JPH0130475B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

産業上の利用分野 本発明は、微生物からコレステロールエステラ
ーゼを収得する方法に関する。コレステロールエ
ステラーゼは、コレステロールの酵素による測定
法が開発されて以来、臨床分析において重要な役
割を演じる。 従来の技術 コレステロールの大部分は生物体内ではエステ
ルの形で存在するので、コレステロールエステラ
ーゼ及びコレステロール酸化酵素、例えばコレス
テロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒド
ロゲナーゼを一緒に使用することにより、コレス
テロールの完全酵素測定が可能である（西独国特
許第2264847号明細書）。 この場合、コレステロールエステラーゼでのコ
レステロール測定の範囲内では、微生物からの酵
素が特に適当であることが判明した（西独国特許
出願公開第2506712.3号明細書）。 公知方法においては、一般に培養は誘導質を含
有する培養基内で行なわれる（ヨーロツパ特許第
24345号明細書参照）。この場合、“誘導質”とは、
微生物を所望の酵素を主として形成するか又は誘
導質が存在しない場合よりも大量に形成すること
を励起する物質であると理解されるべきである。
それというのも、十分に別の培養源が供給される
ので、微生物はコレステロールエステラーゼを必
要としないからであり、従つてこれらはコレステ
ロールエステルを評価するためには不適当であ
る。従つて、誘導質は少なくともコレステロール
エステル又は化学的に類似した化合物から成る。 コレステロールエステルを化学的に遠ざける特
定の誘導質を使用すると、同様に酵素活性を高め
ることができることも公知である。 しかしまた、炭素源として、特に唯一の炭素源
として公知の誘導質を使用すると、コレステロー
ルエステラーゼの収率は比較的低い。 公知方法のもう一つの問題点は、発酵終了した
培養液の後処理にある。 全ての公知の誘導質はほとんど水不溶性であり
かつ十分に利用されない。従つて、有機溶剤又は
同種のもので抽出することにより誘導質残渣を除
去することが必要となり、このことは精製した酵
素の安定性に決定的に不利な影響を及ぼす。 発明が解決しようとする問題点 本発明の課題は、公知方法の欠点を排除し、か
つ唯一の炭素源を用いかつ特別の誘導質を使用し
ないで、公知方法よりも良好な酵素収率を可能に
する方法を提供することであつた。更に、本発明
の課題は、後処理が簡単でありかつ有機溶剤での
抽出を必要としない上記形式の方法を見い出すこ
とであつた。 問題点を解決するための手段 前記課題は、本発明により、プソイドモナス属
菌を適当な培養基中で培養しかつ培養液又は生物
有機体から酵素を収得することによりコルステロ
ールエステラーゼを収得する方法において、培養
を唯一の炭素源として10〜20個の炭素原子を有す
るｎ−アルカンを含有する鉱物塩媒体中で、通気
式浸漬培養として実施することにより解決され
る。培養は１段階以上でバツチ式で並びにまた一
部もしくは完全連続的作業法で実施することがで
きる。このためにはケモスタツト並びにまたター
ビドスタツト操作法が適当である。 本発明方法を実施するには、微生物を本発明に
基づき唯一の炭素源としてｎ−アルカンを含有す
る培養基にまず常法で、培養において徐々に容量
を増大させて接種することにより適応させる。一
般にはまず固体の培養寒天に接種し、次いで有利
には全媒体中で振とう培養により培養しかつ次い
で本発明によるｎ−アルカンを含有する鉱物塩媒
体中に移動する。更に、この前培養においては、
少なくとも5000U／のコレステロールエステラ
ーゼ活性が達成するまで培養するのが有利であ
る。 主培養においては、温度は約15〜45℃であるの
が有利である。特に25〜35℃で操作するのが有利
である。一般にこの条件下では２〜５日間の培養
時間で最大酵素収率が達成され、大低の場合２〜
３日間の培養で十分である。この場合、コレステ
ロールエステラーゼは媒体内並びにまた細胞内に
発生する。培養時間が長くなると、生物有機体内
の酵素活性と培養液内の酵素活性との比は、最終
的には全活性が培養液内に存在するまで、移行す
る。従つて、本発明の有利な１実施例では、培養
は実際に全ての活性が培養液内に存在し、かつそ
の後培養濾液から単離しかつ場合により精製する
ことができるようになるまで実施する。 培養液内への移行は、例えばPH変化、培養温度
の変化又は表面活性物質の添加により促進するこ
とができる。 培養基内のｎ−アルカン濃度は、一般には0.1
〜5v／ｖ％の範囲に保持する。しかしながら、
この値は、何らの利点をももたらさないが、下回
つても又は上回つてもよい。 PH値は調整剤を加えることにより約５〜９、有
利には６〜８の値に保つのが有利である。 本発明による特に有利な培養基は、ｎ−アルカ
ンを別にしてなお以下の塩を1000（１m³）に対
して以下の量で含有する： （NH₄）₂HPO₄ ５〜10Kg、特に６〜８Kg KH₂PO₄ １〜５Kg、特に２〜４Kg MgSO₄ 0.2〜２Kg、特に0.8〜1.2Kg CaCl₂ 0.2〜２Kg、特に0.8〜1.2Kg NaCl 0.01〜0.5Kg、特に0.03〜0.15Kg １％のFell₃溶液 0.1〜11Kg 0.2（％）のCuCl₂溶液 0.1〜11Kg 並びに元素Mn、Co、Mo及びＢの微量。 微生物としては、原則として、後処理のしがい
があるコレステロールエステラーゼの含量をもた
らすものを使用することができる。大量の適当な
微生物は、例えば西独国特許出願公開第2506712
号明細書から公知である。本発明の範囲内では、
プソイドモナス種DSM1280及びDSM1281を使用
するのが有利である。 ｎ−アルカンとしては、14〜18個の炭素原子を
有する直鎖状ｎ−アルカン、従つて特にｎ−テト
ラデカン、ｎ−ヘキサデカン及びｎ−オクタデカ
ンを含有する化合物又は混合物で最良の結果が生
じる。 実施例 次に、時間と関連した培養液内の媒体中のｎ−
アルカンの減少、乾量（ｇ／）、微生物密度
（OD）及び酵素活性の増加を示す図面との関連
において、実施例により本発明を詳細に説明す
る。

