JPS609794B2 - 固定化グルコ−スイソメラ−ゼの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は固定化グルコースィソメラーゼの製造法に関す
るものである。

近年、グルコースィソメラーゼ活性を有する菌体を担体
に固定化して、この固定化グルコースイソメラーゼを用
いてグルコースを効率よく異性化することが工業的に行
なわれている。

固定化グルコースィソメラーゼの製法としては例えば菌
体をポリビニルィミダゾリンあるいは陽性アクリルアミ
ド、キトサンなどの可溶性高分子凝集剤で凝集させて固
定化したり、陰イオン交換樹脂に吸着させて固定化する
方法などが知られている。また菌体のグルコースィソメ
ラーゼ活性の発現率を高めるために、珪藻±、シリカー
アルミナ、活性炭等の多孔性物質を固定化グルコースィ
ソメラーゼに含有させることも知られている。しかしな
がら、このようにして得られる固定化グルコースィソメ
ラーゼはカラムに充填して連続的にグルコースの異性化
反応を行なわせる場合、異性化反応の初期において異性
化された糖液が酸性に傾いたりあるいは異性化反応の後
期に反応速度が低下するにつれて酸性になる傾向が認め
られた。

このような頭向はグルコースィソメラーゼの至適ｐＨあ
るいは安定軸から著しく逸脱し、グルコースィソメラー
ゼの反応性あるいは安定性において充分満足できるもの
とは言い難い。さらに、固定化グルコースィソメラーゼ
をグルコース溶液に投入して、バッチ式に異性化反応を
行なわせる場合も反応が進行するにつれて、異性化され
た糖液が酸性になる傾向がある。

本発明者らは、固定化グルコースィソメラーゼの活性な
らびに物理的強度を低下させることなく、これらの傾向
を解消するために種々鋭意検討したところ、キトサンで
グルコースイソメラーゼ生産菌体を凝集させて固定化グ
ルコースィソメラーゼを製造するに際し、固定化グルコ
ースィソメラーゼに炭酸塩を含有させると所期の目的を
達成することを見出し、本発明に到達した。

すなわち本発明はキトサンでグルコースィソメラーゼ生
産菌体を凝集させて固定化グルコースィソメラーゼを製
造する方法において、任意の段階で固定化グルコースィ
ソメラーゼに炭酸塩を含有させることを特徴とする固定
化グルコースィソメラーゼの製造法である。本発明方法
による固定化グルコースィソメラーゼは酵素の反応性が
著しく増強され、グルコースの異性化能力が大幅に改善
されると同時にグルコースの異性化力も安定し、操作性
にも優れる。

本発明において使用するグルコースィソメラーゼ生産菌
体としては、ストレプトマィセス属、バチルス属、アー
スロバクター属、シュードモナス属等のグルコースィソ
メラーゼを生産する微生物菌体が挙げられる。これらの
菌体は窒素源としてコーンステイーブリカー単独または
他の窒素源を添加し、炭素源として澱粉、キシロースな
どの炭水化物類、無機塩としては燐酸カリウム、塩化コ
バルトおよび塩化マグネシウムなどを含んだ培地に培養
して取得する。使用する菌体には培養菌体そのまま、あ
るいは加熱処理した菌体のいずれでもよい。また、この
菌体はｐＨ５〜９、特に５〜７．０の緩衝溶液に分散も
しくは懸濁されていてもよい。この場合、菌体の濃度は
通常０．１〜５の重量％、好ましくは０．５〜４の重量
％である。本発明におけるキトサンはキトサン自体ある
いはその溶液、たとえば酢酸、蟻酸、塩酸等の酸および
これらの酸の酸性溶液に熔解して得られる溶液である。
この溶液の濃度は０．０５〜２．の重量％、好ましくは
０．１〜１の重量％である。本発明におけるキトサンで
グルコースィソメラーゼ菌体を凝集させて固定化グルコ
ースィソメラーゼを製造する方法は、具体的には菌体を
含む液体にキトサンもしくはその溶液を混合して凝集反
応を行なう方法、キトサン溶液に菌体を添加して混合し
て凝集反応を行なう方法などがある。

固定化酵素製造の操業性から見て、キトサン溶液に菌体
を添加してよく蝿拝するか、あるいは混練りして菌体を
上記キトサン溶液に分散させてから凝集反応を行なうこ
とが好ましい。凝集反応後の菌体は炉過または遠心分離
あるいは圧搾により、水分２０〜５０％に調節して造粒
機で造粒し、そのまま乾燥するかあるし、は整粒機にか
けて整形した後、乾燥する。

本発明において使用する炭酸塩としては、たとえば炭酸
マグネシウム、炭酸マンガン、炭酸バリウム、炭酸カル
シウム、炭酸コバルトなどがあり、これらの炭酸塩は中
性あるいはアルカリ性溶液に不漆性あるいは鱗熔性であ
って、酸性溶液では可溶性である。

