JPS609793B2 - 固定化グルコ−スイソメラ−ゼの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は固定化グルコースィソメラーゼの製造法に関す
るものである。

近年、グルコースィソメラーゼ活性を有する菌体を担体
に固定化して、この固定化グルコースィソメラーゼを用
いてグルコースを効率よく異性化することが工業的に行
なわれている。

固定化グルコースィソメラーゼの製法としては例えば菌
体をポリビニルィミダゾリンあるいは陽性アクリルアミ
ド、キトサンなどの可溶性高分子凝集剤で凝集させて固
定化したり、陰イオン交キ製樹脂に吸着させて固定化す
る方法などが知られている。また菌体のグルコースィソ
メラーゼ活性の発現率を高めるために、珪藤土、シリカ
ーアルミナ、活性炭等の多孔性物質を固定化グルコース
ィソメラーゼに含有させることも知られている。しかし
ながら、このようにして得られる固定化グルコースィソ
メラーゼはカラムに充填して連続的にグルコースの異性
化反応を行なわせる場合、異性化反応の初期において異
性化された糠液が酸性に傾いたりあるいは異性化反応の
後期に反応速度が低下するにつれて酸性になる煩向が認
められた。

このような煩向はグルコースィソメラーゼの至薄ｐＨあ
るいは安定ｐＨから著しく逸脱し、グルコースィソメラ
ーゼの反応性あるいは安定性において充分満足できるも
のとは言い難い。さらに、固定化グルコースィソメラー
ゼをグルコース溶液に投入して、バッチ式に異性化反応
を行なわせる場合も反応が進行するにつれて、異性化さ
れた糠液が酸性になる煩向がある。

本発明者らは、固定化グルコースィソメラーゼの活性な
らびに物理的強度を低下させることなく、これらの傾向
を解消するために種々鋭意検討したところ、キトサンで
グルコースイソメラーゼ生産菌体を凝集させて固定化グ
ルコースィソメラーゼを製造するに際し、固定化グルコ
ースィソメラーゼに中性あるいはアルカリ性水溶液に難
熔性のリン酸塩を含有させると所期の目的を達成するこ
とを見出し、本発明に到達した。

すなわち本発明はキトサンでグルコースィソメラーゼ生
産菌体を凝集させて固定化グルコースィソメラーゼを製
造する方法において、任意の段階で固定化グルコースィ
ソメラーゼに中性あるいはアルカリ性水溶液中で難熔性
のリン酸塩を含有させることを特徴とする固定化グルコ
ースィソメラーゼの製造法である。本発明方法による固
定化グルコースィソメラ−ゼは酵素の反応性が著しく増
強され、グルコースの異性化能力が大幅に改善されると
同時にグルコースの異性化力も安定し、操作性にも優れ
る。

本発明において使用するグルコースィソメラーゼ生産菌
体としては、ストレプトマィセス属「バチルス属、アー
スロバクター属、シュードモナス属等のグルコースィソ
メラーゼを生産する微生物菌体が挙げられる。これらの
菌体は窒素源としてコーンステイープリカー単独または
他の窒素源を添加し「炭素源として澱粉、キシロースな
どの炭水化物類、無機塩としては燐酸カリウムト塩化コ
バルトおよび塩化マグネシウムなどを含んだ培地に培養
して取得する。使用する菌体は培養菌体そのまま「ある
いは加熱処理した菌体のいずれでもよい。またトこの菌
体はｐＨ５〜９も特に５〜７。０の緩衝溶液に分散もし
くは懸濁されていてもよい。この場合、菌体の濃度は通
常０。車〜５０重量％、好ましくは０。５〜４の重量％
である。

本発明におけるキトサンはキトサン自体あるいはその溶
液もたとえば酢酸「蟻酸も塩酸等の酸およびこれらの酸
の酸性溶液に溶解して得られる溶液である。この溶液の
濃度は００５〜２。増重量％も好ましくは０。１〜１の
重量％である。

本発明におけるキトサンでグルコースィソメラーゼ菌体
を凝集させて固定化グルコースィソメラーゼを製造する
方法はも具体的には菌体を含む液体にキトサンもしくは
その溶液を混合して凝集反応を行なう方法トキトサン溶
液に菌体を添加して混合して凝集反応を行なう方法など
がある。

