JPS609494A - Ｌ−スレオニンの取得方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はＬ−スレオニンとＬ−アロスレオニンの混合物
に新規な酵素であるＬ−アロスレオニンアルＶラーゼを
作用させることによってＬ−アロスレオニンを選択的に
分解させ、Ｌ−スレオニンを酢隋する方法に関する。

Ｌ−スレオニンは人間および動物の必須アミノ酸のひと
つであり、各種動、植物蛋白質中の含有量が比較的少な
いことから食品および飼料添加物として潜在需要の大き
なものであろうこのＬ−スレオニンは、従来は天然物よ
りの抽出法とか発酵法で製造されてきたカー、比較的高
価であったために安価な製造法が待望されていた。

Ｌ−スレオニンとＬ−アロスレオニンを光学分割する方
法は挿々知られているめｌ、いずれも分割操作が非常に
煩雑なうえ収率が低いものであった。

また、この光学分割によってＬ−アロスレオニンが得ら
れるが、このＬ−アロスレオニンの需要はほとんどない
。

本発明者らはＬ−スレオニンとＬ−アロスレオニン混合
物の簡便かつ効率的な光学分割とそれによって副生する
Ｌ−アロスレオニンの有効利用を図って安価なＬ−スレ
オニンを市場に供給するべく種々研究の結果、たまたま
Ｌ−アロスレオニンを選択的に分解してグリシンとアセ
トアルヂヒｒを生成させる酵素、Ｌ−アロスレオニンア
ルダラーゼを微生物が増生することを発見し、この酵素
をＬ−スレオニンとＬ−アロスレオニンの混合物に作用
させればＬ−スレオニンを容易に華離し副生物もグリシ
ンとアセトアルデヒＰであるから容易に有効利用しうろ
ことを見出し、これに基いて本発明を完成するに至った
。本酵素に関する研究は比較的少ないが、羊肝臓〔Ｊ、
Ｇｅｎ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、。

ＶｏＬ３８．ｐ１８１（’１９５４））とか、トウモロ
コシ発芽体（農芸化学　昭和５５年度大会要旨集、４９
頁）のなかにその存在が認められている。

本発明者らはこのＬ−アロスレオニンアルダラーゼを微
生物を用いて生産するべく種々研究を重ねた結果、たま
たま／々千ルス属、アリスロバクター属、シューＰモナ
ス属及びアルカリ土類金属に属する細菌がＬ−アロスレ
オニンアルｒラーゼ産生能を有することを見出し、これ
に基いて本発明を完成することができた。なお、Ｌ−ア
ロスレオニンアルｒラーゼが微生物によって育生される
ことは全く知られていないところから微生物による生産
は本発明によってはじめてなしとげられたものである。

すなわち本発明は、Ｌ−スレオニンとＬ−アロスレオニ
ンの混合物にＬ−アロスレオニンアルダラーゼを作用さ
せることを特徴とするＬ−スレオニンとＬ−７０スレオ
ニンの混合４ｅＨ５＞う’Ｌ　−スＬ／オニンな取得す
る方法に関するものである。

本発明において使用される微生物の−は、７々チルス属
に属しＬ−アロスレオニンアルＶラーゼ竜生能を有する
ものであって、例としては土壌より分離したパ千ルスＤ
　Ｋ　−３１，’５微工研菌寄第６２０２号を洋げるこ
とができる。

