JPH022597B2

JPH022597B2 -

Info

Publication number: JPH022597B2
Application number: JP56209983A
Authority: JP
Inventors: Hideaki Yamada; Teruzo Myoshi; Masaaki Kato; Masahisa Ikemi; Haruo Gomi; Yoshiaki Ishimatsu; Noriaki Koizumi
Original assignee: Denki Kagaku Kogyo KK
Current assignee: Denka Co Ltd
Priority date: 1981-12-28
Filing date: 1981-12-28
Publication date: 1990-01-18
Also published as: JPS58116690A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は新規な酵素を用いたＤ−β−ヒドロキ
シアミノ酸の製造法に関する。近年種々のＤ−アミノ酸が発見されるにしたが
つて、その生理的意義が解明されつつあり、Ｄ−
アミノ酸は抗生物質、酵素阻害剤等の各種の医
薬、農薬類、その他の生理活性物質の合成原料と
して有用なものが多い。そしてこれらＤ−アミノ
酸は一部は合成法で製造されたDL−アミノ酸を
光学分割して製造されているが、多くはＬ−アミ
ノ酸を一旦ラセミ化してから光学分割して製造さ
れている。その場合、Ｄ−アミノ酸は長い工程を
経て製造されるために、その手間が大変であり、
また収率も極めて低くなつていた。本発明者らはＤ−アミノ酸の特定のものについ
て、安価で大量に生産されているグリシンとアル
デヒド類から一挙に製造する新規な技術を開発し
た。すなわち、新規な酵素であるＤ−スレオニン
アルドラーゼを用いてグリシンとアルデヒドから
一挙に対応するＤ−β−ヒドロキシアミノ酸を製
造する方法を開発したのである。これまで、Ｌ−
スレオニンをグリシンとアセトアルデヒドに分解
するＬ−スレオニンアルドラーゼ（E.C.4.1.2.5）
を用いてグリシンとアルデヒド類から対応するＬ
−β−ヒドロキシアミノ酸を製造しうることは知
られている。しかしながら、Ｄ−β−ヒドロキシ
アミノ酸については、その製造の前提となるＤ−
スレオニンアルドラーゼの存在自体が全く知られ
ていない。本発明者らは、たまたま特定の微生物
がこのＤ−スレオニンアルドラーゼを産生しうる
ことを知り、更に研究を進めた結果この酵素を用
いればグリシンとアルデヒド類から対応するＤ−
β−ヒドロキシアミノ酸を一挙に製造しうること
を見出してこれに基いて本発明を完成した。すなわち本発明は、グリシンと一般式Ｒ−
CHO（但し、Ｒは水素または飽和アルキル基を表
わす。）で示されるアルデヒド化合物とをＤ−ス
レオニンアルドラーゼの存在で反応させることを
特徴とする一般式（但し、Ｒは水素または飽和アルキル基を表わ
す。）で示されるＤ−β−ヒドロキシアミノ酸の製造法
に関するものである。Ｄ−スレオニンアルドラーゼはＤ−スレオニン
に作用してグリシンとアルデヒドに分解する酵素
で、例えばアルカリゲネス・ハエカリス
（Alcaligenes faecalis）IFO12669、シユードモ
ナス（Pseudomonas）DK−２微工研菌寄第6200
号、およびアリスロバクター（Arthrobacter）
DK−19微工研菌寄第6201号などがこのＤ−スレ
オニンアルドラーゼを産生する能力を有する。シユードモナスDK−２微工研菌寄第6200号お
よびアリスロバクターDK−19微工研菌寄第6201
号の菌学的性質を次に示す。 (a) 形態

