JPS6112920B2

JPS6112920B2 -

Info

Publication number: JPS6112920B2
Application number: JP52039627A
Authority: JP
Inventors: Keenitsuhi Uorufugangu; Gaigaa Rorufu; Ooberumaiyaa Rainaa; Teetsu Fuorukaa
Original assignee: Hoechst AG
Current assignee: Hoechst AG
Priority date: 1976-04-08
Filing date: 1977-04-08
Publication date: 1986-04-10
Also published as: DK149045B; IT1083868B; CH640510A5; DE2615229C2; NL7703576A; IL51831A; SE430060B; IL58616A0; GB1581366A; FR2347337A1; ATA244777A; DE2615229A1; GB1581367A; IL51831A0; FR2347337B1; DK154077A; DK149045C; JPS52125165A; SE7704110L; AT353991B

Description

【発明の詳細な説明】十二指腸から分泌されるホルモンであるセクレ
チンは式Ｈ−His−Ser−Asp−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−Glu−Leu−Ser−Arg−Leu−Arg−Asp −Ser−Ala−Arg−Leu−Gln−Arg−Leu−Leu−Gln−Gly−Leu−Val−NH² を有するヘプタコシペプチドである。

これは膵臓の重炭酸塩産生を刺激しそして膵臓
機能検査に臨床的に使用される。

これまでセクレチンは向流分配法〔J.Am.
Chem.Soc.第89巻第6753頁（1967）参照〕および
SP−セフアデツクス（Sephadex）C25でのイオ
ン交換クロマトグラフイー〔Chem.Ber.第105巻
第2515頁（1972）参照〕により精製されている。
費用のかかる向流分配法ではセクレチン含有試料
を続いて酸性交換体（アルゲニツク・アシツド）
と撹拌しそして吸引過する。吸収されたセクレ
チンを0.2n HClを用いて溶離し、そして弱塩基
性の交換体から塩酸を酢酸を用いて交換する。従
つて向流分配法によれば後処理になお２種類のイ
オン交換クロマトグラフイーが必要である。

SP−セフアデツクスC25でのイオン交換クロマ
トグラフイーによる精製に際しては、粗セクレチ
ンから弱塩基性イオン交換体（酢酸塩形）で処理
することにより取得されるセクレチン酢酸塩を、
モル濃度が高く且つ特定のPH値を有する炭酸アン
モニウム緩衝液を用いて溶離する。溶離は比較的
長時間続きそして生じる溶離液はセクレチンと共
に炭酸アンモニウムをも含有している。この炭酸
アンモニウムは酢酸を用いて酸性化することによ
り酢酸アンモニウムに変換しそして数回の凍結乾
燥により除去されねばならない。

しかしながらセクレチンは水溶液中において絶
えず生物学的活性を失つているので、前に知られ
ている時間のかかる両精製法では効力の高いセク
レチンがほんの少量取得されるのみである。何故
ならば多量の場合では滞留時間が長くなり過ぎそ
してそれにより活性の損失が大きくなるからであ
る。

今や驚くべきことに、水あるいは強く希釈され
た塩化水素酸もしくは臭化水素酸で溶離した場合
にセクレチンが塩酸塩あるいは臭化水素酸塩とし
てアルキル化デキストランゲルでのクロマトグラ
フイーにより精製されることが見出された。なか
んずく溶離には0.001〜0.005n塩酸あるいは臭化
水素酸を用いる。何故ならばこれらの溶液ではセ
クレチンの生物学的活性は純粋な水におけるよう
に早くは減少しないからである。

この方法の利点は、ただ１種の簡単な精製操作
が必要であるのみでありそしてセクレチンは１回
の凍結乾燥により塩を含まないで得られることに
ある。酸性溶離剤は例えばシステイン、アラニン
あるいはグリシンのようなアミノ酸を用いても脱
緩衝しうる。これらの脱緩衝された溶媒において
はセクレチンの生物学的活性は純粋な水中におけ
るよりも良好に保たれる。かくして得られるセク
レチンは添加アミノ酸で汚染されているがしかし
このことは製剤形態にとつて多分所望されうるこ
とであろう。

