JPS6112683A - イミダゾリド - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
この発明は、新規なイミダゾリドおよびその製造法に関
する。この発明のイミダゾリドは、特にタンパクをカッ
プリング（結合）するための試薬として適しておシ、更
に治療に用いられる細胞毒活性のある抱合体を合成する
際に都合がよい。 この発明の化合物は、以下の一般式で表わされる。 上式中、Ｅは不活性介在分子を示し、ＧはＵ 示す。 こ−こて、使われている「不活性介在分子」という言葉
は、細胞毒性を有する抱合体の合成工程に使われる反応
体に対して不活性な２価の有機原子団を示す。例えば、
炭素数１から１５の直鎖または分校アルキレン基が挙げ
られる。これらは１つ以上の二重結合を有してもよいし
、酸素原子が介在してもよい、またはメチル基、遊離若
しくはエステル化されたカルボキシル基、ジアルキルア
ミン基またはカルバメート基のような１つ以上の不活性
官能基を有していてもよい。同じ語は炭素数６から１５
のアリーレン基も示す。これはアルキレン基について記
したように１つ以上の官能基で置換されていてもよい。 「活性ラジカル」という言葉は、ここでＸに関して使わ
れるが、遊離チオールと反応してＸ−８Ｈの放出を伴な
ってジスルフィドを形成し得る、−５−Ｓ−架橋と結合
している基を指す。適当な活性ラジカルには、１つ以上
のノーロダンまたはアルキル基、カルボキシル基若しく
はアルコキシカルボニル基で置換されているか、置換さ
れていないピリジン−２−イルおよびピリジン−４−イ
ル；置換されていない・、または１つ以上のハロダンま
たはニトロ基、アルコキシ基、カルボキシル基若しくは
アルコキシカルボニル基で置換されていることが好まし
いフェニル基；またはメトキシカルがニルのようなアル
コキシカルボニル基が挙げられる。「アルキル」および
「アルコキシ」という１葉は、炭素原子５個までを含む
基をいう。 「アルキレン」という言葉は、炭素原子１０個までを含
む直鎖または分校の飽和脂肪族原子団を示す。これらは
、アルコキシカルボニル基のような１つ以上の不活性官
能基で置換されていてもよい。 Ｅが上記で定義したようなアルキレン基を指す１式の化
合物がタンノ４り結合用試薬として特に適している。％
Ｅが−（ＣＨ２）、−（ｐは２ないし７）または−〇
−ＣＩ（２−ＣＯＯＨである１式の化合物が好ましい０ 式Ｉで表わされる化合物が特に好ましい。その式中のＥ
は−（ＣＨ２）ｐ−基（ｐは２ないし７の整数）、また
は−ＣＨ−ＣＨ２Ｃ００Ｈ基を示す。またＧは−５−Ｓ
−Ｘ構造の基（Ｘは、１つ以上のノーロダンまたはアル
キル基、カルボキシル基若しくはアルコキシカルボニル
基で置換されているか置換されていないピリジン−２−
イルおよびピリジン−４−イル基；１つ以上の）Ａロケ
９ンまたはニトロ基、アルコキシル基、カルボキシル基
若シくはアルコキシカルボニル基で置換されているか置
換されていないフェニル基；またはアルコキシカルぎニ
ル基から選ばれる活性基）である。 １式の新規化合物は次式（ＩＩ）及び（Ｉ［［）の化合
物を反応させることによって製造される。 Ｇ −Ｅ −Ｃ０ＯＨｎ （上式中、ＧおよびＥは上記で定義した通シである。） この反応は、１０ないし４０℃の温度にて有機溶媒中で
行なう。ジオキサンおよびテトラヒドロフランのような
エーテル型溶媒が特に好ましい。１式の化合物は、以下
に定義するタンＡ／りＡおよびＰのようなタンパクのチ
ロシン残基の水酸基とカップリングする試薬として有用
である。その結果、「治療用新規細胞毒性抱合体とその
製造法」と題するフランス特許出願第８４０９７０３号
の主題である抱合体すなわち免疫毒素が得られる。 これらの免疫毒素は次の統計的一般式に相当する。 ｐ’ −Ｗ −Ａ’ Ｒ１’上式中
、Ｐ′は抗体または抗体の断片であるタンパクのラジカ
ルそれ自体または適宜化学的に修飾したものを示す。す
なわちタン／４’りの様々な基の少なくとも１つが除か
れたシ、他の官能基が任意に保護されている。Ａ′はり
シンのＡ鎖であるタンパクのラジカルそれ自体または適
宜化学的に修飾したものを示す。すなわちタンパクの様
々な基の少なくとも１つが除かれたり、他の官能基が任
意に保護されている。Ｗは、チオエーテル基またはジス
ルフィド基を含む２価の共有結合構造を示す。この場合
ジスルフィド基においては、両イオウ原子は、Ｐおよび
Ａのシスティンのそれか、または両イオウ原子はＰおよ
びＡ若しくはそのいずれかに属する原子団に結合してい
る。この後者の場合、両イオウ原子はＰおよびＡ若しく
はそのいずれかに属する前記原子団に結合している官能
基を有する分子が介在して前記原子団と結合してい・る
。但し、Ｗがジスルフィド基を含む場合、前記ジスルフ
ィド基のイオウ原子の１つがＡのシスティンのうちの１
つに属するものであるときは、他方のイオウはアミン基
以外のタンパクＰの基に結合した官能基を有する介在分
子によシタンパクＰに結合している。 ２つのタンパク間のチオエーテル結合は、次の型である
。 上式中のＺ、ＹおよびＥは以下に定義する。 好ましい免疫毒素は、次の一般式に相当する物質である
。 Ｐ’ −Ｗ −Ａ’ Ｖ上式中の〆およ
びＡ′は上記のとおシである。Ｖは次の群φ上ら選ばれ
る共有結合構造を示す。 （ｃ） Ｚ″−Ｙ−Ｅ −８−８−（Ｅ’ −Ｙ’
−Ｚ’ ）ｎ−または （ｄ） −（ＮＴ（−Ｙ−Ｅ’）ｎ７Ｓ−８−Ｅ−
Ｙ−Ｚ−上式中、２および２′はタンパクＡおよびＰに
属する原子団を示し、１つのチロシン残基の水酸基に由
来する酸素原子、ＡおよびＰのグルタミン酸およびアス
パラギン酸またはそのいずれかの末端ないし遊離カルビ
キシル基の１つに由来のカルブニル基、Ｐの糖鎖を過ヨ
ウ素酸で酸化したあと得られるジアルデヒド構造に由来
の基、および１つのりシン残基のε位のアミンの１つ若
しくはＡおよびＰの末端アミンの１つに由来の一洲一基
から選ばれる。２“は上記の２および２′と同じである
が、−■−ではあシ得ない。ＹおよびＹ“はタンパクＰ
およびへのｚ 、 ｚ’および２／／基のいずれか１つ
と共有結合し得る官能基を示す。Ｅおよびビは不活性な
介在分子を示す。 そして、ｎはＯまたは１である。 上記の免疫毒素は、式■および■で簡略した形で表わさ
れる。しかし、注意しておきたいのは、２価共有結合構
造の−Ｗ−または−Ｗ′−が少なくとも１つの２分子お
よび少なくとも１つのへ分子に結合していることである
。タンノギクＡおよびＰとの結合数は、カップリング操
作に関与するこれらのタン／４’りに属する基の数に応
じて異なる。 例エバ、免疫毒素が、ジスルフィド基を有する２価の共
鳴結合構造を介して天然リシンのＡ鎖と抗体Ｐ（例えば
、ＴｌＯ２抗体）との結合によシ形成されるならば（こ
の場合、ジスルフィド基のイオウの一方はりシンＡ鎖の
２５７番目のシスティンに属するものであシ、もう一方
はオキソプロピル基によって抗体Ｐのチロシン残基のフ
ェノール基の酸素に結合している）、その一般式は次の
ようになる。 Ｐ’（０−Ｃｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−８−８−Ａ’）。 上式中、ｔは結合に関与する抗体（例えば、Ｔ １０１
抗体）中のチロシン残基の数を示す。 この結果書られる免疫毒素は、一般式■に相当する化合
物であって一般式Ｖにおいて以下の定義を有するもので
ある。すなわちｙは上記のとおシであるが、特にはチロ
シン残基のフェノール基が除かれたＴｉＯ２抗体の原子
団を指す。 Ａも上記のとおシであるが、特には２５７番目のシステ
ィン残基のチオール基が除かれたりシンのＡ鎖の原子団
を指す。そしてＷ′は基（ｅ）すなわち −２”−Ｙ−Ｅ−８−８−（Ｅ’−Ｙ’−Ｚ’洩−であ
る。この式中、２“は結合に関与するフェノール性水酸
基の酸素を示し、Ｙは−ＣＯ−１Ｅは不活性介在分子−
ＣＨ２−ＣＨ２−であシ、ｎはＯである。 特に好ましくは、リシンのＡ鎖および抗体単分子Ｐに含
まれる１つ以上の構造によシ形成される免疫毒素が挙げ
られる。それは次の一般式％式％ 上式中、ｐ’、ｗ’およびＡ′は上記のとおシであシ、
ｍは結合に関与するタンパクＰに属する原子団の数を示
す。ｍの数は０．３ないし１２であるが、０．５から１
０が好ましい。「ｍの数が０．３ないし１２であるが、
０．５から１０が好ましい」という表現は、結合が抗体
分子の集団内で均一に生じないため、ｍの値が統計的な
値であるという意味である。したがってｍの数は整数で
なくともよい。特にｍの値は使用される抗体に依存し、
さらに詳しくはその分子量に依存する。抗体断片Ｆａｂ
またはＦａｂ’が出発抗体Ｐとして使われるとなると、
ｍの値は０．３から約２の間となシ得る。Ｆ（ａｂ’）
２が用いられると、ｍは０．３から約２の間にな）得る
。またＩｇＧ型の抗体では、ｍの値は０．５ないし６と
なる。最後に、ＩｇＭ抗体の場合、ｍの値はヱないし１
２の数を取シ得る。、しかし抗体Ｐの置換の程度は、ｍ
の値が０．５以上、１０以下となるようなものにするこ
とが好ましい。 壕だ、すでに説明したように構造■およびＶは簡略化し
た型で記された統計的一般式である。 同様に、以下の一般式％式％および■も統計的一般式で
ある（ｎが１であるときは）。というのも結合性反応体
は、タンパクＰ１およびＰ２の群から調製されるからで
ある。そのＰｌおよびＰ２は、これら自体が抗体Ｐまた
はりシンのＡ鎖のいずれであろうと、抗体Ｐに関して上
記で考慮した特徴と全く同一の特徴を有する。 上記構造式■を有する免疫毒素は、次の方法によって得
られよう。この方法において、直接または介在基を介し
て結合した少なくとも１つの遊離チオール基を有するタ
ンパクＰ、（場合に応じて修飾されているりシンのＡ鎖
または抗体または抗体の断片）を、タンパクＰ、の遊離
チオールと結合してチオールエーテルまたはジスルフィ
ド結合を形成し得る原子団を有する、タンノぐりＰ、と
は異なるタンパクＰ２（リシンのＡｌｔたは抗体または
抗体の断片）と、室温にて水溶液中で反応させる。但し
、ジスルフィド結合が形成される場合にタンノ４りＰ、
がリシンのＡ鎖であるときは、ジスルフィド結合はアミ
ン基以外の前記タンパクＰ２の基との間に形成される。 更に、この発明は好ましくは構造式■を有する免疫毒素
の製造法に関する。ここでは、ｐ／。 Ｗ′お！びＡ′は上記のとおシである。この方法におい
ては、次の一般式 ％式％ で示されるタンパクを次の一般式のタンパクと室温にて
水溶液中で反応させる。 ｐ２／ −２／−τ−Ｅ’−Ｇ ■上式
中、Ｐ、′およびＰ２′はＰｌおよびＰ２の原子団であ
って前記タンパクに属する基に結合している、または抗
体若しくは抗体断片の糖鎖を過ヨウ素酸との反応により
開裂して得られるタンノやりＰ またはＰ２の１つの原
子団である。また２゜ｚ’ 、 ｙ 、 Ｙｌｌ Ｅお
よびビは上記のとおシであり、Ｇは次の基を示す。 丑たはＧは−５−Ｓ−Ｘ基（Ｘは活性基）である。Ｇが
−５−Ｓ−Ｘ基であり、Ｐ１′がリシンのＡ鎖である場
合、ｎは１であるが０であることもある。しかしこの場
合２′は一朋一以外である。 従って、ＰおよびＡ双方゛は、次の基のいづれかを有す
る・ （１） 結合に関与する１個以上のチオール基、およ
び （２）上記チオール基と反応してジスルフィドまたはチ
オエーテル結合を形成し得る１つ以上の官能基。 この明細書では、前記チオール基および官能基は天然の
タンパクＰまたはＡのものであるか、または人工的に修
飾されたものである。 以下に上記のタンノ４りまたはその原子団を表わすため
に使われる記号の意味および様々な記号を表わすのに使
われる表現の意味するところを記載して、内容を明確に
しておく。記号Ｐは、いかなる抗体または抗体の断片す
なわちいかなる免疫グロブリンまたは免疫グロブリンの
断片、またはいかなる分子であってその官能基のいずれ
か１つを人工的に修飾して得られるものをも示す。官能
基としてはそれらタンノックに付いている糖鎖構造を含
む。但し修飾されたタンパクは、細胞とシわけ癌細胞の
表面に存在する特定抗原をなお特異的に認識し得るもの
でなければならない。 記号Ａはタンパクであるが、植物毒素のＡ鎖と称される
サブユニットである。それは天然のりシンから直接得る
こともできるし、このタンパクに付いているいかなる官
能基を人工的に修飾してＡ鎖から由来するいかなる分子
をも示す。 但し、無細胞系において証明できるように、これらのタ
