩衝液へ再び懸濁した。次いでｐＧＸ２６０２は５
６ｊ１位ＯエンドヌクレアーゼＨ１ｎｄｌｌｌにニー・
イングランド　バイオラボ社）トトモに、ｐＧＸ２６０
３は２５単位のエンドヌクレアーゼＰｓ＋ｔＩ　（タカ
ラ社、日本）とともに３７℃で２時間保温した。次にこ
の２つのＤＮＡ試料を混合し、フェノールで抽出し、エ
タノールで沈殿させた。２ａの異なる酵素による両ＤＮ
Ａの分解によって、次の段階でこれらを連結するさいの
可能な組合せの数を少なくすることができた。望ましい
連結は県と■部位での九のＰ□への連結であった。

線形化したプラスミドを連結するために、ＤＮＡ（５０
μｆ）を２０００単位のＴ４ポリヌクレオチドリガーゼ
にニー・イングランド　バイオラボ社）により１００μ
ｔの溶液中で１５時間１６℃に保温した。さらに２００
０単位のりガーゼを追加し４８時間保温を続行した。

ＰＲへ結合した左側のオペレーターを含むものと考えら
れるＥｃｏＲＪ　〜ＢａｍＨＩ断片を連結した線形ＤＮ
Ａ断片から取出し、別のプラスミド内へクローン化した
。これを行なうため、まず最初にＤＮＡを１００単位の
エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ　（＝ニー・イングラン
ド　バイオラボ社）ニより３７℃で２時間分解した後、
エタノールで沈殿させた。沈殿物を９６ＡＬの１００　
ｍＭ　Ｔｒｌｓ　、　ｐＨ８，０１１ＣＲ１蜀し、９４
４単位（４μ２）の細菌アルカリフォスターゼによ１７
６５℃で４０分間分解して５′リン酸基を除去した。フ
ェノールで３回抽出しエタノールで沈殿させた後、５　
Ｑ　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　、　ｐＨ７，４、１０ｍＭ１ｇＣ
６２ｅ５ｍＭジチオスレイタール中で１０単位のＴ４ポ
リヌクレオチドキナーゼ（Ｐ、Ｌ、バイオケミカルズ社
）と１００　ｐｃｔの３２Ｐ−ＡＴＰ　（アメルシャム
社、　６３００Ｃ１／ｍ　ｍｏｌ）とともに３７℃で３
５分間保温することにより遊離末端をγ”’Ｐ−ＡＴＰ
　で標識した。非標＠　ＡＴＰを１ｍＭまで加え３７℃
で１０分間保温した。

反応物をフェノールで抽出し、ＤＮＡをエタノールで沈
殿させた。次にこのＤＮＡを８０単位のエンドヌクレア
ーゼＢａｍＨＩにより媒質塩緩衝液中で３７℃で２時間
分解し、フェノールで抽出し、エタノールで沈殿させた
。沈殿物を４５μｔの色素添加ＴＢＥ　（８０％グリセ
リン、０．５チブロムフエノーＡ／）Ａ／　−、０，５
％キシレンシアツール）に８７１）Ｌ、３Ｍ厚さの６％
ポリアクリルアミド調製用ゲル上に装填した。ゲルは１
１，２−のアクリルアミド（４０チ、アクリルアミド：
ビスアクリルアミド＝３０：１）、５６−の水、７．５
−の１０　Ｘ　ＴＢＥ　。

０．５−のｌＯ−過硫酸アンモニウム、および５５μＬ
のＴＥＭＫＤ（バイオラド研究所）から作成した〇２５
０ｖで１時間電気泳動した後、ゲルを臭化エチジウムで
染色し、１５０塩基対のＥｃｏＲｉ　〜ＢａｍＨ（断片
を切出して電気溶出によりゲルから溶離し、シュライヒ
ヤーーンユエル・エリニーチップヲ通した後エタノール
で沈殿させた。この時点での試料の量は臭化エチジウム
染色で大体の程度検出できたため、断片は３２ｐで末端
標識しであることからこれ以降はオートラジオグラフィ
ーによりゲル上で検出した。

