JPS61204200A - ヒトモノクロ−ナル抗体およびその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、緑膿菌外毒素に対するヒトモノクローナル抗
体、その製造方法およびその用途、すなイ）ら具体的に
は緑膿菌を含む線画にまる感染症の°治療剤および外毒
素産生性緑ｍ菌による感染症の珍断用試薬に関する。

細菌感染症の治療において間層となる病原菌は、抗生物
質の開発とともに変化している。すなわら、臨床上用い
られる抗生物質の１類の変遷に伴ない＠菌感染症を引き
起こす線菌、いわゆる起炎菌が交代してきた。従来、低
病原性又は弱毒性と言われた細菌、なかでも特に緑膿菌
（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｃｒｕｇｊｎｏｓａ　）
　　に誹る感染例が増加し、緑膿菌は近年、主要な病原
菌の一つとなっているっ緑膿菌感染は、免疫抑制剤の投
与を受は免疫能の低下している患者、又は癌患者や熱傷
患者および新生児などの免疫不全・低下症の患者におい
て重篤な症状を引き起こし死に至らしめる場合が多い細
菌感染として知られている。緑膿菌の病原性因子として
は、細菌の増殖に伴なう内毒素および緑膿菌の産生する
外毒素および外酵素がある。なかでも外毒素は、はとん
どの緑膿菌臨床分離株において産生されており、その外
毒素は細胞に毒性を示すのみならず、各種の動物に致死
的作用を及ぼす。

細菌感染を予防・治療する方法として、まず第一にあげ
られるのが、抗生物質および合成抗菌剤を用いた化学療
法である。ストレプトマイシン、カナマイシン、ペニシ
リンやセファロスポリンなど幾多の抗生物質が開発され
、その多くはブドウ球菌を代表とするほとんどのグラム
陽性球菌や、大腸菌などのグラム陰性菌に感受性を示し
、著効な臨床効果を示してきた。しかしながら、今日迄
の多くの研究開発にもかかわらず、緑膿菌に感受性を示
す薬剤は依然少ないのが現状であり、しかも、今日、感
受性を示すとされる薬剤でも、そのほとんどが、緑ｍ菌
に対してその増殖を単に阻害するいわゆる静菌的に作用
するのみで、殺菌力に欠けており、臨床の場において著
効な治療効果を示すに至ってぃない。又、抗生物質療法
の限界を示すその他の例は、抗生物質は細菌の増殖を抑
制するものの、細菌が産生しその病原性を発揮する毒素
や岬素に対して阻害効果の無いことである。

ところで、細菌由来の毒素や酵素を中和および阻害する
ことにより細菌感染症を予防および治療することができ
る療法として、免疫グロブリン製剤の投与、いわゆる抗
体療法があり、抗生物質療法と併用される、又はそれに
代わるものとして注目されている。ウマやウサギ等の動
物を能動的に免疫することによって抗体価の高い血清を
得ることができ、その血清を投与する抗体療法は、各種
の動物を用いた実験的感染症において著効な治療効果を
示すことが多くの実験にて実証されている。ヒト以外の
動物由来の血清を用いた抗体療法がヒトにおいても有効
性を示すことは、ジフテリア毒素や蛇毒の例で周知のこ
とである。しかしながら、ヒト以外の動物から得られた
異種蛋白をヒト体内へ移入するこの方法は、アナフィラ
キシ−や、その他のアレルギー反応などの重篤な副作用
を引きおこし一般細菌感染症の治療法として採用される
に至っていない。かくして、細菌および細菌由来の毒素
・酵素に対して高い抗体力価を有し、細菌感染症の治療
効果の大きいヒト免疫グロブリンの開発が望まれている
。

従来のヒト免疫グロブリン製剤は、健常人又は細菌感染
既発患者から血液を採取し、既知の方法にて免疫グロブ
リン画分を分取・精製した後に、ポリエチレングリコー
ル添加、蛋白分解酵素処理、スルホン化、ＤＥＡＪ！；
−カラムクロマトグラフィー等の、凝集物を除去する方
法により、筋肉注射用のみならす、静脈注射用に製剤化
されたものである。これらヒト免疫クロプリン製剤には
、ヒト以外の異種動物由来の免疫グロブリンを投与した
時にみられるアナフィラキシ−等の副作用は無い等の利
点をもつが、幾つかの欠点を持つ。第一に、（り細菌お
よび細菌由来の毒素・酵素に対する抗体価が低（、必ず
しも充分な治療効果を期待しえない。第二に、（子）高
力価の免疫グロブリンを大量に安定して供給することが
難しい。健常人ボランティアや患者より採取された血液
を材料に製造されており、高い力価の血清を一定して入
手することは極めて雛しく、製造ロット毎に、抗体価が
変動することがある。第三に、（）任意のヒトの血液を
材料に製造されることにより、免疫グロブリン製剤にＨ
Ｂｓウィルスなどの肝炎ウィルスやＡｄｕｌｔＴ　ｃｅ
ｌｌ　ｌｅｕｋａｅｍｉａ　ｖｉｒｕｓ　（ＡＴＬＶ　
、　ａＴＬＶ）なとが混入することがあり得る。

こうした状況に鑑み、不発明者らは前述の問題点を改善
すべく、鋭意改良を加え、緑膿菌感染症、特に外毒素産
生縁ＦＱＭ感染症に有効なヒトモノクローナル抗体、お
よびそれを含む高力価ヒト免疫グロブリン、およびそれ
を生体外またｌ：ｔマウスなどを含むヒト以外の生体内
にて安定的かつ大量に製造する方法を確立し本発明を完
成するＩζ至った。

本発明者らは、緑膿菌外毒素に対するヒトの抗体、特に
単一な抗原特異性をもつモノクローナル抗体（単一性抗
体）の生産方法に係わり、更に特定するに特異抗体を連
続的に産生じ得るヒト細胞株の取得方法およびその細胞
を　１ｎｖｉｔｒｏ　　およびｉｎ　ｖｉｖｏ　　培養
することを含む特異抗体の大量製造方法およびそれによ
って得られた緑膿菌外毒素に対する特異モノクローナル
抗体を少なくとも一種類含む、感染治療用のヒト免疫グ
ロブリン製剤、又は診断用試薬としてのヒトモノクロー
ナル抗体に関するものである。

緑膿菌外毒素と特異的に反応するヒトモノクローナル抗
体を連続的に産生ずるヒト細胞株が本発明によって取得
される。第一の方法として、生体内又は生体外にて緑膿
菌および緑膿菌由来の外毒素によって感作されたヒトリ
ンパ球Ｂ細胞をエプスタイン命パー（Ｅｐｓｉｅｉｎ　
−Ｂａｒｒ　）ウィルス（以下、ＥＢウィルスと略）と
混合することによって感染させ、連続的に増殖する細胞
へと形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　）さセ
ル。

次いでクローン化する前の、又はクローン化された形質
転換細胞から、所望の特異抗体産生株を選別し試験管内
（生体外）にて連続的に細胞増殖し、かつ所望の特異抗
体を連続的に生産する細胞株を樹立する。又、第二の方
法として、緑膿菌および緑膿菌由来外毒素によって感作
されたヒトＩＪンパ球Ｂ細胞を骨髄腫細胞（ｍｙｅｌ−
ｏｍａ　）又はＢリンパ芽球様細胞（Ｂ　ｌｙｍｐｈｏ
ｂｌ−ａｓｔｏｉｄ　ｃｅｌｌ　）と細胞融合すること
によって、試験管内にて連続的に細胞増殖し、かつ所望
の特異抗体を連続的に産生ずる細胞株を樹立する。

第三の方法として、第一の方法にて樹立された特異抗体
を産生ずるＥＢウィルス形質転換細胞を骨髄腫細胞又は
Ｂリンパ芽球様細胞とを細胞融合することによって試験
管内にて連続的に細胞増殖し、かつ所望の特異抗体を一
１１！絖的に産生ずる細胞株を樹立する。これらの樹立
株を試験管内培養又はヌードマウス腹腔などの生体内ニ
て培養することによって、培地又は腹水へ分泌された抗
体を精製することによって抗体を大量に製造する。

