JPS61167699A - モノクロ−ナル抗体 - Google Patents
モノクロ−ナル抗体Info
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- JPS61167699A JPS61167699A JP60008129A JP812985A JPS61167699A JP S61167699 A JPS61167699 A JP S61167699A JP 60008129 A JP60008129 A JP 60008129A JP 812985 A JP812985 A JP 812985A JP S61167699 A JPS61167699 A JP S61167699A
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- cancer
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- cells
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔技術分野〕
本発明は、胃低分化型腺癌由来細胞株（ＭＫＮ＝４５）
を免疫原として作成されたハイブリドーマの産生ずる特
定の特性を持つモノクローナル抗体に関する。
を免疫原として作成されたハイブリドーマの産生ずる特
定の特性を持つモノクローナル抗体に関する。
癌研究の究極の目標は、抗癌、制癌作用を示す物質の探
索と、癌の早期発見、即ち早期診断法の確立にあるとい
える。従来、癌に関して種々の薬剤、治療法、試薬が開
発されているが、これらはいずれも癌細胞ばかりでなく
、正常組織、正常細胞にも影響を与え、如何に有効な薬
剤とはいえ、その副作用のために使用が著しく制限され
ているのが現状である。
索と、癌の早期発見、即ち早期診断法の確立にあるとい
える。従来、癌に関して種々の薬剤、治療法、試薬が開
発されているが、これらはいずれも癌細胞ばかりでなく
、正常組織、正常細胞にも影響を与え、如何に有効な薬
剤とはいえ、その副作用のために使用が著しく制限され
ているのが現状である。
免疫反応（抗原−抗体反応）は、非常に特異性が高いも
のであるが、従来のポリクローナル抗体ではいかに吸収
操作を操り返しても、例えばリンパ球間のサブセットの
ような、非常にマイナーな抗原決定基によって区別され
るものを認識することは困難であった。Ｍｉｌｓｔｅｉ
ｎらによって開発されたモノクローナル抗体（Ｋｉ；ｈ
ｌｅｒ、 Ｇ、 ａｎｄ Ｍｔｌｓｔｅｉｎ、 Ｃ，：
Ｎａｔｕｒｅ、 ２５６．４９５ （１９７５））は
、この壁を打ち破るものであり、癌細胞上の癌特異抗原
、あるいは癌関連抗原を特異的に認識するモノクローナ
ル抗体を得ることにより、正常ｍｍへのダメ−ジを与え
ずに癌細胞のみを特異的に排除できるものと期待される
。また、モノクローナル抗体を用いた診断薬あるいは検
査試薬は、正常血清成分に対する交差反応がなく、感度
良く、癌関連抗原、癌特異抗原を検出できるものと思わ
れる。
のであるが、従来のポリクローナル抗体ではいかに吸収
操作を操り返しても、例えばリンパ球間のサブセットの
ような、非常にマイナーな抗原決定基によって区別され
るものを認識することは困難であった。Ｍｉｌｓｔｅｉ
ｎらによって開発されたモノクローナル抗体（Ｋｉ；ｈ
ｌｅｒ、 Ｇ、 ａｎｄ Ｍｔｌｓｔｅｉｎ、 Ｃ，：
Ｎａｔｕｒｅ、 ２５６．４９５ （１９７５））は
、この壁を打ち破るものであり、癌細胞上の癌特異抗原
、あるいは癌関連抗原を特異的に認識するモノクローナ
ル抗体を得ることにより、正常ｍｍへのダメ−ジを与え
ずに癌細胞のみを特異的に排除できるものと期待される
。また、モノクローナル抗体を用いた診断薬あるいは検
査試薬は、正常血清成分に対する交差反応がなく、感度
良く、癌関連抗原、癌特異抗原を検出できるものと思わ
れる。
本発明は、特定の癌抗原に対して特異的に反応するモノ
クローナル抗体を提供するものである。
クローナル抗体を提供するものである。
さらに本発明は、上記特定癌に対する抗原検出用試薬を
提供するものである。
提供するものである。
本発明は、胃癌、特に胃癌の細胞膜抗原に対して特異的
に反応するモノクローナル抗体よりなるものである。
に反応するモノクローナル抗体よりなるものである。
本発明のモノクローナル抗体は、いわゆる細胞融合によ
って製造される。すなわち、抗体産生細胞と骨髄腫細胞
との間に、融合ハイブリッドを形成させ、該ハイブリッ
ドをクローン化し、上記癌細胞（即ち、上記特性を有す
る特定抗原）に対し特異性を示す抗体を産生ずるクロー
ンを選択することによって製造される。その操作は、免
疫用細胞として下記細胞を使用する以外は、従来既知の
方法に準ずればよい。
って製造される。すなわち、抗体産生細胞と骨髄腫細胞
との間に、融合ハイブリッドを形成させ、該ハイブリッ
ドをクローン化し、上記癌細胞（即ち、上記特性を有す
る特定抗原）に対し特異性を示す抗体を産生ずるクロー
ンを選択することによって製造される。その操作は、免
疫用細胞として下記細胞を使用する以外は、従来既知の