プラスミドｐＧＸ１０２５をＯＬ　／ＰＨ断片のクロー
ン化のためのベクター（媒介体）として利用した。この
プラスミドをエンドヌクレアーゼＥｃｏＲ［と７３！！
ｍＨＩで前述の条件下で分解し、次いで細菌アルカリフ
ォスファターゼで処理することにより５′リン酸を除去
し、プラスミドの再環状化はＯＬ／ＰＲ断片）結合した
場合にのみ可能となるようにした。

ＯＬ／ＰＲ断片のベクターへの連結条件は以下の通シで
ある：２００単位のＴ４　ＤＮＡ　リガーゼ（二ニー・
イングランド　バイオラボ）、前述のように調製したｐ
ＧＸ１０２５を５０　Ｏｎ？、および完全に回収したＯ
Ｌ、／ＰＢ断片（量は未知）を含み全容を２０μＬとし
て標準的反応条件下で行なった。保温は１６℃で１８時
間とした。

連結したＤＮＡの形質転換宿主は大腸菌に１２　ＪＭＩ
ＯＩ（λ）Ｆ’　ｔｒａＤ３６□Ａ＋Ｂ十兜■９狂チ礒
１５／△（隻ｐｒｏ）　５ｕｐＥ　ｔｈｌとした。ｎ胞
（２００μＬ）を適合化し、ＪＭ１０３（λ）のところ
で説明したのと同じ方法で８μＬの連結反応液により形
質転換した。形質転換細胞の懸濁液を２００μｔずつに
分注し、１００μ？／＃１ｇのアンビリクンを添加した
ＬＢ寒天（１，０チトリグトン、０．５チ酵母抽出物、
１．５％寒天。

以上すべてディフコ社製、　０．５　％　ＮａＣｔ）上
で３７℃で１５時間平板培養した。約６０００この形質
転換コロニーが得られた。

小型調製ＤＮＡは１０ゴのＬＢ（培養液から寒天を除い
たもの）中で飽和状態まで増殖させたコロニー６４こか
ら調製した（ホルメス、キグレイ。

前掲）。プラスミドＤＮＡをフェノールで２回抽出し、
エタノールで沈殿させた後、１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　。

１）Ｈ８，０、１ｍＭ　ＥＤＴＡ　１００１１１中へ懸
濁した。各小型調製ＤＮＡ試料５μｔを、１２単位のエ
ンドヌクｖ　７−−ｈ’　Ｈｌ　ｎｃＩＩ　にニー・イ
ングランド　バイオラボ社）によシ媒質塩緩衝液中で全
容を２０μｔとして３７℃で２時間分解した。分解物を
５チポリアクリルアミド小型ゲル上の電気泳動で分析し
たところ２つの分離物は５０〜６０塩基対の診査断片を
もっていた。このＨｉｎｃ、［断片は、ＯＬ／ＰＲ断片
の内部のＨｉｎｃ［部位と、ベクターであるプラスミド
内の挿入体のちょうど３′側にあるＨｉｎｃ［部位に由
来するものでめった。もうひとつの診査試験は小型Ｍ！
！ＤＮＡ５μｔを１６単位のエンドヌクレアーゼＢａｍ
ＨＩ　（二ニー・イングランド　バイオラボ社）により
媒質塩緩衝液中で３７℃で２時間分解することにより行
なった。ＢａｍＨＩの分解の完了は、分解、物の少量を
１％寒天小型ゲル上で電気泳動することによシ確認した
。次に分解物を１００　ｍＭＮａｃ４５０　ｍＭ　Ｔｒ
ｉｍ　、　ｐｔ（７，４中へ移し、２０単位のエンドヌ
クレアーゼＥｃｏＲＩにより３７℃で２時間分解した。

反応物を５チポリアクリルアミドゲル上での電気泳動に
より分析した。ＢａｍＨＩ部位とｇｃｏＲＩ部位は０１
．／ＦＢ挿入体に隣接する。このため、この分解により
１６４塩基対の断片が生ずるはずであった。正しいＨｌ
ｎｃ［断片をもつ２つの分離物は、正しいＢａｍＨＩ　
−１ｉ：ｅｏＲＩ断片もまたもっていた・ＯＬ／ＰＢ挿
入体の内容を確認するため、正しい制限パターンをもつ
ひとつの分離物からＤＮＡを精製し、マクサム−ギルバ
ートの方法よってＤＮＡの塩基配列決定を行なった。こ
の配列は、λファージの対応する分節の塩基配列と同一
のものであった（Ｆ、ザンガーら、前掲）。