本発明にまって得られる、緑膿菌外毒素に対するヒトモ
ノクローナル抗体とは、緑膿菌外毒素分子の抗原決定基
を特異的に認識する単一な（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ　
）ヒト型の抗体を指す。本ヒトモノクローナル抗体は、
緑膿菌外毒素に対して結合する能力（結合活性）、外毒
素の細胞への侵入を阻害する活性、外毒素の酵素活性を
阻害する活性（中和活性）をもち、外毒素産生性緑膿菌
による感染症を治癒することができる。更に外毒素産生
性緑膿菌の分離鑑別に用いることができる。

本発明を以下、詳細に説明する。

抗原としての緑ＩＩｊ！菌外毒累とは、外毒素Ａ（Ｅｘ
ｏｔｏｘｉｎ　Ａ　）　（Ｍ、Ｌ、　Ｖａｓｉｌ　、　
Ｄ、　Ｋａｂａｔａｎｄ　Ｂ＋８．　Ｉｇｌａｗｓｋｊ
、　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｔ＋ｄ　Ｉ＋ｎｍｕｎｔｔ
ｙ。

１６．８５８（１９７７）お、Ｉ　Ｑ−Ｇ、Ｌ、（３ｒ
ａｙ　ｅｔ、　ａｌ。

Ｐｒｏｃ、　ＮａｔＪ、ムｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ
、　８１．２６４５（１９８４））に代表される、緑１
ｙＡＮの産生ずる毒素を意味する。

本発明に含まれるヒトモノクローナル抗体の製造方法は
、基本的に、以下の諸過程にわけることができる。■抗
原感作されたヒトリンパ球Ｂ細胞の調製、（４，）無制
限増殖能力の賦与によるモノクローナルな特異抗体産生
細胞株の樹立、リモノクローナルな特異抗体産生細胞株
の培養、ＣＩ培養液からのモノクローナルな特異抗体の
精製、■モノクローナルな特異抗体を含む高力価免疫多
ロブリン製剤の調製。順次、説明する。

ヒトのリンパ球Ｂ細胞とは、緑膿菌外毒素に対する抗体
を産生ずるヒトリンパ系細胞で、主として末梢血液より
リンフォブレップ、モノポリ分離液などのリンパ球分離
液を用いた遠心分離法によって分離されるが、各種疾患
の診断おまび治療の目的で摘出されたリンパ節、膵臓な
どの臓器や請帯血由来のリンパ球Ｂ細胞を材料に用いる
こともできる。緑膿菌による感染、特に外毒素産生性緑
膿菌による感染症を患ったことがあり、生体内で感作さ
れた既応症のヒト由来のリンパ球Ｂ細胞を用いることが
望ましい。

あらかじめ、血清中の抗体価を測定することにより通切
なリンパ球提供者を選別することができる。又、別の方
法として、緑膿菌症の有無を問わず、ヒトリンパ球Ｂ細
胞を採取し、試験管内にて不活化された緑膿菌外毒素と
を混合することによって感作せしめることができる。可
なわら、抗原としての不活化緑膿菌外毒素をリンパ球Ｂ
細胞に添加する。更にアメリカヤマゴボウレクチン（Ｐ
ＷＭ）などの植物性レクチン、Ｃｏｗａｎ　Ｉなとの菌
体成分、又はヒドリン・マ球の混合培養液や膵臓、胸腺
細胞や胱帯血細胞培養液など、Ｂ細胞増殖因子およびＢ
細胞分化因子等のリンフ才力イン類を含む溶液を同時に
、又はそれぞれの組み合わせで添加することによって試
験管内にて抗原感作し、引き続き抗体産生細胞へと増殖
・分化させたヒトリンパ球Ｂ細胞を用いることができる
。これらのヒトリンパ球Ｂ細胞は、その細胞表面に抗体
分子を有し、ある限られた期間、少量の抗体を分泌する
ことが可能であるが、無制限に増殖することはできな　
　′いことを特徴とする。

抗原感作されたヒトリンパ球Ｂ細胞を無制限、連続的に
増殖可能な細胞株とする方法として、不発明は基本的に
二種類の方法を含む、第一の方法は、抗原感作されたヒ
トリンパ球Ｂ細胞をマーモセット細胞Ｂ９５−８から調
製されたＥＢウィルスと混合培養することによってＥＢ
ウィルスをリンパ球Ｂ細胞に感染させる。好ましくは、
ｌ細胞あたり２〜１０　ＴＤ田のウィルスを混合する。

９６穴マイクロプレートのｌウェルあたり０．５〜ａｘ
ｔｏ　　個の細胞を播種し、あらかじめ選別されたウシ
胎児、ウシ、ウマ又はヒト等の血清を２〜２ｏｓ（ｖ／
ｖ）にて含むＲＰＭ１１６４０又１，１　Ｅａｇｌｅ　
ｓ　　ＭＥ　Ｍ　　ｒ（どの通常の培地を用いて５〜１
０　％　００２　存在下、３２〜３７℃にて、２〜５週
間培養することによって形質転換細胞（ｔｒａｎｓｆｏ
ｒｍｅｄ　ｃｅｌｌ　）　　を得る。培養中２〜４日毎
に培地を半量ずつ交換する。必要に応じて、マイコプラ
ズマの汚染を防ぐ抗生物質や合成抗微生物薬を添加する
。形質転換細胞は、感染１０日以降、２０〜２００個の
細胞集団として光学顕微鏡下で観察され、非形質転換細
胞と容易に区別し得る。充分に増殖された形質転換細胞
を含むウェル（ｗｅｌｌ　）の培養液を酵素免疫法（Ｅ
ＬＩ８Ａ）によって抗体価をスクリーニングして抗体産
生の認められるウェルを選択する。その後、形質転換さ
れた細胞塊（クラスター）を含む溶液をピペットを用い
て軽く吸引・排出する操作を繰り返すことによってクラ
スターをほぐし、培地にて適切な細胞濃度に希釈し０．
５〜１００個細胞／ウェルとなるように９６穴マイクロ
プレートに播種培養する、いわゆる限界希釈法（Ｌｉｍ
＋ｔｉｎｇ　ｄｉｌ　−ｕｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　）
を用いるか、　又は軟寒天を利用してクローニングする
。０．８６〜０．４係（ｗ／ｖ）の軟寒天（Ｓｅａ　ｐ
ｌａｑｕｅ　ａｇａｒｏｓｅが好ましい）に形質転換細
胞約７　Ｘ　１０’〜７Ｘ１０”を培養プレート（３０
Ｗｍφ）へ接種し、５　％　ＣＯ２，３７℃にて培養す
る。ｌ細胞から増殖してくるコロニーを得る。クローニ
ングの際に、ｆｅｅｄｅｒｌａｙｅｒとしてマウス腹腔
内細胞、ヒト屓帯血リンパ球又はＸ線照射処理したマウ
ス膵臓細胞を用いることが望ましい。クローニングされ
た細胞株の培養上清の抗体価をＥＬＩＳＡ法にて測定し
、特異抗体産生量の多い株を更に選別する。