固定化酵素製造の操業性から見てもキトサン溶液に菌体
を添加してよく損拝するかもあるいは猿練りして菌体を
上記キトサン溶液に分散させてから凝集反応を行なうこ
とが好ましい。凝集反応後の菌体は炉過または遠心分離
あるいは圧搾により、水分２０〜５０％に調節して造粒
機で造粒し、そのまま乾燥するかあるし、は整粒機にか
けて整形した後、乾燥する。

本発明において使用する中性あるいはアルカリ性水溶液
中で難溶性であるリン酸塩とはｐＨ６以上において溶解
度が１００の９ノｄ‘以下のリン酸塩である、また本発
明におけるリン酸塩とはリン酸「 メタリン酸「ピロリ
ン酸、次リン酸、亜リン酸「メタ亜リン酸「ピロ亜リン
酸、次亜リン酸を含めた広い概念の酸の金属塩である。

具体的にはＩＪン酸カルシウム、リン酸マグネシウム、
リン酸水素マグネシウムなどのリン酸塩、メタリン酸カ
ルシウム「メタリン酸マグネシウムなどのメタリン酸塩
、ピロリン酸カルシウム、ピロリン酸マグネシウムなど
のピロリン酸塩などが挙げられる。特に好ましくは、リ
ン酸水素マグネシウム「 メタリン酸カルシウム、ピロ
リン酸マグネシウムトピロリン酸カルシウムなどがある
。リン酸塩の添加量は異性化糖液のｐＨ低下を抑制する
量が好ましくトリン酸塩の種類によって異なるがも通常
「原料菌体（乾物）に対して１〜２の重量％であること
が望ましい。

本発明におけるリン酸塩の使用は任意の段階で行なう。

たとえば菌体懸濁液にリン酸塩を添加した後もキトサン
溶液と混合して凝集反応を行なってもよいしも菌体懸濁
液にキトサン溶液を加えて凝集反応を行なう時にもリン
酸塩の分散液を独立に添加してもよい。またキトサンで
凝集した菌体を成型した後〜乾燥前にリン酸塩またはそ
の分散液と混合してもよい。本発明に用いるリン酸塩に
は中性あるいはアルカリ性水溶液中でもわずかに溶解す
るものがある。

このようなリン酸塩はその分散液のｐＨが中性附近より
外れる場合がある。したがって〜菌体懸濁液あるいはキ
トサン溶液の酸あるいはアルカリの添加量を加減して凝
集反応時のｐＨを６〜？をこ維持することが望ましい。
本発明によるリン酸塩を含有する固定化グルコースィソ
メラーゼは異性化反応時にリン酸塩が溶鱗しても反応系
のｐＨ低下を防止する。

したがって異性化糠液のｐＨが酵素の至適ｐ凡安定ｐＷ
こ維持されることから「酵素の安定性〜反応性がきわめ
て良い。また〜固定化グルコースィソメラーゼ内に含有
されているリン酸塩が異性化反応時に生成される酸性物
質を直ちに反応して熔解しトその結果として固定化グル
コースィソメラーゼは多孔性になりもグルコースの拡散
抵抗が減少して反応性が増加する。さらに本発明ではキ
トサンでグルコースィソメラーゼ菌体を凝集させるので
、他のカチオン系凝集剤もたとえばポリビニルィミダゾ
リンあるいは腸性アクリルアミドなどで凝集させる場合
に比しても強度的にきわめて強く〜リン酸塩を含有して
もその圧損が非常に少ない。

したがって、異性化反応時、グルコース溶液の流速が大
きいことは勿論、異性化反応開始時と操作経過後におい
ても、ほとんど流速に変化がみられない。以下、実施例
を用いて本発明を説明する。

実施例中、単に％とあるのは重量％を示す。酵素蒲性は
国際グルコースィソメラーゼ単位を用い、グルコース溶
液（グルコース濃度２Ｍ、０．０２ＭＭｇＳ０４、０．
００１ＭＣｏｃ１２、ＰＨ６．８５）で反応温度６０ｑ
０において１分間に１仏モルのグルコースを異性化する
酵素活性を１単位（ＩＧｍと略する）とした。