ＯＬ／ＰＲを含むプラスミドはｐＧＸ２６０６と命名し
た。

このプラスミドで形質転換した大腸菌培養細胞はＧＸ３
１２３　と命名し、北部地方研究所にＮＲＲＬ　Ｎｏ　
、　Ｂ−１５５５１として寄託した。

実施例■　成熟ヒト血清アルブミン（ＩＳＡ）の暗号配
列の前のＸｈｏＩ切断部位へ挿入したＯＬ／ＰＲ制御領
域による制御下でのヒト血清アルブミン遺伝子の発現 ０７、／ＰＢ雑種領域をヒト血清アルブミン（ＩＳＡ　
）の発現を制御するのに利用した。この方法ではＯＬ／
Ｐｇ制御領域はプロモーター、シャイン−ダルカッ領域
、および潤沢開始用コドンＡＴＧを提供する。

ＯＬ／ＰＲ領域は５′末端にＡＴＧコドンをもたぬ成熟
ＩＳＡ暗号配列へ連結された。この形のＩＳＡは、Ｉ（
ｓＡの第一番目のアミノ酸に対応するコドンと重複する
制限部位（Ｘｈ　ｏ　Ｉ　）を導入することにより作り
出された。オリゴヌクレオチド特異性突然変異誘発を利
用して、成熟Ｈ８Ａ暗号配列の５′末端とｉ複するＸｈ
ｏＩ制限エンドヌクレアーゼ切断部位を設置するために
プレプロＩＳＡの野性型暗号配列を修飾した。

この突然変異誘発の方法および大腸菌内でのこの修飾配
列からのｍｅｔＨ８Ａの発現の方法を以下の図式に概略
化し、説明する。

６０．んμＧＣＡＧＣＴＣＴＡＣＧＴ　、　、　。

ＣＴＡＣＧＴ、、。

突然変異誘発はＭ、シラー、Ｍ、スミス（前掲）の方法
を応用した以下の各操作により行なった。

１、　ヒト血清アルブミン遺伝子の一部を第６図に示す
ようにバクテリオファージＭ１３１ＴｌｐＳ内へ予備ク
ローン化した。プラスミドｐＧＸ４０１由来の、プレグ
ロ配列（シー−１と命名）をもつ完全な長さのＩＳＡク
ローンを含む精製ＤＮＡをＨｌ　ｎｅｌＪで分解し、ヌ
クレオチド−２２から１３２８までのｈｓａ−１配列か
ら成る１、３５＝？ロベース（１３５０塩基対）の断片
を寒天ゲルからの電気溶出により精製した。

Ｍ１３ｍｐ８は、Ｈｉｎｃ［で分解し細菌アルカリフォ
スファターゼ（ＲＡＰ　）で完全に処理し５′リン酸を
除去した。ＲＡＰ処理Ｍ１３ｍｐ８　ＤＮＡを精製した
ｈｇａ−Ｉ　ＨＩｎｃｌＩ断片とともにＴ４ＤＮＡ！ｊ
ガーゼの存在下で１２℃に保温した（ベクターと挿入体
のモル比は１．３５　：　１　）。

連結反応物を利用して大腸菌ＪＭ１０３株をトランスフ
ェクト（形質転換感染）した。ｈｓａ−１配列はＭ１３
ｍｐ８内へ時計回りにも反時計回シにもいずれの方向で
も挿入できるので組換え型からの一本鎖ファージＤＮＡ
は有意味あるいは無意味のｈｓａ−１配列のいずれをも
つ場合もあることになる。挿入体の方向性を判定するた
めに、有意味または無意味のｈｓａ−１配列の一部と相
補的なオリゴマー探査子を用いた雑種形成反応によりプ
ラークを分別した（詳細は後述）。望ましい方向に挿入
された’ｈｓａ−１断片をもつ挿入体を制限エンドヌク
レアーゼマツピングおよび３’Ｈ１ｎｃｌｉ部位からＸ
ｂａＩ部位への方向のＤＮＡ配列決定により確認した。