バチルスＤＫ−３１５微工研菌寄第６２０２号の菌学的
性質を次に示す。

（ａ）形態 ■　細胞の形、大きさ：桿菌、０．８　Ｘ　２．０μ■
　多形性：なし ■　運動性：あり、周毛 ■　胞　子：あり、ダ円形で中心よりずれた位置に存在 ■　ゲラム染色：陽性 ■　抗酸性：なし く１））　各培地における生育状態 ■　肉汁寒天平板培養：生育良好、円形■　肉汁寒天斜
面培養：生育良好、半透明、光沢あり ■　肉汁液体培養：生育良好 ■　肉汁ゼラチン穿刺培養：糸状、表面によく生育する ■　リドマス・ミルク：脱色しかつ液化する（Ｃ）生理
学的性質 ■　硝酸塩の還元：　＋ ■　脱窒反応：　＋ ■　ＭＲテスト：＋（弱い） ■　ＶＰテスト二　− ■　インＶ−ルの生成：　− ■　硫化水素の生成：　− ■　デンプンの加水分解：　＋ ■　クエン酸の利用 Ｋｏｅｅｒ培地：　− ａｈｒｉｅｔｅｎｓｅｎ培地：　− ■　無機窒素源の利用 硝　酸　塩二　− アンモニウム塩：　＋ ［相］　色素の生成二　− ■　ウレアーゼ二　− ０オキシ々ゞ−−ｔ！′：＋ ０　力々ラーゼ：＋（弱い） ■　生育の範囲 ＤＨ”　ＰＨ５〜１２ 温度　：　５〜４０’０ ０　酸素に対する態度：　好気性 ００−Ｆテスト（Ｈｕｇｈ　Ｌｅｉｆｓｏｎ法）二ＦＯ
糖類から酸およびガスの生成 （酸）　（がス） （１）Ｌ−アラビノース　−− （２）Ｄ−キシロース　− （３）Ｄ−ゲルコース　＋　＋ （４）Ｄ−マンノース　＋　＋ （５）Ｄ−フラクトース　＋　＋ （６）Ｄ−がラクトース　＋　＋ （力麦芽糖　十　− （８）　シ　ョ　イ唐　−− （９）　乳　糖　−− （ＩＩ）レバロース　＋　− αυ　Ｄ−ソルビット　−− （＋２１　Ｄ−マンニット　十　− （１３１イノジット　−　− （１４）　ゲリセリン　＋　＋ （１勺　デンプン　十　− ［相］　耐塩性：　Ｎａ０ｔ５係で生育せず■　ゼラチ
ン分解性：　＋ ＠　ＤＮＡａ８ｏ’　十 Ｏビタミン要求性：　なし 以上の菌学的性質をもとに［Ｉぐ一シェープ・マニュア
ル・オデ・デターミネイティブ・バクテリオロジー第８
版（１９７４）Ｊを参照すると、ＤＫ−３１５菌はダラ
ム陽性の桿菌であって周鞭毛で運動１７、胞子形成能を
有することから、本菌はパ千ルス属に属するものと同定
した。本発明の微生物はパ千ルス属に属しＬ−アロスレ
オニンアルＹラーゼ産生能を有すれば足り、例えばＤＫ
−３１５菌あるいはその他の菌の人工変異株も含まれる
ことはいうまでもない。

本発明において使用される他の微生物について、アリス
ロパクター属に属する微生物としてはアリスロパク々−
ＤＫ−１９微工研菌寄第６２０１号、シュードモナス属
に属する微生物としてはシューｒモナスＤＫ−２＃ｌ工
研菌寄第６２００号及びアルカリ土類金属に属する微生
物としてはアルカリグ９ネス・ハエ力リス（Ａｌｃａｌ
ｉｑｅｎθｅ　ｆａｅ　ｃａ　ｌｉ　ｅ　）ＩＦＯ１２
６Ａ９号を挙げることがで永る。

