JPS6043954B2 - セルラ−ゼの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、アクレモニウム属菌によるセルラーゼの製
造方法に関するものである。

セルラーゼはセルロースをグルコースまたはセロビオ
ースやゼロオリゴ糖に分解する酵素反応系を触媒する酵
素群の総称であり、その作用様式により、Ｃｌ酵素、Ｃ
ｘ酵素とβ−グルコシダーゼあるいはエキソ−β−グル
カナーゼ、エンド−β−グルカナーゼとセロビアーゼな
ど種々の名称で呼はれる酵素が存在するが、その実体は
いまだ明らかでない。

それは、セルラーゼを生産する微生物起源により、結晶
性セルロース、カルボキシメチルセルロース、ゼロデキ
ストリン、ゼロオリゴ糖やセロビオース等に対する作用
様式の異なる多種多様の酵素が存在することと、セルロ
ースの構造上の複雑さに起因している。しかし、セルラ
ーゼは、これら複数の酵素が調和のとれた相互作用をす
ることによりセルロースをその構成糖であるグルコース
等に分解する複合酵素である。 近年、セルラーゼはバ
イオマス資源の有効利用の観点から注目をあつめ、盛ん
に研究されるようになつたが、従来、よく知られている
トリコデルマ属やアスペルギルス属等のセルラーゼは、
天然セルロースに対する分解力が充分でないか、または
、セルロースを完全にグルコースに分解できず、セロビ
オースやゼロオリゴ糖を多量に生成するなどの問題があ
つた。

更にまた、従来、知られているセルラーゼは、ほとんど
が熱安定性に劣つているため、長時間の糖化反応では４
５〜５０’Ｃ程度での反応しか行えず、このため糖化中
に雑菌に汚染される危険性があつた。 本発明者らは、
結晶性セルロースに対する分解力が優れ、且つグルコー
スヘの糖化能力の強いセルラーゼ生産菌を求めて、広く
自然界から微生物の検索を行つてきた結果、土壌中より
分離し、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属と
同定した糸状菌の生産するセルラーゼが、結晶性セルロ
ースに対する分解力が強く、しかも本酵素はβ−グルコ
゜シダーゼ活性が、従来よく知られている、例えばトリ
コデルマ・レーゼイ等のセルラーゼに比べて著しく強い
ため、セルロースをほとんど完全にグルコースにまで分
解できるという、極めて糖化性の優れた酵素であること
を認めた。

そしてまた、本菌の生産するセルラーゼは熱安定性にお
いても優れているため、従来のセルラーゼを使用する場
合の糖化温度よりも、５〜１０℃高く糖化できる。この
ため糖化中の雑菌汚染はほとんどおこらなくなり、利用
面においても、技術的且つ経済的に著しい効果をもたら
す新規な酵素であることを認めた。本発明はこのような
知見にもとづいてなされたものである。すなわち、本発
明はセルラーゼ生産能を有するアクレモニウム属菌を培
養することを特徴とするセルラーゼの製造方法に関する
ものである。

以下に、本発明を更に具体的に説明する。本発明により
生産されるセルラーゼは、アビセルのような結晶性の高
いセルロースに対しても、優れた糖化能力を示し、糖化
反応によつて得られる生成物の糖組成は、ほとんどがグ
ルコースによつて占められている。

このことは、本発明に係る酵素の大きな特徴として掲げ
ることができる。第１表は、本発明により生産されるセ
ルラーゼを構成するＦＰアーゼ（濾紙分解活性）、ＣＭ
Ｃアーゼとβ−グルコシダーゼの代表的な含有量とトリ
コデルマ・レーゼイの場合のそれらを比較したものであ
る。表から明らかなように、本発明により生産されるセ
ルラーゼはβ−グルコシダーゼ活性がトリコデルマ◆レ
ーゼイの場合に比べ著しく高いことがわかる。

