JPS61103899A - インタ−フエロン−γ測定用ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 イ１発明の目的 １泉上二■月皇１ ヒトインターフェロン−７はその生理活性が注目きれて
医薬として開発きれつつあり、遺伝子工学的手法により
生産が行なわれている。遺伝子工学的手法により生産き
れるヒトインターフェロン−７は天然のそれに比較する
と、糖鎖を有さないという特徴がある。本発明はこの遺
伝子工学的方法で製造きれたインターフェロンゴの測定
に用いるペプチドを提供するものであり、臨床検査部門
で利用されうるものである。

従遣ヱυえ生 １３、　Ａｌｔｒｏｃｋらはヒトインターフェロン（Ｉ
ＦＮ）の７型における１２８〜１４６位のペプチド鎖を
合成し、このペプチドＩＦＮ−７（１２８〜１４６）を
抗原に用いてモノクローナル抗体を得て、天然および組
換えＩＦＮ−７との結合を確認した（　Ｔｈｅ　Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　Ｓｙ
ｓｔｅｍ１９８３、Ｅ、Ｄｅ　Ｍａｙｅｒ　ａｎｄ　Ｈ
，５ｃｈｅｌｌｅｋｅｎｓ、　ｅｄｉｔｏｒｓ（１９８
３）、ｐ、　１３５）。Ｈ，Ｍ、　Ｊｏｈｎｓｏｎらは
ＩＦＮ−７（１〜２０）を合成しポリクローン抗体を得
て、天然ＩＦＮ−７の活性を中和することを確認してい
る（　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、庚、　２３５７（１９８
２）　）　。

特開昭５９−８０６４６号公報には、ＩＦＮ−７の１３
３〜１４１位にあたるペプチド鎖を中心にＮ端側に１６
個までのアミノ酸を、Ｃ端側に５個までのアミノ酸を結
合許せたペプチドを免疫抗原として用いるモノクロナー
ル抗体の製造方法が示きれているが、具体的にはＩＦＮ
−７（１３１〜１４６）のへキサデカペプチドが記載き
れているのみである。

さらに特開昭５９−１２２４４６号公報には、ＩＦＭ−
ｙ（８５〜９５）およびＩＦＮ−７（１３５〜１４６）
ならびにそれらのチロンン誘導体の合成、これらを用い
たラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）およびエンザイムイ
ムノアツセイ（Ｅ　ＩＡ）が記Ｍ、きれている声 明が解決しようとする問題７．。

ＩＦＮ−７の部分構造を有する合成ペプチドを用いて、
組換えＴＦＮ−７を特異的に定性、定量するためにイム
ノアッセイ系を確立しようとする場合、同合成ペプチド
は、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−βに全く交差性を示さず、微
量のＩＦＮ−７を特異的に認識する抗体をもたらすもの
でなければならない。換言すれば、ＩＦＮ−７に特異的
な部分構造を有するものであることが必須要件である。

さらに合成面や経済性を考慮すれば、そのペプチド鎖は
短い方が望ましい。本発明者は上記の特徴を有するペプ
チド鎖をＩＦＮ−７分子構造の内に求めた。

口１発明の構成 問題点を　決するための手段 ＩＦＮ−７の１２６〜１４６位に相当するウンデカペプ
チドを合成し、同ペプチドを常法どおり免疫抗原として
動物に免疫して得られた抗体は上記の所望性状を有して
おり、同ペプチドにチロシルグリシル（Ｔｙｒ−ＧＩＹ
　）基を導入し、そのチロシル基に放射活性標識をして
得た標識抗原を用いると所期の目的である組換えＩＦＮ
−７を精度および感度よく測定するＲＩＡ系が得られた
。

以下に本発明にかかる組換えＩＦＮ−７４Ｉｌ定用ペプ
チドおよびそれを用いたＲＩＡを詳細に記載する。

本発明で用いる２１−ペプチドおよびそのＴ）！亡Ｇ１
ｙ誘導体は下記の一般式で示される。なお、成上の数字
はＩＦＮ−７の対応する位置を示す。

１２６　　　　　１３０　　　　　　　１３５　　　　
　　　　’Ｒ−Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｇｌ
ｙ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　５ｅｒＧ１ｎ　
Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ａ
ｒｇ　Ａｌａ　５ｅｒ　Ｇｌｎ−（式中Ｒは水素または
Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−を表わす。ただし、チロ〉ンは放射性
ヨウ素で標識キれていてもよい。） 本発明で用いるアミノ酸はすべてＬ型であり、本発明副
書で用いる略号はＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの現定に従う。

上記の一般式で示されるペプチドは、ペプチド合成分野
で用いられる化学合成法および酵素合成法゛により合成
しうる。前者においては、液相法および面相法の両方法
を単独でまたは組合わせて用いることが可能である。す
なわち、上記ペプチドの配列に従って固相法で合成して
もよいし、合成に都合のよいフラグメントを決定して、
液相法、固相法またはペプチド合成酵素によりフラグメ
ントを合成したのち、各フラグメントを縮合させて目的
の化合物とすることができる。これらの合成の反応条件
、反応時間等はペプチド合成に通常用いられるものを踏
顛すればよい。

用いるアミノ酸およびペプチドのアミン末端およびカル
ボキシ末端は汎用される保護基により必要に応じて保護
する。アミン保護基として、例えば、ベンジルオキシカ
ルボニル（Ｚ）、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏａ）、
４−メトキシベンジルオキン力ルボニル（Ｚ（ＯＭｅ）
）、ｔ−７ミノオキシカルボニル ヘキシルオキシカルボニル メチルシクロペントキシカルボニル（Ｍｐｏｃ）、９−
フルオレニルメトキシカルボニル（　Ｆｍｏｃ　）、ホ
ルミル、トリフルオロアセチルなどが利用できる、カル
ボキシ保護基としては、メチルエステル（ＯＭｅ）、ｔ
−ブチルエステル（ＯＢｕｔ）、ベンジルエステル（Ｏ
Ｂｚｌ）などのエステル、アミド、置換アミド、ヒドラ
ジド、例えば、ベンジルオキシカルボニルヒドラジノ（
Ｎ．Ｈｔ−Ｚ）、または塩などが例示きれる。アミノ酸
の側鎖官能基も必要に応じて保護しておくとよい。例え
ば、セリンの水酸基、アルキニンのグアニジノ基、リジ
ンのアミン基などの側鎖官能基はベンジル（Ｂｚｌ）、
トシル（Ｔｏｓ）、ｔ−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ’
＞および前記のアミン保護基などの通常用いられる保護
基で保護しておく七よい。なお、保護基については、Ｅ
、　Ｇｒｏｓｓら’　ＴｈｅＰｅｐｔｉｄｅｓ、　Ｖｏ
ｌ、３　Ｊ　（１９８１年、　Ａｃａｄｅｍｉｃｐｒｅ
ｓｓ　）、赤堀四部ほか編「タンパク質化学工」４０５
頁（昭和４９年、大豆出版）およ、びＭ、　　Ｂｏｄａ
ｎｓｚｋｙら’　Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ
　Ｊ　（１９７６年、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏ
ｎｓ　Ｉｎｃ、　）に詳しく記載きれている。