方法に準ずればよい。
抗体産生細胞は、例えば株化癌細胞より得られる抗原に
よって免疫させた動物からの肺細胞、リンパ節細胞、Ｂ
−リンパ球である。株化癌細胞としては、背低分化型腺
癌由来の株化癌細胞（ＭＫＮ−４５）が例示される。
よって免疫させた動物からの肺細胞、リンパ節細胞、Ｂ
−リンパ球である。株化癌細胞としては、背低分化型腺
癌由来の株化癌細胞（ＭＫＮ−４５）が例示される。
免疫させる動物としてはマウス、ラット、馬、ヤギ、ウ
サギなどが例示される。
サギなどが例示される。
抗体産生細胞は、例えば次のようにして製造される。即
ち、胃癌由来細胞株ＭＫＮ−４５（低分化型腺癌）を超
音波処理等で破壊し、遠心分離（例、１０，０００〜２
０．０００Ｇ、 １０〜６０分）を行って細胞抽出液を
得、この上清を分子量１０万〜２００万の物質の分離が
可能なゲル濾過担体（例、セファデックス、セファクリ
ル、セファコース、バイオゲル等）を使用して分子篩し
、高分子画分と低分子画分とに分離する。か（して得ら
れた分子量が約７０万〜１５０万の高分子画分は、例え
ばＦｒｅｕｎｄ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｒｉ
ｔと混和後、動物の免疫用として使用する。免疫は動物
の皮下、筋肉内あるいは腹腔内に約１．５ Ｘ １０’
〜１０” ｃｅｌｌ相当分／回を週１〜２回、３〜７
週間投与することによって行われる。最終免疫より約３
〜５日後、免疫動物から抗体産生細胞を分取する。
ち、胃癌由来細胞株ＭＫＮ−４５（低分化型腺癌）を超
音波処理等で破壊し、遠心分離（例、１０，０００〜２
０．０００Ｇ、 １０〜６０分）を行って細胞抽出液を
得、この上清を分子量１０万〜２００万の物質の分離が
可能なゲル濾過担体（例、セファデックス、セファクリ
ル、セファコース、バイオゲル等）を使用して分子篩し
、高分子画分と低分子画分とに分離する。か（して得ら
れた分子量が約７０万〜１５０万の高分子画分は、例え
ばＦｒｅｕｎｄ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｒｉ
ｔと混和後、動物の免疫用として使用する。免疫は動物
の皮下、筋肉内あるいは腹腔内に約１．５ Ｘ １０’
〜１０” ｃｅｌｌ相当分／回を週１〜２回、３〜７
週間投与することによって行われる。最終免疫より約３
〜５日後、免疫動物から抗体産生細胞を分取する。
骨髄腫細胞としては、マウス、ラット、ヒト等由来のも
のが使用される。抗体産生細胞と骨髄細胞とは同種動物
由来のものであることが好ましい。
のが使用される。抗体産生細胞と骨髄細胞とは同種動物
由来のものであることが好ましい。
細胞融合は、例えばＧ、 Ｋ５ｈｌｅｒ （Ｎａｔｕｒ
ｅ ２５６＋４９５ （１９７５））に記載の方法又は
これに準する方法によって行われる。この際、３０〜５
０％ポリエチレングリコール（平均分子量１，０００〜
４，０００）を用いて３０〜４０℃の温度下、約１〜３
分間程度反応させることによって行われる。
ｅ ２５６＋４９５ （１９７５））に記載の方法又は
これに準する方法によって行われる。この際、３０〜５
０％ポリエチレングリコール（平均分子量１，０００〜
４，０００）を用いて３０〜４０℃の温度下、約１〜３
分間程度反応させることによって行われる。
細胞融合によって得られた細胞はクローニングに付され
る。すなわち、当該細胞を、例えばマイクロプレート中
で培養し、増殖の見られたウェルの培養上清中の抗体価
を、例えば酵素抗体法などてクローニングを行ってクロ
ーンを得る。このクローンは、例えばあらかじめプリス
タンを投与したＢ Ａ Ｌ Ｂ／Ｃマウスの腹腔内へ移
植し、１０〜１４日後にモノクローナル抗体を高濃度に
含む腹水を採取し、検定する。得られたクローンは、次
いで、目的とするモノクローナル抗体を産生ずるクロー
ンのスクリーニングに付される。スクリーニングは、酵
素抗体法などによって追跡される。
る。すなわち、当該細胞を、例えばマイクロプレート中
で培養し、増殖の見られたウェルの培養上清中の抗体価
を、例えば酵素抗体法などてクローニングを行ってクロ
ーンを得る。このクローンは、例えばあらかじめプリス
タンを投与したＢ Ａ Ｌ Ｂ／Ｃマウスの腹腔内へ移
植し、１０〜１４日後にモノクローナル抗体を高濃度に
含む腹水を採取し、検定する。得られたクローンは、次
いで、目的とするモノクローナル抗体を産生ずるクロー
ンのスクリーニングに付される。スクリーニングは、酵
素抗体法などによって追跡される。
選ばれたクローンの産生ずるモノクローナル抗体の回収
は、ＩｇＧの精製法として従来既知の硫安分画法、ＰＥ
Ｇ分画法、エタノール分画法、陰イオン変換体を応用す
ることで、容易に達成される。
は、ＩｇＧの精製法として従来既知の硫安分画法、ＰＥ
Ｇ分画法、エタノール分画法、陰イオン変換体を応用す
ることで、容易に達成される。
本発明によって得られたモノクロール抗体は、腺癌系に
特異的と考えられ、細胞膜表在型抗原を認識し、かつ正
常組織由来培養細胞、赤血球、白血球及び正常組織とは
反応せず、癌特異的な抗原を認識するものと推測される
