JPS61162176A - コレステロールエステラーゼの收得法 - Google Patents
コレステロールエステラーゼの收得法Info
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- JPS61162176A JPS61162176A JP60289526A JP28952685A JPS61162176A JP S61162176 A JPS61162176 A JP S61162176A JP 60289526 A JP60289526 A JP 60289526A JP 28952685 A JP28952685 A JP 28952685A JP S61162176 A JPS61162176 A JP S61162176A
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- cholesterol esterase
- culturing
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
-
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- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/874—Pseudomonas
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、微生物からコレステロールエステラーゼを収
得する方法に関する。コレステロールエステラーゼは、
コレステロールの酵素による測定法が開発されて以来、
臨床分析において重要な役割を演じる。
得する方法に関する。コレステロールエステラーゼは、
コレステロールの酵素による測定法が開発されて以来、
臨床分析において重要な役割を演じる。
従来の技術
］レスチロールの大部分は生物体内ではエステルの形で
存在するので、コレステロールエステラーゼ及びコレス
テロール酸化酵素、例えばコレステロールオキシダーゼ
又ハコレスチロールデヒドロゲナーゼを一緒に使用する
ことにより、コレステロールの完全酵素測定が可能であ
る（西独国特許第２２６４８４７号明細書）。
存在するので、コレステロールエステラーゼ及びコレス
テロール酸化酵素、例えばコレステロールオキシダーゼ
又ハコレスチロールデヒドロゲナーゼを一緒に使用する
ことにより、コレステロールの完全酵素測定が可能であ
る（西独国特許第２２６４８４７号明細書）。
こノ場合、コレステロールエステラーゼでのコレステロ
ール測定の範囲内では、微生物からの酵素が特に適当で
あることが判明した（西独国特許出願公開第２５０６７
１２．３号明細書）。
ール測定の範囲内では、微生物からの酵素が特に適当で
あることが判明した（西独国特許出願公開第２５０６７
１２．３号明細書）。
公知方法においては、一般に培養は誘導質を含有する培
養基内で行なわれる（ヨーロッパ特許第２４３４５号明
細書参照）。この場合、”誘導質”とは、微生物を所望
の酵素を主として形成するか又は誘導質が存在しない場
合よりも大量に形成することを励起する物質であると理
解されるべきである。それというのも、十分に別の培養
源が供給されるので、微生物はコレステロールエステラ
ーゼを必要としないからであす、従ってこれらはコレス
テロールエステルを評価するためには不適当である。従
って、誘導質は少なくともコレステロールエステル又ハ
化学的に類似した化合物から成る。
養基内で行なわれる（ヨーロッパ特許第２４３４５号明
細書参照）。この場合、”誘導質”とは、微生物を所望
の酵素を主として形成するか又は誘導質が存在しない場
合よりも大量に形成することを励起する物質であると理
解されるべきである。それというのも、十分に別の培養
源が供給されるので、微生物はコレステロールエステラ
ーゼを必要としないからであす、従ってこれらはコレス
テロールエステルを評価するためには不適当である。従
って、誘導質は少なくともコレステロールエステル又ハ
化学的に類似した化合物から成る。
コレステロールエステルを化学的に遠ざける特定の誘導
質を使用すると、同様に酵素活性を高めることができる
ことも公知である。
質を使用すると、同様に酵素活性を高めることができる
ことも公知である。
しかしまた、炭素源として、特に唯一の炭素源として公
知の誘導質を使用すると、コレステロールエステラーゼ
の収率は比較的低い。
知の誘導質を使用すると、コレステロールエステラーゼ
の収率は比較的低い。