クローン化されたｈａａ−１断片をもつファージはＭＧ
Ｘ−２と命名した。

２６　望ましい突然変異体は野性型配列とヌクレオチド
ｌこが異なっていた。１７塩基のオリゴヌクレオチドが
合成されたが、これは望ましい塩基変化（Ｇ−＋Ｃ）部
位での塩基ｌこの誤対合を除いて野性型配列と相補的で
あった。

３、突然変異誘発性オリゴヌクレオチドはＤＮＡポリメ
ラーゼＩによるＤＮＡ合成のプライマーとして利用され
た。ＤＮＡリガーゼによる処理後、生じたヘテロ二本鎖
閉環状ＤＮＡ分子はアルカリ性ショ糖勾配遠心分離法に
よシ鞘製し、ひとまとめにして透析した後、適合化した
大腸菌のトランスフェクトに使用した。

４、得られたプラークはファージＤＮＡと突然変異誘発
性オリゴヌクレオチドとの雑種形成反応により分別した
。この操作の原理は、突然変異誘発を指令するのに使う
オリゴヌクレオチドは不完全にしか対合しない（１７塩
基対中１６）野性型クローンのＤＮＡよりも、完全に対
合する（１７塩基対中１７）突然変異ＤＮＡとより熱安
定性の高い二本鎖を形成するということである。このこ
とから、完全に対合したオリゴマーと誤対合したオリゴ
マーとが区別されるような条件下で雑種形成実験を行な
うことにより突然変異ファージを野性型ファージから区
別することができる（Ｒ，Ｂ、ワラス（Ｗａｌｌａｅｅ
）　、　Ｍ、Ｊ、ジョンソｙ　（Ｊｏｈｎｓｏｎ）　、
　Ｔ−ヒロセ、Ｔ、ミャケ、　Ｅ、Ｈ，カワシマ、に、
イタクラ。

ＮｕＣｌ、　Ａｃ１ｄｓ、　Ｒｅａ、　９巻８７９頁（
１９８１））。

ファージ原液は個々のプラークから調製した。各ファー
ジ土ｉ２０μｔをニトロセルロース−フィルター・ペー
パー上に、フィルターの小領域に２０μｔを濃縮するた
めのＳ＆Ｓミニフォールド装置（９６穴）を使ってスポ
ットした。各試料について同一の４×１２列のスポット
を作った。

フィルターを空気乾燥し真空中で８０℃で２時間加熱し
た。このフィルターを予備雑種形成させた後、シラー、
スミス（前掲）の方法にしたがって５′末端標識オリゴ
ｗ−（１０ｐｍｏｔ／４　ｍｏｔ）と雑種形成させた。

２５℃で１時間雑種形成反応させた後、フィルターを探
査子溶液から取出し５（ｌｄの６ＸＳＳＣ中で２５℃で
２分間洗浄した。フィルターを列に沿って切断し同一の
スポット列に分けた。

フィルターの上半分は４８℃で１０分間（２Ｘ２５ｄ　
６Ｘ８ＳＣ）洗浄し下半分は５２℃で１０分間（２Ｘ２
５ｄ　６ＸＳＳＣ）洗浄した。フィルターを空気乾燥し
室温で１２時間Ｘ線フィルムに露出した。ｈｓａ−Ｉ　
ＤＮＡ（ＭＧＸ２）は２５℃で１Ｍ塩中において突然変
異誘発性オリゴヌクレオチドと誤対合した雑種を形成し
、これは４８℃での洗浄では安定だが５２℃では不安定
であることがわかった。このため、突然変異ファージら
れたプラーク由来のＤＮＡ試料は２５℃で雑種形成反応
を行ない次いで４８℃と５２℃で洗浄した。

５、二本鎖複製型ＤＮＡは２この雑種形成陽性クローン
（Ａ７　、　Ｄ７）と２この陰性クローン（Ａ８　、　
Ｄ８）から調製した。各ＤＮＡについてＸｈ　ｏ　Ｉ切
断部位の存否を調べた。ファージＡ７とＤ７由来のＤＮ
ＡはＸｈｏＩで切断されたが、Ａ８とＤ８由来のＤＮＡ
は切断されなかった。ファージＡ７とＤ７由来のＤＮＡ
中のＸｈｏＩ部位の正しい位置は各種の他の制限酵素に
よる分解で確認した◎ＤＮＡ配列分析によＶ望ましい塩
基変化が生じていることがわかった。このｈｓａ変異体
はｈａａ−３とよびこれをもつＭ１３クローンはＭＧＸ
４とする。ＭＧＸ４は成熟Ｈ８Ａ暗号配列の５′末端を
正確に切断する制限部位をもつ。