。すなわち、本発明からなるモノクローナル抗体は腫瘍
のイメージング乃び湘１瘍’ＪＲＩ 、Ｌ ｃｏｎｊｕ
ｇａｔｅさせｔａｒｔｅｔｉｎｓ＋ｔｈｅｒａｏｖ（タ
ーゲティングセラピイ）等への臨床応用が期待される。
特異的と考えられ、細胞膜表在型抗原を認識し、かつ正
常組織由来培養細胞、赤血球、白血球及び正常組織とは
反応せず、癌特異的な抗原を認識するものと推測される
。すなわち、本発明からなるモノクローナル抗体は腫瘍
のイメージング乃び湘１瘍’ＪＲＩ 、Ｌ ｃｏｎｊｕ
ｇａｔｅさせｔａｒｔｅｔｉｎｓ＋ｔｈｅｒａｏｖ（タ
ーゲティングセラピイ）等への臨床応用が期待される。
実施例
（１）免疫用癌関連抗原の調製：
株化胃癌細胞（ＭＫＮ−４５株）を超音波処理法で破壊
し、遠心分離（１５，０ＯＯＧ、３０分）を行い細胞抽
出液を得た。この上清をセファロース４Ｂのカラムを用
い、ゲル濾過し、高分子画分と低分子画分とに分離した
。
し、遠心分離（１５，０ＯＯＧ、３０分）を行い細胞抽
出液を得た。この上清をセファロース４Ｂのカラムを用
い、ゲル濾過し、高分子画分と低分子画分とに分離した
。
分子量が約７０万〜１５０万の高分子画分を、Ｆｒｅｕ
ｎｄ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ａｄｊｕｖａｎｔと混和後、
マウスへ週１回、５週間免疫した。
ｎｄ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ａｄｊｕｖａｎｔと混和後、
マウスへ週１回、５週間免疫した。
最終免疫より４日後にマウス肺臓を取り出し、以下の細
胞融合に用いた。
胞融合に用いた。
（２）細胞融合およびクローニング：
上記のマウス牌細胞と、マウスミエローマＰ３Ｕ １
（Ｃｕｒｒ、 Ｔｏｐ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、 Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ、＋ ８１＋ １（１９７０） ）とを４
：１の割合で混合し、Ｋ１５ｈ ｆｅｎらの方法（Ｉｍ
ｍｕｎｏｌｏｇｌｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄ （Ａｃａｄｅ
ｎｉｃ Ｐｒｅｓｓ） 、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、 ３９
１． （１９７９） ）を一部改変して、４２．６％ポ
リエチレングリコール（平均分子量１．０００）を用い
て２分間反応させることにより細胞融合を行った。
（Ｃｕｒｒ、 Ｔｏｐ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、 Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ、＋ ８１＋ １（１９７０） ）とを４
：１の割合で混合し、Ｋ１５ｈ ｆｅｎらの方法（Ｉｍ
ｍｕｎｏｌｏｇｌｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄ （Ａｃａｄｅ
ｎｉｃ Ｐｒｅｓｓ） 、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、 ３９
１． （１９７９） ）を一部改変して、４２．６％ポ
リエチレングリコール（平均分子量１．０００）を用い
て２分間反応させることにより細胞融合を行った。
本細胞を９６ウエルマイクロプレートに植え込み、ＨＡ
Ｔ培地（表１）で１９〜１４日間培養後、ＨＴ培地（表
１）に移行し、さらにフラスコ（２５ｃＩＡ）に培養で
きるようになってからＤ−ＭＥＭ培地（表１）で培養し
た。増殖の見られたウェルの培養上清中の抗体価を酵素
抗体法により測定し、適切なウェルから限界希釈法によ
り、求めるノ＼イブリドーマのクローニングを行った。
Ｔ培地（表１）で１９〜１４日間培養後、ＨＴ培地（表
１）に移行し、さらにフラスコ（２５ｃＩＡ）に培養で
きるようになってからＤ−ＭＥＭ培地（表１）で培養し
た。増殖の見られたウェルの培養上清中の抗体価を酵素
抗体法により測定し、適切なウェルから限界希釈法によ
り、求めるノ＼イブリドーマのクローニングを行った。
すなわち、マイクロタイタープレートにウェル当たり２
５．０００個のマウス腹腔浸出細胞を植え込み、次にＤ
−ＭＥＭ培地で、１０．５．２．５．１個１０．１ｍｌ
となるようにハイプリドーマを希釈し、これをマイクロ
クイタープレートに０．１ｍｌずつ植え込み培養した。
５．０００個のマウス腹腔浸出細胞を植え込み、次にＤ
−ＭＥＭ培地で、１０．５．２．５．１個１０．１ｍｌ
となるようにハイプリドーマを希釈し、これをマイクロ
クイタープレートに０．１ｍｌずつ植え込み培養した。
４日後にＤ−ＭＥＭ培地を０．１１１１１加え、以後４
〜７日に１度培地の半量交換を行った。培養開始後１０
〜２０日で肉眼で認められるコロニーが形成され、クロ
ーン株を得た。
〜７日に１度培地の半量交換を行った。培養開始後１０
〜２０日で肉眼で認められるコロニーが形成され、クロ