このことが、本発明の酵素によりセルロースを糖化した
場合の生産物がほとんどグルコースであるということを
理由づけるものてあると考．えられるが、この他にも、
本発明において生産されるβ−グルコシダーゼが、従来
知られているβ−グルコシダーゼに比べて基質特異性が
広く、セロビオースの他、セロトリオース、セロテトラ
オース、セロペンタオース等のセロオリゴ糖やゼロ．デ
キストリン、更にはアビセルのような高分子のセルロー
スにも作用しこれをグルコースに分解するという新規な
β−グルコシダーゼであり、そしてまた、この酵素が生
産物であるグルコースによる阻害性が小さいこと等も大
きく関与しているも・のと考えられる。すなわち、本発
明の酵素によるセルロース分解物の糖組成は、生成還元
糖のうちのグルコースは９８〜１００％であるのに対し
、トリコデルマ・レーゼイのセルラーゼによる糖化物は
、セロビオースニグルコースの割合が１：１から１：３
であると報告されている。

（Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．ＴｅｃｈｒｌＯＩ．，第Ｍ巻、
第２６頂（１９７岬）等）そして、このセロビオースを
グルコースに分解するためにセロビオースに対する分解
力の優れたアスペルギルス・ニガーのβ−グルコシダー
ゼを併用して用いることはよく行われていることである
（例えばＡｐｐｌｌｅｄＭｉｃｒＯｂｌＯｌＯｇｙ，第
托巻、第４１９頁（１９６８年）等）。Ｌしかるに、本
発明のセルラーゼにはβ−グルコシダーゼが充分含まれ
ているために、他供給源からのβ−グルコシダーゼを加
える必要は全くなく、セルロースを完全にグルコースに
分解することができるのである。備考； （１） トリコデルマ・レーゼイＱＭ９４ｌ４のセルラ
ーゼのデータはＭ．ＭａｎｄｅｌｓらＢｉＯｔｅｃｈ．
ＢｉＯｅｎｚ．，ＸＸ■，Ｐ２ＯＯ９（１９８１）の記
載を引用した。

（２）ＦＰアーゼは濾紙片（１×６ｃｍ）を分解して還
元糖を生成する酵素力価てあり、測定法はＪ．Ｆｅｒｍ
．Ｔｅｃｈ．，５倦２６頂（１９７６）により行い活性
の表示は国際単位（１分間に１μＭＯＩのグルコースに
相当する還元力を生成する酵素量）である。なお、アビ
ラーゼとＦＰアーゼは同一酵素作用を表すと考えられて
いる。第１表に例示した、トリコデルマ・レーゼイの生
産するセルラーゼは、ＦＰアーゼニＣＭＣアーゼニβ−
グルコシダーゼの比が、１：１７．５：０．０６である
のに対し、本発明の生産するセルラーゼの同比率は、１
：１２．１：５．４である。

このように、本発明のセルラーゼは、ＦＰアーゼ（また
はアビセラーゼ′ ：ＣＭＣアーゼニβ−グルコシダー
ゼの構成比は、通常、１：１０〜２０：３〜１０であり
、β−グルコシダーゼの構成割合の著しく高い酵素であ
る。本発明において使用されるセルラーゼ生産菌の菌学
的性質は下記の通りである。

生育：麦芽工キズ寒天上では生育は速く３０′Ｃ７日間
で直径７０Ｔ＄ｔに達する。

集落は最初白色で後にやや黄色味をおびる。気生菌糸は
ゆるく盛り上ｂがり羊毛状を呈し、時に縄状の菌糸束を
形成する。培養後期には集落裏面は桃褐色ないし赤褐色
を呈する。ツアペツク寒天上でもほぼ同様の生育を示す
が気生菌糸の盛り上がりはより少い。生育ＰＨ範囲は３
．５〜６．０て最適ＰＨは４付近、生育温度範１囲は１
５゜Ｃ〜４３℃で、最適生育温度は３（代）付近である
。形態：菌糸の直径は０．５〜２．５μｍ、無色で菌糸
には隔壁が認められる。