プラスミドベクター内でのｈｓａ−３の再構成ｈｓａ−
３遺伝子はプラスミドベクター内で発現信号の添加に適
した形に再構成した。プラスミドｐＧＸ１０３１は、プ
レプロ領域の小部分（３コド／）を除いてｐＧＸ４０１
由来のｈｓａ−１クローン全体を含む。このプラスミド
をＩＳＡ遺伝子の３′末端とその他の必要なベクター成
分を提供するのに利用した・第７図に、ＭＧＸ４由来の
ｈｓａ−３遺伝子の５′部分をｐＧＸ１０３１のｈｓａ
−１遺伝子の３′末端へ結合させてμｎｏ１部位をもつ
匹−３を含むｐＧＸ１０４２を作るのに使用した過程を
概略示する。ｐＧＸ１０３１　（第７図）をＥｃｏＲＩ
とＸｂａＪで切断し、図示した断片を精製した。この断
片を同じ酵素で切断したベクターＭＧＸ４ＤＮＡと混合
し、ＤＮＡリガーゼとともに保温した。

連結反応物で大腸菌ＪＭＩ　Ｏｆを形質転換すると、１
２００このアンピリジン耐性形質転換株が得られた。無
作為抽出したこのうち４５この細胞に由来するプラスミ
ドＤＮＡについて）（ｈｏＪを含む種々の制限エンドヌ
クレアーゼで分解することにより特性を調べた。ｐＧＸ
１０４２と命名されるプラスミドを望ましい構造をもつ
ものとした。

μＩＯＩ部位でｈｓａ−３へ連結したＯＬ／ＰＢ制御領
域を含むｐＧＸ１０４３の構築 ０１、／ＰＲのｈｓａ−３への結合を第８図に概略示す
る。

形質転換での細菌宿主はＪＭＩＯＩ（λ）とした。ＯＬ
／ＰＲプロモーターはこの株では抑制されるはずである
。

この構築用の断片は精製されていないので、以下の操作
により親分子数とこの操作を行なわない場合に回収され
ると思われる組換プラスミド１種を減少させた。したが
って目的の形質転換株は回収したコロニー中かなり多数
を占めることが期待された。

以下にプロモーターとｈｓａ−３とを連結する方法を概
略示する。

と土−３ ヤエナリヌクレアーゼによる分解　ヤエナリヌクレアー
ゼによる分解プラスミドｐＧＸ２６０６　ＤＮＡはシｔ
ｍＨｉによる分解で調製した（Ｒ，Ｈ，ライス（Ｒｉｃ
ｅ）　、　Ｇ、に、ミーンズ（Ｍｅａｎｓ）　、　Ｊ、
　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２４６巻８３１〜８３２頁
（１９７１））。−重鎖５′末端をヤエナリ（ｍｕｎｇ
　ｂｅａｎ）ヌクレアーゼで除去し、プラスミドを再び
８ｇ１■で切断した。後続の連結反応でｐＧＸ２６０６
が再び環状化するのを防ぐため、ＤＮＡｔ−ｉ菌アルカ
リフォスファターゼで処理した。プラスミドｐＧＸ１０
４２　ＤＮＡもＸｈｏ■で切断し、ヤエナリヌクレアー
ゼで処理して一本鎖５′末端を除去し、ＢｇｌＩで切断
した。

各プラスミドＤＮＡ約２５０ｎｆずつを混合し、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼとともに１６℃で１８時間保温した。

連結反応物をＢａｍＨＩで切断し、再環状化しているｐ
ＧＸ１０４２プラスミドをすべて線形化するとともに考
えられる組換型のうちのひとつを線形化した。

連結ＤＮＡ約７５ｎ？を使用して適合化したＪＭＩＯＩ
（λ）を形質転換した。形質転換反応物をアンピリジン
を含む培地上で３７℃で平板培養した。形質転換株４３
０こが得られた。

