JPS61218523A - 腫瘍細胞増殖抑制剤および殺腫瘍細胞因子の製造法 - Google Patents
腫瘍細胞増殖抑制剤および殺腫瘍細胞因子の製造法Info
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- JPS61218523A JPS61218523A JP60058789A JP5878985A JPS61218523A JP S61218523 A JPS61218523 A JP S61218523A JP 60058789 A JP60058789 A JP 60058789A JP 5878985 A JP5878985 A JP 5878985A JP S61218523 A JPS61218523 A JP S61218523A
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- Japan
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- chromatography
- aqueous solution
- cells
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- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/19—Platelets; Megacaryocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
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- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明はヒト及び動物の血小板に特異的に存在する腫瘍
細胞増殖抑制及び殺細胞因子を嘉純度に濃縮゛された状
態で取得する新規成分の製造法に関する。
細胞増殖抑制及び殺細胞因子を嘉純度に濃縮゛された状
態で取得する新規成分の製造法に関する。
現在腫瘍の完全な薬剤治療法はなく、これま°で世界各
国の多数の研究者により多くの腫瘍治療剤が開発されて
来たにもかかわらず、依然として臨床においては外科的
及び放射線治療法に薬剤を併用することが主流となって
いる。腫瘍の治療剤は癌化学療法剤と癌免疫療法に大別
されている。
国の多数の研究者により多くの腫瘍治療剤が開発されて
来たにもかかわらず、依然として臨床においては外科的
及び放射線治療法に薬剤を併用することが主流となって
いる。腫瘍の治療剤は癌化学療法剤と癌免疫療法に大別
されている。
一方、最近に至り血小板中の生理活性物質について数々
の研究が発表されている。その代表的のものを挙げると
次のとおりである。
の研究が発表されている。その代表的のものを挙げると
次のとおりである。
ワステソンらは血小板からＭＷ ２８．０００〜３４
、 ＯＯ０１ＰＩ９．０〜１１．０のＰＤＧＦ （Ｐｌ
ａｔｅｌｅｔ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａ
ｃｔｏｒ ）を分離し平滑筋細胞、繊維芽細胞などの細
胞増殖促進作用のあることを報告している（ Ｗａｓｔ
ｅｓｏｎ 、 Ａ、 ｅむａｊｌ！ ： Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ。
、 ＯＯ０１ＰＩ９．０〜１１．０のＰＤＧＦ （Ｐｌ
ａｔｅｌｅｔ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａ
ｃｔｏｒ ）を分離し平滑筋細胞、繊維芽細胞などの細
胞増殖促進作用のあることを報告している（ Ｗａｓｔ