また、菌糸表面は滑面である。
１分生子：分生子形成能は非
常に不安定でツアペツク寒天および麦芽工キズ寒天培地
による継代培養により消滅する。分離時における観察で
は、分生子柄は気生菌糸側面より突出し、無色である。
分生子は亜球形（２．５〜５×２〜４．５μｍ）で滑面
、２無色で連鎖は非常にゆるく分散しやすい。以上の菌
学的性質について、Ｗ．Ｇａｍｓの１Ｃｅｐｈａ１０ｓ
ｐ０ｒｉｕｍａｒｔｉｇｅＳｃｈｉｍｍｅ１ｐｉ１？Ｊ
Ｐ８４、Ｇ．Ｆｉｓｈｅ，．ｒ（１９７１年）及びＣ．
Ｈ．ＤｉｃｋｉｒｌｓＯｎ，ＭｙｃＯＩ．Ｐａｐｅｒｓ
ｌｌ５ＰｌＯ（１９Ｂ年）を参照した結果、本２菌はア
クレモニウム（ＡｃｒｅｍＯｎｉｕｍ）属に近縁の糸状
菌と考えるのが妥当であると考えた。

なお、アクレモニウム属には、従来、強力なセルラーゼ
生産性が知られていなかつたこと、及び、本発明の菌株
が強力、かつ特徴的なセルラーゼを生産す．ることから
、本菌をアクレモニウム●セルロリテイカス（Ａｃｒｅ
ｍＯｎｉｕｎｌｃｅｌｌｕｌＯｌｙｔｉｃｌｊｓ）と命
名した。なお、本菌は、ＦＥＲＭＰ−６８６７として、
工業技術院生物工業技術研究所に寄託されている。アク
レモニウム属はＧａｍｓにより詳細な検討がなされ、以
前にセフアロスポリウム属として記載されていた属の再
検討を行うことにより、近年採用された属名であり、本
発明の示すような結晶性セルロースに作用することので
きる強力な真のセルラーゼ、すなわちアビラーゼやＦＰ
アーゼを生産するアクレモニウム属菌は、本発明以前に
は全く知られていない。本菌の生産するセルラーゼは、
作用特性から結晶性の高いセルラーゼであるアビセルに
作用するｉ素、すなわちアビセラーゼまたはＦＰアーゼ
でｚ表されるＣ１酵素、カルボキシメチルセルロー（Ｃ
ＭＣ）に作用する、いわゆるＣＭＣアーゼで之表される
Ｃ潅素と、セロビオースなどセロオｌゴ糖に作用するβ
−グルコシダーゼの主としてｚ種類の酵素群からなる複
合酵素系である。

そし八これら酵素群の調和のとれた相互作用によ）、天
然のセルロースを完全にグルコースにまで）解すること
ができるのである。以下にこれら酵（の性質を記載する
。Ｊアビセラーゼの酵素的性質 （１）作用 セルロース末、アビセル、脱脂綿など結晶性の高い不溶
性セルロースに対し作用してグルコース、セロビオース
等の還元糖を生成する。

（２）作用ＰＨ及び最適作用ＰＨ 本酵素の作用ＰＨ範囲は２〜８、最適作用ＰＨは約４．
５に認められた。

（第１図ａ）（３）安定ＰＨ クエン酸−リン酸塩緩衝液の下で４５゜Ｃで２０時間放
置したときの安定ＰＨ範囲は約３．５〜約６であつた。

（第１図ｃ）（４）作用温度範囲及び最適作用温度 本酵素は約９０℃までの高温に作用するが、１％アビセ
ル、０．０５Ｍ酢酸緩衝液（ＰＨ４．５）の下で１紛間
反応させたときの最適作用温度は約６５℃に認められた
。

（第１図ｂ）（５）熱安定性 本酵素を０．０５Ｍ酢酸緩衝液（ＰＨ４．５）の下で、
各温度で１紛間加熱処理した結果、本酵素は約６０℃ま
での温度ではほとんど失活せず、６５％、１吟間の加熱
で約５０％、そして７０゜Ｃ、１吟間の加熱で約８％失
活した。