ペプチド結合の形成は、これを溶液中で行なう場合は活
性エステル法、アジド法、混合酸無水物法、縮合剤を用
いる方法（例、カルボジイミド法）などの常法に従う。

固相法で行なう場合は、架橋化ポリスチレン等が担体と
して用いられる。例えば、クロロメチル化−スチレンー
ジビニルベンゼンフボリマ−［Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ　
：　Ｊ、Ａ、Ｃ，Ｓ、８５．２１４９（１９６３）］に
］ＢｏＣ−アミノのセシウム塩を反応きせることにより
、Ｃ末端のアミノ酸が同相化され、ついでＮ末端へ向か
ってペブデド鎖の合成が行なわれる。

反応は必要に応して無水または含水溶媒（例えば、ジメ
チルホルムアミド、レメチルスルホキシド、ジオキサン
、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、ンクロロメタン、
クロロホルム、エタノールまたはこれらの混合物）中で
行なわれる。反応終了後、生成物から保護基を除去する
場合は保護基に応じて接触還元（例、水素ガス／パラ・
レウム黒）、フッ化水素やトリフロロ酢酸等の酸による
分解、ピペラジン、ジエチルアミン等の塩基による分解
、などの方法を用いるとよい。

また酵素によりペプチド結合をする場合は、例えば、ト
リプシン（特開昭５３−６２８９６号公報）、キモトリ
プシン（特開昭５２−１０８０８９号公報）、ペプシン
、パパイン、サブチリシン、サーモリンン（特開昭５４
−６４６９２号公報）、カルボキシペプチダーゼ、その
他網菌由来酵素（特公昭５７−４６３６０号公報）など
をそ　　　　　　　ｆ□ のまま又は固定化酵素として用いて実施する。

得られた目的ペプチドはゲル濾過法、イオン交換クロマ
トグラフィー、分配クロマトグラフィー、高速液体クロ
マトグラフィー、向流分配法、電気泳動法などの方法に
より抗ぶとして用いうるに充分な純度まで精製する。

なお、上記一般式で示される２１−ペプチドおよび２３
−ペプチドはＲＩＡのみでなく、ＥＩＡの免疫抗原およ
びモノクロナール抗体産生用の抗原として利用すること
もできる。

チロシン残基を有する２３−ペプチドをＲＩＡ用の標識
抗原とするには、常法により放射性ヨウ素（１！！　ｒ
または”’Ｉ）でチロシン残基をヨウ素化することによ
り行なう。すなわち、放射性ヨウ素標識法として広く用
いられる酵素法［Ｙ。

Ｍｉｙａｃｈｉ　ｅｔ　ａｌ、　：　Ｊ、Ｃ１１ｎ、　
Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、　Ｍｅｔａｂ、。

３４、２３　（１９７２）コまたはクロラミンＴ法［Ｇ
ｒｅｅｎｗｏｏｄ　　ｅｔ　　ａｌ、　　　：　　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、Ｊ、　　８９．　１１４（１９６３ン　コ
などにより容易に調製しうる。

上記ペプチドの抗体の調製は、ペプチドを適当な担体蛋
白質と結合させた複合体を免疫原として免疫動物に接種
して抗血清を得る常法により行なう。担体蛋白質として
、血清アルブミン（例、牛血清アルブミン）、チログロ
ブリン（例、牛チログロブリン）、アスカリス蛋白質な
どが例示される。結合剤としてＥＤＣ［１−エチル−３
−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸
塩コ、グルタルアルデヒドなどを用いるとよい。

得られたペプチド−蛋白複合体をウサギ、ヒツジ、ヤキ
、ウマ、ニワトリ、サル、イヌ、モルモットなどの適当
な動物に免疫し、抗血清を得る。

注射方法、免疫頻度、免疫量は用いる動物の抗体産生能
に応じて決定する。注射時には、各種のアジュバント（
例えば、フロイントのコンプリートアジュバント）を加
えて投与すると抗体の産生が高められる。得られた抗血
清（ｊ濾過、滅菌、防腐剤添加、凍結または凍結乾燥な
どの処理を施し保存し、用時希釈して用いる。

１月 上記で得られた抗血清および標識抗原を用いて組換えＩ
ＦＮ−７のＥＩＡ系が確立された。

Ｘ■劃 以下に実施例によ、り本発明の実施態様を示すが、本発
明は下記の実施例により限定されるものではない。

なお、実施例１および２の合成工程を以下に示す。

（以下余白） 実施例１ ［ＩコＩＦＮ　　７（１２６−１４６）の合成１）司仝
！二９ヨユニＱ旦乙１（Ｉ）ｔ−ブトキシカルボニル−
し−グルタミン（Ｂｏｃ−Ｇｌｎ−ＯＨ、４、９３ｇ　
）とヘンンルアルコール（４，２ｍ１）とを、Ｎ、Ｎ’
−ンメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中、４−ジメチルア
ミノピリジン（２，４４１Ｈ）の存在下にジシクロ口へ
キシルカルボンイミド（ＤＣＣ，４，１３ｇ）により縮
合させてＩを得る。酢酸エチル−石油エーテルから再結
晶して４．６５ｇ（６９％　）　、　ｍｐＨ１〜　１１
２　℃、　　［α　コ　。”−２６５±０．７°　（Ｃ
１、メタノール）。

２）Ｂｏｃ−５ｅｒ（Ｂｚｌ）−ＧＬｎ−ＯＢｚｌ（Ｉ
Ｉ　）　　化合物１（７，８８ｇ）をＭ−塩化水素／酢
酸で２５°Ｃ１６０分間処理。てＢｏＣ基を除去後、酢
酸エチル存在下に５０％炭酸カリウムと振って中和、酢
酸エチル層を無水硫酸マグネシウムで乾燥する０次いで
、これにＮ−Ｂｏｃ、　Ｏ−ヘンシル−し−セリン（Ｂ
ｏａ−５ａｒ＜Ｂｚｌ）−ＯＲ，６゜９０ｇ）を加え、
さらにＤ　ＣＣ（４，８３ｇ）を添加して４℃で１６時
間反応させる。反応液は常法通り処理したのち、生成物
を酢酸エチル−石油エーテルから再沈殿して■を得る。

収量７．９５ｇ。

（６６％　）　、　　［α　コ　。”−１１、９±　０
　、５　。

（Ｃ１，メタノール）。

３）Ｂｏａ−Ａｌａ−５ｅｒ（Ｂｚｌ）−Ｇｌｎ−ＯＢ
ｚｌ（Ｉ［Ｉ）　　ＢｏＣ−Ｌ−アラニン（Ｂｏａ−Ａ
ｌａ−ＯＨ、６、３０ｇ　）をＤＭＦ中ＤＣＣ（３，２
ｇ）で処理して得られる（Ｂｏｃ−Ａｌａ）ｔＯ’７）
溶液に、化合物１（（７，９５ｇ）をＭ−塩化水素／酢
酸で処理して得られるＨ−５ａｒ（Ｂｚｌ　）−Ｇｌｎ
−ＯＢｚｌ　ＨＣＩとトリーローブチルアミン（４ｍｌ
）とを加えて４°Ｃで２００時間反応せる。