ｅｓｏｎ 、 Ａ、 ｅむａｊｌ！ ： Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ。
Ｊ、 １９３．９０７（１９８１） 、 Ｋｅｎｎｅｄ
ａｙ 、 Ｂ、 Ｂ ｅＬａｌ ： Ｊ、Ｂ、Ｃ，２５
６，８８９６（１９８１））。ラングらは血小板からＰ
ＢＰ （Ｐｌａｔｅｊｉ’ｅｔ Ｂａ５ｉｃＰｒｏｔ
ｅｉｎ ）と称するものを得てＭＷＩＩ、０００〜１５
．００Ｑ ＰＩ ９．０〜１１．０ 、５ｗ１ｓｓ
８Ｔ８細胞などの細胞増殖促進作用を示す、と云う（
Ｌａｎｇｅ。
ａｙ 、 Ｂ、 Ｂ ｅＬａｌ ： Ｊ、Ｂ、Ｃ，２５
６，８８９６（１９８１））。ラングらは血小板からＰ
ＢＰ （Ｐｌａｔｅｊｉ’ｅｔ Ｂａ５ｉｃＰｒｏｔ
ｅｉｎ ）と称するものを得てＭＷＩＩ、０００〜１５
．００Ｑ ＰＩ ９．０〜１１．０ 、５ｗ１ｓｓ
８Ｔ８細胞などの細胞増殖促進作用を示す、と云う（
Ｌａｎｇｅ。
Ｅ、 ｅｔ ａｊｌ’ ： Ｐｒｏｃ、 ＮａＬｌ、
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ、 ７７ 。
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ、 ７７ 。
５９１４ （１９８０））。そのほか血小板からキャス
ターらはＣＴＡＰ −ＩＩＩ （Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ
Ｔｉ５ｓｕｅ −ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｐｅｐｔｉ
ｄｅ）を（Ｃａ５ｊｅｐ、 Ｃ，Ｗ、 ｅｔ ａｌ ：
Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ
、８０ ．７６５（１９８８）、ｌ ＢｒｏｗｎらはＰＤＥＣＭ（Ｐｌａ隋ｔ−Ｄｅｒｉｖｅ
ｄ Ｅｎｄｏｔｈ−ｅｌｌｉａｌｌ Ｃｅ１ｌｌｌ Ｍ
ｉｔｏｇｅｎ）を（Ｂｒｏｗｎ、 Ｔ、 ｅＬ ａＡ
＝Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８
０ １６４１（１９８Ｂ））、またスポーンらはＴＧＦ
−β（ＴｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇＧｒｏｗｔｈ Ｆａｃ
ｔｏｒ β−ｔｙｐｅ ）を得て（５ｐｏｒｎ 、 Ｍ
、 Ｂ＋ｅｔ ａｊ’ ： Ｊ、Ｂ、Ｃ，２５８、７１
５５（１９８８） ）、これらは何れも各種細胞の増殖
促進効果あるいはこれに類した活性のあることを見出し
ている。しかしながら、血小板抽出物中にヒトや動物の
腫瘍細胞の増殖を抑制しまたは殺す成分の存在すること
は未だ報告されていない。
ターらはＣＴＡＰ −ＩＩＩ （Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ
Ｔｉ５ｓｕｅ −ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｐｅｐｔｉ
ｄｅ）を（Ｃａ５ｊｅｐ、 Ｃ，Ｗ、 ｅｔ ａｌ ：
Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ
、８０ ．７６５（１９８８）、ｌ ＢｒｏｗｎらはＰＤＥＣＭ（Ｐｌａ隋ｔ−Ｄｅｒｉｖｅ
ｄ Ｅｎｄｏｔｈ−ｅｌｌｉａｌｌ Ｃｅ１ｌｌｌ Ｍ
ｉｔｏｇｅｎ）を（Ｂｒｏｗｎ、 Ｔ、 ｅＬ ａＡ
＝Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８
０ １６４１（１９８Ｂ））、またスポーンらはＴＧＦ
−β（ＴｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇＧｒｏｗｔｈ Ｆａｃ