前記のアリスロパクターＤＫ−ｉ９微工研菌寄第６２０
１号及びシューＶモナスＤＫ−２微工研閑寄第６２００
号の菌学的性質は次のとおりである。

ｆａ）形態 （ｂ）　各培地における生育状態 以−トの菌学的性質をもとに［パージニーズ・マニュア
ル・オプ・ヂターミネイティブ・バクテリオロジー第８
版（１９７４）Ｉを参照して分類すると、ＤＫ−２菌は
グラム陰性の桿菌で極鞭毛を有し、オキシに゛−ゼ陽性
、脱窒反応陽性であるところ力Ｓらシューげモナス属に
舅するものと同定した。一方、Ｄ　Ｋ　−１９菌はダラ
ム染色性が弱い桿菌で多形性及び周毛を有し、糖類を資
化でキないことから、アリスロパクター唄に嘱するもの
として同定したつ このような微生物を培養する培地はｌ々チルス属、アリ
スロパクター属、シューｒモナス嘆及びアルカリ土類金
属に属する細菌を培養する通常の培地でよく、炭素源、
窒素源、有機栄養源、および無機イオンなどを含むもの
を用いる。炭素源としてはゲルコース、ゲリセロール、
糖蜜等の糖類、酢酸、リンイ酸等の有機酸など、窒素源
としては硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、尿素な
ど、有機栄養源としては酵母エキス、ペプトン、肉エキ
ス、コーンステイープリカーなど、そして無機イオンと
してはマグネシウム、鉄、マンガン、カリウム、リン酸
塩などを適宜添加すればよい。培地中にＬ−スレオニン
またはＬ−アロスレオニンを０．０５〜０．５係程度添
加すれば酵素の章生量が増加する場合もある。

培養方法も常法によればよく、例えば培地のＰＨを４〜
１０として菌を接種後２０〜６０°Ｃで１〜３日間好気
的に培養すればよい。

このようにして得られるＬ−アロスレオニンアルダラー
ゼは主として菌体内に生成蓄積される。

そこで、Ｌ−アロスレオニンアルＶラーゼを酵素源とし
て使用する場合には、培養物あるいはそれから分離した
菌体をそのま５あるいは乾燥して用いてもよいが、Ｌ−
アロスレオニンアルＶラーゼをもつと精製した形で使用
する必要がある場合には、まず菌体を機緘的方法、酵素
処理する方法、自己溶解法など公知の方法によって破壊
して粗抽出液を得る。そ拘湧）ら、この粗抽出液を硫安
沈殿、アセトン又は工〃ノールなどによる溶媒沈殿、Ｄ
ＥＡＲ−セファロース、ＤＲＡｌｉｉ−セファデックス
、リン酸カルシウムゲル等の種々のイオン交喚体や吸着
剤を用いたクロマトグラフィーなどを適宜組合せて精製
することによって高純度の酵素標品を得ることができる
う以下に簡巣な物性値を示す。

土　至適ＰＨ、Ｈ８〜９ ２、至適温度　６０〜７０°Ｃ ６、失活の条件　６０℃でｐＨ５〜１１又はｐＨ８で５
０’Ｏ以上で、１時間で失活 ４、阻害剤　Ｃｕ　２　＋、Ｈｇ　２　＋、Ａｔｘ、１
＋　により阻害５、安定剤　ノルカフ０トエタノール、
ジチオスレイトール、亜硫酸ナトリウ ム ６、補酵素　ピリ「キサール−５−リン酸Ｚ　分子量　
セファデックスＧ−２００によるデル濾過の結果分子量
１００．０００〜１５０．０００と測定された。

８、元素分析値　元素分析値　Ｃ：　５２．４４Ｈニア
、５係 Ｎ　：　１５．２係 本酵素の活性発現には補酵素としてピリジキサール−５
′−リン酸を必要とするため、反応時には通常１０−３
〜１０−５　Ｍ存在させる。

Ｌ−スレオニンとＬ−アロスレオニン混ｌｌに作用せし
める酵素は、要は一−アロスレオニンを分解してグリシ
ンとアセトテルヂヒＶを生成しうるものであればよい。

また、この酵素は酵素活性を発押しつる形嘘であればた
り、単離された形に限定されるものではない。従って、
半精製品でもよく、粗抽出液、さらには培饗物、生菌体
、凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体あるいはこれらの菌
体の麿砕物等であってもよい。さらに、酵素自体あるい
は菌体のま５公知の手段τｍ固定化て用いてもよい。固
定化方法は担体結合法、架橋法、包括法、凝集法などを
広く利用できる。

Ｌ−スレオニンとＬ−アロスレオニンは公知のいかなる
方法で得られたものであってもよいｈ″−１木発明の方
法はＬ−アロスレオニンを不斉分解してＬ−スレオニン
を得るものであり、一方、副産物がグリシンとアセトア
ルデヒＶであるから、グリシンとアセトアルヂヒνを原
料とするものが好都合である。この点から、〃ゝリシン
とアセトアルデヒＶを原料としてＬ−スレオニンアルＰ
ラーゼによりＬ−スレオニンとＬ−アロスレオニンを合
成する方法等が好適である。