ーン株を得た。
表１
（３） スクリーニング法
得られたハイブリドーマについて目的とするモノクロー
ナル抗体を産生ずるクローンのスクリーニングを次のよ
うに行った。
ナル抗体を産生ずるクローンのスクリーニングを次のよ
うに行った。
（イ）方法の説明
以下のようにて酵素抗体法を行った。
抗原（各種株化癌細胞または部分精製癌関連抗原または
正常細胞をコートしたマイクロプレートに検体を加え、
３７℃で１時間反応させ、洗浄後ペルオキシダーゼ標識
抗マウス免疫グロブリン（Ｉ ｇＧ＋ Ｉ ｇＡ＋ Ｉ
ｇＭ）ウサギ抗体を加え、さらに３７℃で１時間反応
させた。未反応の標識抗体を洗浄後、０−フェニレンジ
アミン液を加え、室温にて３００分間反応せた後、２Ｍ
硫酸を加えて反応を停止させ、４９０ｎ＋１１の吸光度
を測定した。
正常細胞をコートしたマイクロプレートに検体を加え、
３７℃で１時間反応させ、洗浄後ペルオキシダーゼ標識
抗マウス免疫グロブリン（Ｉ ｇＧ＋ Ｉ ｇＡ＋ Ｉ
ｇＭ）ウサギ抗体を加え、さらに３７℃で１時間反応
させた。未反応の標識抗体を洗浄後、０−フェニレンジ
アミン液を加え、室温にて３００分間反応せた後、２Ｍ
硫酸を加えて反応を停止させ、４９０ｎ＋１１の吸光度
を測定した。
この方法で各種細胞との反応性を調べた。なお白血球と
の交叉反応性はＢ−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ標識抗
体を用いた。その他、ヒト赤血球との交叉反応性は、ヒ
）Ａ、Ｂ、０型赤血球を混合し、ＰＨＡ法で検討した。
の交叉反応性はＢ−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ標識抗
体を用いた。その他、ヒト赤血球との交叉反応性は、ヒ
）Ａ、Ｂ、０型赤血球を混合し、ＰＨＡ法で検討した。
Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ
（ＣＥ Ａ）との交叉反応性は、ＣＥＡ感作血球を用い
ＰＨＡ法で行った。
（ＣＥ Ａ）との交叉反応性は、ＣＥＡ感作血球を用い
ＰＨＡ法で行った。
モノクローナル抗体がＭＫＮ−４５の分泌物抗原か或い
は細胞膜抗原のどちらを認識しているかの検討のために
、ＭＫＮ−４５の培養上清でモノクローナル抗体とＭＫ
Ｎ−４５細胞そのものとの反応性が阻害されるかどうか
を調べた。
は細胞膜抗原のどちらを認識しているかの検討のために
、ＭＫＮ−４５の培養上清でモノクローナル抗体とＭＫ
Ｎ−４５細胞そのものとの反応性が阻害されるかどうか
を調べた。
酵素抗体法を用いたＩｎｈｉｂｉｔｉｏｒ＋ Ｔｅ５
ｔの具体的な方法は、以下の通りである。即ち、ハイブ
リドーマの上清を酵素抗体法でＨｔｒａｔｉｏｎを行い
、それより判断して適当な希釈倍率を決める。次にＭＫ
Ｎ−４５培養上清を５〜２５倍濃縮したものを原液とし
てｔ’ｓ、ｔ’ｓ” ・・・・１ ： ５”希釈した
ものを、適当に希釈したハイブリドーマ上清にそれぞれ
等量加え、１時間３７℃で１ｎｃｕｂａｔｉｏｎする。
ｔの具体的な方法は、以下の通りである。即ち、ハイブ
リドーマの上清を酵素抗体法でＨｔｒａｔｉｏｎを行い
、それより判断して適当な希釈倍率を決める。次にＭＫ
Ｎ−４５培養上清を５〜２５倍濃縮したものを原液とし
てｔ’ｓ、ｔ’ｓ” ・・・・１ ： ５”希釈した
ものを、適当に希釈したハイブリドーマ上清にそれぞれ
等量加え、１時間３７℃で１ｎｃｕｂａｔｉｏｎする。
そして、通常の酵素抗体法（ｔａｒｇｅｔ ：ＭＫＮ−
４５）の系でａｓｓａｙを行った。
４５）の系でａｓｓａｙを行った。
（ロ）スクリーニングの流れ
１次スクリーニング： Ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌ
（ＭＫＮ−４５）及び正常由来細胞（Ｐｌｏｗ ２００
０ ）を用いた酵素抗体法で、ＭＫＮ−４５に対して陽
性でＦｌｏｗ ２０００に対して陰性な％１ｅｌｌを選
抜。
（ＭＫＮ−４５）及び正常由来細胞（Ｐｌｏｗ ２００
０ ）を用いた酵素抗体法で、ＭＫＮ−４５に対して陽
性でＦｌｏｗ ２０００に対して陰性な％１ｅｌｌを選
抜。
２次スクリーニング：さらに他の正常由来細胞株及び赤
血球、白血球を用いたａｓｓａｙ系ですべてに陰性のｗ
ｅｌｌを選抜。
血球、白血球を用いたａｓｓａｙ系ですべてに陰性のｗ
ｅｌｌを選抜。
３次スクリーニング：以上で選抜された細胞株を２〜３
回クローニングし、その培養上清を多くの癌由来のｃｅ
ｌｌ １ｉｎｅとの反応性を検討するとともに、分泌型
或いは細胞膜型抗原のどちらを認識するかを、酵素抗体
法を用いたＩｎｈｉｂｉｔｉｏｎ Ｔｅ５ｔで同定する
。
回クローニングし、その培養上清を多くの癌由来のｃｅ
ｌｌ １ｉｎｅとの反応性を検討するとともに、分泌型
或いは細胞膜型抗原のどちらを認識するかを、酵素抗体
法を用いたＩｎｈｉｂｉｔｉｏｎ Ｔｅ５ｔで同定する
。
（４）モノクローナル抗体の回収、精製（イ）上記のス
クリーニングによって得られたクローン株を予め０．５
＋ａｌ／匹プリスタンを投与した４週令以後のＢＡＬＢ
／Ｃマウス（雄）の腹腔内へ２．０〜３．０ Ｘ １０
