JPS61162178A

JPS61162178A - セルラ−ゼの生産改良法

Info

Publication number: JPS61162178A
Application number: JP58285A
Authority: JP
Inventors: Yoshiyuki Takasaki; 高崎　義幸; Hitoshi Yamabe; 倫山辺; Yasushi Mitsuishi; 三石　安
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 1985-01-07
Filing date: 1985-01-07
Publication date: 1986-07-22
Also published as: JPH0112475B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔技術分野〕本発明は、糸状菌によるセルラーゼの製造方法に関する
ものである。

〔従来技術〕

セルラーゼはセルロースをグルコースまたはセロビオー
スなどセロオリゴ糖分まで分解する酵素反応系を触媒す
る酵素群の総称であり、その作用様式により、Ｃ１−酵
素、　Ｃｘ−酵素とβ−グルカナーゼ、エフソーβ−グ
ルカナーゼ、エンド−β−グルカナーゼとセロビオース
など種々の名称で呼ばれる酵素群から構成されている。

近年、セルラーゼはバイオマス資源の有効利用の観点か
ら注目され、セルロースの糖化研究が盛んにおこなわれ
ているが、従来、セルラーゼ生産菌としてよく知られて
いる、トリコデルマ属、アスペルギルス属やペニシリウ
ム属などの微生物はセルラーゼの生産能が十分でないた
め、酵素の生産コストが高く、セルロースからグルコー
スなどの資源を収得するための酵素源として使用するこ
とができなかった。

本発明者らは、先に、結晶性セルロースに対する分解力
とグルコースへの転換能力が優れ、且つ熱安定性に優れ
たセルラーゼ・生産菌（アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏ
ｎｉｕｍ）属菌）を新たに分離した。そして本菌の生産
するセルラーゼを工業的に使用すべく、本菌の培養方法
について、鋭意研究を続けてきた結果、レシチンの存在
下で培養すると、セルラーゼの生産量、特に、エンド−
β−グルカナーゼ（（カルボキシメチルセルラーゼ（Ｃ
ＭＣアーゼ））とβ−グリコシダーゼの生産量が顕著に
増加できることを認めた。本発明は、この知見にもとず
いてなされたものである。

〔目　　的〕

従って、本発明の目的は、セルラーゼの生産改良法を提
供することにある。

〔構　　成〕

本発明はセルラーゼ生産能を有する糸状菌を培養して、
セルラーゼを生産するに際し、レシチンの存在下で培養
することを特徴とするセルラーゼの生産方法を提供する
ものである。

以下に本発明の詳細な説明する。

レシチンはホスファチジルコリン（リン脂質）の慣用名
であり、卵黄、血球、大豆などの植物種子、など動植物
界に広く存在してい物質である。

しかし、レシチンは構造が簡単であるため、天然のもの
のみならず１合成品も得られている。

本発明で使用されるレシチンとしては、動、植物から採
取されたもののほか、合成品のものも使用することがで
きるが、大豆製のものは、大量。

且つ安価に入手することができる。

レシチンは少量の添加で十分効果を示すが、通常０．１
〜１％程度添加すると、無添加の場合に比べ。

セルラーゼのうち、特にカルボキシメチルセルラーゼ（
ＣＭＣアーゼ）とβ−グルコシダーゼの生産量は２０〜
３０％程度増加する。

本発明に使用される糸状菌としては、トリコデルマ属、
アスペルギルス属、ペニシリウム属、スボロトリクム属
などのセルラーゼ生産菌の他、本発明者らにより新たに
分離されたアクレモニウム属のセルラーゼ生産菌などを
挙げることができ７゜本発明では例示菌として、アクレ
モニウム・セルロリテイカ宵ｃｒｅｍｏｎｉｕｍ　ｃｅ
ｌｌｕｌｏｌｉｔｉｃｕｓ）を使用する。本菌は、ｎＲ
５５ｐ−Ｉ、にとして工業技術院微生物工業技術研究所
に寄託されている。

本菌の菌学的性質の概要は下記の通りである。

生育：麦芽エキス寒天上では生育は速く、３０℃７日で
直径７０■ｍに達する。集落は最初白色で後にやや黄色
味をおびる。気生菌糸はゆるく盛り上がり羊毛状を呈し
、時に綿状の菌糸束を形成する。