【表】 (b) 各培地における生育状態

【表】 (c) 生理学的性質

【表】

【表】以上の菌学的性質をもとに「バージエーズ・マ
ニユアル・オブ・デターミネイテイブ・バクテリ
オロジー第８版（1974）」を参照して分類すると、
DK−２菌はグラム陰性の桿菌で極鞭毛を有し、
オキシダーゼ陽性、脱窒反応陽性であるところか
らシユードモナス属に属するものと同定した。一
方、DK−19菌はグラム染色性が弱い桿菌で、多
形性及び周毛を有し、糖類を資化できないことか
らアリスロバクター属に属するものと同定した。Ｄ−スレオニンアルドラーゼは例えばこれらの
微生物を栄養培地に培養すれば生成させることが
できる。栄養培地は細菌を培養する通常のもので
よく、炭素源としてはグリコース、キシロース、
グリセロール、糖蜜等の糖類、あるいは酢酸、リ
ンゴ酸等の有機酸など、窒素源としては硫酸アン
モニウム、塩化アンモニウム、尿素など、有機栄
養源として酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コ
ーンステイープリカーなど、そして無機イオンと
してマグネシウム、鉄、マンガン、カリウム、リ
ン酸塩などを含むものを用いる。培養方法も細菌を培養する常法に従つて行なえ
ばよく、培地のPHを４〜10として菌を接種後20〜
60℃で１〜３日間好気的に培養すればよい。このようにしてＤ−スレオニンアルドラーゼは
主に菌体内に生成蓄積されるが、反応に供する酵
素源としてはこの菌体そのものを用いてもよく、
又菌体からＤ−スレオニンアルドラーゼを単離・
精製する過程のいかなる段階のものを用いてもよ
い。培養液からＤ−スレオニンアルドラーゼを単
離する場合にはまず菌体を機械的方法、酵素処理
する方法、自己溶解法などの公知の方法の方法に
よつて破壊し粗抽出液を得る。それから、この粗
抽出液を硫安沈澱、アセトン又はエタノールなど
による溶媒沈澱、DEAE−セフアロース、DEAE
−セフアデツクス、リン酸カルシウムゲル等の
種々のイオン交換体や吸着剤を用いたクロマトグ
ラフイーなどを適宜組合せて精製することによつ
て高純度の酵素標品を得ることができる。本酵素
の活性発現には、補助酵素としてピリドキサール
−5′−リン酸を必要とするため、反応時には通常
10^-3〜10^-5Mで存在させる。次に、酵素製造例１で得られた酵素標品につい
て理化学的性質を測定した結果を記す。作用および基質特異性本酵素はＤ−スレオニンおよびＤ−アロスレ
オニンを分解してグリシンとアセトアルデヒド
を生成する。一方、Ｌ−スレオニンおよびＬ−
アロスレオニンにはまつたく作用しない。至適PH Ｄ−スレオニンを基質として各PHにおいて30
℃で10分間反応させ、生成したアルデヒドを定
量したところ、本酵素の至適PHは７〜９にあつ
た。尚、用いた緩衝剤はPH４〜7.5までは0.1M
リン酸緩衝液、PH７〜９までは0.1Mトリス−
HCl緩衝液及びPH９〜11までは0.1M炭酸ソー
ダ緩衝液である。安定PH範囲酵素溶液を各PHにおいて30℃で１時間加温
後、溶液中の残存活性を測定したところ、本酵
素の安定PH範囲は６〜９にあつた。尚、用いた
緩衝液はPH４〜7.5までは0.1Mリン酸緩衝液、
PH７〜９までは0.1Mトリス−HCl緩衝液及び
PH９〜11までは0.1M炭酸ソーダ緩衝液である。力価の測定法酵素含有液0.1mlを100μmoleのＤ−スレオニ
ンを含有するPH8.0の0.1Mトリス−塩酸緩衝液
0.9mlに加え、30℃で10分間加温して生成した
アセトアルデヒドをPaz法〔Arch.Biochem.
Biophys.、Vol.109、p548（1965）〕によつて定
量して求めた。尚、１分間に1μmoleのＤ−ス
レオニンを分解する酵素活性を1Uとした。作用適温の範囲Ｄ−スレオニンを基質としてPH8.0の0.1Mト
リス−塩酸緩衝液を用い、各温度で10分間反応
させ、生成したアセトアルデヒドを測定したと
ころ、本酵素の至適温度は50〜50℃にあつた。熱安定性 PH8.0の0.1Mトリス−塩酸緩衝液に溶解した
酵素溶液を各温度で１時間加熱後、溶液中の残
存活性を測定したところ、本酵素の安定温度は
40℃以下であつた。 PH、温度などによる失活の条件本酵素はPH５以下、PH11以上、および温度70
℃以上では１時間に失活する。阻害、活性化および安定化本酵素はメルカプトエタノール、亜硫酸ナト
リウム、亜硫酸水素ナトリウム、ジチオスレイ
トール、Mn²⁺、Co²⁺、Fe²⁺、Mg²⁺によつて
活性化され安定化される。一方、Ag¹⁺、Cu²⁺、
Hg²⁺、Zn²⁺、Pd²⁺、ヒドロキシルアミン、ｐ
−クロルマーキユリー安息香酸によつて阻害さ
れる。補酵素本酵素の補酵素はピリドキサール−5′−リン
酸である。酵素製造例１で得られた酵素は以上のような理
化学的性質を有しているが、従来知られているス
レオニンアルドラーゼはすべてＬ−スレオニンを
分解するものであつてＤ−スレオニンを分解する
ものは全く知られていないところから、この酵素
は全く新しい作用を有する新規酵素である。グリシンとアルデヒド化合物の反応に用いる酵
素は、要はＤ−スレオニンを分解してグリシンと
アセトアルデヒドを生成しうるものであればよ
い。また、この酵素は酵素活性を発揮しうる形態
であればたり、単離された形に限定されるもので
はない。従つて、半精製品でもよく、粗抽出液、
さらには培養物、生菌体、凍結乾燥菌体、アセト
ン乾燥菌体、あるいはこれらの菌体の磨砕物等で