ｔｏｒ β−ｔｙｐｅ ）を得て（５ｐｏｒｎ 、 Ｍ
、 Ｂ＋ｅｔ ａｊ’ ： Ｊ、Ｂ、Ｃ，２５８、７１
５５（１９８８） ）、これらは何れも各種細胞の増殖
促進効果あるいはこれに類した活性のあることを見出し
ている。しかしながら、血小板抽出物中にヒトや動物の
腫瘍細胞の増殖を抑制しまたは殺す成分の存在すること
は未だ報告されていない。
前記のように、現在用いられている癌化学療法剤はいわ
ゆる細胞毒であり細胞の増殖を非特異的に抑制すること
により作用を発現するため、腫瘍細胞ばかりでなく正常
細胞にも作用して白血球減少症、不姐、脱毛、催奇形、
発癌など極めて重篤な副作用を示すことにより、その使
用量には厳密な制限が設けられている。また癌免疫療法
剤は直接に腫瘍細胞を抑制するのではなく、生体防御機
能に働きかけて間接的に腫瘍の増殖を抑制することによ
り治療効果を発現するので癌化学療法剤に比較して重篤
な副作用は少ないが、腫瘍患者においては生体防御機能
が充分残っていない場合も多く、その治療効果は癌化学
療法剤に比して必らずしも充分でない。
ゆる細胞毒であり細胞の増殖を非特異的に抑制すること
により作用を発現するため、腫瘍細胞ばかりでなく正常
細胞にも作用して白血球減少症、不姐、脱毛、催奇形、
発癌など極めて重篤な副作用を示すことにより、その使
用量には厳密な制限が設けられている。また癌免疫療法
剤は直接に腫瘍細胞を抑制するのではなく、生体防御機
能に働きかけて間接的に腫瘍の増殖を抑制することによ
り治療効果を発現するので癌化学療法剤に比較して重篤
な副作用は少ないが、腫瘍患者においては生体防御機能
が充分残っていない場合も多く、その治療効果は癌化学
療法剤に比して必らずしも充分でない。
以上が腫瘍治療剤の現状であるので、副作用が少なく、
且つ腫瘍細胞に対して選択的に作用する腫瘍治療剤の開
発が期待されている。
且つ腫瘍細胞に対して選択的に作用する腫瘍治療剤の開
発が期待されている。
本発明者等は広範囲に血液由来物質の各種動物細胞に及
ぼす影響を調査した結果、血小板抽出物中にヒト及び動
物の腫瘍細胞に特異的且つ直接に作用し、増殖抑制作用
または殺細胞効果を示すが、正常細胞に対し何らの変化
も与えない活性成分の存在することを発見した。さらに
血小板由来の本活性成分について鋭意研究した結果、新
規なヒト及び動物腫瘍細胞の増殖抑制及び殺細胞因子（
以下ＪＲ−８４０８と称する。）の製造法の確立に成功
した。すなわち、各種動物及びヒト由来の血小板を凍結
、融解をくり返して細胞及び顆粒を破壊し、酸性の水で
抽出したものを材料とし、酸性の条件下でゲルｐ過法で
精製を行なったが純化効率は数倍で１０倍に満たず満足
する結果を得るに致らなかった。そこで末法で得た分画
を透析後陽イオン交換体に流し中性塩による傾斜溶出を
試みたところ、純化効率１００倍以上と云う成績を得た
。つぎにシリカゲルにアルキル基を結合させたシンクロ
パック（５ｙｎｃｈｒｏｐａｋ ） ＲＰ −Ｐ （米
国、Ｓｙｎ ｃｈｒｏｍ社製）及びポリスチレン系ハイ
ポーラスポリマーであるＭＣＩ ＧＥＬ Ｃ）ＩＰ
２０Ｐ（三菱化成工業社製）を担体として前記陽イオ
ン交換で分離した活性成分を逆相クロマトグラフに付し
たところ純化効率は１２００倍以上に上昇した。さらに
本活性成分についてＭｏｎｏ Ｐ、プレパックＩ（Ｒ
５／２０カラム（ファルマシア社製）クロマトフォーカ
ッラングを実施した結果、純イｉ効率２０００倍以上と
云う驚ろくべき結果を得て本発明は完成するに至った（
第１表参照）。
ぼす影響を調査した結果、血小板抽出物中にヒト及び動
物の腫瘍細胞に特異的且つ直接に作用し、増殖抑制作用
または殺細胞効果を示すが、正常細胞に対し何らの変化
も与えない活性成分の存在することを発見した。さらに
血小板由来の本活性成分について鋭意研究した結果、新
規なヒト及び動物腫瘍細胞の増殖抑制及び殺細胞因子（