セクレチンはすでに種々の方法により製造され
ている〔J.Am.Chem.Soc.第89巻第6753頁
（1967）および同第90巻第4711頁（1968）ならび
に、Chem.Ber.第105巻第2508頁（1972）および
同第107巻第215頁（1974）参照〕。しかしこれら
の既知方法は多量のセクレチンを調製することに
対してはあまり適しない。何故ならば例えば断片
（フラグメント）の溶解度が不充分なのでペプチ
ド結合の際の反応速度が遅くなるからである。

それゆえに、本発明の目的はさらに、Ｚ−Thr（Bu^t）−Ser（Bu^t）−Glu（OBu^t）−Leu−Ser（Bu^t）−Arg−Leu−OH ……（）の化合物をＨ−Arg−Asp（OBu^t）−Ser（Bu^t）−Ala−Arg−Leu−Gln−Arg−Leu−Leu−Gln−Gly −Leu−Val−NH₂ ……（）と縮合させ、そして得られる式Ｚ−Thr（Bu^t）−Ser（Bu^t）−Glu−（OBu^t）−Leu−Ser（Bu^t）−Arg−Leu−Arg −Asp（OBu^t）−Ser（Bu^t）−Ala−Arg−Leu−Gln−Arg−Leu−Leu−Gln−Gly−Leu−Val −NH₂ ……（）のペプチドをパラジウム触媒を用いて接触水素添
加しそして続いて得られる式Ｈ−Thr（Bu^t）−Ser（Bu^t）−Glu（OBu^t）−Leu−Ser（Bu^t）−Arg−Leu−Arg −Asp（OBu^t）−Ser（Bu^t）−Ala−Arg−Leu−Gln−Arg−Leu−Leu−Gln−Gly−Leu −Val−NH₂ ……（）のペプチドを Boc−His−Ser（Bu^t）−Asp（OBu^t）−Gly−Thr（Bu^t）−Phe−OH ……（）と縮合させ、そして保護基をトリフルオル酢酸で
開裂させることによるセクレチンの製法におい
て、以上の縮合に際してペプチド断片および
をジメチルホルムアミドおよびジメチルアセトア
ミドからなる混合物中で３−ヒドロキシ−４−オ
キソ−３・４−ジヒドロ−１・２・３−ベンゾト
リアジンおよびジシクロヘキシルカルボジイミド
で予め活性化（その際ではピリジン臭化水素酸
塩の存在が必要である）し、とから得られる
ペプチドをメタノール中で処理することにより
精製し、の接触水素添加を80〜90％トリフルオ
ルエタノール水溶液中で行ない、との縮合の
際ペプチドをジメチルホルムアミド／ジメチル
アセトアミド混合物中に予め溶解させそして保護
基の解裂を５〜20％の２〜6n HClあるいはHBr
および（または）システイン塩酸塩の存在下に行
ないそしてかくして得られるセクレチン塩酸塩を
上記のようにして精製することを特徴とする方法
にある。

との結合に際してはこれまでジシクロヘキ
シルカルボジイミド／１−ヒドロキシベンゾトリ
アゾール（DCC／HOBt）法が利用されてきた
〔Chem.Ber.第107巻第215頁（1974）参照〕。しか
しながらカルボキシ成分が極端に難溶性であるこ
とで大いに困難を惹き起している。7.7ミリモル
部分に対して溶媒として400mlのジメチルホルム
アミド（DMF）を必要とする。希釈が大きいこ
とにより反応速度が強く減殺され、そして長い反
応時間（２日間）が必要となる。