（第１図ｄ）（６）阻害剤 各種重金属イオンのうちで１ｍＭ以上の水銀イオンおよ
び銅イオンにより強く阻害される。

また、ＳＨ阻害剤であるパラクロルマーキユリーベンゾ
エイトによつても１ｍＭで約８０％の阻害を受ける。（
７）精製法 本酵素は培養濾液からホロフアイバー（アミコンＨＩ−
Ｐ５）による脱塩濃縮してのち、ＤＥＡＥ−セフアロー
ス（ＣＬ−σＬによるカラムクロマトグラフィー（Ｎａ
ＣｌＯ→１Ｍグラジエント）と同カラムによる再クロマ
トグラフィー（ＮａＣｌＯ−＋０．６Ｍ）により、より
精製することができる。

（８）分子量 ＢｉＯ−Ｇｅｌ（ＡＯ．５ｒｒｌ）カラムによるゲル濾
過法により測定した分子量は約１４００００であつた。

（９）活性測定法０．１Ｍ酢酸緩衝液（ＰＨ４．５）に
０．５％濃度のアビセル懸濁物（ＰＨ４．５）０．５１
１１１に適量の酵素液を加え、蒸留水で全量１．０ｒＴ
１Ｉとし、５０℃で反応を行つた。

そして生成する還元糖はソモギー・ネルソン法により測
定した。 この条件で、１分間に１μＭＯｌのグルコー
スに相当する還元力を生成する酵素量を１単位とした。

（Ｂ）ＣＭＣアーゼの酵素的性質 （１）ＣＭＣアーゼの多成分性 ＣＭＣアーゼはディスク電気泳動的に少くとも４成分に
分離され、それぞれは分子量と等電点により区別される
。

ＣＭＣアーゼＩは分子量約１６００００て等電点５．６
８、以下同様に■は約１６０００へ４．９＼■は約１２
０００へ４．６へ■２は約１２０００へ４．４８であり
、これらアイソザイムの複合物よりＣＭＣアーゼは成つ
ている。（２）カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）
等の可溶性セルロース誘導体に作用し、これをグルコー
ス及びセロビオース等に分解する成３分（ＣＭＣアーゼ
Ｉおよび■）とグルコースを極わずかしか生成ずにセロ
ビオース以上のセロオリゴ糖に分解する作用を持つ成分
（ＣＭＣアーゼ■、■）が存在する。

（３）作用ＰＨ及び最適作用ＰＨ３．ＣＭＣアーゼ複合
体の作用ＰＨ範囲はほぼ２〜８にわたり最適作用ＰＨは
約４．５に認められた。

（第１図ａ）（４）安定ＰＨ クエン酸−リン酸塩緩衝液の下で４５℃で２０４（時間
放置したときのＣＭＣアーゼ複合体の安定ＰＨ範囲は約
３．５〜約６であつた。

（第１図ｃ）（５）作用温度範囲及び最適作用温度 このＣＭＣアーゼ複合体は約９０℃までの高温に作用す
るが、１％ＣＭＣｌＯ．Ｏ５Ｍ酢酸緩衝液（ＰＨ４．５
）の下で１吟間反応させたときの最適作用温度は約６５
℃に認められた。

（第１図ｂ）（６）熱安定性 本酵素を０．０５Ｍ酢酸緩衝液（ＰＨ４．５）の下で、
各温度で１紛間加熱処理した結果、本酵素は約６０℃ま
での温度ではほとんど失活せず、６５℃、１紛間の加熱
で約４０％、そして７０゜Ｃ１１紛間の加熱で約７０％
失活した。

（第１図ｄ）（７）阻害剤 各種重金属イオンのうちで１ｍＭ以上の水銀イオンおよ
び銅イオンにより強く阻害される（８）精製法 本酵素は培養濾液からホロフアイバー （ＨＩ−Ｐ５）による脱塩濃縮してのち、ＤＥＡＥ．一
セフアロース（ＣＬ−６Ｂ）によるカラムクロマトグラ
フィー（ＮａＣｌＯ→１Ｍグラジエント）と同カラムに
よる再クロマトグラフィー及びクロマトフォーカシング
により各成分に精製できる。