’ ｃｅｌｌ／匹移植し、１０〜１４日後にモノクロー
ナル抗体を高濃度に含む腹水を採取した。
クリーニングによって得られたクローン株を予め０．５
＋ａｌ／匹プリスタンを投与した４週令以後のＢＡＬＢ
／Ｃマウス（雄）の腹腔内へ２．０〜３．０ Ｘ １０
’ ｃｅｌｌ／匹移植し、１０〜１４日後にモノクロー
ナル抗体を高濃度に含む腹水を採取した。
この腹水を０．９％ＮａＣ＃液を加え５〜１０倍希釈し
た後、硫酸アンモニウムを４０％濃度となるように加え
、沈澱画分を分取した。この沈澱画分をなるべく少量の
０．９％Ｎａ（１！液で溶解させた後、０．９％ＮａＣ
１液を外液として透析した。
た後、硫酸アンモニウムを４０％濃度となるように加え
、沈澱画分を分取した。この沈澱画分をなるべく少量の
０．９％Ｎａ（１！液で溶解させた後、０．９％ＮａＣ
１液を外液として透析した。
透析終了後、高速液体クロマトグラフィー（ＴＳＫ−Ｇ
ｅｌｌ Ｇ−３０００５１１）を行い、ＩｇＧ画分を得
、精製モノクローナル抗体とした。
ｅｌｌ Ｇ−３０００５１１）を行い、ＩｇＧ画分を得
、精製モノクローナル抗体とした。
（ロ）本りローン株は、ＢＳＡ含無血清培地中でも増殖
させることができる。すなわち、０．５％ＢＳＡ含無血
清培地（ＲＩＴＣ５５−９培地）中で増殖させ、培養上
清を集めた。この上清に硫酸アンモニウムを４０％濃度
となるように加え、沈澱画分を分取し、これに０．９％
ＮａＣ１液を加え、溶解させた後、さらに硫酸アンモニ
ウムを４０％濃度となるように加え沈澱画分を分取した
。この沈澱画分をなるべく少量の０．９％ＮａＣＪ液で
溶解させた後、０．０２Ｍ生理的リン酸緩衝液を外液と
して透析した。透析終了後、この溶液を再び抗生胎児血
清抗体（ウサギ）を結合した５ｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂカ
ラムに通した後ＤＥＡＥ−Ｃｅｌｌｕｌｏｆｉｎｅカラ
ムにＤＥＡＥ−Ｃｅｌ １ｕｌｏｆ ｉｎｅクロマトグ
ラフィーの最初のピーク部分を精製モノクローナル抗体
とした。
させることができる。すなわち、０．５％ＢＳＡ含無血
清培地（ＲＩＴＣ５５−９培地）中で増殖させ、培養上
清を集めた。この上清に硫酸アンモニウムを４０％濃度
となるように加え、沈澱画分を分取し、これに０．９％
ＮａＣ１液を加え、溶解させた後、さらに硫酸アンモニ
ウムを４０％濃度となるように加え沈澱画分を分取した
。この沈澱画分をなるべく少量の０．９％ＮａＣＪ液で
溶解させた後、０．０２Ｍ生理的リン酸緩衝液を外液と
して透析した。透析終了後、この溶液を再び抗生胎児血
清抗体（ウサギ）を結合した５ｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂカ
ラムに通した後ＤＥＡＥ−Ｃｅｌｌｕｌｏｆｉｎｅカラ
ムにＤＥＡＥ−Ｃｅｌ １ｕｌｏｆ ｉｎｅクロマトグ
ラフィーの最初のピーク部分を精製モノクローナル抗体
とした。
（５）モノクローナル抗体の特性
かくしてスクリーニングされたクローンの産生するモノ
クローナル抗体の性状は、表２及び表３のとおりである
。免疫グロブリンのクラスはオフタロニー法で検定した
。
クローナル抗体の性状は、表２及び表３のとおりである
。免疫グロブリンのクラスはオフタロニー法で検定した
。
表２
※ＣＤ、は１ｎｂｉｔｉｏｎがかからなかった。
表３ ： ＲＰ）ＩＡ試薬と各種ヒト由来株化癌細胞培
養上清と特許出願人 株式会社 ミドリ十字 手続補正書印釦 昭和６０年５月２０日 昭和６０年特許願第８１２９号 ２、発明の名称 モノクローナル抗体 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 氏名（名称） 株式会社 ミドリ十字 ４、代理人■５４１ 住所 大阪市東区平野町４丁目５３番地３ニューライフ
平野町４０６号 電話（０６） ２２７−１１５６ 明細書の「発明の詳細な説明」の欄 ６、補正の内容 （３）同書第９頁、表１の「ソディウム ピバレート」
を「ソディウム ピルベート」に訂訂正する。
養上清と特許出願人 株式会社 ミドリ十字 手続補正書印釦 昭和６０年５月２０日 昭和６０年特許願第８１２９号 ２、発明の名称 モノクローナル抗体 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 氏名（名称） 株式会社 ミドリ十字 ４、代理人■５４１ 住所 大阪市東区平野町４丁目５３番地３ニューライフ
平野町４０６号 電話（０６） ２２７−１１５６ 明細書の「発明の詳細な説明」の欄 ６、補正の内容 （３）同書第９頁、表１の「ソディウム ピバレート」
を「ソディウム ピルベート」に訂訂正する。
（４）同書第１１頁、第１０行の「上清」の前に「培養
」を加入する。
」を加入する。
（５）回書第１１頁、第１５行の「上清」の前に「培養
」を加入する。
」を加入する。
（６）同書第１２頁、第８行の「検討する」の次に「〔
測定はＣＥＬ Ｉ ＳＡ法（ア ニ二一ディメンション
イン バイオロジカルアナリシス、第３７６頁、ブレ
ナム プレス。
測定はＣＥＬ Ｉ ＳＡ法（ア ニ二一ディメンション