今や驚くべきことに、難溶性のカルボキシル成
分がピリジン臭化水素酸塩および３−ヒドロキ
シ−４−オキソ−３・４−ジヒドロ−ベンゾトリ
アジン（HOOBt）の存在下にDMFとジメチルア
セトアミド（DMA）の混合物中に良好に溶解す
ることが見出された。もし一成分を除くと、溶解
度は低下する。この挙動はDCC／HOOBtを用い
る難溶性ヘプタペプチドの予活性化にとつて理想
的である。ピリジン臭化水素酸塩はアルギニンの
遊離グアニジノ基のプロトン化に役立つ。かくし
て10ミリモルのカルボキシル成分を溶解するの
にわずかに50mlのDMFおよび50mlのDMAが必要
となる。予活性化には２時間が必要である。アミ
ノ成分（10ミリモル）は同様にDMF50mlおよ
びDMA50ml中に溶解する。２時間にカツプリン
グ時間をおいたのち後処理する。合計溶媒消費量
はかくして200ml／10ミリモルでありそして合計
反応時間は４時間である。

最後のカツプリング、すなわちとが結合し
て BOc−His−Ser（Bu^t）−Asp（OBu^t）−Gly−Thr（Bu^t）−Phe−Thr（Bu^t）−Ser（Bu^t） −Glu（OBu^t）−Leu−Ser（Bu^t）−Arg−Leu−Arg−Asp（OBu^t）−Ser（Bu^t）−Ala −Arg−Leu−Gln−Arg−Leu−Leu−Gln−Gly−Leu−Val−NH₂ となる場合も、DCC／HOOBtを用いるカルボキ
シル成分の予活性化はDCC／HOBtを用いる一槽
方法（one−pot process）〔Chem.Ber.第107巻第
215頁（1974）参照〕より優れており、その場合
DMFおよびDMAの混合物が再びアミノ成分に対
する溶媒として使用される。反応時間はここでは
36時間から６時間に短縮される。

との縮合により得られるペプチドはこれ
まで酢酸エステルと煮沸〔Chem.Ber.第107巻第
215頁（1974）参照〕によるかあるいはメタノー
ル／酢酸エステルからの再沈殿〔Chem.Ber.第
105巻第2508頁（1972）参照〕により精製されて
いた。この精製操作は難溶性出発物質では何ら大
きな精製効果を有しないことが理解される。驚く
べきことに、この物質をメタノールと煮沸すると
強い精製効果を得られることが判明した。このこ
とは上記文献〔Chem.Ber.第105巻第2508頁
（1972）参照〕と反対のことを表わしており、そ
れによるとペプチドはメタノールに溶解すること
になつている。

からへの接触水素添加はこれまでメタノー
ルとDMAからなる混合物中（143ml/ｇ、Chem.
Ber.第107巻第215頁参照）あるいは80％酢酸中
（269ml/ｇ、Chem.Ber.第105巻第2508頁）で行な
われていた。今や接触水素添加に特に適した溶媒
として80〜90％２・２・２−トリフルオルエタノ
ール（11ml/ｇ）が実証された。この溶媒は酢酸
に対して何らアセチル化が行なわれえないという
利点を有している。メタノール／DMAの混合物
中にはメタノールで精製した生成物は実際上溶
解しない。

接触水素添加後に生成する 5HBr・Ｈ−Thr（Bu^t）−Ser（Bu^t）−Glu（OBu^t）−Leu−Ser（Bu^t）−Arg−Leu−Arg −Asp（OBu^t）−Ser（Bu^t）−Ala−Arg−Leu−Gln−Arg−Leu−Leu−Gln−Gly−Leu −Val−NH₂ ……（）を、Chem.Ber.第105巻第2508頁（1972）によれ
ば生成物がメタノール溶解性であると記載されて
いるにもかかわらず、メタノールと煮沸すること
により再び良く精製する。