（９）活性測定法 ０．１Ｍ酢酸緩衝液に溶解させた１％ＣＭＣ溶液（ＰＨ
４．５）０．５ｒ］１１に、適量の酵素液を加え、蒸留
水で全量１．０ｒＴ１１とし、５０℃て反応を行つた。

そして、生成する還元糖はソモギー・ネルソン法により
測定した。この条件で、１分間に１μＭＯｌのグルコー
スに相当する還元力を生成する酵素量を１単位とした。

β−グルコシダーゼの酵素的性質 （２）作用 サリシン、セロビオース、セロトリオー ス、セロテトラオース、セロペンタオース、セロヘキサ
オースのようなセロオリゴ糖に作用して、これをグルコ
ースに分解する。

また、本酵素はアビセルのような高分子セルロースにも
作用するがＣＭＣやＨＥＣ（ヒドロキシエチルセルロー
ス）にはほとんど作用しない。

サリシン、セロビオース、セロトリオース、セロテトラ
オース、セロペンタオース及びセロヘキサオースに対す
るＫｍ値は、それぞれ３．４０，２．２６，１．１９，
０．８２，０．５２そして０．１５ｒｒ１Ｍであつた。
（２）作用ＰＨ及び最適作用ＰＨ 本酵素の作用ＰＨ範囲は２〜８、最適作用ＰＨは約４．
５に認められた。

（第１図ａ）（３）安定ＰＨ クエン酸−リン酸塩緩衝液の下で４５℃で２０時間放置
したときの安定ＰＨ範囲は約３．５〜約５であつた。

（第１図ｃ（４）作用温度範囲及ひ最適作用温度 本酵素は約９０′Ｃまての高温に作用するが、１％サリ
シン、０．０５Ｍ酢酸緩衝液（ＰＨ４．５）の下で１紛
間反応させたときの最適作用温度は約６５℃に認められ
た。

（第１図ｂ）（５）熱安定性 ０．０５Ｍ酢酸緩衝液（ＰＨ４．５）の下で、各温度て
１紛間加熱処理した結果、本酵素は約６５℃まての高温
ではほとんど失活せず、７０′Ｃｌｌ紛間の加熱て約４
０％失活し、そして８０゜Ｃ、１紛間の加熱て９０％以
上失活した。

（第１図ｄ）（６）阻害剤 各種重金属イオンのうち１ｍＭ以上の水銀イオンおよび
銅イオンにより強く阻害される。

また、グルコ−スーδ−ラクトンは基質に対して拮抗阻
害剤として作用する。（７）精製法 本酵素は培養濾液からホロフアイバー（アミコンＨＩ−
Ｐ５）により脱塩濃縮したのち、ＤＥＡＥ−セフアロー
ス（ＣＬ−６Ｂ）によるカラムクロマトグラフィー（Ｎ
ａＣｌＯ→１Ｍグラジエント）とクロマトフォーカシン
グ（ＰＨ６−４）とＢｉＯ−Ｇｅｌ（ＡＯ．５ｒｒｌ）
によるゲル濾過により、電気泳動的に均一まで精製する
ことができる。

（８）分子量 ＢｉＯ−Ｇｅｌ（ＡＯ．５ｍ）を用いるゲル濾過法によ
り測定した分子量は約２４００００であつた。

（９）活性測定法０．１Ｍ酢酸緩衝液に溶解させた１％
サリシン溶液（ＰＨ４．５）０．５ｎ１１に適量の酵素
液を加え、蒸留水で全量１．０ｎ１１とし、５０℃で反
応を行つた。

そして生成するグルコースをソモギー・ネルソン法によ
り測定した。この条件で、１分間に１μＭＯｌのグルコ
ースに相当する還元力を生成する酵素量を１単位とした
。

本発明のβ−グルコシダーゼは、サリシンやセロビオー
スのような小さい分子の基質よりもセロヘキサオースや
セロペンタオースのようなオリゴ糖に対してより親和性
が大きく、かつ本酵素はアビセルのような高分子量の基
質に対しても作用する。