公知方法のもう１つの問題点は、発酵終了した培養液の
後処理にある。
後処理にある。
全ての公知の誘導質はほとんど水不容性であシかつ十分
に利用されない。従って、有機溶剤又は同種のもので抽
出することによシ誘導質残渣を除去することが必要とな
り、このことは精製した酵素の安定性に決定的に不利な
影響を及ぼす。
に利用されない。従って、有機溶剤又は同種のもので抽
出することによシ誘導質残渣を除去することが必要とな
り、このことは精製した酵素の安定性に決定的に不利な
影響を及ぼす。
発明が解決しようとする問題点
本発明の課題は、公印方法の欠点を排除し、かつ唯一の
炭素源を用いかつ特別の誘導質を使用しないで、公知方
法よシも良好な酵素収率を可能にする方法を提供するこ
とであった。更に、本発明の課題は、後処理が簡単であ
シかつ有機溶剤での抽出を必要としない上記形式の方法
を見い出すことであった。 − 前記課題は、本発明により、適当な微生物を適当な培養
基中で培養しかつ培養液又は生物有機体から酵素を収得
することによりフルステロールエステラーゼを収得する
方法において、培養を唯一の炭素源として１０〜２０個
の炭素原子を有するｎ−アルカンを含有する鉱物塩媒体
中で、通気式浸漬培養として実施することによシ解決さ
れる。培養は１段階以上で・ζツチ式で並びにまた一部
もしくは完全連続的作業法で実施することができる。こ
のためにはケモスタット並びにまたタービＰスタット操
作法が適当である。
炭素源を用いかつ特別の誘導質を使用しないで、公知方
法よシも良好な酵素収率を可能にする方法を提供するこ
とであった。更に、本発明の課題は、後処理が簡単であ
シかつ有機溶剤での抽出を必要としない上記形式の方法
を見い出すことであった。 − 前記課題は、本発明により、適当な微生物を適当な培養
基中で培養しかつ培養液又は生物有機体から酵素を収得
することによりフルステロールエステラーゼを収得する
方法において、培養を唯一の炭素源として１０〜２０個
の炭素原子を有するｎ−アルカンを含有する鉱物塩媒体
中で、通気式浸漬培養として実施することによシ解決さ
れる。培養は１段階以上で・ζツチ式で並びにまた一部
もしくは完全連続的作業法で実施することができる。こ
のためにはケモスタット並びにまたタービＰスタット操
作法が適当である。
本発明方法を実施するには、微生物を本発明に基づき唯
一の炭素源としてｎ−アルカンを含有する培養基にまず
常法で、培養において徐々に容量を増大させて接種する
ことにより適応させる。一般にはまず固体の培養寒天に
接種し、次いで有利には全媒体中で振とう培養により培
養しかつ次いで本発明によるｎ−アルカンを含有する鉱
物塩媒体中に移種する。更に、この前培養においては、
少なくとも５０００Ｕ／ｌのコレステロールエステラー
ゼ活性が達成するまで培養するのが有利である。
一の炭素源としてｎ−アルカンを含有する培養基にまず
常法で、培養において徐々に容量を増大させて接種する
ことにより適応させる。一般にはまず固体の培養寒天に
接種し、次いで有利には全媒体中で振とう培養により培
養しかつ次いで本発明によるｎ−アルカンを含有する鉱
物塩媒体中に移種する。更に、この前培養においては、
少なくとも５０００Ｕ／ｌのコレステロールエステラー
ゼ活性が達成するまで培養するのが有利である。
主培養においては、温度は約１５〜４５℃であるのが有
利である。特に２５〜３５℃で操作するのが有利である
。一般にこの条件下では２〜５日間の培養時間で最大酵
素収率が達成され、大抵の場合２〜３日間の培養で十分
である。こノ場合、コレステロールエステラーゼは媒体
内並びにまた細胞内に発生する。培養時間が長くなると
、生物有機体内の酵素活性と培養液内の酵素活性との比
は、最終的には全活性が培養液内に存在するまで、移行
する。従って、本発明の有利な１実施例では、培養は実
際に全ての活性が培養液内に存在し、かつその後培養濾
液から単離しかつ場合によシ精製することができるよう
になるまで実施する。
利である。特に２５〜３５℃で操作するのが有利である
。一般にこの条件下では２〜５日間の培養時間で最大酵
素収率が達成され、大抵の場合２〜３日間の培養で十分
である。こノ場合、コレステロールエステラーゼは媒体
内並びにまた細胞内に発生する。培養時間が長くなると
、生物有機体内の酵素活性と培養液内の酵素活性との比
は、最終的には全活性が培養液内に存在するまで、移行
する。従って、本発明の有利な１実施例では、培養は実
際に全ての活性が培養液内に存在し、かつその後培養濾
液から単離しかつ場合によシ精製することができるよう