このクローニング、抗体の高産生株の選別を２〜３回繰
り返し、増殖の速い、かつ特異抗体を安定的、大量に産
生ずる形質転換細胞株を選択し樹立する。

第二の方法は、抗原感作されたヒトリンパ球Ｂ細胞と骨
髄腫細胞とをポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の存在
下に細胞融合する方法である。用いられる骨髄腫細胞は
Ｐ３ｘ６Ｂ−Ａｇ８（Ｐ３）、Ｐ３　ｘ　６　Ｂ−Ａｇ
　８．６５８などの、マウス骨髄腫細胞由来のヒボキサ
ンチン・グアニン壽ホスホリボシルトランスフェラーゼ
（ＨＧＰＲＴ　　と略）欠如変異株、又は、ヒト骨髄腫
細胞Ｕ−２６６由来のｔｉＧＰＲＴ欠如変異株などを指
す。骨髄腫細胞の代わりに、ヒトＢリンパ芽球細胞由来
のＨＧＰＲＴ欠如変異株を用いることもできる。Ｉ’Ｅ
Ｇとしては、ＰＥＧＩ、０００〜６、０００を８０〜５
０　％　（ｗ／ｖ　）の濃度で用いる。レクチン、ポリ
ーＬ−リジンやＤＭ８０などを添加することにより融合
効率を高めることもできる。ＰＥ００代わりに、センタ
イウィルス（ＥＩＶＪウィルス）を用いることも可能で
ある。融合方法は、マウス細胞同志を融合し、マウスモ
ノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを取得した
Ｋｏｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｃｅｉｎらの方法（Ｎ
ａｔｕｒｅ　２５６　、４９５　１９７５　）　ニ準Ｔ
　ル。簡単ニ記述すれば、抗ｆｇ、感作されたヒトリン
パ球Ｂ細胞とＥＩＧＰＲＴの欠如した骨髄腫細胞とをｌ
Ｏ〜ｌ：１の割合にて混合し、８０〜５（１（Ｗ／Ｖ）
ＰＥＯ６０００を０．５〜１分間に少ｆｆ１ｆつ加え、
１〜１０分間静置する。その後、５〜ｌＯ分間にｌθ〜
５０−の血清不含培地を加える。更に培地を加えｌ　Ｏ
’〜１０’個細胞／−の濃度に調製し、９６穴マイクロ
プレートに１つ５゛ エルあたり２Ｘｌυ　〜２ｘ１０　個の細胞を播種する
。翌日、ヒボキサンチンζアミノプテリン・チミジン含
有培地（Ｉ（ＡＴ培地と略）に半量交換し、５％ＣＯ２
，３２〜３７℃にて培養するっ約１０〜２０日間断しい
ＥムＴ培地に、続いて約８〜５日間ヒボキサンチン・チ
ミジン含有培地（ｆｉＴと略）に、８日毎に半量ずつ交
換を続は約２〜３週間培養して、増殖してくるコロニー
、いわゆるハイブリドーマを得る。■ＧＰＲＴ欠如変異
株を用いることなく、代謝阻害剤を組み合わせることに
よってハイブリドーマを選択することも可能である。ハ
イブリドーマの培養液の抗体価をＥＬＩＳＡ法又はラジ
オイムノアッセイ（１’ＬＩＡと略）によって測定し、
緑膿菌外毒素に対する特異抗体産生体を選別する。限界
希釈法又は軟寒天法によって、２〜８回クローニングを
繰り返し、増殖の速い、特異抗体産生体の多い、安定し
た細胞株を得る。抗原感作されたヒトリンパ球Ｂ細胞の
代わりに、第一の方法によってＥＢウィルス形質転換さ
れた細胞を用いることもできる。

以上、ＥＢウィルス形質転換法（Ｅ　Ｂ　ｖｉｒｕｓｔ
ｒａｎｓｆ’ｏｒｍａｔｉｏｎ　ｍｅｔｂｏｄ　）又は
細胞融合法（ｃｅｌｌ　　オ゛ｕｓｔｏｎ　　ｍｅｔｈ
ｏｄ　　；　　　ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　　ｍｅｔｈｏｄ
　　）　　を用いて、抗原感作ヒトリンパ球Ｂ細胞より
樹立された細胞株は、連続的に増殖することができるこ
と、しかも、特異抗体を安定的に、かつ大量に産生じ得
ることを特徴とする。

これら樹立された形質転換細胞又はハイブリドーマ（０
，５〜５ｘ　ｔ　ｏ　　個細胞／＋ｄ）を通常の動物細
胞培養用培地にてＣＯ２インキュベーターを使用して２
〜１０チＣＯ２，３２〜３７℃の条件のもとて培養フラ
スコやプレート等の容器内で静置培養又は回転培養する
。特に大量に培養する時は、動物細胞用に設計されたジ
ャーファーメンタ−やホロファイバーシステム等を用い
ることもできる。通常の動物細胞培養用培地とは、ウシ
胎児、仔ウシ、ウシ、ウマおよびヒトなどの血清を２〜
２０％含有する几Ｉ’ＭＩ　１６４０、Ｅａｇｌｅ’ｓ
　　Ｍ　Ｅ　Ｍ　ニ代’ｔＱｃｌｔ”Ｌ；６培地、又は
、インシ工リン、トランスフェリン、エタノールアミン
、セレナイト、ウシアルブミン、リヒドなど細胞の増殖
に必要な微量成分を含む無血清培地を指す。上記の試験
管内細胞培養以外に、形質転換細胞、又はハイブリドー
マをヌードマウスなどの動物体内へ接種することによっ
て細胞を腹腔などの体内にて培饗することも可能である
。マウスやヌードマウスの場合、１匹あたり０．５〜２
．５Ｘ１０　　個の細胞を腹腔内投与するっ乙の場合、
細胞接種前に、ブリスタンや抗アシアロＧＭＩ抗体を投
与することが望ましい。Ｘ線照射や摘牌手術も有効の場
合がある。

抗体の精製は通常の生化学的手法を組み合わせることに
よってなされる。すなわち、硫安沈澱分画法、エタノー
ル沈澱分画法、ＰＥＧ分画法、イオン交換クロマトグラ
フィー、ゲル沖過法、７フイニテイクロマトグラフイー
、高速液体クロマトグラフィー、電気泳動性等である。

精製過程において、凝集物の形成や抗体活性の低下を防
ぐ工夫が必要である。例えば、ヒト血清アルブミン（ｕ
８Ａと略）を０．０５〜２囁の濃度で添加する。その他
グリシンやα−アラニンなどのアミノ酸類、特にリジン
、アルギニンやヒスチジンの塩基性アミノ酸、グルコー
スやマンニトールなどの糖類、塩化ナトリウムなどの塩
類を添加することが好ましい場合がある。

ＩｇＭ抗体の場合、特に凝集しやすいことが知られてい
る。β−プロピオニラクトンや無水酢酸などで処理する
ことは、凝集を阻止することができ静脈内投与も可能と
する。

精製されたヒトモノクローナル抗体は、生物学的製剤の
製剤化に通常用いられる方法にょっ　′て製剤化される
。基本的には、メンブレンフィルター等による濾過除菌
操作の後に、安定化剤とともに滅菌バイアルに凍結乾燥
される。

本ヒトモノクローナル抗体製剤は、細菌感染治療・予防
剤として、緑膿菌外毒素に対する１種類のヒトモノクロ
ーナル抗体より成ることも可能であるが、更に好ましく
は、緑膿菌外毒素分子の異なる抗原決定部位を認識しつ
る、少なくとも２種類又はそれ以上のヒトモノクローナ
ル抗体と混合して用いられる。又は緑膿菌外毒素以外の
緑膿菌由来抗原、例えばエラスターゼ１１０テアーゼな
どの緑膿菌外毒素や外膜蛋白・内毒素構成成分などを認
識する、従来型のヒト抗体と混合して使用される。更に
は、緑膿菌以外の細菌、ウィルス、真菌、原虫、癌細胞
に対するヒト抗体に、本発明によって得られる緑膿菌外
毒素に対するヒトモノクローナル抗体を添加して用いる
ことができる。従来のヒト免疫グロブリン製剤に、本発
明によって得られるヒトモノクローナル抗体を添加して
、外毒素に対する高力価免疫グロブリン製剤とされる。