ンｉ４りは真核細胞においてリゲソームのタンパク合成
を阻害するという性質をなお有するものである。 記号Ｖは、上記タンパクＰそれ自体またはそれを適宜化
学的に修飾したものから得られるラジカルを示す。化学
修飾タンパク６には、それからそれ自体の基の１つ以上
が除かれたもの、またそれに他の官能基が任意に保護さ
れているものが含捷れる。 記号Ａ′は、上記タンノ４りＡそれ自体またはそれを適
宜化学的に修飾したものから得られるラジカルを示す。 化学修飾゛タンノリにはそれからそれ自体の基の１つ以
上が除かれたもの、またそれに他の官能基が任意に保護
されているものが含まれる。 記号Ｐ、は、上記のタンパクＡおよびＰの１つを示す。 それは、直接かまたは介在分子を経て上記タンパクに結
合している遊離チオール基を有する。 記号Ｐ２は、Ｐｌとは異なシ、上記のタンノ４りＡおよ
びＰの１つを示す。それは、上記遊離チオール基と結合
し仰る１つ以上の官能基を有する。 記号ｐ １／は、タンパクＰ、に属する原子団、特にＳ
Ｈ基（システィンの） 、ＮＨ２基（タンパクの末端ま
たはりシンのε位）、ＯＨ基（チロシンの）またはＣ０
ＯＨ基（アスパラギン酸およびグルタミン酸の）に結合
し九Ｐ、のラジカルを示す。またはｐ 、／は、Ｐｌが
抗体または抗体断片である場合、過ヨウ素酸との反応に
よシ糖鎖を開裂することによって得られるタンパクＰ、
のラジカルを示す。 記号Ｐ２′は、特徴的な官能基■２（タンパクの末端ま
たはりシンのε位）、ＯＨ（チロシン）またはＣ０ＯＨ
（アスパラギン酸およびグルタミン酸）に結合している
、タンパクＰ２のラジカルを示す。 例を挙げると、Ｐ、’−８Ｈは、システィンのＳＨ基が
そのままで他の官能基が場合に応じて保〜− 護きれているタンパクＰ、（抗体または抗体断片Ｐ−１
’だはりシンのＡ鎖）を示す。 同様に、ｐ１’−ｃｏ−は、末端カルブキシ基、または
そのグルタミン酸およびアスパラギン酸のカルボキシル
基がＳＲ基を人工的に導入する基と結合されたタンノ千
りＰｌを示す。 更にＰ、２’−Ｎｕ−は、末端アミノ基またはりシンの
アミン基がタンパクＰ１のチオール基と結合し得る基に
付いているタンノ（りＲ２（抗体または抗体断片Ｐまた
はりシンのＡ鎖）を示す。 ＹおよびＹに関して用いられている「共有結合し得る官
能基」という用語は、タンパクＰ。 およびＲ２に属する基と反応して共有結合を形成し得る
原子団（基）を指す。例えば、−ＣＯ−基および−（Ｃ
＝ＮＴ（）−基は、タンパクの遊離アミン、チオールお
よびフェノール性水酸基と反応し得る官能基として適し
ている。同様に−Ｍ−基は、ＰｌまたはＲ２が抗体また
は抗体断片のとき、過ヨワ素酸で酸化した後タンパクＰ
１またはＲ２の糖鎖構造の２つの炭素原子と結合し得る
官能基−とじて適している。 「タンパクに属する原子団」という用語は、ここではｚ
、 ｚ’および２“に関して用いられているが、タン
パクＰ１およびＲ２を形成しているアミノ酸の特徴的な
原子団に由来する原子団のこトラ指す。例えばチロシン
およびセリンの水酸基由来の酸素原子、アスパラギン酸
およびグルタミン酸の末端カルボキシル基すなわち遊離
カルボキシル基由来のカル？ニル基、タンノヤクの末端
アミノ基またはりシンのアミノ基由来のべ徂−基、まだ
はシスティンのチオール基由来のイオウ原子が挙けられ
る。同じ用語は、ＰｌまたはＲ２が抗体または抗体゛断
片の場合、過ヨウ素酸処理によシタンノｅりＰｌまたは
Ｒ２の糖鎖の１つを酸化したのち徊られるジアルデヒド
構造由来の基をも指す。 純粋なりシンのＡ鎖の製造は、この発明の生成物を得る
ために必要であるが、米国特許第４．３４０，５３５に
記載されている。ヒト癌細胞を標的としたモノクローナ
ル抗体の製造法は科学文献に広く記載されておシ、今や
これらの多くは市販品として手に入る。 抗体（または抗体断片）とりシンのＡ鎖との化学的結合
はこの発明の方法によシ実施でき、この方法は次の特徴
を有する。 （１） 包合体の２つの成分すなわち抗体とりシンの
Ａ鎖の各生物学的活性を保持する。 （２ン この方法で充分な再現性が得られ、また高い
収率が保証される。 （３）得られる包合体中のりシンＡ鎖と抗体の比の値を
調節することを可能にする。 （４）安定で水溶性の生成物が調製できる。 これらの特徴を有する工程の中で２つのタンパクを結合
させるために１つ以上のチオール基が関与するものが好
ましい。事実、これらのチオール基は、ジスルフィド結
合またはチオエーテル結合を形成させるために特に適し
ている。 これらの双方は上記の一般的条件を充す。 一般に、タンパク間の結合を成功させ、特に無秩序な架
橋を生じさせないために、結合させる一方のクンｉ、ｅ
りにだけにひとつまたひとつ以上のチオール基を導入す
ることが重要である。 他方のタン・４りは、ｐＨ５ないし９の水性溶媒中で３
０℃を越えない温度にてチオール基と反応して安定な共
有結合を形成し得る１つ以上の基を備えているだけであ
る。出発物質として使用するタンノククＰ１およびＲ２
の特徴は以下で詳細に記載する。介在分子Ｅは好ましい
分子ＲからＲ８と置換させることができる。これｔ／′
ｉ笑施例に述べる。 ■、タンパクＰ１ このタンパクは、どんな場合も結合に関与する１つか１
つ以上のチオール基を有している、ので、生じる状況は
タンパクＰ、の性質に応じて異なる。 Ａ）天然の状態でタンノぞりＰ、は、タンパクＰ２との
結合に関与する１つ以上のチオール基を有している。こ
のことは特に次のような場合に言える。すなわち、タン
パクＰ、が、ペゾシンの存在下で抗体を限定分解し、続
いて高分子間のジスルフィド結合を還元して通常得られ
るよう’ｊＦ（ａｂ）’として知られる抗体断片である
場合である。このことは、タンノ母りＰ、かりシンのＡ
鎖またはＡ鎖の誘導体である場合にもあてＩ′ｉまる。 この場合、天然リシンの１７１番目のシスティン残基お
よム２５７番目のシスティン残基に付いている少なくと
も１つのチオール基が未結合であって化学結合を生じや
すい。これらすべての場合において、天然のチオール基
を有するタンパクＰ１はこのような状態で結合工程に使
用される。 Ｂ）天然の状態でタンパクＰ は、タンパクＰ２との結
合に関与するチオール基を有していない。 このことは特に次のような場合に言える。すなわち、タ
ンパクＰ１が天然の免疫グロブリンであって、抗体全体
か抗体の断片時に通常Ｆ（ａｂ）’また１ｄＦ（ａｂ）
と呼ばれる断片の１つである場合。 天然の状態でタンパクＰ１が結合に関与する１つのチオ
ール基を持た力い場合のいま１つの例はこのタンパクＰ
１が、２つのシスティン残基それぞれがアルキル化によ
シ保護されているか、または化学修飾を受けないリシン
のＡ鎖である場合がある。全ての場合において、結合を
可能にする１つ以上のチオール基をそのような分子に導
入することが妥当といえる。 ３つの型の反応がチオール基を導入するために好ましく
用いられる。 （１）最初の型の反応は、Ｓ−アセチルメルカゾトコハ
ク酸無水物との反応である。この酸無水物は、タンパク
のアミン基のアセチル化を可能にする。その後当該−チ
オール基をヒドロキシ。 アミンと反応させることによってアセチル保護基を除く
ことができる。この方法はすてにアーチープズ・オノや
バイオケミストリー・アンド・バイオフィジクス（Ａｒ
ｃｈｌｖ’ｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎ
ｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｌｃｓ） １１９ 、４１−４９
（１９６７）に記載されている。このように保護基が導
入されたチオール基を続いて活性型フスルフィド基と反
応させる場合、ヒドロキシアミンによって前もって保護
基をはずさなくて済む可能性がある。 事実、この発明の物質を形成する反応体を使つてジスル
フィド結合を形成する反応は、遊離チオール基を使った
場合と同様にＳ−アセチル基を使っても生じる。 文献に記載されている他の方法も、修飾されるタンパク
にチオール基を導入するために使うことができる。 （２）第２の型の反応はタンパクをカル？キシル基を介
して以下に示すジスルフィド構造を有する対称的なジア
ミノ分子と反応させることである。 Ｈ２Ｎ−Ｒ４＝Ｓ−８−Ｒ１−ＮＨ２ 上２上、Ｒ１は炭素数２から５の脂肪族原子団である。 この反応では、カルボジイミド特に１−エチル−３ジメ
チルアミノゾロビル−３−カルボジイミドあような水溶
性誘導体の如きカップリング剤の存在下でシスタミンＣ
Ｒ１＝ （ＣＨ２）２−）と反応させ、用いた化学量
論量に応じて次に示す誘導体の１つか双方の混合物を形
成させることが好ましい。 ｐ＜−ｃｏ−ＮＨ−Ｒ，−５−ｓ−Ｒ４−ＮＨ２（■ａ
）Ｐ’、−Ｃｏ−ＮＴ（−Ｒ１−８−３−Ｒ１−ＮＨ−
ＣＯ−Ｐｌ（ｌＶｂ）この型の反応生成物は次の２つの
工程のいずれかに供される。 ａ）式１ａまたはｒｂ において、タンパクＰ１がリシ
ンのＡ鎖またはその誘導体の１種ならば、得られた反応
溶液は分別せずに２−メルカゾトエタノールのような還
元剤との反応に供せられる。それによって次式の１種類
のタン・ぐり誘導体が得られる・ Ｐ’−ＣＯＮＨ−Ｒ１−ＳＲ こうして得られた生成物は続いて透析かグル渥過により
精製される。 ｂ）式■ａおよび■ｂにおいて、ラジカルＰ、′が抗体
またはその断片の１種から成る、タンパクＰのラジカル
ならば、得られた反応溶液はそのままカップリングに用
いられ、その場合チオール／−）スルフィド交換法が用
いられる。 この交換法は、例えばギリランド（Ｇｌ ｌ ｌ ｉ
１ａｎｄ）とコリニー／ｌ／ （Ｃｏ１１ｉｅｒ ）に
よってキャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ５ｅ
ｒｅｈ’）＋ ４０＋ ３５６４（１９８０）に記載さ
れている。 （３）第３の反応は、導入しようとするチオールを有す
るラジカルを固定するために糖鎖単位を使うことでおる
。この糖鎖単位は天然の状態で抗体に存在しているもの
である。続いてタンパクは、糖鎖単位にアルデヒド基を
生じさせるために過ヨウ素酸で酸化される。過剰の工、
チレングリコールを加えて反応を停止させ、副産物と過
剰の反応体を透析によシ除いた後、得られた放生物を次
の一般式を有する対称なジアミノ分子で処理する。 Ｈ２Ｎ−Ｒ４−８−８−Ｒ１−ＮＨ２ 上式上式中上４素数２ないし５の脂肪族基である。得ら
れた付加生成物は、続いて金属水素化物（特には、水素
化ホウ素ナトリウム）との反応によシ第２’ｌ：たは第
３アミンに還元される。 この反応はシスタミンＣＲ１＝−（ｃｕ２）２− ）
を用いて実施することが好ましく、用いた化学量論量に
応じて次式の誘導体の一方かその両方の混合物が形成さ
れる。 ＯＨ ＯＨ Ｑ）（ＯＨ ＯＨリｈ 得られた反応液を、■ａまたはＩｙｂの構造式で表わさ
れる生成物であってＰ、′が抗体または抗体断片である
ものに関して上記したとおシの処理を行なってもよい。 チオール基を人工的に導入（対称なジアミノジスルフィ
ド反応体を使うタイプ）するだめの上に述べた後二者の
反応において、タンパクＰ１は遊離ＳＨ基または遊離ア
ミン基を持たないことが好ましい。Ａ鎖とその誘導体の
場合には、Ｎ−エチルマ、レイミドまたはヨード酢酸の
ようなチオール基に対する通常の試薬との反応によシ天
然のチオール基をアルキル化し、およびミイーンズ（避
ＡＮＳ ）およびフィーニー（ＦｇＥＮＥＹ）によって
バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ）７
．２１９２（’１９６８）に記載された還元的メチル化
法に従って天然のＮＨ２基をメチル化することにより常
に遊離のチオール基を持たなくさせ得る。このようにし
て天然リシンのＡ鎖に１モル当シロ個までのメチル基を
導入することができる。このようにして修飾されたタン
パクには、生物学的な特性（特には、真核細胞の＋７
＆ンームにおけるタン・ぐり合成を阻害する能力）が備
わっている。抗体または抗体断片さらに第１群のすべて
の物質の場合には、前記したようにそれらは天然の遊離
ＳＨ基を持たないので、還元的メチル化を例えばミーン
ズおよびフィーニーの方法によシ実施するほうがよい。 このようにして通常抗体１モル当シ数十のメチル基を導
入することができる。その場合抗体の細胞表面上の抗原