かくして製造される保護されたセクレチンを慣
用のようにトリフルオル酢酸で処理すると、第三
ブチル型の保護基が解裂される。

しかしながら、２〜6n Hclおよび／またはシ
ステイン塩酸塩５〜20％が添加されているトリフ
ルオル酢酸中で保護基を解裂させるのが好ましい
ことが判つた。この方法では活性度の比較的高い
粗セクレチンが得られ、これは本発明による精製
法によりアルキル化デキストランゲルでクロマト
グラフイーすることにより容易に精製される。

セクレチンは分泌性膵臓機能の全体検査に診断
剤としてそして十二指腸漬瘍の治療剤として使用
される。

実施例Ｚ−Thr（Bu^t）−Ser（Bu^t）−Gln（OBu^t）−
Leu−Ser（Bu^t）−Arg−Leu−Arg−Asp
（OBu^t）−Ser（Bu^t）−Ala−Arg−Leu−Gln−
Arg−Leu−Leu−Gln−Gly−Leu−Val−NH₂ ジメチルホルムアミド50mlおよびジメチルアセ
トアミド50mlからなる混合物中のＺ−Thr
（Bu^t）−Ser（Bu^t）−Glu（OBu^t）−Leu−Ser
（Bu^t）−Arg−Leu−OH・2H₂O12ｇ、ピリジン臭
化水素酸塩1.6ｇおよび３−ヒドロキシ−４−オ
キソ−３・４−ジヒドロ−１・２・３−ベンゾト
リアジン1.63ｇの溶液中にジシクロヘキシルカル
ボジイミド8.4ｇを加えそして室温で２時間撹拌
する。その間にＨ−Arg−Asp（OBu^t）−Ser
（Bu^t）−Ala−Arg−Leu−Gln−Arg−Leu−Leu
−Gln−Gly−Leu−Val−NH₂・4HBr18.8ｇおよ
びＮ−エチルモルホリン5.2mlをジメチルホルム
アミド50mlおよびジメチルアセトアミド50mlから
なる混合物中に溶解させる。この溶液中に予活性
化部分を過して入れる。そこでさらに２時間室
温で撹拌しそして酢酸エステル３中に撹拌下に
加える。析出する沈殿を吸引過し、酢酸エステ
ルと１回煮沸しそして再び吸引過する。さらに
精製するためにメタノール200mlと１回煮沸しそ
して吸引過する。もう１回酢酸エステルと撹拌
し、煮沸し、冷却し、吸引過しそして乾燥させ
る。収量23.1ｇ、m.p.262〜265℃、〔α〕^２０ _Ｄ＝−
22.4゜（ｃ＝１、80％酢酸中）。

Ｈ−Thr（Bu^t）−Ser（Bu^t）−Glu（OBu^t）−
Leu−Ser（Bu^t）−Arg−Leu−Arg−Asp
（OBu^t）−Ser（Bu^t）−Ala−Arg−Leu−Gln−
Arg−Leu−Leu−Gln−Gly−Leu−Val−
NH₂・5HBr Ｚ−Thr（Bu^t）−Ser（Bu^t）−Glu（OBu^t）−
Leu−Ser（Bu^t）−Arg−Leu−Arg−Asp
（OBu^t）−Ser（Bu^t）−Ala−Arg−Leu−Gln−
Arg−Leu−Leu−Gln−Gly−Leu−Val−NH₂6ｇ
およびピリジン塩酸塩300mgを80％トリフルオル
エタノール7.0ml中に溶解する。若干のPd／炭素
触媒を加えそして水素を導入する。水素添加の終
了後（排出ガス中にCO₂なし）、触媒を吸引過
しそしてトリフルオルエタノールを留去する。残
留物を酢酸エステルと磨砕しそして吸引過す
る。さらに精製するにはメタノールと煮沸する。
室温となしそして吸引過する。続いてもう１回
酢酸エステルと煮沸し、冷却しそして吸引過す
る。収量4.58ｇ、〔α〕^２０ _Ｄ＝−26.1゜（ｃ＝１、80
％酢酸中）。