本発明によって得られるヒトモノクローナル抗体は、主
としてクラスＩｇＧおよびＩｇＭに属するがこれに限定
されたものでない。本ヒトモノクローナル抗体は、緑膿
菌外毒素に対して結合する（結合活性）。その結合定数
としてｌＯ８モル／１以上の高い結合層相性をもつこと
が望ましい。その他、外毒素の細胞への侵入を阻害する
活性、外毒素の酵素活性を阻害する活性（中和活性）を
もち、外毒素産生性緑膿菌による実験的マウス感染症を
治癒することができる。

外毒素産生性緑ｌ１ｉｉ！菌による職染症および−その
細菌を含む混合細菌感染症の治療・予防に用いられる時
、本ヒトモノクローナル抗体を少なくとも１鴇類含むヒ
ト免疫グロブリン製剤は、重症の場合成人あたり１回１
〜ＬＯＰ、予防や通常の治療の場合成人あたり１回０．
２〜５？が投与される。

以上、詳しく述べたように、本発明によって得られる緑
膿菌外毒素に対するヒトモノクローナル抗体は、同抗原
に対して高い抗体価を有し、マウス実験的感染症の系で
従来の免疫グロブリン製剤よりも、はるかに優れた治療
効果を示すことが、第一の特徴である。その他、ヒト由
来の蛋白であることより、異種蛋白の投与時にみられる
アナフィラキシ−等の副作用の少ないことが期待される
し、特定の細胞より生産・精製される抗体であることよ
り、不特定多数のヒト血液より製造された従来の免疫グ
ロブリン製剤にくらべ、未知のバイオハザードが混入し
てくる可能性の低いことが特徴である。又、本モノクロ
ーナル抗体の製造方法としては、生体外二大量に、高力
価の特異抗体を安定して製造することが特徴であり、従
来のヒト血液誹り製造する方法にくらべ高力価など生物
活性の点で、安定的供給ができるなど品質管理の点で優
れる。

以上、本発明の基本となるものである。

次に実施例をあげて本発明をさらに具体的に説明するが
、本発明はこれのみに限定されないことは言うまでもな
い。

実施例１ ＥＢウィルス形質転換法によるヒトモノクローナル抗体
産生株の樹立（１） （］）　Ｅ　Ｂウィルス溶液の調製およびそのウィルス
価の検定 ＥＢウィルスを産生放出しているマーモセット細胞Ｂ９
５−８を、ウシ胎児血清（以下ＦＣ８と略）を容量比と
して１０％含有するＲＰＭ　Ｉ　１６４０培地に６．５
Ｘ１０５細胞／−の割合にて懸濁し、培養フラスコＴ−
７５（Ｃａｒｎｉｎｇ　＋　２５１１０　）を用イア　
５　％　００２３７℃の条件のもと４日間静置培養した
つ培養上清を採取し低速遠心機（トミー精工Ｒ８−２Ｑ
Ｂｔ５を用イＴ２，０００　ｒＰｍ（Ｃ１−ターＴ８−
７）、１０分間遠心分離し、おまびそれに引き続いてそ
の上清を０．４５μメンフレンフイルター（マイレクス
８　ＬＥＩＡＯ２５０８）にて沖過した。その湯液をセ
ラムチューブ（住友ベークライトＭＳ−４５０５）に分
注し、−８０℃に保存、必要時適宜溶解しヒトリンパ球
のＥＢウィルスによる細胞形質＆換（＋−ランスフォー
メーション）の実験に用いた。ＥＢウィルス溶液のウィ
ルス価はヒト末梢血リンパ球を指示細胞としてＤ、・】
、Ｍｏ５ｓ　ａｎｄ　ＪｌＩＨ％Ｐｏｐｅの方法（Ｊ％
ｇｅｎｅ−ｒａｌ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、　１７．２８３
　（１９７２）に準じて行なった。すなわちｌ　６ｓＦ
ｃ８含有ＲＰＭＩ　１６４０培地に懸濁されたヒト末梢
血リンパ球（１０６細胞／−）を９６ウエルマイクロプ
レート（住友ベークライト）に１ウエルあたり１００μ
ｌずっ分注した。　その後ｌＯ°〜ＩＯの範囲にて前述
の培地にてｌ。

倍系列希釈されたＥＢウィルス溶液を２０Ｉｔｌ！ずつ
添加し５１００２．８７℃にて培養した。

８日毎にｌ／３容量の培地を交換し３週間後、光学顕微
鏡を用いて形質転換された細胞像の有無を調べた。各希
釈段階ゐたり６ウエルを用いて試験し形質転換率を求め
た。５０チの細胞を形質転換するに要する最高希釈度を
各希釈段階の形質転換率からＲｅｅｄ　ａｎｄ　Ｍｕｅ
ｎｃｈ法にて推計学的に求めその中のウィルス量をＩ　
ＴＤｓｏ　　とし逆算して元の試料中のウィルス量をＴ
Ｄｓｏ数で表わした１、ウィルス量１０〜ｌ　Ｑ７ＴＤ
ｓＯ／ｍ／のＥＢウィルス液を得た。

（２１ＥＬＩＳＡにょる抗緑膿菌外毒素抗体価の測定 抗緑膿菌外毒素抗体価の測定は８．Ｊ。

Ｃｒｙｚ　、　Ｅ、Ｆｕｒｅｒ　、　Ｒ，Ｇｅｒｍａｉ
ｎｅｒの方法（Ｉｎｔ’ｅｃｔｉｏｎ　　ａｎｄ　　Ｉ
ｍｎ＋ｕｎｉｔｙ　　、　　　４Ｑ　　、　　　４３　
５　９　　　。

（１９８Ｂ））に準じて行なった。すなわち５　ｐｆ／
ｌｕｔ　Ｏ）　濃度テ０．１　Ｍ重曹緩衝液（ＰＨ９，
６）に溶解した緑膿菌外毒素溶液を９６ウエルマイクロ
プレート（ファルコンナ８９１２、以下マイクロプレー
トと略称する）にｌウェルあたり１００μｌすつ分注し
、３７℃に２時間インキュベートし外毒素をマイクロプ
レートに吸着させた。

マイクロプレートから外毒素溶液を除去した後８％ウシ
血清アルブミン（以下ＢＳＡと略称する）含有リン酸緩
衝液ＰＥ１７．２（組成ＮａＣ１（８Ｐ／ｌ　）　Ｈ−
Ｃ１（０，２Ｐ／ｌ　）　Ｎａ２　ＥＩ　Ｐ　０４・１
２　Ｅｉ２０　（２，９Ｐ／ｌ　）　）ｊヨヒＫＥＩ２
　Ｐ　（ｌａ（０，２９−／１））（ＰＨ８と略）をｌ
ウェルあたり１２０μｌすつ分注し８７℃にて３０分間
インキュベートすることにより外毒素の未吸着部分をブ
ロッキングした。マイクロプレートを抗原吸着プレート
として以後の操作に用いた。必要に応じてこの段階で一
２０℃に保存した。アッセイ前に抗原吸着プレートをＱ
、　０５　％　Ｔｗｅｅｎ　２Ｑ含有ＰＢＳ　（以下Ｐ
Ｂ８Ｔと略）で３回洗滌した。その後ｘｓＢ８Ａ含有Ｐ
Ｂ　８Ｔをｌウェルあたり５０μ１分注、必要に応じ１
％ＢＳＡ含有ＰＢ８Ｔで適宜希釈した試料（血清腹水又
は培養上清）をｌウェルあたり５０μｌ加え、３７℃で
２時間インキュベートした。その後試料を除去し、ＰＢ
ＳＴで３回洗滌した。続いて第２抗体液を１ウエルあた
り１００μｌずつ加え、３７℃で２時間インキュベート
した、第２抗体としてｌチＢＳＡ含有ＰＢＳで５００〜
１，０００倍希釈したホスファターゼ標ａアフィニティ
精製抗ヒト免疫グロブリン抗体（Ｋｉ　ｒｋｅｇａａ−
ｒｄ　＆　Ｆｅｒｒｙ　Ｌａｂ、　　Ｉｎｃ、）を用い
た。ＩｇＧ。