になるまで実施する。
培養液内への移行は、例えばｐＨ変化、培養温度の変化
又は表面活性物質の添加により促進することができる。
又は表面活性物質の添加により促進することができる。
培養基内のｎ−アルカン濃度は、一般には０．１〜５％
Ｖ／Ｖの範囲に保持する。しかしながら、この値は、何
らの利点をももたらさないが、下回っても又は上回って
もよい。
Ｖ／Ｖの範囲に保持する。しかしながら、この値は、何
らの利点をももたらさないが、下回っても又は上回って
もよい。
ｐＨ値は調整剤を加えることにより約５〜９、有利には
６〜８の値に保つのが有利である。
６〜８の値に保つのが有利である。
本発明による特に有利な培養基は、ｎ−アルカンを別に
してなお以下の塩を１００ＯＡ’（１、Ｆ）に対して以
下の量で含有する： （ＮＨ４）２ＨＰＯ４５〜１０ｋｌｉ＋、特に６〜８ｋ
ｇＫＨＰｏ １〜５ｋＬ特に２〜４
ｋｇＭｇ５０４ ０．２〜２ｋＬ特に０．
８〜１．２ ｋｇ ＣａＣ１□
０．２〜２ｋｇ、特に０．８〜１．２ｋｇＮａＣｌ
Ｏ，０１〜ｏ、ｓｋｙ、特に０．
０３〜０．１５ｋｌ？ １％ｏＦｅ＋１３ｔｌ液 ０．１〜１１ｋｇ０．
２ Ｎ ｏｃｕｃ ｌ □ｆｎ液 ０．１〜１１ｋｇ
並びに元素Ｍｎ、Ｃｏ、Ｍｏ及びＢの微量。
してなお以下の塩を１００ＯＡ’（１、Ｆ）に対して以
下の量で含有する： （ＮＨ４）２ＨＰＯ４５〜１０ｋｌｉ＋、特に６〜８ｋ
ｇＫＨＰｏ １〜５ｋＬ特に２〜４
ｋｇＭｇ５０４ ０．２〜２ｋＬ特に０．
８〜１．２ ｋｇ ＣａＣ１□
０．２〜２ｋｇ、特に０．８〜１．２ｋｇＮａＣｌ
Ｏ，０１〜ｏ、ｓｋｙ、特に０．
０３〜０．１５ｋｌ？ １％ｏＦｅ＋１３ｔｌ液 ０．１〜１１ｋｇ０．
２ Ｎ ｏｃｕｃ ｌ □ｆｎ液 ０．１〜１１ｋｇ
並びに元素Ｍｎ、Ｃｏ、Ｍｏ及びＢの微量。
微生物としては、原則として、後処理のしがいがあるコ
レステロールエステラーゼの含量をもたらすものを使用
することができる。大量の適当な微生物は、例えば西独
国特許出願公開第２５０６７１２号明細書から公知であ
る。本発明の範囲内では、ゾソイｒモナス種ＤＳＭ１２
８０及びＤＳＭ１２８１を使用するのが有利である。
レステロールエステラーゼの含量をもたらすものを使用
することができる。大量の適当な微生物は、例えば西独
国特許出願公開第２５０６７１２号明細書から公知であ
る。本発明の範囲内では、ゾソイｒモナス種ＤＳＭ１２
８０及びＤＳＭ１２８１を使用するのが有利である。
ｎ−アルカンとしては、１４〜１８個の炭素原子を有す
る直鎖状ｎ−アルカン、従って特にｎ−テトラデカン、
ｎ−へキサデカン及びｎ−オクタデカンを含有する化合
物又は混合物で最良の結果が生じる。
る直鎖状ｎ−アルカン、従って特にｎ−テトラデカン、
ｎ−へキサデカン及びｎ−オクタデカンを含有する化合
物又は混合物で最良の結果が生じる。
実施例
次に、時間と関連した培養液内の媒体中のｎ−アルカン
の減少、乾量Ｃ１／ｌ）、微生物密度（ＯＤ）及び酵素
活性の増加を示す図面との関連において、実施例によシ
本発明の詳細な説明する。
の減少、乾量Ｃ１／ｌ）、微生物密度（ＯＤ）及び酵素
活性の増加を示す図面との関連において、実施例によシ
本発明の詳細な説明する。
２）接種及び前培養
プソイｒモナス種ＤＳＭ１２８１の斜面寒天培地を３０
℃で７２時間培養しかつ引続き４℃で保管する。培養基
組成は１）と同じである。
℃で７２時間培養しかつ引続き４℃で保管する。培養基
組成は１）と同じである。
１）液状処理
３００ ａｔの振とうフラスコ内の１）に記載の培養基
１００ ＩＩＩ／及び酵母エキス０．２％（重量／容量
）を、斜面寒天培養基の耳を接種しかつ３０℃、１３０
ｒ−で７２時間培養する。
１００ ＩＩＩ／及び酵母エキス０．２％（重量／容量
）を、斜面寒天培養基の耳を接種しかつ３０℃、１３０
ｒ−で７２時間培養する。
２）液状処理
夫々培養基２５０Ｍを有する４個の１１振とうフラスコ
を、第１の液状処理から比１ ： １００で接種し、３
０℃及び１３０ｒｐ”で７２時間振とうする。
を、第１の液状処理から比１ ： １００で接種し、３
０℃及び１３０ｒｐ”で７２時間振とうする。
その際、ｐＨ値は７．５〜８．０であシがっコレステロ
ールエステラーゼ活性は約５０００Ｕ／ｌである。
ールエステラーゼ活性は約５０００Ｕ／ｌである。
これらの液状処理は、ＩＯＪ発酵器のための接種培養液
として役立つ。
として役立つ。
３）前発酵
４つのそらせ板及び３つの円板攪拌機を備え゛ たｌ
ｏｌｔ発酵器を使用する：接種物は１％である。
ｏｌｔ発酵器を使用する：接種物は１％である。