以下ＪＲ−８４０８と称する。）の製造法の確立に成功
した。すなわち、各種動物及びヒト由来の血小板を凍結
、融解をくり返して細胞及び顆粒を破壊し、酸性の水で
抽出したものを材料とし、酸性の条件下でゲルｐ過法で
精製を行なったが純化効率は数倍で１０倍に満たず満足
する結果を得るに致らなかった。そこで末法で得た分画
を透析後陽イオン交換体に流し中性塩による傾斜溶出を
試みたところ、純化効率１００倍以上と云う成績を得た
。つぎにシリカゲルにアルキル基を結合させたシンクロ
パック（５ｙｎｃｈｒｏｐａｋ ） ＲＰ −Ｐ （米
国、Ｓｙｎ ｃｈｒｏｍ社製）及びポリスチレン系ハイ
ポーラスポリマーであるＭＣＩ ＧＥＬ Ｃ）ＩＰ
２０Ｐ（三菱化成工業社製）を担体として前記陽イオ
ン交換で分離した活性成分を逆相クロマトグラフに付し
たところ純化効率は１２００倍以上に上昇した。さらに
本活性成分についてＭｏｎｏ Ｐ、プレパックＩ（Ｒ
５／２０カラム（ファルマシア社製）クロマトフォーカ
ッラングを実施した結果、純イｉ効率２０００倍以上と
云う驚ろくべき結果を得て本発明は完成するに至った（
第１表参照）。
本発明は、血小板を破壊したのち酸性の水溶液もしくは
水−有機溶媒混合溶媒溶液で抽出し、所望によりゲルク
ロマトグラフィーにより推定分子量１０．０００ないし
２０，０００の腫瘍細胞増殖抑制作用を有する分画を採
取し、次いで、クロマトグラフィーにより分子量ｔｏ、
ｏｏｏ〜２０．０００、等電点９． Ｏ〜１０．０、ニ
ンヒドリン反応陽性、トリプシンで失活するが生理食塩
水中６０°Ｃ８０分間の加熱および０．２Ｎ塩噴と６０
分または７０％ギ酸と８０分間室温下の接触により失活
しない腫瘍細胞増殖抑制作用を有する分画を採取するこ
とを特徴とする腫瘍細胞増殖抑制および殺腫瘍細胞因子
の製造法である。
水−有機溶媒混合溶媒溶液で抽出し、所望によりゲルク
ロマトグラフィーにより推定分子量１０．０００ないし
２０，０００の腫瘍細胞増殖抑制作用を有する分画を採
取し、次いで、クロマトグラフィーにより分子量ｔｏ、
ｏｏｏ〜２０．０００、等電点９． Ｏ〜１０．０、ニ
ンヒドリン反応陽性、トリプシンで失活するが生理食塩
水中６０°Ｃ８０分間の加熱および０．２Ｎ塩噴と６０
分または７０％ギ酸と８０分間室温下の接触により失活
しない腫瘍細胞増殖抑制作用を有する分画を採取するこ
とを特徴とする腫瘍細胞増殖抑制および殺腫瘍細胞因子
の製造法である。
本発明の実施例においてはヒト血小板を主原料として用
いたが、ヒト以外の動物、たとえばげつ歯頚、猫、犬、
牛などの温血動物の血小板中にも同様の活性成分を見出
すことができ、同様に用いうる。また、実施例における
指標細胞にはヒト、ラット、マウスなどを含んでおり、
それらに対する作用から見て、ＪＲ−８４０８は種特異
性の少ない腫瘍細胞増殖抑制及び殺細胞因子と考えられ
る。
いたが、ヒト以外の動物、たとえばげつ歯頚、猫、犬、
牛などの温血動物の血小板中にも同様の活性成分を見出
すことができ、同様に用いうる。また、実施例における
指標細胞にはヒト、ラット、マウスなどを含んでおり、
それらに対する作用から見て、ＪＲ−８４０８は種特異
性の少ない腫瘍細胞増殖抑制及び殺細胞因子と考えられ
る。
発明者らが得たＪＲ−８４０８は従来血小板から抽出さ
れた諸物質と物性及び生理活性において異なり新規な生
理活性物質と考えられる。
れた諸物質と物性及び生理活性において異なり新規な生
理活性物質と考えられる。
ＪＲ−８４０８を得るには、たとえば凍結、融解により
、またはホモジナイザーにより細胞破壊した血小板を無
機または有機酸の水溶液または水−有機溶媒混合溶媒溶
液で抽出操作を行なう。その好ましい例としてはＩＭ−
酢酸、ＩＭ−酢酸含有５０％エタノールまたは０． Ｉ
Ｎ−塩酸含有７５％エタノールなどが挙げられる。Ｊ