ＩｇＭ抗体価の測定にはそれぞれホスタファーセ標識抗
ヒトＩｇＧ抗体、抗ヒトＩｇＭ抗体を用いた第２抗体を
除去し、ＰＢＳＴで８回洗滌後、発色基質溶液（８＋＋
ｖｐ−ニトロフェニルリン酸−２−ナトリウム塩を１−
のＮａＮ３　（０，２ｊｌＰ／　１ｓｄ）Ｊ’Ｃ／２・
６ｔｉ２０（０，１１ｎｙ／　ｍ　）を含む１０％ジエ
タールアミン緩衝液ｐＨ９、ｌに溶解した水溶液）をｌ
ウェルあたり１００μｌすつ加え、３７℃で反応させた
。４５分間反応後、３ＮＮａＯＨを１ウエルあたり２０
μｌずつ加えることにより反応を停止した。反応後のＯ
Ｄ　４０５をマルチスキャン（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ　）で
測定しｔユ（３）リンパ球提供者の選別 ２９名のヒトより末梢血を採取し、分離された血清試料
の抗緑［４外春素抗体価を前述のＥＬＩＳＡ法で測定し
たつその結果の一部を表１に示す。５試料で坑外毒素Ｉ
ｙＧ抗体価が高く、そのうちｌ試料では坑外毒素ＩＢＭ
抗体価も比較的高かった。

ｉｔ　　ヒト血清の抗緑膿菌外毒素抗体価（４）ヒト末
梢血からのリンパ球の調製血清中の抗緑膿菌外毒素抗体
が高かったヒトｘ　ｌのｔ増面１　ｎ　ｎｍ１ｇ、ｍＤ
＋　す―　着、−１、笹（住友ベークライト、５〇−容
積）に１５ｍのモノポリ分離液（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂ、　
）を入れ、その上に更に末梢血２０−を静かに重層した
。

低速遠心機ＣトＺ−精工ＲＢ−２０Ｂｆｌ）’を用い２
．５０　Ｏｒｐｍ（ｏ−ターＴＳ−ｒ＞で室温１５分間
遠心分離し赤血球とリンパ球を分離した。す□ンパ球を
含む部分を回収し、ＩＯ係ＦＣ８含有ＲＰＭ１１６４ｇ
培地（以下培地と略）で２回洗滌した後、細胞数を計算
した。そのＭ果１．２ｘｔ０８ケのリンパ球を得た。

（５）　Ｅ　Ｂウィルス形質転換法による抗緑膿菌外毒
素抗体産生株の樹立 ヒト／に１末梢血リンパ球２　Ｘ　１０７細胞を２−の
培地に懸濁し前述のＥＢウィルス液１０―（ウィルス＠
　１０　　Ｔ　Ｄｓｏ　／ｌｄ　）を加え５チ００２．
３７℃にて２時間インキュベートした。

その後低速遠心機′（トミー精工Ｒ８−２０Ｂ■）を用
い２，０００　ｒｐ＋ｎ　（０−ターＴ８−７）で１０
℃、２分間遠心分離しＥＢウィルスの感染したヒトリン
パ球を回収した。ＥＢウィルスの感染したヒトリンパ球
をｌＯ％牛脂児血清およびペニシリン（１００ＩＵ／ｍ
ｇ）、ストレプトマイシン（５０μ！ｉ’　／　ｒｎｌ
　）　、ポリミキシン（２５μＰ／ｍｔ）、スペクチノ
マイシン（２０μｍ／−）、アルギニン（０，２ｒｌｌ
？／　−）を含む培地（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　Ｃｏｃ
ｋｔａｉｌ　、　Ｂｒａｄ−Ｉｅｙ、　ｅＬ、　ａｌ　
　５ｔｈ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｎｇｒｅ
ｓｓｏｆ　ｌｒｎｍｕｎｏｌｏｇｙ、　Ｋｙｏｔｏ、　
１　ｇ　Ｂ　３　；以下ＭＰＣと略）に懸濁しく約２Ｘ
１０　細胞／＋＋１／り　、あらかじめマウス腹腔内浮
遊細胞Ｍ３ＸｌＯ’細胞／ウェル）を入れておいたマイ
クロプレートに１ウエルあたり１００μｌすつ播種した
。培養−週間後から３日毎に半量ずつ新鮮なＭＰＯと交
換し８週間後に細胞の増殖を観察した。培養したすべて
のウェルでＥＢウィルス形質転換細胞の増殖が認められ
た。更に培養上清に含まれる坑外毒素抗体価を前述のＥ
ＬＩＳＡ法にて測定した。その結果１／９６０の割合で
坑外毒素ＩＰＧ抗体価の高いウェルを認めた（ＦＫ−５
Ａ５）。培養上清には２μｔ／−のヒ）　Ｉ７Ｇが含ま
れ５０倍希釈したＡＩの血清と同程度の抗体価を示した
。

（６）クローニング 坑外毒素抗体価の高かったウェルの細胞集団の一部をと
り、ＩＯ細胞／−の割合にてＭＰＣに懸濁し、あらかじ
めマウスの腹腔内浮遊細胞（８ＸｌＯ細胞／ウェル）を
入れ方おいたマイクロプレートにｌウェルあたり１００
μｌすつ播種しクローニングを行なったっ培饗５日目よ
り３日毎に半量ずつ新鮮なＭＰＣと交換した。３週間後
に培養上清に含まれる坑外毒素抗体価を測定した。培養
３週間後には９６ウエル中６８ウエルで形質転換細胞の
増殖が総められた。そのうち坑外毒素抗体価の高いウェ
ルが８つ、比較的高いウェルが６つ得られた。同様に抗
体価の高いウェルの細胞を用い、更に繰り返し安定して
坑外毒素抗体を産生ずる細胞株ＦＫ−５Ａ５を樹立した
。

実施例２ ＥＢウィルス形質転換によるヒトモノクローナル抗体産
生株の樹立（２） 実施例Ｉのごと（ＥＢウィルス液の調製、ＥＬＩＳＡを
用いたアッセイ、ヒト末梢血リンパ球の調製を行なった
。又、ＥＢウィルストランスフォーメーションによる抗
緑膿菌外毒素抗体産生株の樹立も基本的には実施例１と
同じ方法で行なった。すなわちヒト扁１末哨血リンパ球
９．０Ｘ１０　　ケの細胞とウィルス価１０ＴＤ５０／
−のウィルス液５−とを混合させることによって感染さ
せ、マイクロプレートにｌウェルあたり１．８ＸＬＯケ
の細胞を播種し、実施例１のごとく培養した。培養１２
日後に１００％のウェルで細胞の増殖が認められ１／４
８０の割合で抗緑膿菌外毒素抗体価の高いウェルが得ら
れた。得られた細胞株ＦＫ−００１は抗体価を低下する
ことなく安定的に抗緑ａｂ外毒素抗体を産生じた。産生
された抗体のクラスはＵＬＭであったっ実施例３ ヒト・マウス細胞融合によるヒト抗緑膿菌外毒素モノク
ローナル抗体産生株の樹立（１）ラジオイムノアッセイ
（ＲＩＡ）法による抗緑膿菌外毒素抗体価の測定法 ９６ウエルマイクロプレート（Ｆａｌｃｏｎ　　＋８９
１２）を洗滌し、ｌウェルあたり２００μｌの８−ＢＳ
Ａを含むＰＢＳを添加後３７℃、８０分間インキュベー
トした７次に３−ＢＳＡを含むＰＢＳを除去し３７℃、
１０分間乾燥後ＰＢＳにて３回洗滌した。洗滌後１％Ｂ
ＡＡを含むＰＢＳにて希釈した培養上清又は腹水５０μ
ｌと１％ＢＡＡを含むＰＢＳにて希釈した　ｌ標識緑膿
菌外毒素（約２０゜ＯＱＯｃｌ）ｍ）５０μ／を各ウニ
ＪＬ／に添加し８７℃２時間インキュベート後、４℃に
て一夜静置した。翌日さらにＰＢＳにて希釈したウサギ
抗ヒトＩｙ−Ｍ（Ｇ）抗血清（ＭＩＬＥ８−ＹＥＤＡΦ
６５−０６６抗ＩＰＧ　、　＄６５−０６７抗ＩＰＭ）
５０μｌを各ウェルに添加し３７℃１時間攪拌後、さら
に１　ｍｙ／−のゼラチン、０．０２１のＮ　ａ　Ｎ　
３を含むＰＢＳに懸濁１ｊ：Ｐｒｏｔｅ＋ｎ　　Ａ−８
ｅｐｈａｒｏｓｅ　　（Ｐｈａｒｒｎａｃｉａ　　）　
　　２　Ｑμｆを各ウェルに添加し４℃１時間で攪拌し
た。ｆｉ拌後、マイクロプレートを１，５００×１にて
１０分間遠心した。遠心後、上清の半１を除去し代わり
に５　ｍＭＥ　Ｄ　Ｔ　Ａ、　　Ｉ　Ｗ／−セラチン、
０．０２　％　ＮｒｓＮ３．１５ＱｍＭＮａＣｌを含む
トリス塩酸バッファー（５０ｍＭ。