を認識する能力を変化させない。 ■ タンパクＰ２ あらゆる場合、このタンパクは、タンパクＰ１のチオー
ル基と反応してジスルフィドまたはチオエーテル結合を
形成し得る１つ以上の官能基を有するタン・母りである
。これらの官能基゛は、常にタンノ４りＰ２に人工的に
導入されるが、それがジスルフィド結合によシカツノリ
ングされるのかチオエーテル結合によりカップリングさ
れるのかに応じて異なっている。具体的には以下に記載
する。 １）ジスルフィド結合 この場合、包合体の調製は以下の式で表わされる。 Ｐ１’−（Ｚ−Ｙ−Ｅ）ｎ−８Ｈ＋Ｐ２’−Ｚ’−Ｙ’
−Ｅ’−８−８−Ｘ −＋Ｐ１’−（Ｚ−Ｙ−Ｅ）ｎ
−８−８−Ｅ’−Ｙ’−Ｚ’−Ｐ２／ ＋ Ｘ−８Ｈ。 活性イオウ原子によジ置換されるタンパクＰ２はタンパ
クＰ２または適切に保護されたタンパクＰ２から、それ
自体活性イオウ原子を有する試薬による置換によシ得ら
れる。これは次の式％式％ 上式中、Ｐ２は置換されるべきタンパクを示し、Ｌ−Ｙ
’は試薬をタンノククに共有結合させる基を示す。官能
基Ｌ−Ｙ’は、置換されるべきタンパクの構成アミノ酸
の側鎖に付いているいずれか１つの基と共有結合し得る
基である。これらの基の中で、特に次のものが選び出せ
る。 タンパクに含まれるチロシフ残基のフェノール基。この
場合、Ｌ−Ｙ’は特にイミダゾール−１−イルカルボニ
ル基を示すことがある。それは次の式に従ってタンノｆ
りのフェノール基と反応する。 ａ 上式中、Ｌがイミイダソー＃−１−イルで、Ｙ′がｃｏ
基で、Ｒ４が−Ｒ−８−８−Ｘ基である。Ｉａ式の化合
物はこの発明のイミダゾリッドである。 −５−Ｓ−Ｘは遊離チオール基と反応し得る活性型ジス
ルフィドを示す。特に、このジスルフィドにおいて、Ｘ
は１つ以上のアルキル、ハロゲンまたはカルぎキシ基で
置換されていることのあるピリジン−２−イルまたはピ
リジン−４−イル基を指すことがある。Ｘもまた１つ以
上のフェニル基またはカルボキシル基で好ましくは置換
されているフェノール基を指すことがある。また＃′ｉ
ｘはメト中シカ）Ｖボニル基のよりな°アルコキシカル
ビニル基を指すこともある。 Ｒ基は、置換基Ｙ′およびＳ−５−Ｘを同時に結合し得
る介在分子（前式中のＥのような）を示す。 それは、後の反応において、使用される反応物質と合成
される生成物を訪客するような基を含まないようなもの
でなければ々らない。特に、Ｒ基は−（ＣＨ２）−でも
あシ得（ｎは工ないし１０）、また次の基でもあシ得る
。 Ｒ５−ＣＨ−ＣＨ−Ｒ６ 上式中、Ｒ６は水素または炭素数１ないし８のアルキル
基を指し、Ｒ５は続いて使われる次式のカルカルバメイ
ト基のような反応体に不活性な置換基を指す。 一冊−Ｃ−０Ｒ。 上式中、Ｒ７は炭素数１から５の直鎖または分校アルキ
ル基、特に第３ブチル基を示す。化合物Ｌ−Ｙ’−Ｒ−
８−３−ＸとタンパクＰ２との反応は均質な液相、最も
一般的には水または緩衝液中で進行する。反応体の溶解
性を高めるには、水に可溶性の有機溶媒を反応溶液に加
えることができる。 その最終濃度を、第３ブタノールのような第３アルコー
ルの場合には容量比で２０％までにすることができ、ジ
メチルホルムアミドまたはテトラヒドロフランの場合に
は容量比で１０％まで忙することができる。 反応を、室温にて数分から数時間の時間をかけて実施す
る。その後、低分子量の生成物および特には過剰の反応
体を透析またはグル濾過によって除去することができる
。この方法によシ、タンパクり１モルあたｊ５１ないし
１５の置換基を導入することが可能となる。そのような
化合物を用いる場合、タンノｆりＰ、とのカップリング
は、Ｐ［（６から８の溶液中にて３０℃を越えない温度
で、１時間から２４時間かけておこなう。低分子量の生
成物を除くために適宜、得られた水溶液を透析する。つ
いで包合体を既知の方法の変法によシ精製できる。 ２）チオエーテル結合 この場合、包合体をＰ１′−（Ｚ−Ｙ−Ｋ）ｎ−８Ｉ（
と前もって１つ以上のマレイミド基を導入しておいたタ
ンパクＰ２とを反応させることにょシ調製する。１例と
して、反応を次の式で示す。 上式中、Ｒ８は炭素数１ないし１５の脂肪族または芳香
族介在分子を示す。それは続いて使用される反応体に対
して不活卜ある。２は、結合に関与するタンパクＰ２の
官能基の種類に従って変化し得る基を示す。すなわち、
２は、酸素（チロシン残基（チロシン基）のフェノール
基のエステルの場合） 、 ＮＨ（タンパクのアミノ基
と活性型カルボキシル基のカップリングの場合）まだは
１州−ＣＨ２（タンパクのアミン基とクロロメチルケト
ンの場合）である。 マレイミドで置換されたタンパクＰ２は、それ自体マレ
イミド基を有する試薬によってタンノｆりの適当な基を
置換することによって、タンパクＰ２ 自体からまだは
適当に保護されたタンノやりＰ２から得られる。これら
に適した基のうち、特に次のものが選ばれる。 タンパクに含まれるチロシン残基のフェノール基。この
場合、マレイミド基を有する試薬は次の一般式Ｉｂ’（
すなわち、この発明のイミダゾリド）で示される。 これは次の反応式に従ってタンパクのフェノール基と反
応する。 マレイミドを有する試薬とタンパクＰ２ との反応は均
質な液相、最も一般的には水または緩衝液中で進行する
。反応体の溶解性を高めるには、水に可溶性の有機溶媒
を反応溶液に加えることができる。その最終濃度を、第
３ブタノールのような第３アルコールの場合には容量比
で２０チまでにすることができ、ジメチルホルムアミド
またはテトラヒドロフランの場合には容量比で１０チま
でにすることができる。 反応は室温にて数分から数時間かけておこなう。そのよ
うな化合物を使うと、タンパクＰ１とのカップリングは
、ｐＨ６ないし８の水溶液中にて３００を越えない温度
で１時間ないし２４時間かけて、２つのタンノ４りを混
合することによっておこなわれる。得られた溶液を低分
子量の生成物を除くため適宜透析し、続いて包合体を′
既知の様々な方法によシ精製できる。 式■の生成物は次式の生成物と前記１式の化合物とを反
応させて得られる。 Ｐｌ２−ＯＨ 上１式中 ＰＳは上述したとおシであシ、水酸基はＰ“
２のチロシンから欠失するフェノール性水酸基を示す。 この発明のイミダゾリドは、タンノ母りＰｌ およびＰ
２のカップリング試薬として適している。 それらを用いれば次式で表わされる新規化合物が得られ
る。 Ｐ”２−Ｏ−Ｃｏ−Ｅ−Ｇ
■反応は、１０々いし４０℃の温度でジオキサンまたは
テトラヒドロフランの如きエーテル溶媒のような水に可
溶性の有機溶媒を任意に含む水溶性溶媒中にて行々う。 次に示す実施例により、この発明がよりはっきシと分か
るであろう。しかしこの発明の範囲はこれに限定されな
い。すべての実施例において、記載される包合体の調製
法は、米国特許第４．３４ｏ、５３５号に記載されてい
る方法によシ得られたような天然型のりシンのＡ鎖を用
いたものである。 これら実施例では次のような抗体が使用される。 ０ヒトＴリンパ球や多種ヒトＴリン−母系白血病細胞上
に存在する抗ｉ Ｔ６５に対するモノクローナル抗体Ｔ
１０１゜この抗体は、ジャーナル・オブ・イムノロジー
（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ）’ ）
＋１２５（２）、７２５−７２７（１９８０）に記載
されている。これは、ハイプリチク社（ＨＹＢＲＩＴＥ
ＣＨＩｎｃ・）（米国、カリフォルニア州、サンディエ
デ）から入手できる。 Ｏマウスリンツク球上の’ｒｈｙ １．２抗原に対する
モノクローナル抗体ＡＴ１５Ｅ０この抗体は、ジャーナ
ル・オプ・イムノロシー（Ｊｏｕｒｎａｎｌ ｏｆＩｍ
ｍｕｎｏｌｏｇｙ）、１２２．２４９１−２４９８（１
９８１）に記載されているものであシ、ハイツリドーマ
（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ） 、 １（１）、 １３−１
７（１９８１）に記載のハイツリドーマから得られる。 ０抗−ＤＮＰモノクローナル抗体。 実施例 実施例Ｉ Ｐｌは、アミンを介して導入されたＳＨ基を有するＴｉ
Ｏ２抗体。 −Ｐ２は、チロシンの水酸基を介して導入された活性型
ジスルフィド基を有するリシンのＡ鎖。 （４） カップリング試薬の調製 カップリング試薬には、３−（ピリジン２イルジスルフ
アニル）プロピオン酸（ＰＤＰＡ）カラ誘導したイミダ
ゾリドを用いた。このイミダゾリドはＰＤＰＡとカルボ
シイミダゾール（ＣＤＩ ）とからｌ工程で得られた。 一一一一一一一〉 ＰＤＰＡ４３０１＃をＴｕＦ２ｍＡ！ｌｃｔ！解した。 ＣＤＩ４０５′ｍ９をこの溶液に加えた。この混合物を
、２５℃にて１５分間攪拌したところ炭酸ガスが発生し
た。この反応溶液を精製せずに直接かつ迅速罠使用した
。 調製 １） Ｎ−エチルマレイミドによる天然チオール基の
保護 リシンＡ鎖の濃度８ｒｖ／ｍｌの水溶液１５ｄ（Ａ鎖４
．１マイクロモル）を終濃度１チとなるように２−メル
カノトエタノールの水溶液で処理した。その水溶液を１
時間静置し、続いてｐ）１７の１２５ ｍＭ ＩＪン酸
緩衝液に対して連続的（３００＋＋＋ｌ／時の速さで４
０時間）に透析した。 エルマンの方法〔メソトーイン・エンサイモロジー（Ｍ
ｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ） 、 ２
５ 、４５７（１９７２）］を用いるとりシンＡ鎖１モ
ル当りＳＨは０８ｇ当量であった。このＳＨ基をメソッ
ド・イン・エンサイモロジー、１１，５４１（１９６７
）に記載の方法によＪＮ−エチルマレイミドで保護した
。この際、前段階で得られたりシンＡ鎖を、Ａ鎖１モル
当り２０当量のＮ−エチルマレイミドノ存在下で３０℃
にて２時間インキ−ベートした。過剰の試薬をｐｉ（７
の１２′５ｍＭリン酸緩衝液に対して連続的（５ｏｏｍ
ｉ７時の速さで２０時間）に透析して除いた。この結果
、リシンＡ鎖濃度７ダ／ｄの浴液１３ｄを得た。これに
は、エルマンの試薬で測定し得るチオール基はもはや存
在しなかった。このようにして得られた生成物を以後Ａ
＠（ＮＥＭ ）と呼ぶ。 ２）チロシンの修飾 ＴＪ（Ｆ Ｋ溶解したカップリング試薬３００−ｒイク
ロモルｔ＝、 １８ｍ９（ｏ、６マイクロモル）のＡ鎖
（ＮｚＭ）をｐＨ７の１２５ｍＭのリン酸緩衝液１０ｄ
に溶かした溶液に滴下した。反応溶液を２５℃にて１５
分間攪拌した。過剰の試薬を除くためにｐＨ７の１２５
ｍＭリン酸緩衝液に対して透析して精製した。午の結果
、タン・母り濃度１、５５ ｍ９７ ｍｌの修飾Ａ鋼溶
液９．５コを得た。２−メルカゾトエタノールとの交換
反応により放出されるピリジン２−チオンを３４３ｎｍ
Ｋて分光測定法で解析したところ、得られた修飾Ａ鎖（
ＮＥＭ ）は１分子当り１．６個の活性基を有している
ことが分った。 （Ｃ） 修飾抗体の調製 ＤＭＦに濃度１７０ｍ９／ｍＪとなるように溶かしたＳ
ＡＭＳＡのＤＭＦ 溶液２５ｐｌを、濃度９ ｍ９／ｍ
ｌのＴｉＯ２抗体溶液４５ゴ（０，３マイクｐモ／１／
）に加えた。その混合物を４℃にて２時間攪拌し、続い
て試薬を除くために２４時間ＰＨ７の１２５ｍＭリン酸
緩衝液に対して連続的（４００ｍｌ！／時）透析し、精
製した。この結果、ＩＦｎｌ当、９８．６ｍ９の修飾抗
体を含む溶液４． Ｉ ＷＬｌを得た。ヒドロキシアミ
ン塩酸塩の０．５Ｍ溶液０．６４ｄをこの抗体溶液に加
えた。３０℃にて１時間インキュベーションしたのち、
試薬を除くために２４時間ｐＨ７の１２５ｍＭリン酸緩
衝液に対して透析し。 精製した。エル、マンの方法により遊離したＳＨ基を分
光測定法で解析したところ、得られた抗体は１分子当シ
５個の活性基を有していることが分った。 （２）免疫毒素の調製 修飾されたりシンＡ鎖溶液’ ２ｒｎ！！（０，２７−
ｒイクロモル）を、上記で得られた活性型抗体の溶液２
．１１ｄ（０，１１マイクロモル）に加えた。 続いて、その混合物を３０℃にて５時間インキーペーシ
ョンした。この反応溶液を、実施例１に記載した方法通
シセファデックスＧ１００を詰めたカラム上でダル濾過
して精製した。この結果、濃度１．１ダ／ＷＬｌの免疫
毒素溶液１７ｍ１（１８，７１ｎ９）を得た。コノ溶液
は、１ｒｎｌ当シ修飾されたＡ鎖（ＮＥＭ ） ０．３
２１＃を含んでいた。 従って、この調製物のカップリングの程度は、抗体１分
子当ｆｉＡ鎖（ＮＥＭ ） ２であった。 ′この結果