反応液を常法通り処理して得られる生成物をメタノール
−イソプロパツールから再結晶して■を得る。収量７．
６０＆（８４％）、ｍｐ１７４〜１７５℃、［αコ。”
−２９，８±０．７°、（Ｃ１，メタノール）。

化合物１［［（７，６０ｇ）をトリフロロ酢酸（ＴＦＡ
）−ジクロロメタン（ａ　：　４　、Ｖ／Ｖ）で２５℃
、６０分間処理してトリペプチドエステルＴＦＡ塩を得
る。これをトリーローブチルアミン（３，１ｍ１）と共
にＤＭＦに溶かし、次いでＮ（ｘ−Ｂｏａ。

Ｎ’−トシル−Ｌ−アルギニン・ペンタクロロフェニル
エステル（Ｂｏａ−Ａｒｇ（ｒｏｓ）−０Ｐｃｐ、　１
３　、２　ｇ　＞を加え、２５℃で２００時間反応せる
。溶媒を減圧留去後残渣をメタノール−酢酸エチルから
再沈殿を繰返すことにより■を得る。収量７．６５Ｋ（
６４％　）　、　　［α　コ　Ｄ”−２０，０±　０　
、６１（Ｃ１、メタノール）。

５）Ｂｏａ−Ａｒ、　　（Ｔｏｓ）−Ａｒ　　（Ｔｏｓ
）−Ａｌａ−５ｅｔ（Ｂｚｌ）−Ｇｌｎ−ＯＢｚｌ（Ｖ
　）　　化合物ＩＶ（７，６５ｇ）をＴＦＡで２５°Ｃ
１６０分間処理して得られる生成物をＤ　Ｍ　Ｆ中、ト
リーｎ−ブチルアミン（４，２ｍ１）の存在下、Ｂｏｃ
−Ａｒｇ（Ｉｏｓ）−０Ｐｃｐ（７、５０ｇ　）と２５
℃で２００時間反応せる。粗生成物をシリカゲルカラム
（Ｋｉｅｓａｌｇｅｌ　６０、メルク社；５Ｘ１５ｃｍ
）にのせ、クロロホルム−メタノール（９５：ｌ〜９０
：１０）で溶出する。溶出液は薄着クロマトグラフィー
（ＴＬＣ）で調べ、目的物Ｖを単一に含む溶出液を集め
て減圧留去する。残渣を少量の９メタノールを含む酢酸
エチル−エーテルから再沈殿してＶを得る。収量８．Ｏ
Ｏｇ（７８％）、［α］。ＩＳ−１８、８±０．６″（
ＣＩ、メタノール）。

６）Ｂｏｃ−Ａｒ　（Ｉｏｓ）−Ｇｌ　−ＯＭｅ（ＶＩ
）　　ＢｏＣ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−ＯＨ（１２，８６ｇ
）とグリシン・メチルエステル塩酸塩（３，８０ｇ）と
をトリーｎ−ブチルアミン（７，２ｍ１）の存在下にＤ
ＣＣ（６，２０ｇ）で縮合きせる。粗生成物を常法通り
シリカゲルカラムで精製して■を得る。収１１１．２３
ｇ（７５％）、［α］　Ｄｌ“−２，６±０．４°（Ｃ
Ｉ、メタノール）。

７ンＢｏｃ−Ｐｈｅ−Ａｒ　（Ｔｏｓ）−Ｇｌ−ＯＭｅ
（■）化合物■（１１、ｚｇ）を塩化水素−酢酸で２５
°Ｃ１９０分間処理して得られるＨ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ　
）−Ｇｌｙ−ＯＭｅ塩酸塩をＤＭＦに溶解して水冷、こ
れにトリーｎ−ブチルアミン（８，０ｍ１）とＢｏａ−
Ｌ−フェニルアラニン・Ｎ−ヒドロキンフハク酸イミド
エステル（Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−Ｏ５ｕ、　７　、９　ｇ　
）とを加えて２５°Ｃで２０時間反応きせる。粗生成物
を常法通りシリカゲルカラムで精製したのち酢酸エチル
−石油エーテルから結晶させて目的物■を得る。収量１
１．４ｇ（８１％）、ｍｐ１７１−１７２℃、［ａ　］
　、！＋−９，８±０．５’（ＣＩ、メタノール）。

８）Ｚ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｒ　（Ｉｏｓ）−Ｇｌ−Ｏ
Ｍｅ（■）化合物■（９，０５ｇ）をＴＦＡで２５°Ｃ
１３０分間処理して得た生成物をトリーｎ−ブチルアミ
ン（３，５ｍ１）と共にＤＭＦに溶解し、これにヘンジ
ルオキンカルボニルーし一ロインン、Ｎ−ヒドロキンコ
ハク酸イミドエステル（Ｚ−Ｌｅｕ−Ｑ５ｕ、４．９５
ｇ）を加え、２５°Ｃで２０時間反応させる。反応液を
常法通り処理して得た生成物を酢酸エチル−エーテルか
ら再沈殿した目的物■を得る。収量１０．５ｇ（９５％
）、［α］、”−２７，４±０．７’（Ｃ１、メタノー
ル）。

９）Ｚ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｒ　（ＴＱＳ）−Ｇｌ　−
ＮＨＮＨ，（ＩＸ　）　　化合物■（１０，５ｇ）を９
９％エタノールに溶解し、これに抱水ヒドラジン（３，
３ｍ１）を加え２５℃で２０時間反応きせる。析出した
結晶を濾別、９９５！６エタノールから再結晶して■を
得る。収量９１５ｇ　（８９％　）　、　ｍｐｌ　　２
　８　〜１　３　０”Ｃ、［α　コ　　１ｓ−１９，１
±０．６°（Ｃ１、メタノール）。

１０）Ｚ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｒ　　（Ｉｏｓ）−Ｇｌ
　　−Ａｒ　　（Ｔｏｓ）−Ａｒ　　（Ｔｏｓ）−Ａｌ
ａ−５ｅｒ（Ｂｚｌン−Ｇｌｎ−ＯＢｚｌ（Ｘ　）　　
化合物Ｖ　（４，００ｇ）をＴＦＡで２５℃、５０分間
処理してＨ−Ａｒｇ（Ｉｏｓ　）−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−
Ａｌａ−５ｅｒ（Ｂｚｌ　）−Ｇｌｎ−ＯＢｚｌ　４Ｆ
Ａ塩を得る。一方、化合物ＩＸ（’３．１６ｇ）をＤＭ
Ｆに溶解して一３０°Ｃに冷却、これに４Ｍ−塩化水素
−／オキサン（５ｍｌ）、次いで亜硝酸イソアミル（０
，７ｍ１）を添加する。３０分後ぎらに一５０℃まで冷
却し、トリーｎ−ブチルアミン（７，３ｍ１）をカロえ
て中和する。これに上に得たペンクベブチドエステル、
ＴＦＡ塩のＤＭＦ溶液を加え、４°Ｃで２０時間反応さ
せる。溶媒を減圧留去後、水を加えて生しる沈殿＝を集
め、これを含水Ｄ　Ｍ　Ｆ−メタノールから再沈殿して
目的物Ｘを得る。収量５．６５ｇ（９１％、）、［ｆｆ
］ｏ”　　１４．０士０．５°（Ｃ１，ＤＭＦ）。