Ｒ−８４０８は比較的強い酸性の水溶液または水性もし
くは含水有機溶媒により失活することなく抽出すること
ができ、かくして夾雑たん白質などを除去することがで
きる。抽出液からは遠心分離及び数、ｚｍ程度の細孔を
有するフィルター濾過と組み合わせることにより澄明な
抽出液を得ることができる。抽出液がアルコールなどの
有機溶媒を含む場合は、たとえば、約５倍容量のエーテ
ル、エタノール等量混合液を加えると目的物は沈澱する
のでこれを１取し酸性水溶液とする。また所望により抽
出液をゲル濾過して活性成分を分画して集めてもよい。
、またはホモジナイザーにより細胞破壊した血小板を無
機または有機酸の水溶液または水−有機溶媒混合溶媒溶
液で抽出操作を行なう。その好ましい例としてはＩＭ−
酢酸、ＩＭ−酢酸含有５０％エタノールまたは０． Ｉ
Ｎ−塩酸含有７５％エタノールなどが挙げられる。Ｊ
Ｒ−８４０８は比較的強い酸性の水溶液または水性もし
くは含水有機溶媒により失活することなく抽出すること
ができ、かくして夾雑たん白質などを除去することがで
きる。抽出液からは遠心分離及び数、ｚｍ程度の細孔を
有するフィルター濾過と組み合わせることにより澄明な
抽出液を得ることができる。抽出液がアルコールなどの
有機溶媒を含む場合は、たとえば、約５倍容量のエーテ
ル、エタノール等量混合液を加えると目的物は沈澱する
のでこれを１取し酸性水溶液とする。また所望により抽
出液をゲル濾過して活性成分を分画して集めてもよい。
ゲル濾過の担体としてはバイオゲル（Ｂｉｏｇｅｌ）
Ｐ −６０、Ｐ−１００（米国、バイオラド社製）、セ
ファデックス（５ｅｐｈａｄｅｘ ） Ｇ −７５（フ
ァルマシアジャパン社製）などを用いることができる。
Ｐ −６０、Ｐ−１００（米国、バイオラド社製）、セ
ファデックス（５ｅｐｈａｄｅｘ ） Ｇ −７５（フ
ァルマシアジャパン社製）などを用いることができる。
ＪＲ−８４０１の活性は後記する試験法によって識別す
ることができる。水晶の推定分子量は１０．０００〜２
０．０００である。本発明においては上記抽出液または
これをゲル濾過して集めた活性分画をクロマトグラフィ
ー、たとえばイオン交換クロマトグラフィー、逆相クロ
マトグラフィー、クロマトフオーカシングの少なくとも
−っ°の操作に付してＪＲ−８４０８の活性成分を採取
する。
ることができる。水晶の推定分子量は１０．０００〜２
０．０００である。本発明においては上記抽出液または
これをゲル濾過して集めた活性分画をクロマトグラフィ
ー、たとえばイオン交換クロマトグラフィー、逆相クロ
マトグラフィー、クロマトフオーカシングの少なくとも
−っ°の操作に付してＪＲ−８４０８の活性成分を採取
する。
イオン交換クロマトグラフィーは陽イオン交換体を用い
て竹われる。陽イオン交換体としては天然または合成高
分子を基材とするものが何れも用いられ、その例として
は、ＣＭ−セファデックスＣ−２５、ＳＰ−セファデッ
クス＝ Ｍｏｎｏ Ｓ（ファルマシア、ジャパン社製）
・バイオ、レックス−７０（米１国、バイオラド社製）
などが挙げられる。上記のゲル濾過を経、または経ない
酸性抽出液は、ｐＨ補正後陽イオン交換体のカラムに加
えられる。その際Ｊ Ｒ−８４０８活性は交換体に吸着
される。ついで吸着物を濃度を逐次上昇勾配させた中性
塩の水溶液を用いて傾斜溶出する。中性塩は水溶性で細
胞毒性を有しないものであればいずれも用い得るが、塩
化ナトリウムが最も好んで用いられる。
て竹われる。陽イオン交換体としては天然または合成高
分子を基材とするものが何れも用いられ、その例として
は、ＣＭ−セファデックスＣ−２５、ＳＰ−セファデッ
クス＝ Ｍｏｎｏ Ｓ（ファルマシア、ジャパン社製）
・バイオ、レックス−７０（米１国、バイオラド社製）
などが挙げられる。上記のゲル濾過を経、または経ない