イン バイオロジカルアナリシス、第３７６頁、ブレ
ナム プレス。
ニューヨーク、ロンドン、 １９８０年：ＡＮｅｗＤｉ
ｎ＋ｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎ
ａｌｙｓｉｓ＋ ｐ、３７６＋Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓ
ｓ＋ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ＋ Ｌｏｎｄｏｎ＋ １９８０
）によった。〕」を加入する。
ｎ＋ｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎ
ａｌｙｓｉｓ＋ ｐ、３７６＋Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓ
ｓ＋ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ＋ Ｌｏｎｄｏｎ＋ １９８０
）によった。〕」を加入する。
（７）同書第１４頁、下から第２行のｒＲＰＨＡ試薬と
各種ヒト由来株化癌細胞培養上清と」を「各種ヒト由来
株化癌細胞と」に訂正する。
各種ヒト由来株化癌細胞培養上清と」を「各種ヒト由来
株化癌細胞と」に訂正する。
（８）同書第１１頁全文を別紙の通りに訂正する。
以上
（別紙）
特許出願人 株式会社 ミドリ十字
手 続 ネ甫 正 書（方式）
％式％
■、事件の表示
昭和６０年特許願第８１２９号
２、発明の名称
モノクローナル抗体
３、補正をする者
事件との関係 特許出願人
氏名（名称） 株式会社 ミドリ十字
４、代理人■５４１
住所 大阪市東区平野町４丁目５３番地３ニューライフ
平野町４０６号 電話（０６） ２２７−１１５６ ｂ、悄止卵賃の日１丁 ６、補正の対象 明細書の「発明の詳細な説明」の欄 ７、補正の内容 （１）明細書第２頁、第１５行のｒ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ
Ｊを「ミルスティン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ） ｊに訂正
する。
平野町４０６号 電話（０６） ２２７−１１５６ ｂ、悄止卵賃の日１丁 ６、補正の対象 明細書の「発明の詳細な説明」の欄 ７、補正の内容 （１）明細書第２頁、第１５行のｒ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ
Ｊを「ミルスティン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ） ｊに訂正
する。
（２）回書第２頁、第１６〜１７行のｒ （Ｋ６ｈｌｅ
ｒ、 Ｇ。
ｒ、 Ｇ。
ａｎｄ Ｍ目５ｔｅｉｎ＋ Ｃ，： Ｎａｔｕｒｅｌを
「〔ケーラー。
「〔ケーラー。
ジーおよびミルスティン、シー：ネーチャー（Ｋ５ｈｌ
ｅｒ、 ｃ、 ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、 Ｃ，：
Ｎａｔｕｒｅ ）Ｊに訂正する。
ｅｒ、 ｃ、 ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、 Ｃ，：
Ｎａｔｕｒｅ ）Ｊに訂正する。
（３）同書第５頁、第１行のｒ Ｆｒｅｕｎｄ Ｃｏｍ
ｐｌｅｔｅａｄｊｕｖａｎｔＪを「完全フロインドアジ
ュバント（Ｆｒｅｕｎｄ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ａｄｊｕ
ｖａｎｔ）Ｊに訂正する。
ｐｌｅｔｅａｄｊｕｖａｎｔＪを「完全フロインドアジ
ュバント（Ｆｒｅｕｎｄ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ａｄｊｕ
ｖａｎｔ）Ｊに訂正する。
（４）同書第５頁、第１０行のｒ Ｇ、 Ｋ５ｈｌｅｒ
（Ｎａｔｕｒｅ Ｊを「ジー、ケーラー（Ｇ、に５ｈ
ｌｅｒ） （ネーチャー （Ｎａｔｕｒｅ） Ｊに訂正
する。
（Ｎａｔｕｒｅ Ｊを「ジー、ケーラー（Ｇ、に５ｈ
ｌｅｒ） （ネーチャー （Ｎａｔｕｒｅ） Ｊに訂正
する。
（５）回書第６頁、最終行〜第７頁、第１行のｒ ｃｏ
ｎｊｕｇａｔｅさせｔａｒｇｅｔｉｎｇｔｈｅｒａｐｙ
（ターゲティングセラピイ）」を「コンジュゲートさせ
、ターゲティングセラピイ（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈ
ｅｒａｐｙ）Ｊに訂正する。
ｎｊｕｇａｔｅさせｔａｒｇｅｔｉｎｇｔｈｅｒａｐｙ
（ターゲティングセラピイ）」を「コンジュゲートさせ
、ターゲティングセラピイ（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈ
ｅｒａｐｙ）Ｊに訂正する。
（６）同書第７頁、第１１行のｒ Ｆｒｅｕｎｄ Ｃｏ
＋ｗｐｌｅｔｅ＾ｄｊｕｖａｎｔＪ ヲｒ完全フロイン
ドアジュバント」に訂正する。
＋ｗｐｌｅｔｅ＾ｄｊｕｖａｎｔＪ ヲｒ完全フロイン
ドアジュバント」に訂正する。