Ｌ−スレオニンとＬ−アロスレオニ：／にＬ−アロス１
／オニ゛／アルげラーゼを作用させるには、要は両者を
水性媒体中で混合すればよい。Ｌ−スレオニンとｆ」−
アロスレオニンは酵素活性を著しく阻害しない程度であ
ればよいが、０．１〜２モル／を程度が好ましい。反応
系の溶媒は原則として水であるが、酵素反応を阻害しな
い有機溶媒等が含まれていてもよい。反応時のＰＨは使
用する酵素によって異なるが、例示した微生物が産生す
る酵素の場合にはＤＨ６〜１０付近が好ましい９反応温
変も使用する酵素によるが、例示した微生物が産生ずる
酵素の場合には３０〜４５℃の範囲が好適である。また
、この微生物の酵素の場合には、補酵素として、１０−
３〜１０−５　Ｍ糊度のビリｒキ廿−ルー５−リン酸を
共存させると酵素反応を促進大せることがで去るうその
他種々の目的で界面活性剤などを添加してもよい。反応
は・々ツ千方式で行なってもよく、連続方式で行なって
もよい。かくして、反応は５〜１００時間程ＩＷで終了
する。

反応終了後は、必要により遠心分離、濾過等で懸濁物を
除去してから、イオン交換樹脂処理、晶析等で精製し、
活性炭等で脱色してこの脱色液を濃縮することによって
Ｌ−スレオニン結晶を紗枠な形で取得することができる
。酵素反応によってグリシンとアセトアルヂヒＶが副生
ずるが、グリシンは例えばイオン交換樹脂を用いたクロ
マトグラフィーによって容易に分離して回収することが
できる。アセトアルデヒドは酵素反応中に同時に副生す
るグリシンと楠合反応したり、Ｌ−アロスレオニンアル
１ラーゼによる逆反応を起こしてグリシンと再結合して
Ｌ−アロスレオニンを生じたりするので、アセトアル？
ヒＶばむしろ反応中に蒸溜等で回収してしまうのがよい
。

本発明の方法を用いれば、Ｌ−スレオニンを簡便な手段
で容易に取得することができ、安価なＬ−スレオニンを
市場に供給できる。才た、副生するグリシンとアセトア
ルデヒドも市場価値の高いものであり、特にグリシン、
またはグリシンとアセトアルデヒドを出発物質とするＬ
−スレオニン・β とＬ−アロスレオンの合成法と組合わせれば、これらの
副産物を合成原料として再利用できるのでさらに好まし
い。

次に、酵素製造例を示す。なお、チは全て重険チを表わ
している。

本酵素の活性の測定方法としては、酵素含有液０．１ｍ
ｌを１００μｍｏｌｅのＬ−アロスレオニンを含有する
ｐＨ８，０のトリス−塩酸緩衝液０．９ｍｌに加え、３
０°Ｃで１０分間加温して生成したアセトアルデヒＶを
Ｐａｚ法（Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ、。

Ｖｏｌ、１０９．ｐ５４８（１９’６５））で定量する
方法釦よって行なった。なお、酵素活性の１Ｕは１分間
に１μｍｏ　ｌｅのＬ−アロスレオニンを分解する酵素
活性とした。

酵素製造例１ ぼりペプトン０．５％、酵母エキス０．５係、ＫＨ２Ｐ
Ｏ，Ｑ、１チ、ＭｇＳＯ４０，０５チ、Ｌ−グルタミン
酸０．１チ、およびＬ−スレオニン０．１チからなるｐ
Ｈ７，５の培地を３を調製し、５を容の培猪槽に張込ん
で１２０℃で１５分間加熱殺菌した。この培地にバチル
スＤＫ−３１５微工研菌寄第６２０２号を接種１．、ｐ
Ｈ７，５に保ちながら６０℃で２０時間通気および撹拌
をしつつ培養した。