あつてもよい。さらに、酵素自体あるいは菌体の
まま公知の手段で固定化して用いてもよい。Ｄ−
スレオニンアルドラーゼは前述のような微生物由
来のものに限定されず、他の動植物由来のもので
あつてもよい。アルデヒド化合物は一般式Ｒ−CHOのうちＲ
が水素または飽和アルキル基のものである。炭素
数は20以下のものが好ましく、例えばホルムアル
デヒド、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒ
ド、ブチルアルデヒド、ラウリルアルデヒドなど
が好適である。反応は、要はＤ−スレオニンアルドラーゼとグ
リシンとアルデヒド化合物とを混合すればよく、
添加の順序は問わない。アルデヒド化合物は酵素
活性を著しく阻害しない程度であればよいが、
0.05〜0.2モル／程度が好ましい。グリシンは
アルデヒド化合物と等モル程度でよいが、グリシ
ンの反応収率を高めるためにはアルデヒド化合物
より少なくするのがよい。反応温度は10〜70℃位
でよいが10〜40℃程度が好適である。反応時のPH
は６〜9.5程度好ましくは、７〜８に維持するの
がよい。補酵素として、ピリドキサール−5′−リ
ン酸を反応系に添加すると酵素活性を高めて反応
を促進させることができる。反応はバツチ方式で
行なつてもよく、連続方式で行なつてもよい。か
くして、反応は５〜50時間程度で終了する。反応終了後は、必要により遠心分離、過等で
懸濁物を除去してから、イオン交換樹脂処理、晶
析等で精製し、活性炭等で脱色してこの脱色液を
濃縮することによつてＤ−β−ヒドロキシアミノ
酸を単離することができる。次に、酵素製造例を示す。なお、％は全て重量
％である。酵素製造例１ポリペプトン0.5％、酵母エキス0.5％、
KH₂PO₄0.1％、MgSO₄0.05％、Ｌ−グルタミン
酸0.1％、およびＤ−スレオニン0.1％からなるPH
7.5の培地を調製し、５容の培養槽にその３
を投入して120℃で15分間加熱殺菌した。この培
地にアリスロバクターDK−19微工研菌寄第6201
号を接種し、PH7.5に保ちながら30℃で20時間通
気および撹拌をしつつ培養した。培養終了後、培養液１から菌体を遠心分離
し、生理食塩水で１回洗滌後、この湿菌体を0.1
ｍＭピリドキサール−5′−リン酸及び10ｍＭメル
カプトエタノールを含むPH7.5の0.1Mトリス−塩
酸緩衝液100ml中に懸濁した。この菌体懸濁液を
20KHzで10分間超音波処理して菌体を破壊してか
ら遠心して傾瀉し105mlの粗酵素抽出液を得た。得られた粗酵素抽出液に硫安を加えて0.3〜0.5
飽和区分を分取し、この区分を上記緩衝液に対し
て１晩透析した。DEAEセフアデツクスＡ−50
100mlを充填し、前記の緩衝液で予め平衡化して
おいたカラムに透析残液を通液して酵素を吸着さ
せた後、塩化ナトリウム溶液を0.1〜0.4Mまで濃
度を変えてカラムに通液し、溶液の各フラクシヨ
ンのうちＤ−スレオニンアルドラーゼ活性区分を
集めた。この活性区分は塩化ナトリウムの濃度が
0.3Mの付近にあつた。集めた活性区分をセフア
デツクスＧ−200 200mlを充填したカラムに通液
してゲル過を行ない、Ｄ−スレオニンアルドラ
ーゼ活性区分を集め、メムブラムフイルターで濃
縮し、酵素濃縮液15mlを得た。この酵素液中のタ
ンパク含量は2.4mg／でＤ−スレオニンに対す
る比活性は1.24U／mgであり、Ｄ−アロスレオニ
ンに対する比活性は3.33U／mgであつた。一方、
Ｌ−スレオニンおよびＬ−アロスレオニンに対し
ては全く活性を示さなかつた。酵素製造例２シユードモナスDK−２微工研菌寄第6201号お
よびアルカリゲネス・ハエカリスIFO12669を用
い、いずれも酵素製造例１と同じ培地に同様に培
養し、培養液から酵素を分離したところシユード
モナスDK−２菌の場合にはタンパク質濃度2.3
mg／mlの酵素液12mlが、そしてアルカリゲネス・
ハエカリス菌の場合には、タンパク質濃度2.1
mg／mlの酵素液11mlが得られた。この酵素活性を
測定したところ、前者はＤ−スレオニンに対する
比活性が1.01U／mgであり、Ｄ−アロスレオニン
に対する比活性が2.96U／mgであつた。一方、後
者のそれはＤ−スレオニンに対する比活性が
0.86U／mgであり、Ｄ−アロスレオニンに対する
比活性が2.95U／mgであつた。そして、いずれも
Ｌ−スレオニンおよびＬ−アロスレオニンに対し
ては全く活性を示さなかつた。以下、実施例を示す。なお、生成物の定量およ
びスレオ体／アロ体比は、ｔ−ブタノール：メチ
ルエチルケトン：25％アンモニア水比が４：３：
１の混合物を展開溶媒としてペーパークロマトグ
ラフイーを行ない、ニンヒドリンで発色させてス
ポツトを切りとり、硝酸銅を0.005％含むメタノ
ールで抽出し、比色定量して求めた。実施例１酵素製造例１および２と同様に培養して得られ
たアルカリゲネスハエカリスIFO12669、シユー
ドモナスDK−２微工研菌寄第6200号、およびア
リスロバクターDK−19微工研菌寄第6201号の培
養液各１mlを遠心分離して菌体を集め、いずれも
0.9％食塩水を加えて洗浄する操作を２回繰返し
た。各洗滌菌体にグリシン200μmole、アセトアル
デヒド200μmole、およびPH8.0の0.1Mトリス−塩
酸緩衝液１mlよりなる基質溶液を加え30℃で20時
間反応させた。反応終了後、溶液中のＤ−スレオニンおよびＤ
−アロスレオニンを定量したところ下表に示す如
き結果が得られた。