１１＞Ｂｏｃ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−ＯＭｅ（ＸＩ）　’　
Ｂ　ｏ　ｃ−グルタミン、ｐ−ニトロフェニルエステル
（Ｂｏｃ−Ｇｌｎ−ＯＮｐ、　３．７０ｇ）とＬ−メチ
オニン・メチルエステル（）ｌ−Ｍａｔ−ＯＭｅ）塩酸
塩（２，２０ｇ）とを、ＤＭＦ中トリーｎ−ブチルアミ
ン（２、７’ｍｌ）の存在下に２５°Ｃｌ２Ｏ時間反応
きせる。反応液を常法通り処理して得られる生成物を酢
酸エチルから再結晶してＸＩを得る。収！２．８８ｇ（
７４％）、ｍｐＨ４〜　１１５　℃、　　［α　コ　、
”−３２、４±　０．７　′（Ｃ１’、　メタノール）
。

１２　）Ｂｏｃ−５ｅｒ（Ｂｚｌ　）−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ
−ＯＭｅ（ＸＩＩ　）化合物℃（２，７０ｇ）をＴＦＡ
で２５℃、３０分間処理してＨ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−ＯＭ
ｅ４ＦＡ塩を得る。これを、トリーｎ−ブチルアミ７（
３，３ｍ１）と共にＤＭＦに溶解し、さらにＢｏＣ−５
ａｒ（Ｂｚｌ）−０Ｓｕ（２、６０ｇ　）を加えて２５
°Ｃで２０時間反応きせる。反応液を常法通り処理して
得られる生成物をシリカゲルカラムにのせ、クロロホル
ム−メタノール（９８：２、Ｖ／Ｖ）で溶出する。ＴＬ
Ｃで調へ目的物を単一に含む溶出液を集めて減圧留去、
残渣を酢酸ニゲル−エーテルから再沈殿してＸＩＩを得
る。収量２．５０ｇ（６７％）、［α］Ｄ”　　２４．
’７±０．６’（Ｃ１、メタノール）。

１３）Ｂｏｃ−Ａｒ　（Ｔｏｓ）−５ｅｒ（Ｂｚｌ）−
Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−ＯＭｅ（ＸＩＩＩ）化合物ｘｎ（１，
ｚｏｇ）をＴＦＡで２５℃、３０分間処理して得られる
トリペプチドエステルＴＦＡ塩とＢｏｃ−Ａｒｇ（Ｔｏ
ｓ）−０Ｐｃｐ（２、４０ｇ　）とをＤＭＦ中トリーｎ
−ブチルアミン（２、０ｍ１）＋７）存在下に２５°Ｃ
ｌ２Ｏ時間反応きせる。反応液を常法通り処理して得ら
れる生成物をＸＩＩの場合と同様シリカゲルカラムでネ
青製して目的物ＸＩＩＩを得る。収量０．４５ｇ（５９
％）。

１４）敗免Ｊｔコ互鯨≦連ｄ影エヒ倶１世斐ご世凹」入
式ｌ化合物ＸＩＩＩ（０，６５ｇ）を９９％エタノール
中抱水ヒドラジン（０，２ｍ１）で２５°Ｃ１３日間処
理する。析出した沈殿を濾取し、さらにメタノール−エ
ーテルから再沈殿して目的物ＸＩＶを得る。

収量０．６０ｇ（９２％）、［α］。”−１７，０士０
．９″’（Ｃ０，６、メタノール）。

１５）ＢｏＣ−Ａｒ　（Ｔｏｓ）−５ｅｒ（Ｂｚｌ）−
Ｇ１ｎ＝Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｒ（Ｔｏｓ＞−Ｇ
ｌ　−Ａｒ　（Ｔｏｓ）−Ａｒ　（Ｔｏｓ）−Ａｌａ−
５ｅｒ−Ｇｌｎ−ＯＨΔ毀　化合物Ｘ（１，２６ｇ）を
ＤＭＦ＝酢酸−水（６：　１　：　１　、ｖ／ｖ）中パ
ラジウム黒を触媒として２５°Ｃ５１０時間接触還元を
行ないＨ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ　）−Ｇｌ
ｙ−Ａｒｇ＜Ｉｏｓ　）−Ａｒｇ（Ｔｏｓ　）−Ａｌａ
−５ｅｒ−Ｇｌｎ−ＯＨを得る。一方、化合物ＸＩＶ（
０、７７ｇ　）をＤＭＦに溶解し一３０℃に冷却する。

これに４Ｍ−塩化水素−ジオキサン（１，１２ｍ１）、
次いで亜硝酸イソアミル（０，２１ｍ１）を加えて反応
させる。３０分後反応液を一５０°Ｃに冷却し、トリー
ローブチルアミン（１，７ｍ１）により中和後、上に得
たノナペプチドのＤＭＦ−ンメチルスルホキンド（ＤＭ
ＳＯ）溶液を加え、４°Ｃで２００時間反応せる。ＤＭ
Ｆを減圧留去後、水を加えて生じる沈殿を集める。これ
をＤ’ＭＦ−水（７：３、ｖ／ｖ）に溶解しダウエック
ス５０ＷＸ８（Ｈ“型、ダウ・ケミカル社）３０ｍｌを
加えて振盪し、未反応のアミン・フンボネント（ノナペ
プチド）を除去する。樹脂を濾別後濾液を減圧留去、残
渣をＤＭＦ−酢酸エチルから再沈殿して目的物Ｘ■を得
る。収量１．２７ｇ（８０％）。

１６）ｙ巴」四■士往士尖μ匹ρ二社園東竺Ｉ）　　Ｉ
　　−Ｚ−Ｌ−Ｕンン・メチルエステル（Ｈ−Ｌｙｓ（
Ｚ）−ＯＭｅ）塩酸塩（７，２８ｇ）をジクロロメタン
に溶解し、水冷下に５０％炭酸カリウム水溶液を加えて
振盪する。