培養後期には集落裏面は桃褐色ないし赤褐色を呈する。

ツアペック寒天上でもほぼ同様の生育を示すが気生菌糸
の盛り上がりはより少い。生育ｐＨ範囲は３．５〜６．
０で最適ＰＩ（は４付近、生育温度範囲は１５°Ｃ〜４
３℃で、最適生育温度は３０℃付近である。

形態：菌糸の直径は０．５〜２．５μ■、無色で菌糸に
は隔壁が認められる。また、菌糸表面は滑面である。

分生子：分生子形成能は非常に不安定でツアペック寒天
および麦芽エキス寒天借地による継代倍養により容易に
消失した。分離時におけるＩｌ！察では、分生子柄は気
生菌糸側面より突出し、無色である。

分生子は亜球形（２，５〜５Ｘ２〜４．５μｍ）で滑面
、無色で連鎖は非常にゆるく分散しやすい。

以上の菌学的性質について、１１．Ｇａｍ５のｒｃｅｐ
ｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ　　ａｒｔ、ｉｇｅ　　Ｓｃｈ
ｉｍｍｅｌｐｉｌｇｅＪ　　ｐ８４、Ｇ、　Ｆｉｓｈｅ
ｒ（１９７１年）及びＣ，Ｈ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、　
Ｍｙｃｏｌ。

と同定した。

本菌は、ＦＥＲＭ　Ｂｌ）−１，８＜とじて、工業技術
院微生物工業技術研究所に寄託されている。

本菌の生産するセルラーゼは下記の酵素的性質を有して
いる。

（Ａ）アビセラーゼの酵素的性質（１）作用セルロース末、アビセル、脱脂綿など結晶性の高い不溶
性セルロースに対し作用してグルコース、セロビオース
等の還元糖を生成する。

（２）作用ｐＨ及び最適作用ｐＨ本酵素の作用ｐＨ範囲は２〜８．最適作用ｐＨは約４．
５に認められた。

（３）安定ｐＨクエン酸−リン酸塩緩衝液の下で４５℃で２０時間放置
したときの安定ｐＨ範囲は約３．５〜約６であった。

（４）作用温度範囲及び最適作用温度本酵素は約９０℃までの高温に作用するが、１％アビセ
ル、０．０５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，５）の下で１０分
間反応させたときの最適作用温度は約６５℃に認められ
た。

（５）熱安定性本酵素を０．０５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，５）の下で、
各温度で１０分間加熱処理した゛結果、本酵素は約６０
℃までの温度ではほとんど失活せず、６５℃、１０分間
の加熱で約５０％、そして７０℃、１０分間の加熱で約
８０％失活した。

（６）阻害剤各種重金属イオンのうちで１＋ｍＭ以上の水銀イオンお
よび銅イオンにより強く阻害される。また、ＳＨ阻害剤
であるパラクロルマーキュリ−ベンゾエイトによっても
１■Ｎで約８０％の阻害を受ける。

（７）精製法本酵素は培養濾液からホロファイバー（アミコンＨＩ　
−Ｐ５）により脱塩濃縮してのち、ＤＥＡＥ−セファロ
ース（ＣＬ　−６Ｂ）によるカラムクロマトグラフィー
（ＮａＣＱ　Ｏ→ＩＭグラジェント）と同カラムによる
再グロマトグラフィー（Ｎａ（１０→０．６Ｍ）により
１番畔精製することができる。

（８）分子量Ｂｉｏ−ｇｅｌ（Ａ　０．５ｍ）カラムによるゲル濾過
法により測定した分子量は約１４０，０００であった。

（９）活性測定法０．１Ｍ酢酸緩衝液に０．５％濃度のアビセル懸濁物（
ｐＨ４，５）０．５ｍΩに適量の酵素液を加え、蒸留水
で全量１．０ｍＱとし、５０℃で反応を行った。そして
生成する還元糖はソモギー・ネルソン法により測定した
。