、前記Ｈ式゛の免疫痒素が得られた。 この式中で。 Ａ′は、ＳＨ基がＮ−エチルマレイミドで保護されたり
シンＡ鎖のラジカル。 Ｐ′は、ＴｉＯ２抗体のラジカル。およびＷ′は、次の
式で示される原子団。 −（ＮＨ−Ｙ’−Ｅ’）ｎ−８−３−Ｅ−Ｙ−Ｚ−上式
中。 ・Ｙ′は−ＣＯ− ・Ｅ′は−ＣＩ−１２０Ｈ２− ・Ｅは一〇）Ｉ− ＣＨ２Ｃ００Ｈ ・Ｙは−Ｃ〇− ・ ２は一〇− ・ｎは１゜ （ト）免疫毒素活性試験 ６０ Ｓ リポソームサブユニットを分解スルコとによ
って真核細胞のタンパク合成を阻害することが、リシン
Ａ鎖の基本的な生物学的特性である。従って無細胞系（
テスト−１）または有細胞系（テスト−２）でタンパク
合成の阻害を調べる試験を行なった。 １）無細胞系（テスト−１） この生体外の実験法においては、適当に改良したラット
肝の細胞レベル以下の画分てあって人工メツセンジャー
ＲＮＡ （ポリウリジル酸）の存在下で１４Ｃ−７エニ
ルアラニンを取込むことができるものを用いた。細胞レ
ベル以下の画分の調製のため、および Ｃ−フェニルア
ラニンの取込みの測定のために使用した方法は、ノ９イ
オケミカ・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｃａＢｉｏｐｈｙａｉｃａ Ａｃｔａ ）、 ３１２．
６０８−６１５（１９７３）に記載された方法を応用し
たものである。それには。 ミクロゾーム画分と細胞質両分の両方を用いた。 Ａ鎖を含む試料をｐＨ７，６の５０ｒｆ１Ｍトリス塩酸
緩衝液（０，２ｑ６の２−メルカプトエタノールおよび
１５ｑ／Ｉｎｌのウシ血清アルブミンを含む）中に導入
した。得られた計数を計算（阻害剤を含まない対照溶液
を比較として）し、リシンＡ鎖を含む各反応溶液に対し
てタンパクへの１４ｃｍ’フェニルアラニンの取込みの
阻害率を求めた。 これらの値から、この実験条件下で Ｃ−７エニルアラ
ニンの取込みを５０％阻害するりシンＡ鎖の濃度（工Ｃ
３ｏ）を求めることができた。 ２）有細胞系（テスト−２） この試験では、培養癌細胞中への１４Ｃ−ロイシンの取
込みを−測って、その物質の効果を調べた。使用した細
胞は、免疫毒素を調製するために選ばれた抗体の特異性
に依存した。この実施例では、通常Ｔ６５抗原を有する
ＯＥＭヒドリン・母芽球様の細胞を使用した。この細胞
を、測定すべき物質の製剤の存在下でインキ−ベートし
た。 そして、インキーベーションを終えてから、その細胞が
１４０−ロイシンをどの程度耽込む、かを調べた。この
測定に使用した手法は、ジャーナル・オプ・バイオロジ
カル・ケミストリー、（Ｊ。 Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）、２４９（１１）、３５５７−
３５６２（１９７４）に記載の方法を応用し牟ものであ
る。すなわちトレーサーとして１４ｃ−ロイシンを用い
、タン・ぐり合成の程度を測定した。取込まれだ放射線
活性は、ここではグル濾過で単離した完全な細胞に関し
て測定した。この方法に基づくと、投与量−作用曲線（
横軸に被験物質の濃度を取り、縦軸に被験物質存在下で
対照細胞の Ｃロイシンの取込に対するパーセントで表
わした１４Ｃ−ロイシンの取込みを取る）を作製するこ
とができる。このようにして、各被験物質に対して。 １４０−ロイシンの取込みを５０パーセント阻害する濃
度、す々わち「５０チ阻害濃度」（Ｉ′Ｃ５゜）を求め
ることができる。完全細胞の Ｃロイシンの取込みを測
定すれば、従来のタン・ｆり合成の測定法によって得ら
れる結果と一致する■Ｃ５ｏを決定できることも調べた
。 ３）結果 ａ・ テスト−１（無細胞系） 修飾Ａ鎖の阻害活性を測定した。工Ｃ５ｏは３、６ Ｘ
１０”１０モル／ｌとなった。この実験で対照Ａ鎖の
工Ｃ５ｏは１．２ Ｘ １０”モル／ｌであった。 従って、修飾してもＡ鎖の活性はあまシ減少しない。 ｂ、テスト−２（有細胞系） 活性剤（５０ｎＭモネンシン）存在下での工Ｃ５゜は、
１．２ Ｘ １０”１２モ）Ｌ／／ノであった。この値
は、Ａ鎖のそれ（■Ｃ５ｏは６ Ｘ １０−８モル／７
）よシ５×１０ 倍高いことを示している。 実施例２ Ｐｌは、アミンを介して導入されたＳＲ基を有するＴｉ
Ｏ２抗体。 Ｐ２は、チロシンの水酸基を介して導入された活性型マ
レイミド基を有するリシンのＡ鎖。 （４） カップリング試薬の調製 カップリング試薬にはマレイミドカシロン酸から誘導し
たイミダゾリドを用いた。このイミダゾリドはマレイミ
ドカシロン酸とカルがジイミドから１工程で得られた。 マレイミドカプロン酸４２２■ヲＴＨＦ２１７！に溶解
した。ＣＤＩ ４０５〜をこの溶液に加えた。 この混合物を、室温にて１５分間攪拌したところ炭酸ガ
スが発生した。この反応浴液を精製せずに直接に使用し
た。 調製 １）Ｎ−エチルマレイミドによる保護 実施例１に同じ。 ２）チロシンの修飾 ＴＨＦに溶解したカップリング試薬３９０マイクロモル
ヲ、１８ｍ９ （０，６マイクロモル）（７）Ａ鎖（Ｎ
ＥＭ ）をｐＨ−７の１２５ｍＭのリン酸緩衝液１０ｒ
ｎｌに溶かした溶液に滴下した。反応溶液“を２５℃に
て１５分間攪拌した。過剰の試薬を除くためにｐＨ７の
１２５’ｍＭ ＩＪン酸緩衝液に対して透析して精製し
た。、この結果、タンパク濃度１、４５１１１１１／
ｒｎｌノ修飾Ａ鎖溶液２０ｍ１を得た。 Ｃ−システィンによるマレイミド基を測定したところ、
得られた修飾Ａ鎖（ＮＥＭ ）は１分子当り１個の活性
基を有していることが分った。 実施例１に同じ。 修飾されたりシンＡ鎖溶液５．８Ｍ（０，２８マイクロ
モル）を、上記で得られた活性型抗体の溶液２，１ｍｌ
（Ｑ、１１マイクロモル）に加えた。 続いて、その混合物を３０℃にて１時間インキュベーシ
ョンした。残ったマレイミド基を５マイクロモルのシス
ティンで保護した。３０℃にて１時間インキーペーショ
ンし、この反応混合物を、実施例１に記載した方法通シ
セファデックスＧ１００を詰めたカラム上でダル濾過し
て精製（−だ、この結果、濃度１．ｃ）５ｍｔｉ／ゴの
免疫毒素溶液１．９．５ｍｌ （２０，５ｍ９）を得た
。コノ溶液は、ｌ ｍｌ当シ修飾され九Ａ鎖（ＮＥＭ
） ０．３１ ｍ９を含んでいた。従って、この調製物
のカンプリングの程度は、抗体１分子当りＡ鎖（ＮＥＭ
） ２であった。 この結果、前記Ｈ式の免疫毒素が得られた。 この式中で− Ａ′は、 ＳＲ基がＮ〜エチルマレイミドで保護された
りシンＡ鎖のラジカル。 Ｐ′は、ＴｉＯ２抗体のラジカル。および、Ｗ′は、次
の式′−で示される原子団。 上式中、 ・Ｚ′は一朋一 ・Ｙ′は−ＣＯ− ・Ｅ′は−ＣＨ− ＣＨ２Ｃ０ＯＨ ・Ｅは−ＣＨ２−ＣＨ２− ・Ｙは−ＣＯ− ・２は一〇− ・ｎは１゜ （匂“活性試験 ａ、テスト−１（無細胞系） 修飾されたＡ鎖の阻害活性を測定した。工Ｃ５゜は１（
ＩＸＩＯモル／ｌであった。この実験で、対照のＡ鎖の
ＩＣ５ｏは１． Ｉ Ｘ １０””モル／ｌであった。 活性がかなシ消失しているものの、修飾Ａ鎖のタンパク
合成阻害能はまだ高かった。 ｂ、テスト−２（有細胞系） 実施例１と同じ条件下で試験を実施した。活性剤（５０
℃Ｍモネンシン）存在下でのＩＣ５ｏは３’Ｘ１Ｏ−１
１モル／ｌであった。この値は、Ａ鎖のそれ（ＩＣ５ｏ
は６ Ｘ １０−８モル／ｌ）よシ３×１０’倍高かっ
た。 実施例中 Ｐｌは、天然状態のりシンＡ鎖。 Ｐ２は、チロシンの水酸基を介して導入された活性型ノ
スルフィド基を有するＴｉＯ２抗体。 （Ｎ カップリング試薬の調製 実施例１に同じ。 （Ｂ） 修飾抗体の調製 ２倍希釈した前記ＴＨＦ溶液３４μｍ３ （ＩｇＧ濃度
は２００当量１モル）を、ＴｉＯ２抗体１２．８■を１
．８ｍｌのｐＨ７の１２５ｍＭリン酸緩衝液に溶かした
溶液に滴下した。この反応溶液を室温にて１５分間攪拌
し、続いて透析によシ精製したところ、濃度４．５５り
／ゴの修飾抗体の溶液２．６ｍｌを得た。２−メルカゾ
トエタノールとの交換反応によシ放出されたピリジン２
−チオンを３４３ｎｍで分光測定法によ如解析したとこ
ろ５得られた抗体は１分子当り２．２個の活性基を有し
ていることが分った。 濃度４．５５ ｍｑ ／ ｍｌの活性型抗体の浴液２．
５ ｔｎｌ（０，０７５ｒイクＣＩ％ル）を、濃度７．
１ｍ！７／ｌｌｌ１のりシンＡ鎖の溶液７５０μｍ３（
０，１７７マイクロモル）に加えた。続いて、その混合
物を２５℃にて１８時間インキーベーションした。この
反応混合物を、実施例１に記載した方法通シセファデノ
クスＧＩＯＱを詰めたカラム上でグル濾過して精製した
。この結果、濃度０．８ｍ９７ｍ１の溶液１３ｍ１（１
０，４１ｎ９’）を得だ。この溶液は、ｌ ｍｌ当ｐｈ
鎖（ＮＥＭ ） ０．２■を含んでいた。従って、この
調製物のカップリングの程度は、抗体１分子当りＡ鎖（
ＮＥＭ ） １．５であった。 この結果、前記■式の免疫毒素が得られた。 この式中で、 Ａ′は、リシンＡ鎖のラジカル。 Ｐ′は、Ｔ１０１−抗体のラジカル。および、Ｖは、次
の式で示される原子団。 −Ｚ’−Ｙ−Ｅ−８−８− （Ｅ’−Ｙ’−Ｚ’） −
上式中、 ・ ｚ〃は、−〇− ・Ｙは、−ＣＯ− ・Ｅは、−ＣＨ２−ＣＨ２”− ’ｎば、録綽；τ− −ｍに、１．５ （Ｄ） 活性試験 テスト−２（有細胞系） 実施例１と同じ条件下で試験を実施した。活性剤（５０
ｎＭモネンシン）存在下でのＩＣ５ｏは３、５ Ｘ Ｉ
Ｆ”モル／ｌであった。この値は、その細胞毒活性が
Ａ鎖のそれ（工Ｃ５ｏは０．６ 、Ｘ １０−８−ｔ＋
／Ｌ）よ＃）１．５×１０５倍高かった。 実施例４ Ｐ、は、天然状態のりシンＡｉ。 Ｐ２ｉｄ、チロシンの水酸基を介して導入されたマレイ
ミド基を有するＴ１０１抗体。 （４） カップリング試薬の調製 実施例２に同じ。 （Ｂ） 修飾抗体の調製 ２倍希釈した前記ＴＨＦ溶液３４μｌ（ＩｇＧ濃度は２
００当量１モル）を、Ｔ１０１抗体１２，８■を１．８
麻のＰＨ７の１２５ ｍＭ リン酸緩衝液に溶かした溶
液に滴下した。この反応溶液を室温にて１５分間攪拌し
、続いて透析によシ精製したところ、濃度４．５η／ｍ
ｌの修飾抗体の溶液２．６Ｎを得た。 Ｃ−システィン
によるマレイミド基を測定したところ、得られた抗体は
１分子当シ４個の活性基を有していることが分った。 （Ｃ） 免疫獣素の調製 濃度４．５ ｍ９／ｍｌの活性型抗体の溶液２．５ ｍ
ｌ（０，０７５マイクロモル）を、濃度７．１４包のり
シンＡ ｓの溶液８５０μｌ（０，２０マイクロモル）
Ｋ加えた。続いて、その混合物を２５℃にて１時間イン
キュベーションした。残ったマレイミド基を６マイクロ
モルのシスティンで保護した。この反応混合物を、実施
例１に記載した方法通シセ７アデックスＧ１００を詰め
たカラム上でグル濾過して精製した。この結果、濃度０
、７６ ｍｙ／縦の免疫毒素溶液１１絞（１’０．４９
）を得た。この溶液は、ｌ ａｔ当ｐＡ鎖（ＮＦ、Ｍ）
０．２９ｍｇを含んでいた。従って、この調製物の平均
のカップリングの程度は、抗体１分子当、９Ａ鎖（ＮＥ
Ｍ） ３であった。 この結果、前記■式の免疫毒素が得られた。 この式中で、 Ａ′は、リシンＡ鎖のラジカル。 Ｐ′は、Ｔ１０１抗体のラジカル。および、Ｗ′は、次
の式で示される原子団。 上式中、 ｏｚは、−〇− ・Ｙは、−ＣＯ− ・Ｅは、−（ＣＨ２）５− ・ｎは、μ拘；ｌキ − Ｉｎは、３ い）活性試験 テスト−２（有細胞系） このテストは、実施例１と同じ条件下で実施した。活性
剤（５０ｎＭモネンシン）存在下でのＩＣは１．７ Ｘ
１０−１２モル／ｌであった。このイ直は、同実験に
おいてＡ鎖のそれより３×１０倍高〃１つだ・
する。この発明のイミダゾリドは、特にタンパクをカッ
プリング（結合）するための試薬として適しておシ、更
に治療に用いられる細胞毒活性のある抱合体を合成する
際に都合がよい。 この発明の化合物は、以下の一般式で表わされる。 上式中、Ｅは不活性介在分子を示し、ＧはＵ 示す。 こ−こて、使われている「不活性介在分子」という言葉
は、細胞毒性を有する抱合体の合成工程に使われる反応
体に対して不活性な２価の有機原子団を示す。例えば、
炭素数１から１５の直鎖または分校アルキレン基が挙げ
られる。これらは１つ以上の二重結合を有してもよいし
、酸素原子が介在してもよい、またはメチル基、遊離若
しくはエステル化されたカルボキシル基、ジアルキルア
ミン基またはカルバメート基のような１つ以上の不活性
官能基を有していてもよい。同じ語は炭素数６から１５
のアリーレン基も示す。これはアルキレン基について記