目的のプラスミドｐＧＸ１０４３はプロモーターとｈａ
ａ−３の連結部に第８図最後段に示す配列をもりことが
予想された。矢印の左側の配列はＡＴＧ配列とシャイン
−ダルガノ領域（下線部）を含んでおりＯＬ／ＰＲ分節
由来でめった。矢印の右側の配列はｈｓａ−３由来でら
った。

得られた４３０この形質転換株は種々の方法で検査され
た。

Ａ、コロニー雑種形成反応（Ｍ、グルンンユタイ／（Ｇ
ｒｕｎｓｔｅｉｎ）　、　Ｄ、Ｓ、ホグネス（Ｈｏｇｎ
ｅｇｓ）　。

Ｐｒｏ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ
、Ａ、７２巻３９６１頁（１９７５）） ｈｓａの５′末端由来の５２ｐ標識探査子を使用して榊
をもつコロニーを検出した。形質転換株を９６穴ミクロ
タイタープレートにより３７℃で１００μｍ／−アンピ
リジン添加ＬＢ培地内で生育させた。

培養液の一部をレプリクーターによりアンピリジン添加
ＬＢ培地上のニトロセルロースフィルターへ移し、さら
に３７℃で５時間保温した。フィルター処理と雑種形成
反応の条件は前掲の参考文献に説明されている。５２ｐ
標識ＤＮＡ探査子は成熟ＩＳＡの５′末端の暗号配列を
含むプラスミドから調製した０５′末端由来の１７８塩
基対の断片をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼによりｒ−
５２Ｐ−ＡＴＰで標識し、目的の吏断片を５チポリアク
リルアミドゲルで精製した。既知の陽性および陰性対照
試料は予想通りの結果を示した。形質転換株の３９俤は
少なくともこのｈｓａ分節をもっていた。

Ｂ、サザンープロット（Ｅ、Ｍ、サザｙ　（３ｏｕｔｈ
ｅｒｎ）。

Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　９８巻５０３頁（１９７
５））宿主細胞はλ溶原性なので、形質転換株は直接λ
ＯＬ／ＰＢ配列に関してコロニー雑種形成反応により調
べることはできなかった。その代わりとして１、蝕υ配
列をもっことが確実な（前掲のＡ項で確認された）形質
転換株４５こからＤＮＡを調製し、プラスミドＤＮＡを
寒天ゲル上で染色体ＤＮＡがら分Ｒｆｔし、サザン・プ
ロットをこのゲルから調製した。

正りいプラスミ）”　ＤＮＡは、ｐＧＸ２６０６由来の
１６４塩基対の、ショＲＩ〜１３ａｍＨＩ断片を末端標
識して作成した３２ｐ標識ＯＬ／Ｐ　Ｒ断片との雑種形
成反応により同定した。雑種形成反応はＡ項と同様にし
て行なった。４４この分離株がＯＬ／ＰＨ配列をもって
いた。

Ｃ８正しく構築されたプラスミドの同定Ｂ項で検査した
４５この形質転換株それぞれから採取したプラスミドＤ
ＮＡを制限エンドヌクレア１ゼによる分解で分析した。

１）寒天ゲル電気泳動法による分解前のプラスミドの大
きさの分析、２）且ａｍＨｉ部位の欠損（ｐＧＸ１０４
２は加ＩＩ部位をもつが目的とする組換体はもたない）
、３）ＯＬ／ＰＲ制御領域の存在を診断する制限断片の
存在、以上の点により、２つのクローンが正しい構造を
もつものと考えられた。

Ｄ、ＤＮＡ配列決定 前掲の期待される特性すべてをもつ２つのプラスミドＤ
ＮＡについてファージＭ１３内で塩基配列決定を行なっ
た＠Ｉ）ＧＸ１０４３由来のＯＬ／ＰＲ−ｈｓａ−３結
合物ノＭ１３予備クローンは、ｐＧＸ１０４３由来のＯ
Ｌ／／ｐＲ−上と−３分節（肪ＲＩ〜現壓■）をＭ１３
ｍｐ９内へクローン化することにより作成した。デオキ
シＤＮＡ配列決定はＦ、ザンガーら、Ｐｒｏ、　Ｎａｔ
ｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ。