この条件で、１分間に１μｍｏｌのグルコースに相かす
る還元力を生成する酵素量を１単位とした６−ＩＩＢ）
ＣＭＣアーゼの酵素的性質（１）ＣＭＣアーゼの多成分性ＣＭＣアーゼはディスク電気泳動的に少くとも４成分に
分離され、それぞれは分子量と等電点により区別される
。ＣＭＣアーゼＩは分子量約１６０，０００で等電点５
．０８、以下同様に■は約１６０，０００．４．９５．
　ｍは約１２０　、０００．４．６０、■は約１２０　
、０００．４．４８であり、これらアイソザイムの複合
物よりＣＭＣアーゼは成っている。

（２）カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）等の可溶
性セルロース誘導体に作用し、これをグルコース及びセ
ロビオース等に分解する成分（ＣＭＣアーゼ■および■
）とグルコースを極くわずかしか生成せずゼロビオース
以上のセロオリゴ糖に分解する作用を持つ成分（ＣＭＣ
アーゼ■、■）が存在する。

（３）作用ｐＨ及び最適作用ｐＨＣＭＣアーゼ複合体の作用ｐＨ範囲は、はぼ２〜８にわ
たり最適作用ＰＨは約４．５に認められた。

（４）安定ｐＨクエン酸−リン酸塩緩衝液の下で４５℃で２０時間放置
したときのＣＭＣアーゼ複合体の安定ｐＨ範囲は１３．
５〜約６であった。

（５）作用温度範囲及び最適作用温度このＣＭＣアーゼ複合体は約９０℃までの高温に作珀す
るが、１％ＣＭＣ１０，０５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，５
）の下で１０分間反応させたときの最適作用温度は約６
５℃に認められた。

（６）熱安定性本酵素を０．０５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，５）の下で、
各温度で１０分間加熱処理した結果、本酵素は約６０℃
までの温度ではほとんど失活せず、６５℃、１０分間の
加熱で約４０％、そして７０℃、１０分間の加熱で約７
０％失活した。

（７）阻害剤各種金属イオンのうちで１ｍＭ以上の水銀イオンおよび
銅イオンにより強く阻害される。

（８）精製法本酵素は培養濾液からホロファイバー（アミコＪＨＩ−
ｐｓ）により脱塩濃縮してのち、　ＤＥＡＲ−セファ１
＠−ス（ＣＬ　−６Ｂ）によるカラムクロマトグラフィ
ー（１ａＣＱ　Ｏ→ＩＭグラジェント）と同カラムによ
る再グロマトグラフィー及びクロマトフォーカスシング
により各成分に精製できる。

（９）活性測定法０．１Ｍ酢酸緩衝液に溶解させた１％ＣＭＣ溶液（ｐＨ
４，５）０．５＋ｓＱに、適量の酵素液を加え、蒸留水
で全量１．０＋＊Ωとし、５０℃で反応を行った。そし
て、生成する還元糖はソモギー・ネルソン法により測定
した。

この条件で、１分間に１μｍｏｌのグルコースに相当す
る還元力を生成する酵素量を１単位とした６（Ｃ）　β
−グルコシダーゼの酵素的性質（１）作用サリシン、セロビオース、セロトリオース、セロテトラ
オース、セロペンタオース、セロヘキサオースのような
セロオリゴ糖に作用して、これをグルコースに分解する
。また１本酵素はアビセルのような高分子セルロースに
も作用するがＣＭＣやＨＥＣ（ヒドロキシエチルセルロ
ース）にはほとんど作用しない。サリシン、セロビオー
ス、セロトリ／ｆｉ４−ス、セロテトラオース、セロペ
ンタオース及びセロヘキサオースに対するＫｍ値は、そ
れぞれ、３ＪＯ１２，２６，１，■９．０．８２，０．
５２ソＬテ０．５１ｍＭ’ｔ”アラた。

（３）安定ＰＨクエン酸−リン酸塩緩衝液の下で４５℃で２０時間放置
したときの安定ｐＨ範囲は約３．５〜約５であった。

（４）作用温度範囲及び最適作用温度本酵素は約９０℃までの高温に作用するが、１％サリシ
ン、０．０５Ｍ酢酸緩衝液（ＰＨ４，５）の下で１０分
間反応させたときの最適作用温度は約６５°Ｃに認めら
れた。