したように１つ以上の官能基で置換されていてもよい。 「活性ラジカル」という言葉は、ここでＸに関して使わ
れるが、遊離チオールと反応してＸ−８Ｈの放出を伴な
ってジスルフィドを形成し得る、−５−Ｓ−架橋と結合
している基を指す。適当な活性ラジカルには、１つ以上
のノーロダンまたはアルキル基、カルボキシル基若しく
はアルコキシカルボニル基で置換されているか、置換さ
れていないピリジン−２−イルおよびピリジン−４−イ
ル；置換されていない・、または１つ以上のハロダンま
たはニトロ基、アルコキシ基、カルボキシル基若しくは
アルコキシカルボニル基で置換されていることが好まし
いフェニル基；またはメトキシカルがニルのようなアル
コキシカルボニル基が挙げられる。「アルキル」および
「アルコキシ」という１葉は、炭素原子５個までを含む
基をいう。 「アルキレン」という言葉は、炭素原子１０個までを含
む直鎖または分校の飽和脂肪族原子団を示す。これらは
、アルコキシカルボニル基のような１つ以上の不活性官
能基で置換されていてもよい。 Ｅが上記で定義したようなアルキレン基を指す１式の化
合物がタンノ４り結合用試薬として特に適している。％
Ｅが−（ＣＨ２）、−（ｐは２ないし７）または−〇
−ＣＩ（２−ＣＯＯＨである１式の化合物が好ましい０ 式Ｉで表わされる化合物が特に好ましい。その式中のＥ
は−（ＣＨ２）ｐ−基（ｐは２ないし７の整数）、また
は−ＣＨ−ＣＨ２Ｃ００Ｈ基を示す。またＧは−５−Ｓ
−Ｘ構造の基（Ｘは、１つ以上のノーロダンまたはアル
キル基、カルボキシル基若しくはアルコキシカルボニル
基で置換されているか置換されていないピリジン−２−
イルおよびピリジン−４−イル基；１つ以上の）Ａロケ
９ンまたはニトロ基、アルコキシル基、カルボキシル基
若シくはアルコキシカルボニル基で置換されているか置
換されていないフェニル基；またはアルコキシカルぎニ
ル基から選ばれる活性基）である。 １式の新規化合物は次式（ＩＩ）及び（Ｉ［［）の化合
物を反応させることによって製造される。 Ｇ −Ｅ −Ｃ０ＯＨｎ （上式中、ＧおよびＥは上記で定義した通シである。） この反応は、１０ないし４０℃の温度にて有機溶媒中で
行なう。ジオキサンおよびテトラヒドロフランのような
エーテル型溶媒が特に好ましい。１式の化合物は、以下
に定義するタンＡ／りＡおよびＰのようなタンパクのチ
ロシン残基の水酸基とカップリングする試薬として有用
である。その結果、「治療用新規細胞毒性抱合体とその
製造法」と題するフランス特許出願第８４０９７０３号
の主題である抱合体すなわち免疫毒素が得られる。 これらの免疫毒素は次の統計的一般式に相当する。 ｐ’ −Ｗ −Ａ’ Ｒ１’上式中
、Ｐ′は抗体または抗体の断片であるタンパクのラジカ
ルそれ自体または適宜化学的に修飾したものを示す。す
なわちタン／４’りの様々な基の少なくとも１つが除か
れたシ、他の官能基が任意に保護されている。Ａ′はり
シンのＡ鎖であるタンパクのラジカルそれ自体または適
宜化学的に修飾したものを示す。すなわちタンパクの様
々な基の少なくとも１つが除かれたり、他の官能基が任
意に保護されている。Ｗは、チオエーテル基またはジス
ルフィド基を含む２価の共有結合構造を示す。この場合
ジスルフィド基においては、両イオウ原子は、Ｐおよび
Ａのシスティンのそれか、または両イオウ原子はＰおよ
びＡ若しくはそのいずれかに属する原子団に結合してい
る。この後者の場合、両イオウ原子はＰおよびＡ若しく
はそのいずれかに属する前記原子団に結合している官能
基を有する分子が介在して前記原子団と結合してい・る
。但し、Ｗがジスルフィド基を含む場合、前記ジスルフ
ィド基のイオウ原子の１つがＡのシスティンのうちの１
つに属するものであるときは、他方のイオウはアミン基
以外のタンパクＰの基に結合した官能基を有する介在分
子によシタンパクＰに結合している。 ２つのタンパク間のチオエーテル結合は、次の型である
。 上式中のＺ、ＹおよびＥは以下に定義する。 好ましい免疫毒素は、次の一般式に相当する物質である
。 Ｐ’ −Ｗ −Ａ’ Ｖ上式中の〆およ
びＡ′は上記のとおシである。Ｖは次の群φ上ら選ばれ
る共有結合構造を示す。 （ｃ） Ｚ″−Ｙ−Ｅ −８−８−（Ｅ’ −Ｙ’
−Ｚ’ ）ｎ−または （ｄ） −（ＮＴ（−Ｙ−Ｅ’）ｎ７Ｓ−８−Ｅ−
Ｙ−Ｚ−上式中、２および２′はタンパクＡおよびＰに
属する原子団を示し、１つのチロシン残基の水酸基に由
来する酸素原子、ＡおよびＰのグルタミン酸およびアス
パラギン酸またはそのいずれかの末端ないし遊離カルビ
キシル基の１つに由来のカルブニル基、Ｐの糖鎖を過ヨ
ウ素酸で酸化したあと得られるジアルデヒド構造に由来
の基、および１つのりシン残基のε位のアミンの１つ若
しくはＡおよびＰの末端アミンの１つに由来の一洲一基
から選ばれる。２“は上記の２および２′と同じである
が、−■−ではあシ得ない。ＹおよびＹ“はタンパクＰ
およびへのｚ 、 ｚ’および２／／基のいずれか１つ
と共有結合し得る官能基を示す。Ｅおよびビは不活性な
介在分子を示す。 そして、ｎはＯまたは１である。 上記の免疫毒素は、式■および■で簡略した形で表わさ
れる。しかし、注意しておきたいのは、２価共有結合構
造の−Ｗ−または−Ｗ′−が少なくとも１つの２分子お
よび少なくとも１つのへ分子に結合していることである
。タンノギクＡおよびＰとの結合数は、カップリング操
作に関与するこれらのタン／４’りに属する基の数に応
じて異なる。 例エバ、免疫毒素が、ジスルフィド基を有する２価の共
鳴結合構造を介して天然リシンのＡ鎖と抗体Ｐ（例えば
、ＴｌＯ２抗体）との結合によシ形成されるならば（こ
の場合、ジスルフィド基のイオウの一方はりシンＡ鎖の
２５７番目のシスティンに属するものであシ、もう一方
はオキソプロピル基によって抗体Ｐのチロシン残基のフ
ェノール基の酸素に結合している）、その一般式は次の
ようになる。 Ｐ’（０−Ｃｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−８−８−Ａ’）。 上式中、ｔは結合に関与する抗体（例えば、Ｔ １０１
抗体）中のチロシン残基の数を示す。 この結果書られる免疫毒素は、一般式■に相当する化合
物であって一般式Ｖにおいて以下の定義を有するもので
ある。すなわちｙは上記のとおシであるが、特にはチロ
シン残基のフェノール基が除かれたＴｉＯ２抗体の原子
団を指す。 Ａも上記のとおシであるが、特には２５７番目のシステ
ィン残基のチオール基が除かれたりシンのＡ鎖の原子団
を指す。そしてＷ′は基（ｅ）すなわち −２”−Ｙ−Ｅ−８−８−（Ｅ’−Ｙ’−Ｚ’洩−であ
る。この式中、２“は結合に関与するフェノール性水酸
基の酸素を示し、Ｙは−ＣＯ−１Ｅは不活性介在分子−
ＣＨ２−ＣＨ２−であシ、ｎはＯである。 特に好ましくは、リシンのＡ鎖および抗体単分子Ｐに含
まれる１つ以上の構造によシ形成される免疫毒素が挙げ
られる。それは次の一般式％式％ 上式中、ｐ’、ｗ’およびＡ′は上記のとおシであシ、
ｍは結合に関与するタンパクＰに属する原子団の数を示
す。ｍの数は０．３ないし１２であるが、０．５から１
０が好ましい。「ｍの数が０．３ないし１２であるが、
０．５から１０が好ましい」という表現は、結合が抗体
分子の集団内で均一に生じないため、ｍの値が統計的な
値であるという意味である。したがってｍの数は整数で
なくともよい。特にｍの値は使用される抗体に依存し、
さらに詳しくはその分子量に依存する。抗体断片Ｆａｂ
またはＦａｂ’が出発抗体Ｐとして使われるとなると、
ｍの値は０．３から約２の間となシ得る。Ｆ（ａｂ’）
２が用いられると、ｍは０．３から約２の間にな）得る
。またＩｇＧ型の抗体では、ｍの値は０．５ないし６と
なる。最後に、ＩｇＭ抗体の場合、ｍの値はヱないし１
２の数を取シ得る。、しかし抗体Ｐの置換の程度は、ｍ
の値が０．５以上、１０以下となるようなものにするこ
とが好ましい。 壕だ、すでに説明したように構造■およびＶは簡略化し
た型で記された統計的一般式である。 同様に、以下の一般式％式％および■も統計的一般式で
ある（ｎが１であるときは）。というのも結合性反応体
は、タンパクＰ１およびＰ２の群から調製されるからで
ある。そのＰｌおよびＰ２は、これら自体が抗体Ｐまた
はりシンのＡ鎖のいずれであろうと、抗体Ｐに関して上
記で考慮した特徴と全く同一の特徴を有する。 上記構造式■を有する免疫毒素は、次の方法によって得
られよう。この方法において、直接または介在基を介し
て結合した少なくとも１つの遊離チオール基を有するタ
ンパクＰ、（場合に応じて修飾されているりシンのＡ鎖
または抗体または抗体の断片）を、タンパクＰ、の遊離
チオールと結合してチオールエーテルまたはジスルフィ
ド結合を形成し得る原子団を有する、タンノぐりＰ、と
は異なるタンパクＰ２（リシンのＡｌｔたは抗体または
抗体の断片）と、室温にて水溶液中で反応させる。但し
、ジスルフィド結合が形成される場合にタンノ４りＰ、
がリシンのＡ鎖であるときは、ジスルフィド結合はアミ
ン基以外の前記タンパクＰ２の基との間に形成される。 更に、この発明は好ましくは構造式■を有する免疫毒素
の製造法に関する。ここでは、ｐ／。 Ｗ′お！びＡ′は上記のとおシである。この方法におい
ては、次の一般式 ％式％ で示されるタンパクを次の一般式のタンパクと室温にて
水溶液中で反応させる。 ｐ２／ −２／−τ−Ｅ’−Ｇ ■上式
中、Ｐ、′およびＰ２′はＰｌおよびＰ２の原子団であ
って前記タンパクに属する基に結合している、または抗
体若しくは抗体断片の糖鎖を過ヨウ素酸との反応により
開裂して得られるタンノやりＰ またはＰ２の１つの原
子団である。また２゜ｚ’ 、 ｙ 、 Ｙｌｌ Ｅお
よびビは上記のとおシであり、Ｇは次の基を示す。 丑たはＧは−５−Ｓ−Ｘ基（Ｘは活性基）である。Ｇが
−５−Ｓ−Ｘ基であり、Ｐ１′がリシンのＡ鎖である場
合、ｎは１であるが０であることもある。しかしこの場
合２′は一朋一以外である。 従って、ＰおよびＡ双方゛は、次の基のいづれかを有す
る・ （１） 結合に関与する１個以上のチオール基、およ
び （２）上記チオール基と反応してジスルフィドまたはチ
オエーテル結合を形成し得る１つ以上の官能基。 この明細書では、前記チオール基および官能基は天然の
タンパクＰまたはＡのものであるか、または人工的に修
飾されたものである。 以下に上記のタンノ４りまたはその原子団を表わすため
に使われる記号の意味および様々な記号を表わすのに使
われる表現の意味するところを記載して、内容を明確に
しておく。記号Ｐは、いかなる抗体または抗体の断片す
なわちいかなる免疫グロブリンまたは免疫グロブリンの
断片、またはいかなる分子であってその官能基のいずれ
か１つを人工的に修飾して得られるものをも示す。官能
基としてはそれらタンノックに付いている糖鎖構造を含
む。但し修飾されたタンパクは、細胞とシわけ癌細胞の
表面に存在する特定抗原をなお特異的に認識し得るもの
でなければならない。 記号Ａはタンパクであるが、植物毒素のＡ鎖と称される
サブユニットである。それは天然のりシンから直接得る
こともできるし、このタンパクに付いているいかなる官
能基を人工的に修飾してＡ鎖から由来するいかなる分子
をも示す。 但し、無細胞系において証明できるように、これらのタ
ンｉ４りは真核細胞においてリゲソームのタンパク合成
を阻害するという性質をなお有するものである。 記号Ｖは、上記タンパクＰそれ自体またはそれを適宜化
学的に修飾したものから得られるラジカルを示す。化学
修飾タンパク６には、それからそれ自体の基の１つ以上
が除かれたもの、またそれに他の官能基が任意に保護さ
れているものが含捷れる。 記号Ａ′は、上記タンノ４りＡそれ自体またはそれを適
宜化学的に修飾したものから得られるラジカルを示す。 化学修飾゛タンノリにはそれからそれ自体の基の１つ以
上が除かれたもの、またそれに他の官能基が任意に保護
されているものが含まれる。 記号Ｐ、は、上記のタンパクＡおよびＰの１つを示す。 それは、直接かまたは介在分子を経て上記タンパクに結
合している遊離チオール基を有する。 記号Ｐ２は、Ｐｌとは異なシ、上記のタンノ４りＡおよ
びＰの１つを示す。それは、上記遊離チオール基と結合
し仰る１つ以上の官能基を有する。 記号ｐ １／は、タンパクＰ、に属する原子団、特にＳ
Ｈ基（システィンの） 、ＮＨ２基（タンパクの末端ま
たはりシンのε位）、ＯＨ基（チロシンの）またはＣ０