これらの物質は固定化グルコースィソメラーゼ中に含有
され、異性化糖液中の酸性物質を中和させ、糖液ｐＨの
低下を抑制する。また、これらの物質は酵素反応に阻害
作用を示さず、かつ固定化に何ら支障を持たない。炭酸
塩の添加量は異性化糖液の解低下を抑制する量が好まし
く、炭酸塩の種類によって異なるが、通常、原料菌体（
乾物）に対して１〜２の重量％であることが望ましい。

本発明における炭酸塩の使用は任意の段階で行なう。

たとえば菌体懸濁液に炭酸塩を添加した後、キトサン溶
液と混合して凝集反応を行なってもよいし、菌体懸濁液
にキトサン溶液を加えて凝集反応を行なう時に、炭酸塩
の分散液を独立に添加してもよい。またキトサソで凝集
した菌体を成型した後、乾燥前に炭酸塩と混合してもよ
い。本発明に用いる炭酸塩には中性あるいはアルカリ性
溶液中で、わずかに溶解するものがある。このような炭
酸塩はその分散液の恥が中性附近より外れる場合がある
。したがって、菌体懸濁液あるいはキトサン溶液の酸あ
るいはアルカリの添加量を加減して凝集反応時のｐＨを
６〜７に維持することが望ましい。本発明による炭酸塩
含有固定化グルコースィソメラーゼは異性化反応時に炭
酸が溶解して、反応系のｐＨ低下を防止する。

したがって異性化糖液のｐＨが酵素の至適ｐＨ、安定ｐ
Ｈに維持させることから、酵素の安定性、反応性がきわ
めて良い。また固定化グルコースイソメラーゼ内に含有
されている炭酸塩が異性化反応時に生成される酸性物質
を直ちに反応して溶解し、その結果として固定化グルコ
ースィソメラーゼは多孔性になり、グルコースの拡散抵
抗が減少して反応性が増加する。以下、実施例を用いて
本発明を説明する。実施例中、単に％とあるのは重量％
を示す。

酵素活性は国際グルコースィソメラーゼ単位を用い、グ
ルコース溶液（グルコース濃度２Ｍ、０．０２ＭＭが０
４、０．００１ＭＣｏＣ１２、ｐＨ６．８５）で反応温
度６０ｑ０において１分間に１一モルのグルコースを異
性化する酵素活性を１単位（ＩＧＩＵと略する）とした
。なお、各測定項目は下記の方法に従った。

【１’膨７閏度 固定化グルコースィソメラーゼ１夕を水に懸濁し、沈降
せしめた時に水中で占める体積（叫）で表わす。

■堅さ 粒状の固定化グルコースィソメラーゼを４０Ｗ′Ｗ％ブ
ドウ糖液（ｐＨ８．５）で、室温で一夜放置した後、次
の方法に従って堅さを検査した。

すなわち人差し指と親指でつまみ、３人のパネルで感覚
的に堅さを判定した。工業的使用に耐える堅さは３．５
以上であると考える。‘３’崩壊性活性測定時の１時間
の鷹幹反応中において固定化グルコースィソメラーゼが
崩壊する程度を表わす。

■ 沈降性 ４０Ｗ／Ｗ％のグルコース溶液中での沈降速度で表わし
た。

実施例 １ グルコースィソメラーゼ生産凍結菌体１．５ｋｇ（固形
分３８％ＩＧＩＵ／のを６０その水に懸濁し、１０のこ
６等分した。

この懸濁液に炭酸マグネシウムを菌体（乾物）当り、１
％、２．５％、５％、１０％、２０％添加し、酢酸を加
えてｐＨを７．０に調節した。予め調製した０．２％キ
トサンの酢酸溶液（ｐＨ６．０）を上記菌体懸濁液によ
く燭拝しながら添加し、凝集反応を行なわせた。凝集し
た菌体を脱水してキトサン菌体凝集反応物を得た。これ
を成型したのち６０ｑｏの熱風下で乾燥後、筋別し３０
〜４０メッシュの固定化グルコースィソメラーゼを得た
。得られた固定化グルコースィソメラーゼの活性と堅さ
と膨潤度を第１表に示す。第１表 これらの固定化グルコースイソメラーゼの異性化反応の
相違を調べるためにグルコースの異性化反応を行ない、
異性化率を測定した。