前発酵の経過時間は約２４〜４８時間である。
その際、コレステロールエステラーゼ活性は約６Ｘ１０
’Ｕ／Ｊである。
’Ｕ／Ｊである。
４）主発酵
３つの円板攪拌機、４つのそらせ板及び１つの機械的消
泡装置を備えたＩｎ発酵器を使用する。
泡装置を備えたＩｎ発酵器を使用する。
プロセス水として、飲料水を使用する。全ての培養基成
分を発酵器内で溶かしかつ滅菌する。
分を発酵器内で溶かしかつ滅菌する。
ｎ−へキサデンカンを別に約１０％ＶＥ水で滅菌しかつ
２０℃よシも高い温度で培養基に無菌添加する。発酵は
２０〜３７℃、２５０〜４００ｒｐｍ及び空気供給０．
５〜１．５ ＶＶＭ テ２０〜５０時間実施する。
２０℃よシも高い温度で培養基に無菌添加する。発酵は
２０〜３７℃、２５０〜４００ｒｐｍ及び空気供給０．
５〜１．５ ＶＶＭ テ２０〜５０時間実施する。
発酵経過は図面にグラフで示されている。コレステロー
ルエステラーゼの収率ｄ６．５Ｘ１０’Ｕ／ｌである。
ルエステラーゼの収率ｄ６．５Ｘ１０’Ｕ／ｌである。
図面は本発明に基づき実施した、時間と関連した培養液
内の媒体中のｎ−アルカンの減少、乾燥（ｇ／ｌ）、微
生物密度（００）及び酵素活性の増加経過を示す図であ
る。
内の媒体中のｎ−アルカンの減少、乾燥（ｇ／ｌ）、微
生物密度（００）及び酵素活性の増加経過を示す図であ
る。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、適当な微生物を適当な培養基中で培養しかつ培養液
又は生物有機体から酵素を収得することによりコレステ
ロールエステラーゼを収得する方法において、培養を唯
一の炭素源として１０−２０個の炭素原子を有するｎ−
アルカンを含有する鉱物塩媒体中で通気式浸漬培養とし
て実施することを特徴とするコレステロールエステラー
ゼの収得法。 ２、１５〜４５℃で２〜５日間培養する特許請求の範囲
第１項記載の方法。 ３、実質的に全ての酵素活性が培養液内に存在するよう
になるまで培養する特許請求の範囲第２項記載の方法。 ４、培養媒体中のｎ−アルカン濃度が０．１〜５５％Ｖ
／Ｖである特許請求の範囲第１項から第３項までのいず
れか１項記載の方法。 ５、微生物を使用し、該微生物を、ｎ−アルカン媒体で
の前培養において少なくとも５０００Ｕ／ｌのコレステ
ロールエステラーゼ活性が達成されるまで培養する特許
請求の範囲第１項から第４項までのいずれか１項記載の
方法。 ６、ｎ−アルカンとして１４〜１８個の炭素原子を有す
るもの又はそれらの混合物を使用する特許請求の範囲第
１項から第５項までのいずれか１項記載の方法。 ７、培養中にｐＨを５〜９に保つ特許請求の範囲第１項
から第６項までのいずれか１項記載の方法。 ８、緩衝液として燐酸塩緩衝剤を使用する特許請求の範
囲第７項記載の方法。 ９、ＮＨ＿４、Ｆｅ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｃａ及びＭｇイオン
を含有する特許請求の範囲第１項から第８項までのいず
れか１項記載の方法。 １０、プソイドモナス種ＤＳＭ１２８０又は１２８１を
培養する特許請求の範囲第１項から第９項までのいずれ
か１項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19843447390 DE3447390A1 (de) | 1984-12-24 | 1984-12-24 | Verfahren zur gewinnung von cholesterinesterase |
| DE3447390.4 | 1984-12-24 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61162176A true JPS61162176A (ja) | 1986-07-22 |
| JPH0130475B2 JPH0130475B2 (ja) | 1989-06-20 |
Family
ID=6253889
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60289526A Granted JPS61162176A (ja) | 1984-12-24 | 1985-12-24 | コレステロールエステラーゼの收得法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4677068A (ja) |
| EP (1) | EP0188770B1 (ja) |
| JP (1) | JPS61162176A (ja) |