ＯＨ基（アスパラギン酸およびグルタミン酸の）に結合
し九Ｐ、のラジカルを示す。またはｐ 、／は、Ｐｌが
抗体または抗体断片である場合、過ヨウ素酸との反応に
よシ糖鎖を開裂することによって得られるタンパクＰ、
のラジカルを示す。 記号Ｐ２′は、特徴的な官能基■２（タンパクの末端ま
たはりシンのε位）、ＯＨ（チロシン）またはＣ０ＯＨ
（アスパラギン酸およびグルタミン酸）に結合している
、タンパクＰ２のラジカルを示す。 例を挙げると、Ｐ、’−８Ｈは、システィンのＳＨ基が
そのままで他の官能基が場合に応じて保〜− 護きれているタンパクＰ、（抗体または抗体断片Ｐ−１
’だはりシンのＡ鎖）を示す。 同様に、ｐ１’−ｃｏ−は、末端カルブキシ基、または
そのグルタミン酸およびアスパラギン酸のカルボキシル
基がＳＲ基を人工的に導入する基と結合されたタンノ千
りＰｌを示す。 更にＰ、２’−Ｎｕ−は、末端アミノ基またはりシンの
アミン基がタンパクＰ１のチオール基と結合し得る基に
付いているタンノ（りＲ２（抗体または抗体断片Ｐまた
はりシンのＡ鎖）を示す。 ＹおよびＹに関して用いられている「共有結合し得る官
能基」という用語は、タンパクＰ。 およびＲ２に属する基と反応して共有結合を形成し得る
原子団（基）を指す。例えば、−ＣＯ−基および−（Ｃ
＝ＮＴ（）−基は、タンパクの遊離アミン、チオールお
よびフェノール性水酸基と反応し得る官能基として適し
ている。同様に−Ｍ−基は、ＰｌまたはＲ２が抗体また
は抗体断片のとき、過ヨワ素酸で酸化した後タンパクＰ
１またはＲ２の糖鎖構造の２つの炭素原子と結合し得る
官能基−とじて適している。 「タンパクに属する原子団」という用語は、ここではｚ
、 ｚ’および２“に関して用いられているが、タン
パクＰ１およびＲ２を形成しているアミノ酸の特徴的な
原子団に由来する原子団のこトラ指す。例えばチロシン
およびセリンの水酸基由来の酸素原子、アスパラギン酸
およびグルタミン酸の末端カルボキシル基すなわち遊離
カルボキシル基由来のカル？ニル基、タンノヤクの末端
アミノ基またはりシンのアミノ基由来のべ徂−基、まだ
はシスティンのチオール基由来のイオウ原子が挙けられ
る。同じ用語は、ＰｌまたはＲ２が抗体または抗体゛断
片の場合、過ヨウ素酸処理によシタンノｅりＰｌまたは
Ｒ２の糖鎖の１つを酸化したのち徊られるジアルデヒド
構造由来の基をも指す。 純粋なりシンのＡ鎖の製造は、この発明の生成物を得る
ために必要であるが、米国特許第４．３４０，５３５に
記載されている。ヒト癌細胞を標的としたモノクローナ
ル抗体の製造法は科学文献に広く記載されておシ、今や
これらの多くは市販品として手に入る。 抗体（または抗体断片）とりシンのＡ鎖との化学的結合
はこの発明の方法によシ実施でき、この方法は次の特徴
を有する。 （１） 包合体の２つの成分すなわち抗体とりシンの
Ａ鎖の各生物学的活性を保持する。 （２ン この方法で充分な再現性が得られ、また高い
収率が保証される。 （３）得られる包合体中のりシンＡ鎖と抗体の比の値を
調節することを可能にする。 （４）安定で水溶性の生成物が調製できる。 これらの特徴を有する工程の中で２つのタンパクを結合
させるために１つ以上のチオール基が関与するものが好
ましい。事実、これらのチオール基は、ジスルフィド結
合またはチオエーテル結合を形成させるために特に適し
ている。 これらの双方は上記の一般的条件を充す。 一般に、タンパク間の結合を成功させ、特に無秩序な架
橋を生じさせないために、結合させる一方のクンｉ、ｅ
りにだけにひとつまたひとつ以上のチオール基を導入す
ることが重要である。 他方のタン・４りは、ｐＨ５ないし９の水性溶媒中で３
０℃を越えない温度にてチオール基と反応して安定な共
有結合を形成し得る１つ以上の基を備えているだけであ
る。出発物質として使用するタンノククＰ１およびＲ２
の特徴は以下で詳細に記載する。介在分子Ｅは好ましい
分子ＲからＲ８と置換させることができる。これｔ／′
ｉ笑施例に述べる。 ■、タンパクＰ１ このタンパクは、どんな場合も結合に関与する１つか１
つ以上のチオール基を有している、ので、生じる状況は
タンパクＰ、の性質に応じて異なる。 Ａ）天然の状態でタンノぞりＰ、は、タンパクＰ２との
結合に関与する１つ以上のチオール基を有している。こ
のことは特に次のような場合に言える。すなわち、タン
パクＰ、が、ペゾシンの存在下で抗体を限定分解し、続
いて高分子間のジスルフィド結合を還元して通常得られ
るよう’ｊＦ（ａｂ）’として知られる抗体断片である
場合である。このことは、タンノ母りＰ、かりシンのＡ
鎖またはＡ鎖の誘導体である場合にもあてＩ′ｉまる。 この場合、天然リシンの１７１番目のシスティン残基お
よム２５７番目のシスティン残基に付いている少なくと
も１つのチオール基が未結合であって化学結合を生じや
すい。これらすべての場合において、天然のチオール基
を有するタンパクＰ１はこのような状態で結合工程に使
用される。 Ｂ）天然の状態でタンパクＰ は、タンパクＰ２との結
合に関与するチオール基を有していない。 このことは特に次のような場合に言える。すなわち、タ
ンパクＰ１が天然の免疫グロブリンであって、抗体全体
か抗体の断片時に通常Ｆ（ａｂ）’また１ｄＦ（ａｂ）
と呼ばれる断片の１つである場合。 天然の状態でタンパクＰ１が結合に関与する１つのチオ
ール基を持た力い場合のいま１つの例はこのタンパクＰ
１が、２つのシスティン残基それぞれがアルキル化によ
シ保護されているか、または化学修飾を受けないリシン
のＡ鎖である場合がある。全ての場合において、結合を
可能にする１つ以上のチオール基をそのような分子に導
入することが妥当といえる。 ３つの型の反応がチオール基を導入するために好ましく
用いられる。 （１）最初の型の反応は、Ｓ−アセチルメルカゾトコハ
ク酸無水物との反応である。この酸無水物は、タンパク
のアミン基のアセチル化を可能にする。その後当該−チ
オール基をヒドロキシ。 アミンと反応させることによってアセチル保護基を除く
ことができる。この方法はすてにアーチープズ・オノや
バイオケミストリー・アンド・バイオフィジクス（Ａｒ
ｃｈｌｖ’ｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎ
ｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｌｃｓ） １１９ 、４１−４９
（１９６７）に記載されている。このように保護基が導
入されたチオール基を続いて活性型フスルフィド基と反
応させる場合、ヒドロキシアミンによって前もって保護
基をはずさなくて済む可能性がある。 事実、この発明の物質を形成する反応体を使つてジスル
フィド結合を形成する反応は、遊離チオール基を使った
場合と同様にＳ−アセチル基を使っても生じる。 文献に記載されている他の方法も、修飾されるタンパク
にチオール基を導入するために使うことができる。 （２）第２の型の反応はタンパクをカル？キシル基を介
して以下に示すジスルフィド構造を有する対称的なジア
ミノ分子と反応させることである。 Ｈ２Ｎ−Ｒ４＝Ｓ−８−Ｒ１−ＮＨ２ 上２上、Ｒ１は炭素数２から５の脂肪族原子団である。 この反応では、カルボジイミド特に１−エチル−３ジメ
チルアミノゾロビル−３−カルボジイミドあような水溶
性誘導体の如きカップリング剤の存在下でシスタミンＣ
Ｒ１＝ （ＣＨ２）２−）と反応させ、用いた化学量
論量に応じて次に示す誘導体の１つか双方の混合物を形
成させることが好ましい。 ｐ＜−ｃｏ−ＮＨ−Ｒ，−５−ｓ−Ｒ４−ＮＨ２（■ａ
）Ｐ’、−Ｃｏ−ＮＴ（−Ｒ１−８−３−Ｒ１−ＮＨ−
ＣＯ−Ｐｌ（ｌＶｂ）この型の反応生成物は次の２つの
工程のいずれかに供される。 ａ）式１ａまたはｒｂ において、タンパクＰ１がリシ
ンのＡ鎖またはその誘導体の１種ならば、得られた反応
溶液は分別せずに２−メルカゾトエタノールのような還
元剤との反応に供せられる。それによって次式の１種類
のタン・ぐり誘導体が得られる・ Ｐ’−ＣＯＮＨ−Ｒ１−ＳＲ こうして得られた生成物は続いて透析かグル渥過により
精製される。 ｂ）式■ａおよび■ｂにおいて、ラジカルＰ、′が抗体
またはその断片の１種から成る、タンパクＰのラジカル
ならば、得られた反応溶液はそのままカップリングに用
いられ、その場合チオール／−）スルフィド交換法が用
いられる。 この交換法は、例えばギリランド（Ｇｌ ｌ ｌ ｉ
１ａｎｄ）とコリニー／ｌ／ （Ｃｏ１１ｉｅｒ ）に
よってキャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ５ｅ
ｒｅｈ’）＋ ４０＋ ３５６４（１９８０）に記載さ
れている。 （３）第３の反応は、導入しようとするチオールを有す
るラジカルを固定するために糖鎖単位を使うことでおる
。この糖鎖単位は天然の状態で抗体に存在しているもの
である。続いてタンパクは、糖鎖単位にアルデヒド基を
生じさせるために過ヨウ素酸で酸化される。過剰の工、
チレングリコールを加えて反応を停止させ、副産物と過
剰の反応体を透析によシ除いた後、得られた放生物を次
の一般式を有する対称なジアミノ分子で処理する。 Ｈ２Ｎ−Ｒ４−８−８−Ｒ１−ＮＨ２ 上式上式中上４素数２ないし５の脂肪族基である。得ら
れた付加生成物は、続いて金属水素化物（特には、水素
化ホウ素ナトリウム）との反応によシ第２’ｌ：たは第
３アミンに還元される。 この反応はシスタミンＣＲ１＝−（ｃｕ２）２− ）
を用いて実施することが好ましく、用いた化学量論量に
応じて次式の誘導体の一方かその両方の混合物が形成さ
れる。 ＯＨ ＯＨ Ｑ）（ＯＨ ＯＨリｈ 得られた反応液を、■ａまたはＩｙｂの構造式で表わさ
れる生成物であってＰ、′が抗体または抗体断片である
ものに関して上記したとおシの処理を行なってもよい。 チオール基を人工的に導入（対称なジアミノジスルフィ
ド反応体を使うタイプ）するだめの上に述べた後二者の
反応において、タンパクＰ１は遊離ＳＨ基または遊離ア
ミン基を持たないことが好ましい。Ａ鎖とその誘導体の
場合には、Ｎ−エチルマ、レイミドまたはヨード酢酸の
ようなチオール基に対する通常の試薬との反応によシ天
然のチオール基をアルキル化し、およびミイーンズ（避
ＡＮＳ ）およびフィーニー（ＦｇＥＮＥＹ）によって
バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ）７
．２１９２（’１９６８）に記載された還元的メチル化
法に従って天然のＮＨ２基をメチル化することにより常
に遊離のチオール基を持たなくさせ得る。このようにし
て天然リシンのＡ鎖に１モル当シロ個までのメチル基を
導入することができる。このようにして修飾されたタン
パクには、生物学的な特性（特には、真核細胞の＋７
＆ンームにおけるタン・ぐり合成を阻害する能力）が備
わっている。抗体または抗体断片さらに第１群のすべて
の物質の場合には、前記したようにそれらは天然の遊離
ＳＨ基を持たないので、還元的メチル化を例えばミーン
ズおよびフィーニーの方法によシ実施するほうがよい。 このようにして通常抗体１モル当シ数十のメチル基を導
入することができる。その場合抗体の細胞表面上の抗原
を認識する能力を変化させない。 ■ タンパクＰ２ あらゆる場合、このタンパクは、タンパクＰ１のチオー
ル基と反応してジスルフィドまたはチオエーテル結合を
形成し得る１つ以上の官能基を有するタン・母りである
。これらの官能基゛は、常にタンノ４りＰ２に人工的に
導入されるが、それがジスルフィド結合によシカツノリ
ングされるのかチオエーテル結合によりカップリングさ
れるのかに応じて異なっている。具体的には以下に記載
する。 １）ジスルフィド結合 この場合、包合体の調製は以下の式で表わされる。 Ｐ１’−（Ｚ−Ｙ−Ｅ）ｎ−８Ｈ＋Ｐ２’−Ｚ’−Ｙ’
−Ｅ’−８−８−Ｘ −＋Ｐ１’−（Ｚ−Ｙ−Ｅ）ｎ
−８−８−Ｅ’−Ｙ’−Ｚ’−Ｐ２／ ＋ Ｘ−８Ｈ。 活性イオウ原子によジ置換されるタンパクＰ２はタンパ
クＰ２または適切に保護されたタンパクＰ２から、それ
自体活性イオウ原子を有する試薬による置換によシ得ら
れる。これは次の式％式％ 上式中、Ｐ２は置換されるべきタンパクを示し、Ｌ−Ｙ
’は試薬をタンノククに共有結合させる基を示す。官能
基Ｌ−Ｙ’は、置換されるべきタンパクの構成アミノ酸
の側鎖に付いているいずれか１つの基と共有結合し得る