Ｕ、Ｓ、Ａ、７４巻５４６３頁（１９７７）の方法にし
たがって行なった。予悲通シの配列をもつ分離体はｐＧ
Ｘ１０４３と命名した。

ｍｅｔ　ＩＳＡの発現 ＩＳＡの発現を検査するため、プラスミドｐＧＸ１０４
３を温度銹導性の欠損グｃｒ７アージλ△ｆ（Ｉ△Ｂａ
ｍ　（Ｊ８５７をもりＧＸ１８６４株へ移した。次に温
度を４２℃に上昇させることによりＯＬ／ＰＨプロモー
ターから転写を誘導し、経時的に試料を採取して分析し
た。

試料は５Ｄ８−ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動（
Ｕ、ラムリ（Ｌａｅｍｍｌυ、　Ｎａｔｕｒｅ、　２２
７巻６８８゜頁（１９７０））にかけた後、ウェスタン
−プロット法（Ｈ，トウビン（Ｔｏｗｂｉｎ）ら、Ｐｒ
ｏ、　Ｎａｔｉ。

Ａｅａｄ、　Ｓａｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　７６巻４３５ｏ
頁（１９７９）：Ｗ、プルネット（Ｂｕｒｎｅｔｔｅ）
　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１１２巻１９５頁（
１９８１））を行なった。ＩＳＡは抗Ｈ８Ａ抗体とこれ
に引続きホースラディツシュ・パーオキシダーゼへ結合
したヤギ抗ウサギ抗体を使用して分析した。発色操作に
より抗原帯を視覚化した。宿主株の対照とｐＧＸ１０４
３を含む非誘導細胞はともに染色帯を示さなかった。誘
導したｐＧＸ１０４３ＤＮＡは分子量６８キロダルトン
（Ｋｄ）に相当する移動度の太い帯を生じた。この他に
、より小さな分子量に相当する移動度の細い帯もいくつ
か生じた。

仁れらの細い帯は！ＩＳＡのタンパク質分解酵素による
分解やｈｓａ遺伝子の転写・翻訳のυ日始−停止の異常
によって生じた可能性がるる。

染色したｐＧＸ１０４３由来の６８Ｋｄの帯の強度を既
知量の精製Ｈ８Ａ　（シグマ・ケミカル社）のものと比
較した結果、誘導後２時間で誘導ｐＧＸ１０４３抽出物
中の全タンパク質の０．２係がＩＳＡでおると評定され
た。この発現量は前掲と同じ誘導過程の間に５Ｈ−ロイ
シンで標識した抽出物から免疫沈殿法を行なうことによ
りｄす定した。１ｌｌ（−ホルムアルデヒドで標識した
既知量のＩＳＡ　（フラクションｖ１シグマ・ケミカル
社）を内部標準（Ｌｌ（、ライス（Ｒｌｃｅ）　、　Ｇ
、Ｅ、ミー７ズ（Ｍｅａｎｓ）　）　として使用した。

内部標準を細胞抽出物へ添加した後Ｓ、Ｗ、ケスラー（
Ｋｅｓｓｌｅｒ）　、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１１
５巻１６１７〜１６２４頁（１９７５）の方法を少し修
飾した方法により免疫沈殿させた。免疫沈殿物を７．５
％ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動にかけ、ＩＳＡ
帯を切出してパラカード試料酸化装置内で酸化した。１
ｌＩＣＯ２および５Ｈ２０産物は別々に液体シンテレー
クヨン分光測定により定量した。５Ｈ−ＩＳＡの収量は
、添加した既知量のｌ５Ａ−”’Ｃ内部標準の収量と直
接比較することにより決定した。次に３）Ｉ　−ＩＳＡ
量を細菌タンパク質内へ取込まれた全３Ｈ−ロイシン量
に対する百分率として算出した。

ＩＳＡの最大収量は全タンパク質の０．２％で８った。

このプラスミド（ｐＧＸ１０４３）で形質転換した大腸
菌培養細胞はＧＸ１８６４と命名し、イリノイ州ビオリ
アの北部地方調査研究所にＮＲＲＬ　Ｎｏ、　Ｂ（５６
１３として供託した。