ｐＨ７，５、以下洗滌バッファーと略１）を各ウェルに
添加した１、Ｐ＋び遠心後、上清の半量を洗滌バッファ
ーにて交換した。この操作を３〜５回繰り返した後、各
ウェルを分離してｒ−カウンターにより放射能量を計測
した。

（２）抗原感作されたヒト末梢血リンパ球の調製 実施例１−（３）および！　−（４）において述べた要
領にてヒトの末梢血まりリンパ球Ｂ細胞を調製した。

（３）細胞融合 Ｍｏｐｃ−ｚｔセランに由来しＨＧ　Ｐ　ＲＴ（ヒボキ
サンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラー
セ）を欠如するマウスＢＡＬＢ７Ｃミエローマ細胞、Ｐ
　３　ｘ　６　’ａ　−Ａｔ８１Ｊ　ｌ　（Ｍａｒｇｕ
ｉｌｉｅｓ　ｅｔ、　ａｌ、、　Ｃｏ１ｄ　８ｐｒｉｎ
ｇ［（ａｒｂａｒ　Ｓｙｍｐ、　Ｑｕａｎｔ、　Ｂｉｏ
ｌ、、　　４１　、７８１（１９７６））をＲＰＭＩ１
６４０培地（含１０チ牛脂児血清）又はＭＰＣで継代し
ておき、そのうち１０ケの細胞をＥａｇｌｅｓ　Ｍ　Ｅ
　Ｍにて８回洗滌した。一方、実施例１−　（４）に記
載すｔ’Ｌ　ｆ：　モノホリ分離液に代えて、リンホブ
レ７ブ（Ｎｙｅｇａａｒｄ　）にて分離したヒト末梢血
リンパ球１〜５’ＩＯケの細胞をＥａｇ　１　ｅ　ｓＭ
ＥＭにて３回洗滌し１０７ケのミエローマ細胞を遠心管
（Ｃｏｒｎｉｎｇ　＋　２５８　ａ　Ｏ）内にて混合し
て４００Ｘｙ−で７分間遠心しペレットと（７た。この
ペレットに１−のＰＥＧ　＋６．０００　（４５％　Ｅ
ａｇｌｅｓ　　ＭＥＭ溶液、ＫＯＣＨ−ＬＩＧＥ（Ｔ）
を約３０秒かけて遠心管を回転しつつ添加し室温にて３
分間静置した。

次ニＥａｇｌｅｓ　Ｍ　Ｅ　Ｍを１分間に２−の割合で
遠心管を回転しつつ添加しこれを７回繰り返シタ、、最
後Ｈｃ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　　Ｍ　Ｅ　Ｍを約２０−加え
た後４００ｘＰにて７分間遠心した。遠心後ペレットを
１５％牛脂児血清、２ｍＭＬ−グルタミン、１ｍＭピル
ビン酸ナトリウムを含む１５０−のｌＬＰＭ１１６４０
培地又はＭＰＣに懸濁し１ウエルあたり６．７Ｘ１０’
ケのミエローマ細胞となるよう９６ウエルマイクロプレ
ート（Ｆａｌｃｏｎ　４＝　３０４０　）に分注したつ
同時にｔ’ｅｅｄｅｒ　１ａｙｅｒとして５ｘｌＯ／ｍ
（となるようマウスＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　７　Ｕ肺臓細胞を
各ウェルに添加した１、このマイクロプレートを５％Ｃ
Ｏ２，８７℃にて培饗し翌日より２〜３日ごとにＨＡＴ
選択培地にて半量を培地交換した。融合約２週間後、増
殖のみられたウェルの培養上清についてＥＬ　Ｉ　ＳＡ
（実施例１−　（２１）又はＲＩ　Ａ（実施例３−（１
））にＪり抗緑膿菌外毒素抗体産生の有無を調べた。そ
の結果の一部を表２に示す。その中から抗体価の比較的
高いウェル中の融合細胞（ハイブリドーマ）を拡大培養
すると同時に限界希釈法（ｌｉｍｉｔｉｎｇ　ｄｉｌｕ
ｔｉｏｎ　）によりクローン化した。約２週間後、クロ
ーンの培養上清について同様の方法により抗緑膿菌外毒
素抗体産生の有無を調べ最終的に４種のクローンを得た
。

表２　ハイブリドーマ培養上清の抗緑膿菌外毒素抗体価 （２）クローニング後 １ＬＩＡによるＩｌｌ定、詳しい方法は、実施例８−（
１）に記載っ （４）細胞の拡犬培饗、抗体の調！＆！および抗体価の
測定 得られたクローン化ハイブリドーマ及びクローン化前の
抗体産生性ウェル中のハイツリドーマをｉｎ　ｖｉｔｒ
ｏ　　で培養し、培養上清を得ると共に約１０ケのハイ
ブリドーマをブリスタン（２，６，１０，１４−テトラ
メチルペンタデカン）で前処理したヌードマウスの腹腔
内に注射することによってｉｎ　ｖｉｖｏで培養し、腹
水を採取し、ＲＩＡ（実施例３−　（１）　）にて抗体
価を調べた。その結果の一部を表３に示す。ハイブリド
ーマ３Ｆ６由来の腹水は対照（７）Ｅエローム細胞Ｐ３
Ｕ１由来の腹水よりも有意に高い抗体価を示した。

表３　ハイブリドーマ出来腹水の抗緑Ｐａ菌ＲＩＡによ
る測定。実施例８−（１）を参照。

（５）抗体の特異性 ハイブリドーマ由来腹水中の抗体が緑膿菌外毒素に対し
て特異的に反応することをＲＩＡ（実施例８−（１）　
）を利用した拮抗阻害実験に誹って確認した。実施例３
−（１）に述べられたごと＜、Ｂ８Ａをあらかじめ吸着
させた９６ウエルマイクロプレート（Ｆａｌｃｏｎ　＋
　８９１２）を洗滌後、ｌチＢＡＡを含むＰＢＳにて希
釈した腹水５０μ／、１％ＢＳＡを含むＰＢＳにて希釈
した一定量の　Ｉ標識緑膿菌外毒素（約２０，０００ｃ
ｐｍ）５０ｉｔｌおよび１ｓＢｓＡを含むＰＢＳにて希
釈した各々の濃度の無標識緑膿菌外毒素１０μｌを各ウ
ェルに添加し３７℃２時間インキュベート、その後４℃
にて一夜静置した。その後実施例３−（１）に述べられ
たごとくウサギ抗ヒトＩ５１Ｍ（Ｇ）抗血清、Ｐｒｏｔ
ｅｉｎ　Ａ　−８ｅｐｈａｒｏｓｅを順次添加、インキ
ュベート、遠心分離、洗滌後、抗原抗体結合物の放射能
量を計測した。ハイフリドーマ３Ｆ６由来の腹水中杭体
の例を表４に示す。無標識抗原の同時添加により拮抗阻
害がみられ、本抗体が緑膿菌外毒素と特異的に反応する
ことが示された。