なお、各測定項副ま下記の方法に従った。

ｍ 膨潤度 固定化グルコースィソメラーゼ１夕を水に懸濁し、沈降
せしめた時に水中で占める体積（叫）で表わす。

【２｝ 堅さ 粒状の固定化グルコースィソメラーゼを４０Ｗ／Ｗ％ブ
ドウ糖液（ｐＨ８．５）で、室温で一夜放置した後ハ次
の方法に従って堅さを検査した。

すなわち人差し指と親指でつまみ、３人のパネルで感覚
的に堅さを判定した。工業的使用に耐える堅さは３．５
以上であると考える。

【３； 崩壊性活性測定時の１時間の鷹杵反応中におい
て固定化グルコースィソメラーゼが崩壊する程度を表わ
す。

‘４｝ 沈降性 ４０Ｗ／Ｗ％のグルコース溶液中での沈降速度で表わし
た。

実施例 １ グルコースィソメラーゼ生産凍結菌体１．５ｋ９（固形
分３８％ＩＧＩＵ′夕）を６０その水に懸濁し、１０の
こ６等分した。

この懸濁液にリン酸水素マグネシウム、ピロリン酸マグ
ネシウム、リン酸マグネシウム、リン酸カルシウム、ピ
ロリン酸カルシウムを菌体（乾物）当り１０％添加し、
次いでｐＨを７．０に調節した。予め調製した０．２％
キトサンの酢酸溶液（ｐＨ６．０）を上記菌体懸濁液に
よく損拝しながら添加し、凝集反応を行なわせた。凝集
した菌体を脱水してキトサン菌体凝集反応物を得た。こ
れを成型したのち７０℃の熱風下で乾燥後、節別し３０
〜４０メッシュの固定化グルコースィソメラーゼを得た
。得られた固定化グルコースィソメラーゼの活性と堅さ
と膨？塵度を第１表に示す。

第１表 これらの固定化グルコースィソメラーゼの異性化反応の
相違を調べるためにグルコースの異性化反応を行ない、
異性化率を測定した。

異性化反応はグルコース溶液（グルコース５０％、０．
００９ＭＭｇＳ０４、０．００１ＭＣｏｃ１２、ｐＨ７
．０）２０の【に固定化グルコースィソメラーゼ（１２
０１０１Ｕ）を加え、６０ｑＣで１岬時間反応を行なっ
た。

異性化反応終了後、酵素を回収し、再び同じ組成のグル
コース溶液を加えて異性化反応を繰り返した。フラクト
ース異性化率＝グルコース＋フラクトース×１００反応
終了後、異性化率および異性化糖液のｐＨを第２表に示
す。

第 ２ 表実施例 ２ 実施例１で得られた３０〜４０メッシュのリン酸水素マ
グネシウム含有固定化グルコースィソメラーゼ７５夕を
カラムに充填し、５０％のグルコース溶液を重力下に流
下させ、１時間毎に流速を調べた。

その結果を第３表に示す。比較のため、同様にして他の
凝集剤、プリマフロツクＣ−７およびＡ−１０で凝集さ
せ、かつリン酸水素マグネシウム含有した固定化グルコ
ースイン〆う−ゼの場合も第３表に示す。

第３表 第３表から明らかなようにキトサンで凝集させ、かつリ
ン酸水素マグネシウムを含有する固定化グルコースイソ
メラーゼによると「グルコース溶液の流速は全裸作時間
４独特間後もほとんど変化していない。

実施例 ３ 実施例１で得た固定化グルコースィソメラーゼ１０夕を
二重円筒カラム（２励磁０×１８仇肌）に充填し、連続
異性化反応を行なった。

その結果を第４表に示す。第 ４ 表 （夫１）異性化率４５％を維持して流せるグ’レコース
溶液の最大流速

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ キトサンでグルコースイソメラーゼ生産菌体を凝集
   させて固定化グルコースイソメラーゼを製造する方法に
   おいて、任意の段階で固定化グルコースイソメラーゼに
   、中性あるいはアルカリ性水溶液中で難溶性のリン酸塩
   を含有させることを特徴とする固定化グルコースイソメ
   ラーゼの製造法。