特にセロビオースを分解し、かつアビセルを相当程度分
解てきる基質特異性を持つた酵素の存在は本発明により
初めて明らかになつたものであり、しかも生成物はすべ
てグルコースてあることなど本菌の生産するβ−グルコ
シダーゼは、従来知られていない新規なβ−グルコシダ
ーゼであつて、澱粉に対するグルコアミラーゼとよく似
た作用特性をもつことから本発明者らはこの酵素をグル
コセルラーゼと命名した。このように、本発明のアクレ
モニウム属菌により生産されるセルラーゼは、新規なβ
−グルコシダーゼを含む新規なセルラーゼ複合酵素剤で
ある。

本発明のアクレモニウム属菌によるセルラーゼを生産す
るためには、通常、セルロース、アビセ．ル、綿、バガ
ス、上麦麩等のセルロースまたはセルロース含有物を炭
素源とし、これに窒素源として、硝酸塩、アンモニウム
塩、尿素あるいはペプトン、酵母工キズのような有機ま
たは無機の窒素源と少量の金属塩を含む液体または固体
培地を用ノい、２０〜４０℃で、２〜１５日間程度、好
気的に培養される。

セルラーゼは菌体外に生産される酵素であるので、液体
培地の場合は、培養後濾過した上澄液、そして固体培養
の場合は、培養後、水または適当な無機塩類液て抽出す
ることにより酵素液７として採取することができる。次
に実施例により本発明の詳細な説明する。

実施例１セルロース４％、バクトペプトン１％、硝酸カ
リ０．６％、尿素０．２％、塩化カリ０．１６％、硫酸
マグフネシウム０．１２％、リン酸１カリウム１．２％
、硫酸亜鉛１×１０−３％、硫酸マンガン１×１０−３
％と硫酸銅１刈０−３％含む培地（ＰＨ４．Ｏ）２０ｒ
Ｔ１１を２００ｒＴ１１容三角フラスコに入れ、常法に
より殺菌後アクレモニウム・セルロリテイカス（ＦＥＲ
ＭＰ−６８６７）を接種し、３０℃で６日間通気培養し
た。

培養後、遠心分離機により除菌し、得られた上澄液につ
いて、アビセラーゼ活性、ＣＭＣアーゼ活性とβ一グル
コシダーゼ活性を測定した結果、それぞれ３．１ｕ／Ｍ
ｌｌ２６．３ｕ／ｍ１と１３．８ｕ／ｍ１であつた。実
施例２実施例１において、バクトペプトンに代えて、カ
ツオソルブルを２％添加した培地にアクレモニウム・セ
ルロリテイカス（ＦＥＲＭＰ−６８６７）を接種し、３
０゜Ｃで８日間通気培養した。

培養後、遠心分離した上澄液について、アビセラーゼ、
ＣＭＣアーゼ及びβ−グルコシダーゼ活性を測定した結
果、それぞれ３．９Ｌ１／Ｍｌｌ４５．５ｕ／ｍｌと２
１．１ｕ／ｍ１であつた。培養上澄液に対して冷アセト
ン２倍容量加え、生成する沈澱を遠心分離機（９０００
ｒｐｍ１１紛）により集め、少量の水に溶解させ、不溶
物を除去して、清澄な濃縮酵素液を得た。

アビセラーゼ、ＣＭＣアーゼ及びβ−グルコシダーゼの
それぞれの回収率は９１．９％、７１．７％、及び９６
．８％であつた。

【図面の簡単な説明】

第１図はアクレモニウム（ＦＥＲＭＰ−６８６７）の生
産するセルラーゼのアビセラーゼ、ＣＭＣアーゼ及びβ
−グルコシダーゼについて、ａ・・・・・・最適作用Ｐ
Ｈ．．ｂ・・・・・・最適作用温度、ｃ・・・・・・Ｐ
Ｈ安定性そしてｄ・・・・・・熱安定性を示している。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ セルラーゼを生産するアクレモニウム属菌を培養し
   、培養物からセルラーゼを採取することを特徴とするセ
   ルラーゼの製造法。