表４ハイブリドーマ８Ｆ６由来腹水の抗体の特異性 バックグランド値は６５０〜７５０　ｃｐｍ０実施例４ ヒト・ヒト細胞融合に誹るヒト仇緑膿菌外毒素モノクロ
ーナル抗体産生株の機宜 ＰＧＩＣ８３０ライン由来ｔｉＧｔ″ＲＴ（ヒボキサン
チン・クアニン・ホスホリホシルトランスファーセ）を
欠如するヒトリンノ＜芽球様細胞Ｎ　ＯＱ　４５７　、
３　（Ｃｈ＋ｏｒａｚｚ＋　ｅｔ。

ａｌ、、　Ｊ、　Ｅｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１５６．９３
０　（１９８２））をＲＰＭ１１６４０培地（含ＩＯ％
牛脂児血１、−ｒｘ　＋Ｍｔ　ｊ４’　＋−〜、、　エ
／Ｔ’％あわ１．７と、岬胞を実施例３に述べたハイブ
リドーマ作製と同じ方法にて１〜５×１０　ケのヒト末
梢血リンパ球と融合させた。融合約２週間後増殖のみら
れたウェルの培養を清についてＥＬＩＳＡ（実施例１−
（２））又は几ＩＡ（実施例３−（１１）により抗緑膿
菌外毒素抗体産生の有無を調べ抗体産生性ウェル中のハ
イブリドーマにライて限界希釈法（Ｊｉｍｊｔｉｎｇ　
ｄｉｌｕｔｉｏｎ　）によりりＯ−ン化した。約３週間
抜クローンの培養上清について同様の方法により抗緑膿
菌外毒素抗体産性の有無を調べ抗体産生性クローンを得
た。

実施例５ ＥＢウィルス形質転換細胞を用いた細胞融合 実施例１および２のごと＜ＥＢウィルスにて形質転換し
た抗体産生性ヒトリンパ芽球様細胞株１〜５Ｘ１０　　
ケの細胞を用いヒト・マウスハイブリドーマ作製（実施
例３）又はヒ１−・ヒトハイブリドーマ作製（実施例４
）と同じ方法にてマウスミエローマ細胞又はヒトリンパ
芽球様細胞を融合させた。但しハイブリドーマ培養液に
はｌμＭのウアバインを追加した。融合約２〜３週間後
、増殖のみられたウェルの培養上清についてＥＬＩ８Ａ
（実施例１−　（２）　）又はＲＩＡ（実施例８−　（
］）　）により抗緑膿菌外毒素抗体産生の有無を調べ、
［Ｅ産４４ウェル中のハイブリドーマについて限界希釈
法（ｌｉｍｉｔｉｎｇ　ｄｉｌｕｔｉｏｎ　）によりク
ローン化した。約２〜３週間抜クローンの培養上清につ
いて同様の方法により抗緑膿菌外毒素抗体産生の有無を
調べ抗体産生性クローンを得た。

実施例６ 試験管内免疫法による抗原感作リンパ球の調製および細
胞融合実験 ２５人のヒトの血液から調製されたヒト末梢血リンパ球
を混合しく各々２　Ｘ　１０’ケの細胞）、５０−のＲ
ＰＭＩ　１６４０倍抱含含ｌＯ饅牛脂児血清）を加えて
培養フラスコＴ−７５（ＣｏｒｎｉｎｇΦ２５１１０）
にて５　ｓ　ＣＯｚ、８７℃、３日間培養して得られた
培養上清を１５チ牛脂児血清、２ｍＭＬ−グルタミン、
１ｍＭピルヒン酸ナトリウムを含むＲＰＭＩ　１６４０
倍抱含等量ずつ混合し、さらに０．２５〜２．５μ？／
−のアメリカヤマゴボウレクチン（ＰＷＭ）、０．００
１１のＯｏｗａｎ　Ｉおよび１００　ｎ％／−の不活性
化緑膿菌外毒素を添加した培地に１０／−となるようヒ
ト末梢血リンパ球を加え１０−を培養フラスコＴ　−７
５（Ｃｏｒｎｉｎｇ　＋　２　ｓ　ｔ　ｔ　ｏ　）にて
５＊　ＣＯ２，３７℃４日闇培養した。培養後、遠心に
より試験管内免疫法により抗原感作されたヒト末梢血を
分離し、その１〜５ＸｌＯケの細胞を用いてヒト・マウ
スハイブリドーマ作製（実施例３）又はヒト・ヒトハイ
ブリドーマ作製（実施例４）と同じ方法にてマウスミエ
ローマ細胞、又はヒトリンパ芽球様細胞と融合させた。

融合約２〜３週間後、増殖のみられたウェルの培養上清
についてＥＬＩＳＡ（実施例１−　（２）　）又はＲＩ
Ａ（実施例８−　（１）　）により抗緑膿菌外毒素抗体
産生の有無を調べ、抗体産生性ウェル中のハイブリドー
マについて限界希釈２　（ｌｉｍｉｔｉｎｇ　ｄｉｌｕ
ｔｉｏｎ　）によりクローン化した。約２〜８週間後、
クローン化された細胞の培養上清について同様の方法に
より抗緑膿菌外毒素抗体産生の有無を調べ抗体産生性ク
ローンを得た。

実施例７ 特異抗体の精製 ＥＢウィルによりて形質転換され、抗緑膿菌外毒素抗体
産性株として樹立されたＰＫ−ｏｏｔ細胞を１Ｏ−ＦＯ
８含有几ＰＭ１１６４０培地にて培養した。その培養上
清８３０ｄ（蛋白質ｆｆ１７５０Ｆ）を５０％飽和硫安
にて沈殿させ、その後Ｑ、　２Ｍ　ＮａＣ７含有０．１
　Ｍトリス−塩酸緩衝液ｐｆｌ１８．０に対して透析し
た。透析液１ＯｆＲｔを８ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　−２Ｑ
　Ｏカラム（＠径２．５戊、長さ８５薗、容量４１７ｆ
１１ｔ）に負荷し、０．２　Ｍ　ＮａＣ１！含”Ｍ　Ｏ
，Ｉ　Ｍ　トリスー塩酸緩衝液ｐＥｉｓ、ｏにて溶出し
た。この゛ゲルｐ過にて蛋白として３つのピーク（ＩＰ
Ｍ。