（７）同書第７頁、第１７行のｒ （Ｃｕｒｒ、 Ｔｏ
ｐ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、＋ Ｊ
を「〔カレント トビカルマイクロバイオロジカル イ
ムノロジー（Ｃｕｒｒ 。
ｐ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、＋ Ｊ
を「〔カレント トビカルマイクロバイオロジカル イ
ムノロジー（Ｃｕｒｒ 。
Ｔｏｐ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、）
＋Ｊに訂正する。
＋Ｊに訂正する。
（８）同書第７頁、第１８行のｒＫ５ｈｌｅｎＪを「ケ
ーラー（Ｋ６ｈｌｅｒ） Ｊに訂正する。
ーラー（Ｋ６ｈｌｅｒ） Ｊに訂正する。
（９）同書第７頁、第１９〜２０行のｒ （Ｉｍｍｕｎ
ｏｌｏｇｔｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄ （Ａｃａｄｅｎｉｃ
Ｐｒｅｓｓ）＋ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｊを「〔イムノ
ロジカル メソッド（アカデミツク プレス）、ニュー
ヨーク （Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄ
（＾ｃａｄｅｎ＋ｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、 Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋ）＋ Ｊに訂正する。
ｏｌｏｇｔｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄ （Ａｃａｄｅｎｉｃ
Ｐｒｅｓｓ）＋ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｊを「〔イムノ
ロジカル メソッド（アカデミツク プレス）、ニュー
ヨーク （Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄ
（＾ｃａｄｅｎ＋ｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、 Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋ）＋ Ｊに訂正する。
（１０）同書第１０頁、第１７行のｒＢ−Ｇａｌａｃｔ
ｏｓｉｄａｓｅＪを「Ｂ−ガラクトシダーゼ（Ｂ−Ｇａ
ｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ） Ｊに訂正する。
ｏｓｉｄａｓｅＪを「Ｂ−ガラクトシダーゼ（Ｂ−Ｇａ
ｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ） Ｊに訂正する。
（１１）回書第１０頁、最終行のｒ Ｃａｒｃｉｎｏｅ
ｍｂｒｙｏｎｉｃａｎｔｉｇｅｎ Ｊを「癌胎児性抗原
（Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃａｎｔｉｇｅｎ）
Ｊに訂正する。
ｍｂｒｙｏｎｉｃａｎｔｉｇｅｎ Ｊを「癌胎児性抗原
（Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃａｎｔｉｇｅｎ）
Ｊに訂正する。
（１２）回書第１１頁、第８行のｒｌｎｈｉｂｉｔｔｏ
ｎ Ｔｅ５ｔｊを「インヒビジョン テスト（Ｉｎｈｉ
ｂｉｔｉｏｎ Ｔｅ５ｔ） ｊに訂正する。
ｎ Ｔｅ５ｔｊを「インヒビジョン テスト（Ｉｎｈｉ
ｂｉｔｉｏｎ Ｔｅ５ｔ） ｊに訂正する。
（１３）同書第１１頁、第１０行のｒｔｉｔｒａｔｉｏ
ｎ Ｊを「タイトレージョン」に訂正する。
ｎ Ｊを「タイトレージョン」に訂正する。
（１４）回書第１１頁、第１５〜１６行のｒ １ｎｃｕ
ｂａｔｉｏｎＪを「インキュベーション」に訂正する。
ｂａｔｉｏｎＪを「インキュベーション」に訂正する。
（１５）回書第１１頁、第１６行のｒ ｔａｒｇｅｔＪ
を「ターゲット」に訂正する。
を「ターゲット」に訂正する。
（１６）同書第１１頁、第１７行のｒａｓｓａｙ Ｊを
［アッセイ （ａｓｓａｙ） Ｊに訂正する。
［アッセイ （ａｓｓａｙ） Ｊに訂正する。
（１７）同書第１１頁、第１９行のｒＴａｒｇｅｔ ｃ
ｅｌｌ Ｊを「ターゲットセル」に訂正する。
ｅｌｌ Ｊを「ターゲットセル」に訂正する。
（１８）同書第１２頁、第２行のｒ ｗｅｌｌ Ｊを「
ウェル」に訂正する。
ウェル」に訂正する。
（１９）回書第１２頁、第４行のｒａｓｓａｙ ｊを「
アッセイ」に訂正する。
アッセイ」に訂正する。
（２０）回書第１２頁、第５行のｒ ｗｅｌｌ Ｊを「
ウニ（２１）回書第１２頁、第８行のｒ ｃｅｌｌ ｌ
１ｎｅＪを「セルライン」に訂正する。
ウニ（２１）回書第１２頁、第８行のｒ ｃｅｌｌ ｌ
１ｎｅＪを「セルライン」に訂正する。
（２２）回書第１２頁、第１０行のｒｌｎｈｉｂｉｔｉ
ｏｎ Ｔｅ５ｔＪを「インヒビジョン テスト」に訂正