【表】生成スレオニンがＤ−体であつたことは各菌と
も１スケールで反応させて確認した。すなわ
ち、反応液をH⁺型のDowex50WX8 500mlを充填
したカラムに通液し、水洗後0.2Nアンモニアで
溶離してスレオニン区分とグリシン区分に分離し
た。スレオニン区分を濃縮後活性炭で脱色し、脱
色液にエタノールを添加して結晶を得た。この結
晶についてNMR、赤外線吸収スペクトル、元素
分析、および比旋光度を測定して、この結晶がＤ
−スレオニンであることを確認した。一方、各反応液についてストレプト・コツカ
ス・ハエカリスIFO3181を用いたバイオアツセイ
法で測定し、反応液にはＬ−体が全く含まれてい
ないことを確認した。実施例２アリスロバクターDK−19微工研菌寄第6201号
の実施例１と同じ培養液を用い、菌体を遠心分離
して洗浄後凍結乾燥した。下表に示す各アルデヒド50ｍmole、グリシン
50ｍmole、およびPH8.0の0.1Mトリス−塩酸緩衝
液500mlよりなる基質溶液に上記の乾燥菌体を２
ｇ宛投入し、それぞれ30℃で40時間反応させた。反応終了後、溶液中のＤ−β−ヒドロキシアミ
ノ酸定量した結果を下表に示す。なお、スレオ
体／アロ体の比は各溶液とも約1.6であつた。

【表】実施例３酵素製造例１で得られたＤ−スレオニンアルド
ラーゼ含有液２mlにグリシン200μmole、アセト
アルデヒド200μmole、メルカプトエタノール
100μmole、及びPH7.5の0.1Mトリス−塩酸緩衝液
５mlよりなる基質液を加え30℃で10時間反応させ
た。反応終了後Ｄ−スレオニン及びＤ−アロスレ
オニンを定量したところＤ−スレオニン
85μmole、Ｄ−アロスレオニン53μmoleであつ
た。

Claims

【特許請求の範囲】１グリシンと一般式Ｒ−CHO（但し、Ｒは水素
または飽和アルキル基を表わす。）で示されるア
ルデヒド化合物とをＤ−スレオニンアルドラーゼ
の存在下で反応させることを特徴とする一般式（但し、Ｒは水素または飽和アルキル基を表わ
す。）で示されるＤ−β−ヒドロキシアミノ酸の製造
法。