（５）熱安定性０．０５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４、５）の下で、各温度で
１０分間（加熱処理した結果１本酵素は約６５℃までの
高温ではほとんど失活せず、７０℃、１０分間の加熱で
約４１）℃失活し、そして８０℃、１０分間の加熱で９
０％以上失活した。

（６）阻害剤コース−δ−ラクトンは基質に対して拮抗阻害剤として
作用する。

（７）精製法本酵素は培養濾液からホロファイバー（アミコン旧−Ｐ
５）により脱塩濃縮したのた、ＤＥＡＥ−セファロース
（ＣＬ　−６Ｂ）によるカラムクロマトグラフィー（Ｎ
ａＣΩ０→ＩＭグラジェント）セクロマトフォーカシン
グ（ｐＨ６→４）とＢｉｏ−ｇｅｌ（Ａ　０．５ｍ）に
よるゲル濾過により、電気泳動的に均一まで精製するこ
とができる。

（８）分子量Ｂｉｏ−ｇｅｌ（Ａ　Ｏ，５＋ｓ）を用いるゲル濾過法
により測定した分子量は約２４０，０００であった。

（９）活性測定法０．１Ｍ酢酸緩衝液に溶解させた２％サリシン溶液’ｐ
Ｈ４，５）０．５ｍ　（ｌに適量の酵素液を加え、蒸留
水で余量１．ＯｍＱとし、５０℃で反応を行った。そし
て生成するグルコースをソモギー・ネルラン法により佃
定した。

この条件で、１分間にｌμ１ｄｏｌのグルコースに相当
する還元力を生成する酵素量を１単位とした。

セルラーゼ生産菌の培養は、炭素源として、セルロース
、アビセル、綿のような純セルロース、または、バガス
、小麦瓢のようなセルロース含有物が使用され、窒素源
として、硝酸塩、アンモニウム塩、尿素のような無機窒
素またはペプトン、酵母エキス、肉エキス、大豆粕のよ
うな有機窒素源のいずれか単独または併用し、これに補
足する培地原料として、マンガン、亜鉛などの金属塩な
どが添加された培地で行われるが、この培地に対し、レ
シチンを０．１〜１％程度添加する。培養は固体培養ま
たは液体培養のいずれでもよいが通常、π）４０℃、２
〜１５日間好気的に培養される。

寸ルラーゼは菌体外に生産される酵素であるの、−液体
培養の場合、培養後、濾過した上澄液に７５１で、また
、固体培養の場合は、培養後、水または適当な塩類溶液
で抽出した酵素液について、硫安または硫酸ナトリウム
などで沈澱させるか、あるいはアセトン、アルコールの
ような有機溶媒を添加してセルラーゼを沈澱させ、分離
、乾燥して酵素粉末をうろことができる。

次に、実施例により本発明の詳細な説明する。

実施例１セルロース４％、Ｋ２ＨＰＯ４１，２％、バクトペプト
ン１％、ＺｎＳ０４４Ｈ２０１Ｘ　１０−３　％、ＫＮ
Ｏ３０，６％、ＭｎＳＯ４４Ｈ２０１ＸＩＯ−”　％、
尿素０．２％、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２０１ＸＩＯ−３％、
ＫＣＱ　　Ｏ，１６％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，１２
％からなる培地（ｐＨ４，０）および、これに大豆製レ
シチン０．５％添加した培地、各２０ｍ　Ｑを２００＋
ａ　０種し、３０℃で１２日間好気的に培養した。培養
後、遠心分離して得た上澄液について生産された、セル
ラーゼのアビセラーゼ、カルボキシメチルセルラーゼ（
ＣＭＣアーゼ）及びβ−グルコシダーゼ活性を測定した
。結果は第１表に示す通りであった。

第１表〔効　　果〕表から明らかなように、レシチンを添加して培養すると
、無添加の場合に比べ、アビセラーゼ、ＣＭＣアーゼ及
びβ−グルコシダーゼの生産量が、いずれも増加し、特
に、ＣＭＣアーゼとβ−グルコシダーゼの生産に対し、
顕著な効果を示した。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）セルーゼ生産能を有する糸状菌を培養して、セル
ラーゼを生産するに際し、レシチンの存在下で培養する
ことを特徴とするセルラーゼの生産改良法。