基である。これらの基の中で、特に次のものが選び出せ
る。 タンパクに含まれるチロシフ残基のフェノール基。この
場合、Ｌ−Ｙ’は特にイミダゾール−１−イルカルボニ
ル基を示すことがある。それは次の式に従ってタンノｆ
りのフェノール基と反応する。 ａ 上式中、Ｌがイミイダソー＃−１−イルで、Ｙ′がｃｏ
基で、Ｒ４が−Ｒ−８−８−Ｘ基である。Ｉａ式の化合
物はこの発明のイミダゾリッドである。 −５−Ｓ−Ｘは遊離チオール基と反応し得る活性型ジス
ルフィドを示す。特に、このジスルフィドにおいて、Ｘ
は１つ以上のアルキル、ハロゲンまたはカルぎキシ基で
置換されていることのあるピリジン−２−イルまたはピ
リジン−４−イル基を指すことがある。Ｘもまた１つ以
上のフェニル基またはカルボキシル基で好ましくは置換
されているフェノール基を指すことがある。また＃′ｉ
ｘはメト中シカ）Ｖボニル基のよりな°アルコキシカル
ビニル基を指すこともある。 Ｒ基は、置換基Ｙ′およびＳ−５−Ｘを同時に結合し得
る介在分子（前式中のＥのような）を示す。 それは、後の反応において、使用される反応物質と合成
される生成物を訪客するような基を含まないようなもの
でなければ々らない。特に、Ｒ基は−（ＣＨ２）−でも
あシ得（ｎは工ないし１０）、また次の基でもあシ得る
。 Ｒ５−ＣＨ−ＣＨ−Ｒ６ 上式中、Ｒ６は水素または炭素数１ないし８のアルキル
基を指し、Ｒ５は続いて使われる次式のカルカルバメイ
ト基のような反応体に不活性な置換基を指す。 一冊−Ｃ−０Ｒ。 上式中、Ｒ７は炭素数１から５の直鎖または分校アルキ
ル基、特に第３ブチル基を示す。化合物Ｌ−Ｙ’−Ｒ−
８−３−ＸとタンパクＰ２との反応は均質な液相、最も
一般的には水または緩衝液中で進行する。反応体の溶解
性を高めるには、水に可溶性の有機溶媒を反応溶液に加
えることができる。 その最終濃度を、第３ブタノールのような第３アルコー
ルの場合には容量比で２０％までにすることができ、ジ
メチルホルムアミドまたはテトラヒドロフランの場合に
は容量比で１０％まで忙することができる。 反応を、室温にて数分から数時間の時間をかけて実施す
る。その後、低分子量の生成物および特には過剰の反応
体を透析またはグル濾過によって除去することができる
。この方法によシ、タンパクり１モルあたｊ５１ないし
１５の置換基を導入することが可能となる。そのような
化合物を用いる場合、タンノｆりＰ、とのカップリング
は、Ｐ［（６から８の溶液中にて３０℃を越えない温度
で、１時間から２４時間かけておこなう。低分子量の生
成物を除くために適宜、得られた水溶液を透析する。つ
いで包合体を既知の方法の変法によシ精製できる。 ２）チオエーテル結合 この場合、包合体をＰ１′−（Ｚ−Ｙ−Ｋ）ｎ−８Ｉ（
と前もって１つ以上のマレイミド基を導入しておいたタ
ンパクＰ２とを反応させることにょシ調製する。１例と
して、反応を次の式で示す。 上式中、Ｒ８は炭素数１ないし１５の脂肪族または芳香
族介在分子を示す。それは続いて使用される反応体に対
して不活卜ある。２は、結合に関与するタンパクＰ２の
官能基の種類に従って変化し得る基を示す。すなわち、
２は、酸素（チロシン残基（チロシン基）のフェノール
基のエステルの場合） 、 ＮＨ（タンパクのアミノ基
と活性型カルボキシル基のカップリングの場合）まだは
１州−ＣＨ２（タンパクのアミン基とクロロメチルケト
ンの場合）である。 マレイミドで置換されたタンパクＰ２は、それ自体マレ
イミド基を有する試薬によってタンノｆりの適当な基を
置換することによって、タンパクＰ２ 自体からまだは
適当に保護されたタンノやりＰ２から得られる。これら
に適した基のうち、特に次のものが選ばれる。 タンパクに含まれるチロシン残基のフェノール基。この
場合、マレイミド基を有する試薬は次の一般式Ｉｂ’（
すなわち、この発明のイミダゾリド）で示される。 これは次の反応式に従ってタンパクのフェノール基と反
応する。 マレイミドを有する試薬とタンパクＰ２ との反応は均
質な液相、最も一般的には水または緩衝液中で進行する
。反応体の溶解性を高めるには、水に可溶性の有機溶媒
を反応溶液に加えることができる。その最終濃度を、第
３ブタノールのような第３アルコールの場合には容量比
で２０チまでにすることができ、ジメチルホルムアミド
またはテトラヒドロフランの場合には容量比で１０チま
でにすることができる。 反応は室温にて数分から数時間かけておこなう。そのよ
うな化合物を使うと、タンパクＰ１とのカップリングは
、ｐＨ６ないし８の水溶液中にて３００を越えない温度
で１時間ないし２４時間かけて、２つのタンノ４りを混
合することによっておこなわれる。得られた溶液を低分
子量の生成物を除くため適宜透析し、続いて包合体を′
既知の様々な方法によシ精製できる。 式■の生成物は次式の生成物と前記１式の化合物とを反
応させて得られる。 Ｐｌ２−ＯＨ 上１式中 ＰＳは上述したとおシであシ、水酸基はＰ“
２のチロシンから欠失するフェノール性水酸基を示す。 この発明のイミダゾリドは、タンノ母りＰｌ およびＰ
２のカップリング試薬として適している。 それらを用いれば次式で表わされる新規化合物が得られ
る。 Ｐ”２−Ｏ−Ｃｏ−Ｅ−Ｇ
■反応は、１０々いし４０℃の温度でジオキサンまたは
テトラヒドロフランの如きエーテル溶媒のような水に可
溶性の有機溶媒を任意に含む水溶性溶媒中にて行々う。 次に示す実施例により、この発明がよりはっきシと分か
るであろう。しかしこの発明の範囲はこれに限定されな
い。すべての実施例において、記載される包合体の調製
法は、米国特許第４．３４ｏ、５３５号に記載されてい
る方法によシ得られたような天然型のりシンのＡ鎖を用
いたものである。 これら実施例では次のような抗体が使用される。 ０ヒトＴリンパ球や多種ヒトＴリン−母系白血病細胞上
に存在する抗ｉ Ｔ６５に対するモノクローナル抗体Ｔ
１０１゜この抗体は、ジャーナル・オブ・イムノロジー
（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ）’ ）
＋１２５（２）、７２５−７２７（１９８０）に記載
されている。これは、ハイプリチク社（ＨＹＢＲＩＴＥ
ＣＨＩｎｃ・）（米国、カリフォルニア州、サンディエ
デ）から入手できる。 Ｏマウスリンツク球上の’ｒｈｙ １．２抗原に対する
モノクローナル抗体ＡＴ１５Ｅ０この抗体は、ジャーナ
ル・オプ・イムノロシー（Ｊｏｕｒｎａｎｌ ｏｆＩｍ
ｍｕｎｏｌｏｇｙ）、１２２．２４９１−２４９８（１
９８１）に記載されているものであシ、ハイツリドーマ
（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ） 、 １（１）、 １３−１
７（１９８１）に記載のハイツリドーマから得られる。 ０抗−ＤＮＰモノクローナル抗体。 実施例 実施例Ｉ Ｐｌは、アミンを介して導入されたＳＨ基を有するＴｉ
Ｏ２抗体。 −Ｐ２は、チロシンの水酸基を介して導入された活性型
ジスルフィド基を有するリシンのＡ鎖。 （４） カップリング試薬の調製 カップリング試薬には、３−（ピリジン２イルジスルフ
アニル）プロピオン酸（ＰＤＰＡ）カラ誘導したイミダ
ゾリドを用いた。このイミダゾリドはＰＤＰＡとカルボ
シイミダゾール（ＣＤＩ ）とからｌ工程で得られた。 一一一一一一一〉 ＰＤＰＡ４３０１＃をＴｕＦ２ｍＡ！ｌｃｔ！解した。 ＣＤＩ４０５′ｍ９をこの溶液に加えた。この混合物を
、２５℃にて１５分間攪拌したところ炭酸ガスが発生し
た。この反応溶液を精製せずに直接かつ迅速罠使用した
。 調製 １） Ｎ−エチルマレイミドによる天然チオール基の
保護 リシンＡ鎖の濃度８ｒｖ／ｍｌの水溶液１５ｄ（Ａ鎖４
．１マイクロモル）を終濃度１チとなるように２−メル
カノトエタノールの水溶液で処理した。その水溶液を１
時間静置し、続いてｐ）１７の１２５ ｍＭ ＩＪン酸
緩衝液に対して連続的（３００＋＋＋ｌ／時の速さで４
０時間）に透析した。 エルマンの方法〔メソトーイン・エンサイモロジー（Ｍ
ｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ） 、 ２
５ 、４５７（１９７２）］を用いるとりシンＡ鎖１モ
ル当りＳＨは０８ｇ当量であった。このＳＨ基をメソッ
ド・イン・エンサイモロジー、１１，５４１（１９６７
）に記載の方法によＪＮ−エチルマレイミドで保護した
。この際、前段階で得られたりシンＡ鎖を、Ａ鎖１モル
当り２０当量のＮ−エチルマレイミドノ存在下で３０℃
にて２時間インキ−ベートした。過剰の試薬をｐｉ（７
の１２′５ｍＭリン酸緩衝液に対して連続的（５ｏｏｍ
ｉ７時の速さで２０時間）に透析して除いた。この結果
、リシンＡ鎖濃度７ダ／ｄの浴液１３ｄを得た。これに
は、エルマンの試薬で測定し得るチオール基はもはや存
在しなかった。このようにして得られた生成物を以後Ａ
＠（ＮＥＭ ）と呼ぶ。 ２）チロシンの修飾 ＴＪ（Ｆ Ｋ溶解したカップリング試薬３００−ｒイク
ロモルｔ＝、 １８ｍ９（ｏ、６マイクロモル）のＡ鎖
（ＮｚＭ）をｐＨ７の１２５ｍＭのリン酸緩衝液１０ｄ
に溶かした溶液に滴下した。反応溶液を２５℃にて１５
分間攪拌した。過剰の試薬を除くためにｐＨ７の１２５
ｍＭリン酸緩衝液に対して透析して精製した。午の結果
、タン・母り濃度１、５５ ｍ９７ ｍｌの修飾Ａ鋼溶
液９．５コを得た。２−メルカゾトエタノールとの交換
反応により放出されるピリジン２−チオンを３４３ｎｍ
Ｋて分光測定法で解析したところ、得られた修飾Ａ鎖（
ＮＥＭ ）は１分子当り１．６個の活性基を有している
ことが分った。 （Ｃ） 修飾抗体の調製 ＤＭＦに濃度１７０ｍ９／ｍＪとなるように溶かしたＳ
ＡＭＳＡのＤＭＦ 溶液２５ｐｌを、濃度９ ｍ９／ｍ
ｌのＴｉＯ２抗体溶液４５ゴ（０，３マイクｐモ／１／
）に加えた。その混合物を４℃にて２時間攪拌し、続い
て試薬を除くために２４時間ＰＨ７の１２５ｍＭリン酸
緩衝液に対して連続的（４００ｍｌ！／時）透析し、精
製した。この結果、ＩＦｎｌ当、９８．６ｍ９の修飾抗
体を含む溶液４． Ｉ ＷＬｌを得た。ヒドロキシアミ
ン塩酸塩の０．５Ｍ溶液０．６４ｄをこの抗体溶液に加
えた。３０℃にて１時間インキュベーションしたのち、
試薬を除くために２４時間ｐＨ７の１２５ｍＭリン酸緩
衝液に対して透析し。 精製した。エル、マンの方法により遊離したＳＨ基を分
光測定法で解析したところ、得られた抗体は１分子当シ
５個の活性基を有していることが分った。 （２）免疫毒素の調製 修飾されたりシンＡ鎖溶液’ ２ｒｎ！！（０，２７−
ｒイクロモル）を、上記で得られた活性型抗体の溶液２
．１１ｄ（０，１１マイクロモル）に加えた。 続いて、その混合物を３０℃にて５時間インキーペーシ
ョンした。この反応溶液を、実施例１に記載した方法通
シセファデックスＧ１００を詰めたカラム上でダル濾過
して精製した。この結果、濃度１．１ダ／ＷＬｌの免疫
毒素溶液１７ｍ１（１８，７１ｎ９）を得た。コノ溶液
は、１ｒｎｌ当シ修飾されたＡ鎖（ＮＥＭ ） ０．３
２１＃を含んでいた。 従って、この調製物のカップリングの程度は、抗体１分
子当ｆｉＡ鎖（ＮＥＭ ） ２であった。 ′この結果
、前記Ｈ式゛の免疫痒素が得られた。 この式中で。 Ａ′は、ＳＨ基がＮ−エチルマレイミドで保護されたり
シンＡ鎖のラジカル。 Ｐ′は、ＴｉＯ２抗体のラジカル。およびＷ′は、次の
式で示される原子団。 −（ＮＨ−Ｙ’−Ｅ’）ｎ−８−３−Ｅ−Ｙ−Ｚ−上式
中。 ・Ｙ′は−ＣＯ− ・Ｅ′は−ＣＩ−１２０Ｈ２− ・Ｅは一〇）Ｉ− ＣＨ２Ｃ００Ｈ ・Ｙは−Ｃ〇− ・ ２は一〇− ・ｎは１゜ （ト）免疫毒素活性試験 ６０ Ｓ リポソームサブユニットを分解スルコとによ
って真核細胞のタンパク合成を阻害することが、リシン
Ａ鎖の基本的な生物学的特性である。従って無細胞系（
テスト−１）または有細胞系（テスト−２）でタンパク
合成の阻害を調べる試験を行なった。 １）無細胞系（テスト−１） この生体外の実験法においては、適当に改良したラット
肝の細胞レベル以下の画分てあって人工メツセンジャー
ＲＮＡ （ポリウリジル酸）の存在下で１４Ｃ−７エニ
ルアラニンを取込むことができるものを用いた。細胞レ
ベル以下の画分の調製のため、および Ｃ−フェニルア
ラニンの取込みの測定のために使用した方法は、ノ９イ