Boc−His−Ser（Bu^t）−Asp（OBu^t）−Gly−
Thr（Bu^t）−Phe−Thr（Bu^t）−Ser（Bu^t）−
Glu（OBu^t）−Leu−Ser（Bu^t）−Arg−Leu−
Arg−Asp（OBu^t）−Ser（Bu^t）−Ala−Arg−
Leu−Gln−Arg−Leu−Leu−Gln−Gly−Leu
−Val−NH₂ ジメチルアセトアミド17ml中のBoc−His−Ser
（Bu^t）−Asp（OBu^t）−Gly−Thr（Bu^t）−Phe−
OH4.24ｇおよび３−ヒドロキシ−４−オキソ−
３・４−ジヒドロ−１・２・３−ベンゾトリアジ
ン709mgの溶液中に０℃で2.87ｇのDCCを加え
る。０℃で１時間そして室温で１時間撹拌する。
その間にジメチルホルムアミド87mlおよびジメチ
ルアセトアミド87mlからなる混合物中にＨ−Thr
（Bu^t）−Ser（Bu^t）−Glu（OBu^t）−Leu−Ser
（Bu^t）−Arg−Leu−Arg−Asp（OBu^t）−Ser
（Bu^t）−Ala−Arg−Leu−Gln−Arg−Leu−Leu
−Gln−Gly−Leu−Val−NH₂・5HBr13.7ｇをゼ
ラチン状の塊となるまで溶解させる。このゼラチ
ン状の溶液中にＮ−エチルモルホリン1.13mlを加
え、ジメチルアセトアミド22mlで希釈しそして予
活性化部分を注ぐ。そこで室温で２時間撹拌す
る。その間に、上記のようにしてもう１つ予活性
部分を調製し、これを再び反応部分に過して加
える。もう１回室温で２時間撹拌しそしてゼラチ
ン状の溶液を熱酢酸エステル1740mlと撹拌する。
室温まで冷却し且つ沈殿を吸引過する。沈殿を
もう１回酢酸エステルと煮沸し、吸引過しそし
て乾燥する。収量17ｇ。

粗セクレチンおよびセクレチン精製 (a) トリフルオル酢酸15mlおよび4n HCl 1.5ml
からなる混合物中に保護されたセクレチン1.5
ｇおよびシステイン塩酸塩150mgを溶解させ
る。室温に30分間放置し、濃縮し、水に溶解し
そしてこの溶液を凍結乾燥する。収量1.69ｇ。

粗セクレチン1.69ｇを0.001nシステインHCl
溶液約10ml中に溶解しそしてセフアデツクス
LH−20カラム（200×４cm）でクロマトグラフ
イーで処理する。0.001nシステインHCl溶液を
用いて溶離する。300滴までを１フラクシヨン
として捕捉する。良好なセクレチンフラクシヨ
ンは初めのピークの下降部分（約32〜37フラク
シヨン）にある。セクレチン含有フラクシヨン
を合しそして凍結乾燥する。収量約400mg。後
続のフラクシヨンからさらに約80mgのわずかに
汚染されたセクレチンが取得される。400mgま
での主フラクシヨンはアミノ酸分析でペプチド
含量65％および生物学的活性2600E/mgを有す
る。これは活性度4000E/mgペプチド塩基に相
当する。保護されたセクレチンに基づく収量22
％。塩および水と並んでかくして単離されたセ
クレチンはなお約５％のシステイン塩酸塩を含
有している。アミノ酸分析結果は次のとおりで
ある。Asp（2.0）、Thr（1.9）、Ser（3.1）、
Glu（3.0）、Gly（2.0）、Ala（1.1）、Cys
（0.7）、Val（1.1）、Leu（6.0）、Phe（1.0）、
His（1.0）、Arg（3.9）。

(b) 保護されたセクレチン1.5ｇをトリフルオル
酢酸15mlおよび4n HCl 1.5mlからなる混合物
中に溶解させる。30分間室温で撹拌し、濃縮し
且つ水に溶解させ、そしてこの溶液を凍結乾燥
する。収量1.328ｇ。