有機溶媒溜は無水硫酸マグ不ソウムで乾燥後これにＢｏ
ｃ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−ＯＨ（８、５７ｇ）およびＤＣ
Ｃ（４，１３ｇ）を加えて４°Ｃで２００時間反応せる
。反応液を常法通り処理して得られる生成物をさらにシ
リカゲルカラム上ンクロヘキサンー酢酸エチル系溶媒で
精製して目的物ＸＶＩを得る。収量１０．９．ｇ（，７
７％　）　、　　［α　コ　ｏ　！３　　５．７　　±
０．５’（Ｃ１、メタノール）。４ １７）Ｂｏａ−Ｌ　５（Ｚ）−Ａｒ　（Ｔｏｓ）−Ｌ　
ｓ（Ｚ）−ＯＭｅ（ＸＶＩＩ）化合物ＸＶＩ（１０，８
ｇ：）をＴＦＡＴ２５℃、３゜分間処理してＨ−Ａｒｇ
（Ｔｏｓ）＝Ｌｙｓ（Ｚ）−０Ｍｅ４ＦＡ塩を得る。こ
れをＤＭＦ中トリーｎ−ブチルアミンの存在下にＢｏａ
−Ｌｙｓ（Ｚ）−０Ｐｃｐ（９、４３ｇ　）と４°ｃ、
　　　　　　　　　　１２０時間反応させる。反応液を
常法通り処理して得られる生成物をシリカゲルカラム上
、クロロホルム−メタノール酢酸系溶媒で精製して目的
物ＸＶＩＩを得る。収量９．４７ｇ（６４％）、［α］
、”’−１３，１１０，５°（Ｃ１、Ｈノール）。

１ｇ）Ｚ−Ｔｈｒ−Ｇｌ　−ＯＭｅ’（’ＸＶＩＩＩ）
　　Ｚ−Ｔｈｒ−ＯＨ（１６、２ｇ）とＨ−Ｇｌｙ−Ｏ
Ｍｅ塩酸塩（８，０４ｇ）とをジクロロメタンに溶解し
、これにトリーｎ−ブチルアミン（１５，２ｍ１）おＪ
：びＤｃｃ（１３，２ｇ）を加えて４°Ｃで２００時間
反応せる。反応液を常法通り処理して得られる生成物を
酢酸エチル−石油エーテルから再結晶してＸＶＩＩＩを
得る。収量１５．７ｇ（７６％）、ｍｐ、　１０７−１
０９℃、［αコＤ”　’−１５、Ｏｆｏ　、５”　（Ｃ
１、メタノール）。

１９）Ｚ−Ｌ　５（Ｂｏｃ）−Ｔｈｒ−Ｇｌ　−ＯＭｅ
（ＸＩＸ）　　化合物ＸＶＩ　Ｉ工（１３□０ｇ）を４
Ｍ塩化水素−ジオキサン１１ｍ１を含むメタノール中、
パラノウム黒存在下に接触１９元してＨ−Ｔｈｒ−Ｇｌ
ｙ−ＯＭｅ塩酸塩を得た。一方、α Ｎ　　−Ｚ、　Ｎ　　−Ｂｏｃ−Ｌ−リンノ（Ｚ−Ｌｙ
ｓ（Ｂｏａ）−０Ｈ１１５，２ｇ）とＮ−ヒドロキシフ
ハク酸イミド（ＨＯ５ｕ　。

４−．６０［）とをテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶
解、これにＤＣＣ（８，２５ｇ）を加え０℃、４時間反
応きせる。析出したジシクロヘキンール尿素の沈殿を濾
別後溶媒を減圧留去してＺ−Ｌｙｓ（Ｂｏａ）−０Ｓｕ
を得る。次にこの活性エステルと上に得たジペプチドエ
ステルとをＤＭＦ中トリーｎ−ブチルアミン（１’０ｍ
１）の存在下に４℃、１８時間反応させる。反応液を常
法通り処理して得た生成物を酢酸エチル−石油エーテル
から再結晶してＸＩＸを得る。収量１４．１ｇ（６４％
）、ｍｐ１２０−１２４℃、　　［α　コ　Ｄ”−２１
、６±　０　、６　°　　（Ｃ１、メタノール）。

２０）Ｚ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＯＭｅ（ＸＸ）　　　　Ｚ
−Ａｌａ−Ｏ５ｕ（９、６１ｇ）とＨ−’Ａｌ’ａ−Ｏ
Ｍｍ塩酸塩（４，５７ｇ）とをＤＭＦ中トリーｎ−ブチ
ルアミン（７，５５ｍ１）の存在下、４°Ｃｌ２Ｏ時間
反応させたのち常法通り処理して得られる生成物を酢酸
エチル−石油エーテルから再結晶してＸＸを得る。収ｆ
ｉｔ８．７７ｇ（９５％）、ｍｐ、　１０５−１０８　
、５℃、［，２］　Ｄ！１−５２，３±０，９°　（Ｃ
１、メ〃／−ル）。

２１）Ｚ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＮＨＮＨ，ＣＸＸＩ）　　
化合物ＸＸ（７，７１＆）をメタノールに溶解、これに
泡水ヒ１ラジン（２ｓｍｌ）を加えて２５℃、２０時間
反応させる。溶媒を留去し、残渣をメタノール−エーテ
ルから再結晶して目的物ＸＸＩを得る。収［６、２９ｇ
（８２％）、ｍｐ２１５．５−２１７．５℃、［αコｏ
”−４９、１±０．９°　（Ｃ１、メタノール）。

２２）Ｚ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌ　ｓ（Ｂｏｃ）−Ｔｈｒ
−Ｇｌ−ＯＭｅ（ＸＸＩＩ）化合物ＸＩＸ（２、７６＆
　）を酢酸中パラジウム黒存在下に２５℃、６時間接触
還元してＨ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−０員
ｅ酢酸塩を得る。一方、化合物ＸＸＩ　（１，５４ｇ）
をＤＭＦに溶解し一３０℃に冷却する。これに５，６Ｍ
−塩化水素−ジオキサン（１，８ｍ１）次いで亜硝酸イ
ンアミル（０，８８ｍ１）をカロえる。３０分後反応液
を一５０°Ｃに冷却し、トリーｎ−ブチルアミン（４，
７６ｍ１）により中和したのち、上に得たトリペプチド
エステル酢酸塩を加え、４°Ｃｌ２Ｏ時間反応させる。

溶媒を減圧留去し、残渣に水を加えて析出する沈殿をＤ
ＭＦ−メタノールから再沈殿して目的とするＸＸＩＩを
得る。収量２．９４ｇ（８５％）、ｍｐ２２５．５−２
３０℃、〔αＬ”−１５，２士０．７’　　（Ｃｏ　、
８、ンメチルスルホキシドＣＤＭＳＯ））。

２３）Ｚ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌ　５（Ｂｏｃ）−Ｔｈｒ
−Ｇｌ　−Ｎ）ｌＮＨ＋（ＸＸＩＩＩ）化合物ＸＸＩＩ
（２，９４ｇ）をＤＭＦに溶解し潅水ヒドラジン（５ｍ
ｌ）をカロえ２５℃、２０時間反応きせる。析出したゲ
ル状沈殿を濾取し、含水メタノールから再結晶してＸＸ
Ｉ　Ｉ　Ｉを得る。収ｉｋ２．６３ｇ（９０％）、ｍｐ
２２５−２３０’Ｃ，［（Ｚコ、−１５，６±１．１”
（Ｃ０，５、ＤＭＳＯ）。