オケミカ・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｃａＢｉｏｐｈｙａｉｃａ Ａｃｔａ ）、 ３１２．
６０８−６１５（１９７３）に記載された方法を応用し
たものである。それには。 ミクロゾーム画分と細胞質両分の両方を用いた。 Ａ鎖を含む試料をｐＨ７，６の５０ｒｆ１Ｍトリス塩酸
緩衝液（０，２ｑ６の２−メルカプトエタノールおよび
１５ｑ／Ｉｎｌのウシ血清アルブミンを含む）中に導入
した。得られた計数を計算（阻害剤を含まない対照溶液
を比較として）し、リシンＡ鎖を含む各反応溶液に対し
てタンパクへの１４ｃｍ’フェニルアラニンの取込みの
阻害率を求めた。 これらの値から、この実験条件下で Ｃ−７エニルアラ
ニンの取込みを５０％阻害するりシンＡ鎖の濃度（工Ｃ
３ｏ）を求めることができた。 ２）有細胞系（テスト−２） この試験では、培養癌細胞中への１４Ｃ−ロイシンの取
込みを−測って、その物質の効果を調べた。使用した細
胞は、免疫毒素を調製するために選ばれた抗体の特異性
に依存した。この実施例では、通常Ｔ６５抗原を有する
ＯＥＭヒドリン・母芽球様の細胞を使用した。この細胞
を、測定すべき物質の製剤の存在下でインキ−ベートし
た。 そして、インキーベーションを終えてから、その細胞が
１４０−ロイシンをどの程度耽込む、かを調べた。この
測定に使用した手法は、ジャーナル・オプ・バイオロジ
カル・ケミストリー、（Ｊ。 Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）、２４９（１１）、３５５７−
３５６２（１９７４）に記載の方法を応用し牟ものであ
る。すなわちトレーサーとして１４ｃ−ロイシンを用い
、タン・ぐり合成の程度を測定した。取込まれだ放射線
活性は、ここではグル濾過で単離した完全な細胞に関し
て測定した。この方法に基づくと、投与量−作用曲線（
横軸に被験物質の濃度を取り、縦軸に被験物質存在下で
対照細胞の Ｃロイシンの取込に対するパーセントで表
わした１４Ｃ−ロイシンの取込みを取る）を作製するこ
とができる。このようにして、各被験物質に対して。 １４０−ロイシンの取込みを５０パーセント阻害する濃
度、す々わち「５０チ阻害濃度」（Ｉ′Ｃ５゜）を求め
ることができる。完全細胞の Ｃロイシンの取込みを測
定すれば、従来のタン・ｆり合成の測定法によって得ら
れる結果と一致する■Ｃ５ｏを決定できることも調べた
。 ３）結果 ａ・ テスト−１（無細胞系） 修飾Ａ鎖の阻害活性を測定した。工Ｃ５ｏは３、６ Ｘ
１０”１０モル／ｌとなった。この実験で対照Ａ鎖の
工Ｃ５ｏは１．２ Ｘ １０”モル／ｌであった。 従って、修飾してもＡ鎖の活性はあまシ減少しない。 ｂ、テスト−２（有細胞系） 活性剤（５０ｎＭモネンシン）存在下での工Ｃ５゜は、
１．２ Ｘ １０”１２モ）Ｌ／／ノであった。この値
は、Ａ鎖のそれ（■Ｃ５ｏは６ Ｘ １０−８モル／７
）よシ５×１０ 倍高いことを示している。 実施例２ Ｐｌは、アミンを介して導入されたＳＲ基を有するＴｉ
Ｏ２抗体。 Ｐ２は、チロシンの水酸基を介して導入された活性型マ
レイミド基を有するリシンのＡ鎖。 （４） カップリング試薬の調製 カップリング試薬にはマレイミドカシロン酸から誘導し
たイミダゾリドを用いた。このイミダゾリドはマレイミ
ドカシロン酸とカルがジイミドから１工程で得られた。 マレイミドカプロン酸４２２■ヲＴＨＦ２１７！に溶解
した。ＣＤＩ ４０５〜をこの溶液に加えた。 この混合物を、室温にて１５分間攪拌したところ炭酸ガ
スが発生した。この反応浴液を精製せずに直接に使用し
た。 調製 １）Ｎ−エチルマレイミドによる保護 実施例１に同じ。 ２）チロシンの修飾 ＴＨＦに溶解したカップリング試薬３９０マイクロモル
ヲ、１８ｍ９ （０，６マイクロモル）（７）Ａ鎖（Ｎ
ＥＭ ）をｐＨ−７の１２５ｍＭのリン酸緩衝液１０ｒ
ｎｌに溶かした溶液に滴下した。反応溶液“を２５℃に
て１５分間攪拌した。過剰の試薬を除くためにｐＨ７の
１２５’ｍＭ ＩＪン酸緩衝液に対して透析して精製し
た。、この結果、タンパク濃度１、４５１１１１１／
ｒｎｌノ修飾Ａ鎖溶液２０ｍ１を得た。 Ｃ−システィンによるマレイミド基を測定したところ、
得られた修飾Ａ鎖（ＮＥＭ ）は１分子当り１個の活性
基を有していることが分った。 実施例１に同じ。 修飾されたりシンＡ鎖溶液５．８Ｍ（０，２８マイクロ
モル）を、上記で得られた活性型抗体の溶液２，１ｍｌ
（Ｑ、１１マイクロモル）に加えた。 続いて、その混合物を３０℃にて１時間インキュベーシ
ョンした。残ったマレイミド基を５マイクロモルのシス
ティンで保護した。３０℃にて１時間インキーペーショ
ンし、この反応混合物を、実施例１に記載した方法通シ
セファデックスＧ１００を詰めたカラム上でダル濾過し
て精製（−だ、この結果、濃度１．ｃ）５ｍｔｉ／ゴの
免疫毒素溶液１．９．５ｍｌ （２０，５ｍ９）を得た
。コノ溶液は、ｌ ｍｌ当シ修飾され九Ａ鎖（ＮＥＭ
） ０．３１ ｍ９を含んでいた。従って、この調製物
のカンプリングの程度は、抗体１分子当りＡ鎖（ＮＥＭ
） ２であった。 この結果、前記Ｈ式の免疫毒素が得られた。 この式中で− Ａ′は、 ＳＲ基がＮ〜エチルマレイミドで保護された
りシンＡ鎖のラジカル。 Ｐ′は、ＴｉＯ２抗体のラジカル。および、Ｗ′は、次
の式′−で示される原子団。 上式中、 ・Ｚ′は一朋一 ・Ｙ′は−ＣＯ− ・Ｅ′は−ＣＨ− ＣＨ２Ｃ０ＯＨ ・Ｅは−ＣＨ２−ＣＨ２− ・Ｙは−ＣＯ− ・２は一〇− ・ｎは１゜ （匂“活性試験 ａ、テスト−１（無細胞系） 修飾されたＡ鎖の阻害活性を測定した。工Ｃ５゜は１（
ＩＸＩＯモル／ｌであった。この実験で、対照のＡ鎖の
ＩＣ５ｏは１． Ｉ Ｘ １０””モル／ｌであった。 活性がかなシ消失しているものの、修飾Ａ鎖のタンパク
合成阻害能はまだ高かった。 ｂ、テスト−２（有細胞系） 実施例１と同じ条件下で試験を実施した。活性剤（５０
℃Ｍモネンシン）存在下でのＩＣ５ｏは３’Ｘ１Ｏ−１
１モル／ｌであった。この値は、Ａ鎖のそれ（ＩＣ５ｏ
は６ Ｘ １０−８モル／ｌ）よシ３×１０’倍高かっ
た。 実施例中 Ｐｌは、天然状態のりシンＡ鎖。 Ｐ２は、チロシンの水酸基を介して導入された活性型ノ
スルフィド基を有するＴｉＯ２抗体。 （Ｎ カップリング試薬の調製 実施例１に同じ。 （Ｂ） 修飾抗体の調製 ２倍希釈した前記ＴＨＦ溶液３４μｍ３ （ＩｇＧ濃度
は２００当量１モル）を、ＴｉＯ２抗体１２．８■を１
．８ｍｌのｐＨ７の１２５ｍＭリン酸緩衝液に溶かした
溶液に滴下した。この反応溶液を室温にて１５分間攪拌
し、続いて透析によシ精製したところ、濃度４．５５り
／ゴの修飾抗体の溶液２．６ｍｌを得た。２−メルカゾ
トエタノールとの交換反応によシ放出されたピリジン２
−チオンを３４３ｎｍで分光測定法によ如解析したとこ
ろ５得られた抗体は１分子当り２．２個の活性基を有し
ていることが分った。 濃度４．５５ ｍｑ ／ ｍｌの活性型抗体の浴液２．
５ ｔｎｌ（０，０７５ｒイクＣＩ％ル）を、濃度７．
１ｍ！７／ｌｌｌ１のりシンＡ鎖の溶液７５０μｍ３（
０，１７７マイクロモル）に加えた。続いて、その混合
物を２５℃にて１８時間インキーベーションした。この
反応混合物を、実施例１に記載した方法通シセファデノ
クスＧＩＯＱを詰めたカラム上でグル濾過して精製した
。この結果、濃度０．８ｍ９７ｍ１の溶液１３ｍ１（１
０，４１ｎ９’）を得だ。この溶液は、ｌ ｍｌ当ｐｈ
鎖（ＮＥＭ ） ０．２■を含んでいた。従って、この
調製物のカップリングの程度は、抗体１分子当りＡ鎖（
ＮＥＭ ） １．５であった。 この結果、前記■式の免疫毒素が得られた。 この式中で、 Ａ′は、リシンＡ鎖のラジカル。 Ｐ′は、Ｔ１０１−抗体のラジカル。および、Ｖは、次
の式で示される原子団。 −Ｚ’−Ｙ−Ｅ−８−８− （Ｅ’−Ｙ’−Ｚ’） −
上式中、 ・ ｚ〃は、−〇− ・Ｙは、−ＣＯ− ・Ｅは、−ＣＨ２−ＣＨ２”− ’ｎば、録綽；τ− −ｍに、１．５ （Ｄ） 活性試験 テスト−２（有細胞系） 実施例１と同じ条件下で試験を実施した。活性剤（５０
ｎＭモネンシン）存在下でのＩＣ５ｏは３、５ Ｘ Ｉ
Ｆ”モル／ｌであった。この値は、その細胞毒活性が
Ａ鎖のそれ（工Ｃ５ｏは０．６ 、Ｘ １０−８−ｔ＋
／Ｌ）よ＃）１．５×１０５倍高かった。 実施例４ Ｐ、は、天然状態のりシンＡｉ。 Ｐ２ｉｄ、チロシンの水酸基を介して導入されたマレイ
ミド基を有するＴ１０１抗体。 （４） カップリング試薬の調製 実施例２に同じ。 （Ｂ） 修飾抗体の調製 ２倍希釈した前記ＴＨＦ溶液３４μｌ（ＩｇＧ濃度は２
００当量１モル）を、Ｔ１０１抗体１２，８■を１．８
麻のＰＨ７の１２５ ｍＭ リン酸緩衝液に溶かした溶
液に滴下した。この反応溶液を室温にて１５分間攪拌し
、続いて透析によシ精製したところ、濃度４．５η／ｍ
ｌの修飾抗体の溶液２．６Ｎを得た。 Ｃ−システィン
によるマレイミド基を測定したところ、得られた抗体は
１分子当シ４個の活性基を有していることが分った。 （Ｃ） 免疫獣素の調製 濃度４．５ ｍ９／ｍｌの活性型抗体の溶液２．５ ｍ
ｌ（０，０７５マイクロモル）を、濃度７．１４包のり
シンＡ ｓの溶液８５０μｌ（０，２０マイクロモル）
Ｋ加えた。続いて、その混合物を２５℃にて１時間イン
キュベーションした。残ったマレイミド基を６マイクロ
モルのシスティンで保護した。この反応混合物を、実施
例１に記載した方法通シセ７アデックスＧ１００を詰め
たカラム上でグル濾過して精製した。この結果、濃度０
、７６ ｍｙ／縦の免疫毒素溶液１１絞（１’０．４９
）を得た。この溶液は、ｌ ａｔ当ｐＡ鎖（ＮＦ、Ｍ）
０．２９ｍｇを含んでいた。従って、この調製物の平均
のカップリングの程度は、抗体１分子当、９Ａ鎖（ＮＥ
Ｍ） ３であった。 この結果、前記■式の免疫毒素が得られた。 この式中で、 Ａ′は、リシンＡ鎖のラジカル。 Ｐ′は、Ｔ１０１抗体のラジカル。および、Ｗ′は、次
の式で示される原子団。 上式中、 ｏｚは、−〇− ・Ｙは、−ＣＯ− ・Ｅは、−（ＣＨ２）５− ・ｎは、μ拘；ｌキ − Ｉｎは、３ い）活性試験 テスト−２（有細胞系） このテストは、実施例１と同じ条件下で実施した。活性
剤（５０ｎＭモネンシン）存在下でのＩＣは１．７ Ｘ
１０−１２モル／ｌであった。このイ直は、同実験に
おいてＡ鎖のそれより３×１０倍高〃１つだ・
Claims (2)
- （１）次の一般式で示されるイミダゾリド。 ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔上式中、Ｅは不活性介在分子を示し、Ｇは▲数式、化
学式、表等があります▼基または−Ｓ−Ｓ−Ｘ基（ここ
で、Ｘは活性基）を示す。〕 - （２）次の一般式で示される特許請求の範囲第１項記載
の化合物。 ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔上式中、Ｅは−（ＣＨ＿２）−＿ｐ基（ｐは２ないし
７の整数）または▲数式、化学式、表等があります▼基
を示し、Ｇは−Ｓ−Ｓ−Ｘ構造で表わされる基（ここで
、Ｘは、１つ以上のハロゲン、アルキル基、カルボキシ
基若しくはアルコキシカルボニル基で置換されているか
、置換されていないピリジン−２−イルもしくはピリジ
ン−４−イル基；１つ以上のハロゲン、ニトロ基、アル
コキシ基、カルボニル基若しくはアルコキシカルボニル
基で置換されているか置換されていないフェニル基；ま
たはアルコキシカルボニル基の中から選ばれる活性基を
示す。）〕
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|---|---|---|---|
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| FR8409704A FR2566403B1 (fr) | 1984-06-20 | 1984-06-20 | Imidazolides, procede d'obtention et application a titre d'intermediaires de synthese de conjugues cytotoxiques |
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-
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