ＩｙＧ、アルブミン画分）が得られ、抗緑膿菌外毒素抗
体活性は’ＩＰＭ画分のみに回収された。

蛋白の回収率は３％で、比活性は約８倍上昇した。

実施例８ ウェスタンプロット法による抗原特異性の解析 緑膿菌外毒素３．５μ？および、分子量測定マーカー用
蛋白１３．２μ？（フォスホリラーゼｂ゛１，５μ）、
Ｂ８Δ１．９μｍ、卵白アルブミン８．８μｍ、炭酸脱
水素酵素１．９μ？、大豆トリプシンインヒビター１．
８μｆ、ａ−ラクトアルブミン２．８μｍの混合物）を
８Ｄ８／ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、ゲルをト
ランスバｙ”）ｙ　　（２５’ｍＭ）リス＠１９２ｍＭ
グリシンｐＥＩｇ、３．２０％（Ｖ／Ｖ）メタ／−ル）
に４℃−夜浸漬した。次いでニトロセルロース膜（Ｂｉ
ｏｒａｄ　）　ヘ！気的（ａＯＶ、４．５ｈ）に、室温
にてトランスファーし、２ｓＢＳＡ含有０．９　Ｓ　Ｎ
ａＣ７加５０　ｍＭ　ト１３　ス、塩酸緩ｓ液ｐＥｆ３
．Ｑ（ＴＢ８と略）で室温、１時間インキュベートする
ことによりブロッキングした。吏ニＯ，ｌ　％　Ｂ　Ｓ
　Ａ、ｔｏｓｒｃｓ含有ＴＢＳで室温、１時間インキエ
ベートすることによりブロッキングされたニトロセルロ
ース膜を■＆ｌ血清（ＥＬ　Ｉ　８Ａ法にて抗緑膿菌外
毒素抗体活性のあるヒト血清）、ＩＪ）抗緑膿菌外毒素
抗体産生細胞株ＦＫ−００１培養上清、■ＦＫ−００１
培養上清まり精製されたＩｙＭ画分、■ＥＢウィルス形
質転換細胞株ＨＩ−００６培養上清、の各々の水溶液を
８７℃１時間、続いて４℃−夜インキユベートした。０
．０５　％　Ｔ％ｖｅｅｎ　２０含有Ｔ　Ｂ　Ｓ　（ｐ
Ｅ［８，０）でニトロセルロース膜を５回洗滌した後、
第２抗体（１％Ｂ８Ａ、　０．０５＊Ｔｗｅｅｎ　２０
含有ＰＢ８にてａ、ｏｏｏ倍希釈されたペルオキシダー
ゼ標識抗ヒトイムノグロブリン抗体）と３７℃１時間イ
ンキュベートした。同様に０、０５　優ＴＷｅｅｎ　２
０含有ＴＢＳ（ｐｔ１８．０）で５回洗滌後、発色試薬
（０，５Ｔｑ／−クロロナフトール、２０チメタノール
、ｏ、　ｏ　ａ　５Ｈ２０２を含むＴＢＳ、ｐＥ１７．
６）を添加し発色させた。その結果、緑膿菌外毒素を電
気泳動したレーンでは扁１血清（■）、ＦＫ−９０１培
養上清（（υ）およびその精製ＩＰＭ　（■）との反応
において、分子量６８〜７２に付近に発色したバンド１
本のみを認めた。ＦＫ−００６培養上清（■）との反応
においては、全く発色がみられなかった。又、分子量測
定用マーカー蛋白を電気泳動した場合は、いずれの抗体
とも反応せす、発色がみられなかった。このことはＦＫ
−００１抗体か特異的に緑膿菌外毒素と反応しているこ
とを示す。

実施例９ 抗体による緑膿菌外毒素中和活性 マウスＢＡＬＢ／Ｃａ’Ｉ’ａ細胞を２．０×１０　細
胞／艷の割合でｌＯチＦに８含有ＲＰＭＩ　１６４０培
地に懸濁し、９６ウエルマ・イクロプレート（住友ベー
クライトＭＳ−３０９６Ｆ）に１ウエルあたり１００μ
ｌずつ播稲して５％ｃｏ２．ａ７℃にて４８時間培養ｔ
た。その後、ＦＫ　−５Ａ　５、ＰＫ−００１−１ＥＩ
Ｉ−００６等のＥＢウィルス形質転換モノクローナル抗
体産生細胞株の培喫上清を１ウエルあたりｌＯＯμｌ加
えた。同一に緑膿菌外毒素（１０〜８００　ｎＰ／ｓｄ
）をｌウェルあたりｌＯμｌ添加した、５饅ω２．３７
℃にて２４時間培養後、　Ｈ−ロイシン（１０μＣｉ　
７１，１　）を含む培地へ全量交換し更に２時間培養し
た。細胞をＰＢＸ、次いで０．０２％ＥＤＴＡ含有ＰＢ
８で洗滌し、更に０．２５％トリプシン溶液で細胞をプ
レート表面よりはがし細胞を浮遊させた。細胞を５襲ト
リクｏａ酢酸（ＴＣＡ）で４℃インキエベート、洗滌す
る操作を３回繰り返すことにより、可溶性３Ｈ−ロイシ
ンを抽出除去した。ＴＯＡ不溶性画分に取り込まれた３
Ｈ量を液体シンチレーションカウンター（ベックマン）
で測定した。その結果を表５に示す５ＥＢウイルス形質
転換された抗緑膿菌外毒素抗体産生株のうちＦＫ−５Ａ
５の培養上清は、緑膿菌外毒素による細胞毒性を強く中
和した。又、ＦＫ−００１＠養上清も弱いながら中和活
性を示した。゛ 実施例１０ 抗体によるマウス実験的緑膿菌感染症の治療効果 緑膿菌Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ
　ＰＡ−ＩＱ３（外毒素Ａｆｉ生株）１０細胞を封入し
た、ミリボア製ディフユージコンテェンパー（ミリポア
フィルタ−〇、４５μｍポアサイス、外径１４励、内径
１０襲、厚さ２襲）を、ｌ０Ｉ（、−５ｌｃマウス（４
〜５週令、雄、１群５匹）の腹腔内に植え込んだ。チェ
ンバー内で増殖した細菌より定常的に外毒素Ａが分泌さ
れる。チェンバー内え込み直後に、ヒトモノクローナル
抗体産生株ＦＫ−００１の培養上清より精製されたＩｙ
Ｍ（ＦＫ−００１抗体精製品と略）、市販ヒトイムノク
ロプリン製剤又は、ＢＳＡをそれぞれ静脈内投与し、５
日後のマウスの生存率をもって治療効果を判定した。そ
の結果を表６に示す。ＦＫ−００１抗体精製品２μ？／
マウス投与群では金側が生存し、市販ヒトイムノグロブ
リン製剤１１１Ｐ／マウス投与群に匹敵する治療効果を
示した。

表６　マウス実験的緑膿菌感染症における治療効果 填１頁の続き ／／ＣＣ１２Ｐ　　２１１００ Ｃ１２Ｒ１：９１） 手続補正書（自発） 昭和５９年１０月３１日

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）緑膿菌外毒素に対する、ヒト体外で産生されたヒ
   トモノクローナル抗体。
2. （２）緑膿菌外毒素に対する、ヒトモノクローナル抗体
   を少なくとも一種類含む免疫グロブリン製剤。
3. （３）緑膿菌外毒素に対する、ヒトモノクローナル抗体
   を少なくとも一種類含む細菌感染症治療剤。
4. （４）緑膿菌外毒素に対する、ヒトモノクローナル抗体
   を少なくとも一種類含む外毒素産生性緑膿菌感染症診断
   用の試薬。
5. （５）緑膿菌外毒素に対する抗体産生能を持つヒトリン
   パ球Ｂ細胞に、ＥＢウィルスを感染させることにより継
   代培養可能な増殖型細胞に形質転換させ、この形質転換
   細胞を増殖させて抗体を取得することを特徴とする緑膿
   菌外毒素に対するヒトモノクローナル抗体を製造する方
   法。
6. （６）緑膿菌外毒素に対する抗体産生能をもつヒトリン
   パ球Ｂ細胞とミエローマ細胞とを細胞融合させることに
   より両細胞間のハイブリドーマを形成させ、このハイブ
   リドーマを増殖させることによって抗体を取得すること
   を特徴とする緑膿菌外毒素に対するヒトモノクロナール
   抗体を製造する方法。
7. （７）緑膿菌外毒素に対する抗体産生能を持つヒトリン
   パ球Ｂ細胞にＥＢウィルスを感染させることにより、緑
   膿菌外毒素に対する抗体を産生し、かつ継代培養可能な
   増殖型細胞に形質転換された細胞とミエローマ細胞とを
   細胞融合させることにより両細胞間のハイブリドーマを
   形成させ、このハイブリドーマを増殖させることによっ
   て抗体を取得することを特徴とする緑膿菌外毒素に対す
   るヒトモノクローナル抗体を製造する方法。