２４）Ｚ−Ａｌａ−Ａｌｇ−Ｌ　　５（Ｂｏｃン−４ｈ
ｒ−Ｇｌ　　−Ｌ　　５（Ｚ）−Ａｒ　　（Ｔｏｓ−Ｌ
　ｓ（Ｚ）−ＯＭｅ（ＸＸＩｖ）　　化合物ｘｖｔＩ（
ｏ、ｓ５ｇ）をＴＦＡより２５℃、４０分間処理して）
ｌ−Ｌｙｓ（Ｚ）−Ａｒｇ（Ｔｏｓン−Ｌｙｓ　（Ｚ　
）−ＯＭｅ　ＴＦＡ塩を得る。一方、化合物ＸＸＩＩＩ
（０，６１ｇ　）をＤＭＳＯ−ＤＭＦ（２：　３　、５
　ｍｌ）　　　　　　　　ｆに溶解し、−３０″Ｃに冷
却したのち５，６Ｍ−塩化水素−ジオキサン（０，ａ７
ｍ１）と亜硝酸イソアミル（０，２８ｍ１）を順次加え
る。３０分間攪拌後−５０℃に冷却しドーリ−ｎ−ブチ
ルアミン（１，０５ｍ１）を加えて中和する。これに、
上に得たトリペプチドエステル酢酸塩を加え、４°Ｃｌ
２Ｏ時間反応きせる。溶媒を一１ｆｆ留去し、残渣にＭ
−酢酸を加えて生しる沈殿を濾取し、エタノールから再
沈殿して目的物ＸＸＩＶを得る。収量１．０１ｇＣ７４
％）、ｍｐｌ　６７−１７０℃、［α］、”−１０，３
±０．５”　（１、ＤＭＳＯ＞。

２５）ζ旦と呂り以躬よ回ヨαづ匹り江旦互」ユコヨ（
５（Ｚ）−ＮＨＮＨ＊（ＸＸＶ）　　化合物ＸＸＩＶ（
０、７９ｇ　）をＤ　Ｍ　Ｆ中泡水ヒドラジン（１ｍｌ
）により２５℃、２０時間処理する。溶媒を減圧留去し
、残渣にメタノールを加えて生しるゲル状沈殿を含水メ
タノールから結晶化許せてｘｘｖを得る。収（ｉｔｏ、
６３ｇ（７９％　）　、　ｍｐ２０９−２１９　　°Ｃ
１［α　コ　、２′−１２，２±０．５＠（ＣＩ、ＤＭ
ＳＯ）。

Ａｒ　（Ｔｏｓ）−Ｇｌ　−Ａｒ　（Ｔｏｓ）−Ａｒ　
（Ｔｏｓ）−Ａｌａ−５ｅｒ−Ｇｌｎ−ＯＨ（ＸＸＶＩ
）　　化合物ＸＶ（０，３６ｇ）をＴＦＡにより２５℃
、４０分間処理しトリデカペプチド・ＴＦＡ塩を得る。

一方、化合物ＸＸＶ（０、３４ｇ＞をＤＭＦに溶解し一
３０℃に冷却したのち４Ｍ−塩化水素−）オキサン（０
，２ｍ１）、次いで亜硝酸イソアミル（４０μｍ）を加
える。３０分後−５０℃に冷却し、トリーｎ−ブチルア
ミン（０，４ｍ１）、きらに上に得たトリデカペプチド
ＴＦＡ塩をＤＭＳＯ−ＤＭＦ混液に溶かして加え４°Ｃ
ｌ２Ｏ時間反応きせる。溶媒を減圧留去し、残渣に水を
加えて生じる沈殿を濾取する。次にこれを含水ＤＭＦ中
ダウエックス５０ＷＸ８（Ｈ４型、１０ｍ１）と２５°
Ｃ１６０分間振盪する。樹脂を濾別後溶媒を減圧留去、
残渣を酢酸エチルで処理しテＸＸＶＩを得る。収量０．
６３［。

ＯＲ，ＩＦＮ−７（１２６−１４６）　　化合物ＸＸＶ
Ｉ（０、４１ｇ）をメチオニン（１００ｍｇ）、アニソ
ール（１ｍｌ）と共に無水フン化水素に溶解しＯ″Ｃ１
９０分間反応させる０次いでフッ化水素を０°Ｃで減圧
留去し、残渣を冷水に溶解後酢酸エチルで洗浄する。

この水溶液をアンバーライトＣＧ−４００（アセテート
型、ローム・アンド・ハース社）のカラム（２，６Ｘ１
３ｃｍ）を通すことによりフン化水素酸塩から酢酸塩に
変わる。これをカルボキシメチルセルロース（ＣＭ−５
２、ワットマン社）のカラム（２，４Ｘ２１ｃｍ）にの
せ、０−ＩＭの直線的、ｆ！１度勾配を有する酢酸アン
モニウム緩衝液（ｐＨ６，５、３，０００ｍ１）を用い
てｌ容出する。溶出液はバイオラド・プロティンアッセ
イ試薬（バイオラド社）で比色しく５９５ｎｍ）、主ピ
ークに相当する画分を集め凍結乾燥し１７２ｍｇを得る
。

この中１３８ｍｇについてＣＭ−５２カラムによる再ク
ロマトを行ない、目的とするＩＦＮ−７（１２６−１４
６）を得る。収量１０４ｍｇ、酸氷解物のアミノ酸組成
（６ＭＭＣ＋、１１０°Ｃ１２０ｈ、５％チオグリコー
ル酸含有）： Ｔｈｒ　１．０２（１）　、　Ｓｉｒ　１．７９＜２）
　、　Ｇｌｕ　Ｌ、９８（２）。

Ａｌａ　３．０７（３）　、　Ｍｅｔ　Ｏ，９８（１）
　、　Ｌａｕ　１．００（１）。

Ｐｈｅ　１．００（１）　、　Ｌｙｓ　３．０２（３）
　、　Ａｒｇ　５．０４（５）。

ここに得られたＩＦＮ−７（１２６−１４６）は逆相Ｈ
ＰＬＣにより満足すべき純度を有することが示された。

ＨＰＬＣ条件：固定相、ヌクレオシル５Ｃ＋ａ　、　０
　、４　Ｘ　２５ｃｍ（ｖケリー、ナーゲル社）；移動
相、アセトニトリル（１２％）、硫酸ナトリウム（５０
ｍＭ）、ｎ−ブタンスルホン酸ナトリウム（５ｍＭ）を
含む５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ３）、１　ｍｌ／　ｍｉ
ｎ　；検出、２２０　ｎｍ。

実施例２ ［Ｉ［〕〕ｒｙｒ−Ｇｕｙ−ＩＦＮ−７（１２６−１４
６）の合成 ２８）Ｂｏｃ−Ｔ　ｒ−Ｇｌ　−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌ　
５（Ｂｏａ）−Ｔｈｒ−Ｇｌ　−ＯＭｅ（ＸＸＶＩＩ）
　　化合物ＸＸＩＩ（１，０４ｇ）を酢酸中パラジウム
黒を触媒として３．５時間接触還元し、Ｈ−Ａｌａ−Ａ
ｌａ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−ＯＭｅ酢酸
塩を得る。