| AT (1) | ATE63570T1 (ja) |
| DE (2) | DE3447390A1 (ja) |
| DK (1) | DK578985A (ja) |
| ES (1) | ES8605575A1 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK186791D0 (da) * | 1991-11-15 | 1991-11-15 | Novo Nordisk As | Nye enzymer |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1283904A (en) * | 1969-01-30 | 1972-08-02 | Asahi Chemical Ind | Culture of microorganisms |
| FR2105445A5 (ja) * | 1970-09-07 | 1972-04-28 | Inst Francais Du Petrole | |
| JPS50157588A (ja) * | 1974-06-17 | 1975-12-19 | ||
| DE2933646A1 (de) * | 1979-08-20 | 1981-03-26 | Boehringer Mannheim Gmbh, 68305 Mannheim | Verfahren zur gewinnung von cholesterinesterase |
| DE3200274A1 (de) * | 1982-01-07 | 1983-07-14 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur stabilisierung waessriger loesungen von cholesterinesterase aus pseudomonaden |
-
1984
- 1984-12-24 DE DE19843447390 patent/DE3447390A1/de not_active Withdrawn
-
1985
- 1985-11-06 US US06/795,632 patent/US4677068A/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-11-28 ES ES549377A patent/ES8605575A1/es not_active Expired
- 1985-12-13 DK DK578985A patent/DK578985A/da not_active Application Discontinuation
- 1985-12-19 EP EP85116214A patent/EP0188770B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-12-19 AT AT85116214T patent/ATE63570T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-12-19 DE DE8585116214T patent/DE3582880D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-12-24 JP JP60289526A patent/JPS61162176A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0130475B2 (ja) | 1989-06-20 |
| US4677068A (en) | 1987-06-30 |
| ATE63570T1 (de) | 1991-06-15 |
| DK578985A (da) | 1986-06-25 |
| ES8605575A1 (es) | 1986-04-01 |
| DE3582880D1 (de) | 1991-06-20 |
| EP0188770A2 (de) | 1986-07-30 |
| DE3447390A1 (de) | 1986-07-03 |
| DK578985D0 (da) | 1985-12-13 |
| EP0188770A3 (en) | 1988-02-03 |
| EP0188770B1 (de) | 1991-05-15 |
| ES549377A0 (es) | 1986-04-01 |
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