ここで得られる粗セクレチン1.328ｇを
0.005n HCl約10ml中に溶解しそしてセフアデ
ツクスLH−20カラム（200×４cm）でクロマト
グラフイー処理する。0.005n HClで溶離す
る。300滴までを１フラクシヨンとして捕捉す
る。良好なセクレチンフラクシヨンは第２ピー
クの上昇区分（約34〜39フラクシヨン）中に包
含されている。フラクシヨンを合しそして凍結
乾燥する。収量419mg。後続のフラクシヨン中
からさらに296.5mgの汚染されているセクレチ
ンが取得される。419mgまでの主フラクシヨン
はアミノ酸分析ではペプチド含量70％および生
物学的活性度2600〜2700E/mgを有する。しか
しながらアミノ酸分析は上記(a)項のそれに相当
するがシステインは何ら含有していない。

Claims

【特許請求の範囲】１セクレチン塩酸塩あるいは臭化水素酸塩を
水、希塩酸水溶液あるいは希臭化水素酸水溶液を
溶離剤として用いてアルキル化デキストランゲル
でのクロマトグラフイーにより精製することを特
徴とする、セクレチンの精製法。２ HClまたはHBr溶液を当モル量までのアミノ
酸を用いて脱緩衝することを特徴とする、前記特
許請求の範囲第１項による方法。３Ｚ−Thr（Bu^t）−Ser（Bu^t）−Glu（OBu^t）−Leu−Ser（Bu^t）−Arg−Leu−OH ……（）をＨ−Arg−Asp（OBu^t）−Ser（Bu^t）−Ala−Arg−Leu−Gln−Arg−Leu−Leu−Gln−Gly −Leu−Val−NH₂ ……（）と縮合させ、得られるペプチドＺ−Thr（Bu^t）−Ser（Bu^t）−Glu（OBu^t）−Leu−Ser（Bu^t）−Arg−Leu−Arg −Asp（OBu^t）−Ser（Bu^t）−Ala−Arg−Leu−Gln−Arg−Leu−Leu−Gln−Gly−Leu−Val −NH₂ ……（）をパラジウム触媒を用いて接触水素添加し、続い
て、得られるペプチドＨ−Thr（Bu^t）−Ser（Bu^t）−Glu（OBu^t）−Leu−Ser（Bu^t）−Arg−Leu−Arg −Asp（OBu^t）−Ser（Bu^t）−Ala−Arg−Leu−Gln−Arg−Leu−Leu−Gln−Gly−Leu −Val−NH₂ ……（）を Boc−His−Ser（Bu^t）−Asp（OBu^t）−Gly−Thr（Bu^t）−Phe−OH ……（）と縮合させ、そして保護基をトリフルオル酢酸で
解裂させることによるセクレチンの製造にあた
り、以上の縮合に際してペプチド断片および
をジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド
またはそれらの混合物の存在下に３−ヒドロキシ
−４−オキソ−３・４−ジヒドロ−１・２・３−
ベンゾトリアジンおよびシクロヘキシルカルボジ
イミドを用いて予活性化し、その際ではピリジ
ン臭化水素酸塩の存在が必要であり、とから
得られるペプチドをメタノール中処理すること
により精製し、の接触水素添加を80〜90％トリ
フルオルエタノール水溶液中で行ない、との
縮合の際ペプチドをジメチルホルムアミド／ジ
メチルアセトアミド混合物中に予め溶解し、保護
基の解裂を５〜20％の２〜6N HClあるいはHBr
および／またはシステイン塩酸塩の存在下に行な
いそしてかくして得られるセクレチン塩酸塩を
水、希塩酸水溶液あるいは希臭化水素酸水溶液を
溶離剤として用いてアルキル化デキストランゲル
でのクロマトグラフイーにより精製することを特
徴とする、セクレチンの製法。