一方、Ｂｏａ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−ＮＨＮＨｚ　（０、８
３ｇ、特許第１１４７３０９号）をＤＭＦに溶解し−２
０〜　　　　　　　　ｆ−３０℃に冷却、これに５．６
Ｍ塩化水素−シオキサン（０，６７ｍ１）と亜硝酸イン
アミル（０，３６ｍ１）を順次加えて攪拌する。３０分
後−６０℃に冷却し、トリーｎ−ブチルアミン（２，０
６ｍ１）を加えて中和する。これに上に得たペンタペプ
チド酢酸塩をＤＭＦに溶かして加え、４℃、２０時間反
応させる。溶媒を減圧留去後、残渣に０．５Ｍ酢酸を加
えて生じる沈殿を濾取し、これをシリカゲルカラム上ク
ロロホルム；メタノール−酢酸（９５：５：３と８０　
：　２０　：　３間の濃度勾配）を７１ｉ媒とするクロ
マトグラフィーで精製、言らにダイヤイオン）ＩＰ−２
０（三菱化成）のカラムにのせ、メタノール水のメタノ
ール濃度を５０％から１００％まで連続的に変えながら
溶出することにより精製した。最後に、メタノール−酢
酸エチルから沈殿させて目的物ＸＸＶＩＩを得る。収量
０５５ｇ（４２％）、ｍｐ２１１−２１３．５℃、［α
］。２ｓ−２２−８±０．６°（ＣＩ、メタノール）。

２９）Ｂｏｃ−Ｔ　ｒ、−Ｇｌ　−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌ
　５（ＢｏＣ）−Ｔｈｒ−Ｇｌ　−ＮＨ−ＮＨ１（ＸＸ
ＶＩＩ　）　　化合物ＸＸＶＩＩ（０，５２ｇ　）をＤ
ＭＦに溶解し、潅水ヒドラジン（１，２ｍ１）を加えて
２５℃２０時間反応きせる。溶媒を留去して得られる残
渣をメタノールから再結晶してＸＸＶＩＩＩを得る。収
ｔｏ、４５ｇ（８８％）、ｍｐ２０８−２１０’Ｃ、［
α　コ　ｏ”−１３、６ｔ０　　、　５（Ｃ１゜ＤＭＦ
）。

３０）Ｂｏｃ−Ｔ　ｒ−Ｇｌ　−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌ　
５（Ｂｏｃ）−ｒｈｒ−Ｇｌ　−Ｌ　５（Ｚ）−Ａｒ　
（Ｔｏｓ）−Ｌ　ｓ（Ｚ）−ＯＭｅ（ＸＸＩＸ）　　化
合物ＸＸＩＶ（７）合成におイテ、ＸＸＩＩＩノ代わり
＋：ＸＸＶＩＩＩ（０、３９ｇ）を用いたほかは全く同
様にして目的物ＸＸＩＸを得る。収量０．５８ｇ（７５
％）、ｍｐ１８１−１８４　℃、　　［α　コ　。！３
．８　　　１　２　　、　６　　±　０　、５　。

（Ｃ１、ＤＭＦ）。

（０，５５ｇ）をＤＭＦ中抱水ヒドラジン（１ｍｌ＞で
２９）と同様に処理しＸｘＸを得る。収量０．４１ｇ（
７４％）、［αコＤ”１．０±０．４（Ｃ１、ＤＭＦ）
、ｍｐ、２１２−２１６℃。

Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｒ　（Ｔｏｓ）−Ｇｌ　−
Ａｒ　（Ｔｏｓ）−Ａｒ　（Ｔｏｓ）−Ａｌａ−５ｅｒ
−Ｇｉｎ−ＯＨ（ＸＸＸＩ）　　化合物ＸＸＶＩの合成
において、化合物ｘＸｖノ代わりにＸＸＸ（０，３７ｇ
）を用いたほかは同様にして目的物ＸＸＸＩを得る。収
量０．５２ｇ。

ＸＸＸＩ（２４９ｍｇ）を、ＸＸＶＩ（７）脱保護ノ場
合と同様に処理し目的物を得る。収量１３．３＋ｎｇ、
酸氷解物のアミノ酸組成（６ＭＭＣＩ、１１０℃、２０
ｈ　）　：　Ｔｈｒ　Ｏ，９９＜１）　、　Ｓｅｔ　１
．８６（２）　、　Ｇｉｎ　１．９６＜２）。

Ｇｌｙ　３．０３（３）、　Ａｌａ　２．９６（３）、
　Ｍａｔ　０１９４（１）　。

Ｌａｕ　１．００（１）　、　Ｔｙｒ　Ｏ，９９（１）
　、　ＰｈｅＯ，９９（１）。

Ｌｙｓ　２．９５（３）　、　Ａｒｇ　４．７ｇ（５）
。

ここに得られたペプチドは逆相ＨＰＬＣにより充分な純
度を有することが示された。

実施例３ １２８１標識抗原の調 Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−ＩＦＮ−７（１２６−１４６）１ｍｇ
を含む０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ，７、５）６０μｍ
にヨウ化ナトリウム（”’Ｉ）溶液（１００（ｉ／ｍ１
）５μｌ及びクロラミンＴ溶液（２ｍｇ／　ｍｌ　）　
１０μｍを加え、室温で３０秒攪拌する。これにピロ亜
硫酸ナトリウム溶液（２、５ｍｇ／ｍｌ）　５０μｍと
ヨウ化カリウム溶液（５０ｍｇ／ｍｌ）　１０μｍを加
えた後、セファデックスＧ−１５カラム（φＩＸ２０ｃ
ｍ）に付す。０．１％ウシ血清アルブミンを含む０．１
Ｍ酢酸３０＋ｎｌ、ついで１Ｍ塩化ナトリウムを含む０
．１Ｍ酢酸２０ｍ１で溶出し、目的の標識抗原を得る。

総放射活性は２５０μＣｉでその比放射能は４００μＣ
ｉ／μｇであった。

実施例４ 抗血清の調製 １）ＩＦＮ−７（１２６−１４６）１０ｍｇと牛血清ア
ルブミン（ＢＳＡ）１３．９ｍｇを水６００μｍに溶か
し、ＥＤＣ１１７ｍｇを加え、０．５Ｍ塩酸でｐＨ５，
０に調整した後室温で２時間攪拌する。

ついで１ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に対して透　
　　　　　　！析した後、凍結乾燥する。得られた免疫
［（１３，１ｍｇ）では、Ｂ５Ａｌ分子にＩＦＮ−７（
１２６−１４６）１０分子が結合していた。

２）グルタルアルデヒドを用いて１）と同様に免疫原を
調製すると、Ｂ５Ａｌ分子に対してＩＦＮ−７（１２６
−１４６）１２分子が結合している免疫原が得られる。

３）上記１）で得られた免疫原５００′μｇを生理食塩
液５００μｍに溶かし、フロイントのコンプリートアジ
ュバント５００μｍを加えてエマルジョンにする。これ
を家兎の背部皮肉に３週間間隔で６回繰返し注射し、最
終免疫後１０日目に採血して抗血清を得る。