する。
ｏｎ Ｔｅ５ｔＪを「インヒビジョン テスト」に訂正
する。
（２３）同書第１３頁、第１８行のｒＳｅｐｈａｒｏｓ
ｅ Ｊを「セファロース」に訂正する。
ｅ Ｊを「セファロース」に訂正する。
（２４）同書第１３頁、第１９行のｒＤＥ＾Ｅ−Ｃｅｌ
ｌｕｌｏｆｉｎｅＪｔ−ｒＤＥＡＥ−セルロファイン」
に訂正する。
ｌｕｌｏｆｉｎｅＪｔ−ｒＤＥＡＥ−セルロファイン」
に訂正する。
（２５）同書第１４頁、第１行のｒ ＤＥＡＲ−Ｃｅｌ
ｌｕｌｏｆｉｎｅＪＧ ｒＤＥＡＥ−セルロファイン」
に訂正する。
ｌｕｌｏｆｉｎｅＪＧ ｒＤＥＡＥ−セルロファイン」
に訂正する。
（２６）同書第１４頁、下から第３行の「※ＣＤ、は１
ｎｂｉ ｔｉｏｎがかからなかった。」を「※：インヒ
ビション テストにおいて、インヒビジョンがかがらな
かった。」に訂正する。
ｎｂｉ ｔｉｏｎがかからなかった。」を「※：インヒ
ビション テストにおいて、インヒビジョンがかがらな
かった。」に訂正する。
以上
手 続 争甫 正 書１発）
昭和６０年６月２０日
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 胃低分化型腺癌由来細胞株（ＭＫＮ−４５）を免疫原と
して作成されたハイブリドーマの産生する以下の特性を
持つモノクローナル抗体； （１）Ｉｇクラス（Ｌｉｇｈｔ鎖）：ＩｇＧ＿１（Ｋ）
（２）認識抗原タイプ：細胞表面抗原 （３）癌細胞との反応性：次の癌細胞に対して陽性を示
す。 食道癌（ＴＥ−３）、肺癌（ＰＣ−３）、胃癌（ＭＫＮ
−４５）、胃癌（ＫＡＴＯ−III）、肝癌（ＨＥＫ）。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60008129A JPS61167699A (ja) | 1985-01-19 | 1985-01-19 | モノクロ−ナル抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60008129A JPS61167699A (ja) | 1985-01-19 | 1985-01-19 | モノクロ−ナル抗体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61167699A true JPS61167699A (ja) | 1986-07-29 |
| JPH046358B2 JPH046358B2 (ja) | 1992-02-05 |
Family
ID=11684675
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60008129A Granted JPS61167699A (ja) | 1985-01-19 | 1985-01-19 | モノクロ−ナル抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61167699A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61250000A (ja) * | 1985-04-27 | 1986-11-07 | Green Cross Corp:The | モノクロ−ナル抗体 |
| JPS6236398A (ja) * | 1985-08-12 | 1987-02-17 | Green Cross Corp:The | モノクロ−ナル抗体 |
| US6461824B1 (en) * | 1988-09-06 | 2002-10-08 | Xoma Technology Ltd. | Production of chimeric antibodies with specificity to human tumor antigens |
-
1985
- 1985-01-19 JP JP60008129A patent/JPS61167699A/ja active Granted
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61250000A (ja) * | 1985-04-27 | 1986-11-07 | Green Cross Corp:The | モノクロ−ナル抗体 |
| JPS6236398A (ja) * | 1985-08-12 | 1987-02-17 | Green Cross Corp:The | モノクロ−ナル抗体 |
| US6461824B1 (en) * | 1988-09-06 | 2002-10-08 | Xoma Technology Ltd. | Production of chimeric antibodies with specificity to human tumor antigens |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH046358B2 (ja) | 1992-02-05 |
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