【表】

【表】 (2) 接種及び前培養 プソイドモナス種DSM1281の斜面寒天培地
を30℃で72時間培養しかつ引続き４℃で保管す
る。培養基組成は(1)と同じである。 (1) 液状処理 300mlの振とうフラスコ内の(1)に記載の培養
基100ml及び酵母エキス0.2％（重量／容量）
を、斜面寒天培養基の耳を接種しかつ30℃、
130rpmで72時間培養する。 (2) 液状処理 夫々培養基250mlを有する４個の１振とう
フラスコを、第１の液状処理から比１：100で
接種し、30℃及び130rpmで72時間振とうする。 その際、PH値は7.5〜8.0でありかつコレステ
ロールエステラーゼ活性は約5000U／であ
る。 これらの液状処理は、10発酵器のための接
種培養液として役立つ。 (3) 前発酵 ４つのそらせ板及び３つの円板撹拌機を備え
た10発酵器を使用する：接種物は１％であ
る。 前発酵の経過時間は約24〜48時間である。そ
の際、コレステロールエステラーゼ活性は約６
×10⁴U／である。 (4) 主発酵 ３つの円板撹拌機、４つのそらせ板及び１つ
の機械的消泡装置を備えた１m³発酵器を使用す
る。 プロセス水として、飲料水を使用する。全て
の培養基成分を発酵器内で溶かしかつ滅菌す
る。ｎ−ヘキサデンカンを別に約10％の完全脱
塩水で滅菌しかつ20℃よりも高い温度で培養基
に無菌添加する。発酵は20〜37℃、250〜
400rpm及び空気供給0.5〜1.5v／ｖ／ｍ（容量／
容量／分）で20〜50時間実施する。 発酵経過は図面にグラフで示されている。コ
レステロールエステラーゼの収率は6.5×
10⁴U／である。 比較例 （西独国特許出願公開第2933646号明細書の実
施例１） 強冷却アンプルから傾斜管に入れたプソイドモ
ナス属菌DSM1280を主培養基内で30℃で２日間
給気下に（振とうフラスコ）前培養しかつ次いで
その10％までを、１当り以下の組成： Ha₂HPO₄−2H₂O ７ｇ KH₂PO₄ ３ｇ NH₄Cl １ｇ NaCl 0.05ｇ FeCl₃（１％） 0.1ml CuCl₂（0.2％） 0.1ml ZnSO₄（１％） 0.1ml CaCl₂（10％） 1.0ml MgSO₄（12％） 5.0ml 大豆レシチン（PH7.0） 15ml 培養は、30℃で給気下に振とうフラスコ内で行
う。１〜３日後、活性度約15000U／（上澄及
び生物有機体；基質：コレステリルオレエート）
が得られる。 ほぼ同等な収率は、同じ条件下でプソイドモナ
ス属菌DSM1280の代わりにプソイドモナス属菌
DSM1281を使用する場合に得られる。 以上の比較例によれば、同じ微生物を使用して
15000U／の収量が達成されるのに対して、本
願発明の実施例によれば65000U／、即ち公知
技術水準の400％が達成される。

【図面の簡単な説明】

図面は本発明に基づき実施した、時間と関連し
た培養液内の媒体中のｎ−アルカンの減少、乾燥
（ｇ／）、微生物密度（OD）及び酵素活性の増
加経過を示す図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ プソイドモナス属菌を適当な培養基中で培養
   しかつ培養液又は生物有機体から酵素を収得する
   ことによりコレステロールエステラーゼを収得す
   る方法において、培養を唯一の炭素源として10〜
   20個の炭素原子を有するｎ−アルカンを含有する
   鉱物塩媒体中で通気式浸漬培養として実施するこ
   とを特徴とするコレステロールエステラーゼの収
   得法。 ２ 15〜45℃で２〜５日間培養する特許請求の範
   囲第１項記載の方法。 ３ 実質的に全ての酵素活性が培養液内に存在す
   るようになるまで培養する特許請求の範囲第２項
   記載の方法。 ４ 培養媒体中のｎ−アルカン濃度が0.1〜5v／
   ｖ％である特許請求の範囲第１項から第３項まで
   のいずれか１項記載の方法。 ５ プソイドモナス属菌を、ｎ−アルカン媒体で
   の前培養において少なくとも5000U／のコレス
   テロールエステラーゼ活性が達成されるまで培養
   する特許請求の範囲第１項から第４項までのいず
   れか１項記載の方法。 ６ ｎ−アルカンとして14〜18個の炭素原子を有
   するもの又はそれらの混合物を使用する特許請求
   の範囲第１項から第５項までのいずれか１項記載
   の方法。 ７ 培養中にPHを５〜９に保つ特許請求の範囲第
   １項から第６項までのいずれか１項記載の方法。 ８ 緩衝液として燐酸塩緩衝剤を使用する特許請
   求の範囲第７項記載の方法。 ９ NH₄、Fe、Cu、Zn、Ca及びMgイオンを含
   有する塩を使用する特許請求の範囲第１項から第
   ８項までのいずれか１項記載の方法。 １０ プソイドモナス種DSM1280又は1281を培
   養する特許請求の範囲第１項から第９項までのい
   ずれか１項記載の方法。