【図面の簡単な説明】

第１図は雑種ＯＬ／Ｐ−１制御領域を作るために連結し
たプロモーター／オペレーター配列を示す説明図。 第２図は雑［ＯＬ／ＰＲ制御領域を含むプラスミドの遺
伝子地図を示す説明図。 第３図、第４図、および第５図はＯＬ／ＰＲ領域を含む
プラスミドｐＧＸ２６０６の構築の各操作過程を示す説
明図。 第６図、第７図、および第８図はプラスミドｐＧＸ１０
４３の構築の各操作過程を示す説明図。 特許出願人　ジェネックス・コーポレイションｗＪ面の
浄ＩＦ（内容に変更なし） −３５−１０ Ｐ。 −３５−１０ Ｈｉｎｃｌｌｌｌ’ ＦＩＧ、　２ ＦＩＧ、５ ＦＩＧ、６ ＦＩＧ、７ １蓮茄 ｌ　ＢａｍＨｒ ＦＩ　Ｇ、　８ 手続補正書（自発） 昭和５９イＰ°１８月 特許庁長官殿 ｌ、事件の表示　特願昭５９−１９６９２４号２、発明
の名称 雑種制御領域 ３、補正をする者 ５、補正の対象 ６、補正の内容 （１）別紙のとおり願書の特許出願人の代表者を補正す
る。 （２）別紙のとおり委任状およびその訳文を補充する。 （３）図面の浄書（内容に変更なし）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ＋１）　！−４）７’ロモーターーオペレーター領域の
   プロモーター配列を第二のプロモーター−オペレーター
   領域のオペレーター配列へ結合したものから成り、前述
   の第二のプロモーター−オペレーター領域のオペレータ
   ー配列が前述の第一の領域由来のプロモーターをその本
   来のオペレーター配列よりも高い効率で制御できるよう
   な、その後続に位置する遺伝子配列の転写を指令し制御
   することのできる雑種制御領域。 （２）　λファージプロモーター配列ＰＲをλファージ
   ブロモ−ター−オペレーター領域ＰＬのオペレーター配
   列へ結合したものから成る、特許請求の範囲第１項記載
   の雑種制御領域。 （３）完全なプロモーターＰＲを含むλＰＲプロモータ
   ーーオペレーター領域由来の断片と、オペレータ一部位
   ＯＬ２とＯＬ３を含むλＰ、プロモーターーオペレータ
   ー領域由来の断片へ結合したオペレータ一部位ＯＲ■か
   ら成る、特許請求の範囲第１項記載の雑種制御領域。 （４）ＰＲプロモーターに近い側の末端を、末端にメチ
   オニ；　（ＡＴＧ）翻訳開始コドンをもつプラント末端
   となるように修飾し、これによシ翻訳開始コドンを欠く
   遺伝子へ結合できるようにした、特許請求の範囲第２項
   または第３項記載の雑種制御領域。 ＋５）　ＰＲプロモーターに近い側の末端を、末端にＡ
   ＴＧコドンを欠くように修飾し、これによりそれ自身の
   開始コドンをもつ遺伝子へ結合できるようにした、特許
   請求の範囲第２項または第３項記載の雑種制御領域。 （６）制限酵素で分解し、そのＰＲプロモーター配列よ
   り後方に位置する天然のシャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎ
   ｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）領域を除去しである、特許請求
   の範囲第２項または第３項記載の雑種制御領域。 （７）特許請求の範囲第４項記載の雑種制御領域から成
   り、原核生物または真核生物内で前掲の遣伝子配列の転
   写と翻訳を指令することのできるプラスミド。 （８）前掲の原核生物が大腸画風であるような、特許請
   求の範囲第７項記載のプラスミド。 （９）特許請求の範囲第７項記載のプラスミドにより形
   質転換した微生物・ Ｑｌ　大腸菌属である特許請求の範囲第９項記載の微生
   物。 αＤ　大腸菌（ｃｏｌｔ）種である特許請求の範囲第１
   ０項記載の微生物。 １１２　ＧＸ３１２３　と命名され北部地方調査研究所
   （Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｒｅｇｌｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａｒ
   ｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　）にＮＲＲＬ　Ｎｏ、　
   Ｂ−１５５５１として供託された、大腸菌属および８１
   ［（ｐ、ｃｏｌｌ）　である微生物。