培養終了後、培養液１ｔから菌体を遠心分離し、生理食
塩水で１回洗浄後得られた湿菌体を０．１ｍＭビリＶキ
サールー５′−リン酸及び１０ｍＭメルカプトエタノー
ルを含むｐＨ８，０００，Ｉ　Ｍ　）リス−塩酸緩衝液
１００＋ｕ／中に懸濁した。この菌体晋濁液を２０　Ｋ
Ｈ２で１０分間超音波処理して菌体を破壊してから１２
０００　ｒ、ｐ、ｍで６０分遠心して傾瀉し、１０３ｄ
の粗酵素抽出液を得た。

得られた粗酵素抽出液に硫安を加えてＯ０３〜０．５飽
和区分を分取し、この区分を上記緩衝液に対して１晩透
析ｌ−た。ＤＥＡＥセファデックスＡ−５０１００ｄを
充填し、前記の緩衝液で予め平衡化しておいたカラムに
透析残液を通液して酵素を吸着させた後、塩化ナトリウ
ム溶液を０．１〜０．４Ｍまで濃度を変えてカラムに通
液し、洛出液の各フラクションのうちＬ−アロスレオニ
ンアルダラーゼ活性区分を集めた。活性区分はＮａ０６
濃度０．１〜０．１５Ｍの付近にあった。この活性区分
を今度はセファデックスＧ−２００２００ｄを充填した
カラムに通液してｒル濾過を行ない、Ｌ−アロスレオニ
ンアルｒラーゼ活性区分を集め、メンプラムフィルター
で濃縮し、酵素濃縮液２２ｍ、ｌを得た。この酵素液中
のタンパク含量は１．３ｍ１ｉＪ／ｍｌでＬ−アロスレ
オニンに対する比活性は１．１４　Ｕ／ｍｇであった。

一方、この精製標品のＬ−スレオニンに対する比活性は
０．０１１Ｊ／■であり、Ｄ−スレオニンおよびＤ−ア
ロスレオニンに対する比活性は０であった。

酵素製造例２ 酵素製造例１のパ千ルスＤＫ−３１５微工研菌寄第６２
０２号の代りに、アリスロ／々クターＤＫ−１９微工研
菌寄第６２０１号、シューｒモナスＤＫ−２微工研菌寄
第６２００号及びアルカ１）ｒネス・ハエカリスエＦ０
１２６６９号を使用した以外は酵素製造例１と同様に操
作してＬ−アロスレオニンアルＶラーゼの精製標品を得
た。

以下、実施例を示す。なお、スレオニン、アロスレオニ
ン、およびグリシンは、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール二
メ千ルエ千ルケトン：水：＠アンモニアの比が４：３：
）：１の混合液を展開溶媒とシテペーパークロマトグラ
フイーを行ない、ニンヒＶリンで発色させてグリシン、
スレオニンおよびアロスレオニンのスポットを切抜式、
硝酸鋼を０゜００５チ含むメタノールで抽出して比色定
量した。また、アセトアルデヒｒはＰＥＧ６０００×６
ｍのカラムを用いたがスクロマトグラフイーで定量した
。

次に本発明を実施例について鋭５明するが、本発明はこ
れによりなんら限定されるものではない。

実施例　１ Ｌ−スレオニン１部とＬ−アロスレオニン１部からなる
結晶１．１９　ｇ、ビリＶキサール５−リン酸１０−６
モル、メルカプトエタノール１０−４モルを含む３０ｄ
の水溶液に酵素製造例１で得られた精製Ｌ−アロスレオ
ニンアルｖ−７−ゼ溶液１９　ｍｌを加え、減圧蒸溜し
て生成したアセトアルデヒｒを反応液から除去、回収し
ながら３０℃で２４時間反応させた。反応中はＱ、ｌ　
ＮＮａＯＨで反応液の−を７．５〜８．５に保持した。