実施例５ １土五 組換えＩＦＮ−ｙ標準溶液（０〜２５０ｎｇ／ｍ１）１
００μｍを採り、＋６１標識抗原（０、ｉ２μＣｉ／ｍ
ｌ）　１００μｍおよび上記抗血清希釈液（１：５００
）１０”Ｏμｌを加え、４℃で１６時間インキュベート
した後、０．８％ウシ血清グロブリン溶液１００μｍと
２５％ポリエチレングリフール溶液４００μｍを加え３
０秒放置する。ついで４℃遠心分離（２０００Ｘｇ、３
０分）したのち上清を吸引除去しその沈殿の放射活性を
ウェル型シンチレーションカウンターで計測する。

この場合の標準曲線は第１図に示すととおりで、その測
定限界は２　ｎｇ／　ｔｕｂｅで感度が良いことが認め
られる。

ハ１発明の効果 本発明により得られる抗血清に対し第２図に示されるよ
うに組換えＩＦＮ−７はＩＦＮ−７−（１２６−１４６
）およびＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ｉ　Ｆ　Ｎ　−７−（１２６
−１４６）と同等の交差性を示すが、第３図に示すよう
にＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βとは全く交差性を示さな
い。

きらに本発明のＲＩＡを用いて、６０℃で加熱処理して
部分的に不活性化した試料について免疫活性と同時に抗
ウィルス活性を測定したところ加熱処理時間に対するＲ
ＩＡ／Ｉｔｌ定値と抗ウイルス活性測定値の間に相関関
係が認められる。したがって、本発明のＲＩＡの測定値
は生物活性をよく反映しており、本発明のＲＩＡ系は組
換えＩＦＮ−７の測定法として有用である。

＋９区面の簡単な説明 （１）第１図は組換えＩＦＮ−７の標準曲線を示す。

（２）第２図は抗ＩＦＮ−７（１２６−１４６）血清を
用いた組換えＩＦＮ−７、ＩＦＮ−７（１２６−１４６
）、Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｉ　Ｆ　Ｎ　−７（１２６−１４
６）、ＩＦＮ−７（１３４−１３６）、ＩＦＮ〜７（１
３８−１４６）、ＩＦＮ−７（１４２−１４６）のＲＩ
Ａの結果を示す。

（３）第３図は抗ＩＦＮ−７（Ｌ２６−１４６）血清を
用いた組換えＩＦＮ−α１、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ７のＲ
ＩＡの結果を示す。

（４）第４区は加熱処理した組換えＩＦＮ−７のＲＩＡ
／Ｊ！ｌ］定値と抗ウイルス活性測定値を示す。

第　　１　　図 ＩＦＮ−１、ｎｇ／ｌｕｂｅ 第　　３　　図 ＩＦＮ　、０７肩ｌ 第　　４　　図 加熱時間　（分） 手続辛市正書（方式） ％式％ １、事件の表示 昭和５９年特許願第２２５４３４号 ２、発明の名称 インターフェロン−７測定用ペプチド ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 住所　大阪府大阪市東区道修町３丁目１２番地４、代理
人 住所　大阪市福島区鷺洲５丁目１２番４号〒５５３゜塩
野義製薬株式会社　特許部 ６、補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄。

７、補正の内容 （１）明ＭＥ８２頁４行の’　Ｂ、　Ａｌｔｒｏｃｋ　
」を１ビー。

アルドロック（Ｂ、　Ａｌｔｒｏｃｋ　）　Ｊに訂正す
る。

（２）同書同頁９〜１１行の’　（Ｔｈｅ　Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ　ｏｆ・−Ｈ，Ｍ、　Ｊｏｈｎｓｏｎらは、を「（
イー・デイメイヤー・エッチ・ンユレツケンス編集：ザ
・バイオロン−・才ブ・ザ・インターフェロン・システ
ム（Ｅ、Ｄｅ　Ｍａｙｅｒ　ａｎｄ　Ｈ，５ｃｈｅｌｌ
ｅｋｅｎｓ（ｅｄｉｔｏｒｓ）、　ＴｈｅＢｉｏｌｏｇ
ｙ　　ｏｆ　　ｔｈｅ　　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　　Ｓ
ｙｓｔｅｍ）　　（１９８３年　）１３５頁）ｐ。エッ
チ・エム・ジョンソン（Ｈ，ＭＪｏｈｎｓｏｎ　）らは
、に訂正する。

（３）同書同頁下から７行を１ザ・ジャーナル・オブ番
イミュノロレー（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍ
ｒｎｕ−ロｏｌｏｇｙ）　１２９巻２３５７頁（１９８
２年）、に訂正する。

り４）同書７頁３〜５行の’　Ｅ、　Ｇｒｏｓｓら　　
Ｐｒｅｓｓ　）」を１イー・グロス（Ｅ、　Ｇｒｏｓｓ
　）ら１ザ・ペブタイズ（’ｒｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ
　）　３巻（１９８１年、アカデミンク・ブＬ−ス（Ａ
ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒａｓｓ　）　）　、に訂正す、る
。

（５）同３岡頁７〜８行の’　Ｍ、　Ｂｏｄａｎｓｚｋ
ｙら　　・・５ｏＨ５Ｉｎｃ、　）　Ｊを１エム・ボダ
ンスツキー（Ｍｇｏｄａｎｓｚｋｙ　）ら１ペブタイド
・ンンセシス（Ｐｅｐ−ｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ
）　Ｊ　（１９７６年、ジョン・ウィリー・アンド・ソ
ング（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ）社発行）
、に訂正する。

（６）同書同頁下から４行目の１Ｍｅｒｒ１ｆｉｅ１ｄ
・・・（１９６３）、を１メリフイールＦ　（Ｍｅｒｒ
ｉｆｉｅｌｄ）；ンヤーナル・才プ・ザ・アメリカン・
ケミカル０ソサエテイー　（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔ
ｈｅ　ＡｍｅｒｉｃａｎＣｈｅｍｉｃａｌ　５ｏｃｉａ
ｔｙ）、８５巻２１４９頁（１９６３年）、に訂正する
。

（７）同書９頁下から９．〜１１行の’　Ｙ、　Ｍｉｙ
ａｃｈｉ・・Ｃ１９７２）ｐを１ワイ・ミャチ（Ｙ、　
Ｍｉｙａｃｈｉ　）ら：ザ・ジャーナル・才ブ・クリニ
カル・エンド・クリノａンー・アンド・メタボリスム（
ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｅｎ
ｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄＭｅｔａｂｏｌｉｓｍ
）　３４巻２３頁（１９７２年）」に訂正する。

（８）同書同頁下から６行を１グリーンウツド（Ｇｒｅ
ｅｎｗｏｏｄ　）ら；ザ・バイオケミカル・ジャーナル
（Ｉｈｅ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　
）　８９巻１１４頁（１９６３年）、に訂正する。

り９）同書１５頁下から４行の’　Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ
　Ｊを「キーゼルゲル（Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ　）　、Ｉ
に訂正する。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 下記の一般式で表わされるペプチド 【アミノ酸配列があります】 （式中Ｒは水素またはＴｙｒ−Ｇｌｙ−を表わす。ただ
   し、チロシンは放射性ヨウ素ア標識されていてもよい。 ）