異性化反応はグルコース溶液（グルコース５０％、０．
００８ＭＭｇＳ０４、０．００１ＭＣｏＣ１２、ｐＨ７
．０）２０舷に固定化グルコースイソメラーゼ（１２０
１ＧＩＵ）を加え、６ｏｑ○で１蝿時間反応を行なった
。異性化反応終了後、酵素を回収し、再び同じ組成のグ
ルコース溶液を加えて異性化反応を繰り返した。フラク
トース 異性化率＝グルコ−ス十フラクトース×１００反応終了
後、異性化率および異性化糖液のｐＨを第２表に示す。

第２表第１表および第２表から明らかなように、炭酸マ
グネシウムを含有する固定化グルコースィソメラーゼは
、物性がほとんど変わらず、異性化率が大きく、その保
持率もかなりよい。

実施例 ２ 実施例１と同じ方法で得た炭酸マグネシウム含有固定化
グルコースイソメラーゼ（ＭｇＣ０３含有率１０％）８
夕（４３０１ＣＩＵ／夕）と対照として炭酸マグネシウ
ムを含まない固定化グルコースイソメラーゼ８．９夕（
３９１１０１Ｕ／夕）を各々二重円筒カラム（２仇奴Ｊ
×１８仇舷）に詰めて連続異性化反応を行なつた。

連続異性化反応は５０％結晶グルコース溶液（織舷ｓｏ
４、ＰＨ８．２５）を６５℃で保温した力弘に通し、異
性化率を４５％に維持するようにした。

グルコース溶液の通液経過を第１図に示す。第１図から
明らかなように、対照の固定化グルコースイソメラーゼ
は経時的にｐＨが低下するに対して、炭酸マグネシウム
含有固定化グルコースイソメラーゼはｐＨが低下しない
。従って異性化反応速度が速い。また炭酸マグネシウム
含有固定化グルコースィソメラーゼは異性化能力の急激
な変動が少なく、スムースであり、異性化率を４５％に
維持するため、グルコース溶液の通液量がきわめて簡単
に予測できる。なお、固定化グルコースィソメラ−ゼｌ
ｋ９当りのグルコースの異性化能力は炭酸マグネシウム
含有のものが２４００ｋ９であるのに対し、含有しない
ものは２０００ｋｇであった。実施例 ３実施例１にお
ける炭酸マグネシウムを塩基性炭酸コバルト〔父ｏ（Ｏ
Ｈ）２・ＸｏＣ０３０日２０〕、炭酸カルシウム、炭酸
マンガンに代えて、菌体（乾物）当り１０％添加する以
外は実施例１と同様にして、固定化グルコースィソメラ
ーゼを得た。

得られた固定化グルコースイソメラーゼの活性、堅さお
よび膨潤度を第３表に示す。第３表これらの固定化グル
コースイソメラーゼを用い、実施例１と同様にして異性
化反応を行なった。

その結果を第４表に添す。第４表 実施例 ４ グルコースィソメラーゼ生産凍結菌体１．２ｋ９（固形
分２９．０％）を５２．８その水に懸濁し、これにマグ
ネシウムシリケートを３４．８９添加してよく混合した
。

実施例１と同じように０．２％キトサン酢酸溶液を上記
の菌体懸濁液によく凝拝しながら添加し凝集をおこなわ
せた。凝集後、脱水してキトサン菌体凝集物を得た。こ
れを６等分し、もとの菌体（乾物）に対して塩基性炭酸
コバルト〔ＸｏＣ０３１父ｏ（ＯＨ）２１日２０〕を０
％、２％、４％」６％、８％または１０％を加えてよく
混合した。

これを成型したのち、６０℃の熱風下でよく乾燥した。
上記方法により得られた固定化グルコースィソメラーゼ
の活性と堅さおよび膨潤度を第５表に示す。

第５表 次いで実施例１と同様にグルコース溶液（グルコース５
０％、硫酸マグネシウム０．０８Ｍ「塩化コバルト０．
００１Ｍ）２０の‘に各固定化グルコースイソメラーゼ
をそれぞれ４９０１Ｕ／夕加えて〜 ６０ｑｏで２０時
間反応をおこない、反応液の異性化率およびｐＨを調べ
た。

また上記の各固定化グルコースィソメラーゼを２重円筒
カラム（２仇吻？×１８仇舷）に詰めて「実施例２と同
じ方法で連続異性化反応をおこない、固定化グルコース
イソメラーゼｌｋ９当りのグルコースの異性化能力（異
性化率４５％）を調べたところ結果は第６表の通りであ
った。第６表

【図面の簡単な説明】

第１図は異性化率を４５％に維持して異性化反応を行な
ったときのグルコース溶液の給液速度とｐＨの経時的変
化を示す。 第１図

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ キトサンでグルコースイソメラーゼ生産菌体を凝集
   させて固定化グルコースイソメラーゼを製造する方法に
   おいて、固定化グルコースイソメラーゼに炭酸塩を含有
   させることを特徴とする固定化グルコースイソメラーゼ
   の製造法。