反応終了後、反応液を希塩酸で中和してからＨ＋型のＤ
ｏｗｅｘ　５０　Ｗ　Ｘ　８　１００−を充填したカラ
ムに通液し、水洗後、０．２　Ｎアンモニアで吸着した
スレオニン、グリシン等を溶出した。溶出液を減圧濃縮
して乾固し、水２０ｍ１で再溶解して、希塩酸を加えて
酸性水溶液にして（ｐＨ３）再びＨ＋型のＤｏｗｅｘ５
ＱＷＸ３　１ｏｏｍｌを充填したカラムに通液した。水
洗後、こんどは０．０５　Ｎアンモニアを通液してスレ
オニン含有区分を溶出させ、溶出液を減圧下で乾固した
。この乾固物に水５ｄを加えて溶解し、エタノール５　
ｍｌを徐々に添加して析出した結晶を分１１１１した。

得られた結晶は乾燥重量で０．４７　＆であり、慇−パ
ークロマトグラフィーによってスレオニンの純品である
ことを確認した。また、比旋光度も〔α〕Ｂフー　’）
　Ｒ−７（Ｈ２Ｃ）でアリ、Ｌ−スレオニンの純品のそ
れと一致した。

０．０５　Ｎアンモニアを更に通液し、グリシン含有区
分を溶出し、溶出液を減圧下で乾固した。乾固物に水２
ゴを加えて溶解し、エタノール２　ｍｌを徐々に添加し
て析出した結晶を分離した。得られた結晶は乾燥重量で
０．３ｇであり、（−パークロマトグラフィーで分析し
たところグリシンのみであった。

一方、反応中に減圧蒸溜で回収されたアセトアルデヒｒ
は０．１５．！ｉ’であった。

実施例　２ 酵素製造例２でシューＶモナスＤＫ−２ｇ１．工研菌寄
第６２００号より得られた精製Ｌ−アロスレオニンアル
Ｖラーゼ溶液１５ＴｒＬｌを用い、実施例１と同様に反
応させ、分離操作を行なったところ、やはりアロスレオ
ニンを全く含まないスレオニンの結晶０．４５　、！ｉ
’、グリシン結晶０．３２　、！ｉ＋、およびアセトア
ルデヒＹＯＡ６ｇが得られた。なお、スレオニン結晶の
比旋光度は〔α）Ａ７　＝　−２８，７（Ｈ２Ｃ）で、
Ｌ−スレオニンのみであった。

実施例　６ 酵素製造例２でアルカリゲネス・ハエ力すスエＦＯ１２
６６９より得られた精製Ｌ−アロスレオニンアルＶラー
ゼ溶液２　Ｑ　ｍｌを用い、実施例１と同様に反応させ
、分離操作を行なったところ、アロスレオニンを全く含
まないスレオニンの結晶０．４３　ｇ、グリシン結晶０
．２５　、！７　、およびアセトアルデヒ￥０．１２．
９が得られた。なお、スレオニン結晶の比旋光度は〔α
）”　＝　−２８，７（Ｈ２Ｃ）でＬ一スレオニンのみ
であった。

実施例　４ 酵素製造例２でアリスロパクター属ＤＫ−１９微工研菌
寄第６２０１号より得られたＬ−アロスレオニンアルド
ラーゼ溶液ＩＱｍ／！を用いて、反応中に減圧蒸溜操作
を行なわなかった点を除いて、実施例１と同様に反応、
分離操作を行なったところ、アロスレオニン８．２％を
含むスレオニン結晶０．４ｇ、グリシン結晶０．１！Ｍ
、およびアセトアルデヒ￥　０．０２　ｇが得られた。

特許出願人　電気化学工業株式会社 手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 昭和５８年特許願第１１８８２０号 ２、発明の名称 Ｌ−スレオニンの取得方法 ６、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所　東京都千代田区有楽町１丁目４番１号昭和５８年
１０月２５日　（発送日） ５、補正の対象 明細書 ６、補正の内容 明細書の浄書（内容に変更なし）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. Ｌ−スレオニンとＬ−アロスレオニンの混合物ＫＬ−７
   ０スレオニンアル「ラーゼを作用させることを特徴とす
   るＬ−スレオニンとＬ−アロスレオニンの混合物からＬ
   −スレオニンを取得する方法。