酸性抽出液は、ｐＨ補正後陽イオン交換体のカラムに加
えられる。その際Ｊ Ｒ−８４０８活性は交換体に吸着
される。ついで吸着物を濃度を逐次上昇勾配させた中性
塩の水溶液を用いて傾斜溶出する。中性塩は水溶性で細
胞毒性を有しないものであればいずれも用い得るが、塩
化ナトリウムが最も好んで用いられる。
逆相クロマトグラフィは疎水性基を有する担体を用いで
行われる。その担体の例としてはシンクロパック（５ｙ
ｎｃｈｒｏｐａｋ） ＲＰ −Ｐシリーズ（米国、Ｓｙ
ｎ ｃｈｒｏｍ社製）のような炭素鎖で修飾されたシに
／− リカゲル、ＭＣＩ＝ ＧＥＬ ＣＨＰ−２０Ｐシリー
ズ（三菱化成工業社製）、アンバーライト（Ａｍｂｅｒ
ｌｉｔｅ ） Ｘ Ａ Ｄシリーズ（米国、ｏ−ｂ７ン
ドハース社製）、のようなポリスチレン系ハイポーラス
吸着樹脂などが挙げられる。これらのうち特に好ましい
ものはシンクロパックＲＰ −Ｐ（Ｃ１８）、ＭＣｌ−
ＣＨＰ２０Ｐ、アンバーライトＸＡＤ−７などである。
行われる。その担体の例としてはシンクロパック（５ｙ
ｎｃｈｒｏｐａｋ） ＲＰ −Ｐシリーズ（米国、Ｓｙ
ｎ ｃｈｒｏｍ社製）のような炭素鎖で修飾されたシに
／− リカゲル、ＭＣＩ＝ ＧＥＬ ＣＨＰ−２０Ｐシリー
ズ（三菱化成工業社製）、アンバーライト（Ａｍｂｅｒ
ｌｉｔｅ ） Ｘ Ａ Ｄシリーズ（米国、ｏ−ｂ７ン
ドハース社製）、のようなポリスチレン系ハイポーラス
吸着樹脂などが挙げられる。これらのうち特に好ましい
ものはシンクロパックＲＰ −Ｐ（Ｃ１８）、ＭＣｌ−
ＣＨＰ２０Ｐ、アンバーライトＸＡＤ−７などである。
前記のゲル濾過を経または経ない酸性抽出液は担体の入
ったカラムに加えられ、ＪＲ−８４０８は担体に吸着さ
れる。ついで吸着物は濃度を逐次上昇勾配させた親水製
有機溶媒の水溶液を用いて傾斜溶出される。親水性有機
溶媒の例としては、エタノール、プロピルアルコールの
ような低級脂肪族アルコール、アセトンのような低級脂
肪族ケトン、アセトニトリルのような低級脂肪族ニトリ
ルが挙げられ、好ましい例はアセトニトリル、メタノー
ル、イソプロピルアルコールである。クロマトフォーカ
ッラングはＭｏｎ。
ったカラムに加えられ、ＪＲ−８４０８は担体に吸着さ
れる。ついで吸着物は濃度を逐次上昇勾配させた親水製
有機溶媒の水溶液を用いて傾斜溶出される。親水性有機
溶媒の例としては、エタノール、プロピルアルコールの
ような低級脂肪族アルコール、アセトンのような低級脂
肪族ケトン、アセトニトリルのような低級脂肪族ニトリ
ルが挙げられ、好ましい例はアセトニトリル、メタノー
ル、イソプロピルアルコールである。クロマトフォーカ
ッラングはＭｏｎ。
Ｐカラムを用いてＦＰＬＣシステム（ファルマシア、ジ
ャパン社製）を用いて行われる。
ャパン社製）を用いて行われる。
クロマトフォーカノラングの例としではファルマライト
（Ｆｈａｒｍａｊｌ’ｙｔｅ ） ８−１０．５を含む
ポリバッフｙ −（Ｐｏｎｙ−ｂｕｆｆｅｒ ）−９６
（何れもファルマシア ジャパン社製）により逐次ｐＨ
傾斜系がＭｏｎｏ Ｐカラム内に作成され順次等電点に
従がい溶出される。イオン交換、逆相クロマトグラフィ
ーまたはクロマトフォーカッラング等のクロマトグラフ
ィーにより得られる溶出液の画分は後記する試験法によ
りＪＲ−８４０８活性が試験され有効画分が採取される
。イオン交換、逆相クロマトグラフィーまたはクロマト
フォーカッラングによるＪＲ−８４０８の精製操作は何
れを用いてもよく、また望ましくは、これらの操作を２
つ以上組合わせて行なってもよい。
（Ｆｈａｒｍａｊｌ’ｙｔｅ ） ８−１０．５を含む
ポリバッフｙ −（Ｐｏｎｙ−ｂｕｆｆｅｒ ）−９６
（何れもファルマシア ジャパン社製）により逐次ｐＨ
傾斜系がＭｏｎｏ Ｐカラム内に作成され順次等電点に
従がい溶出される。イオン交換、逆相クロマトグラフィ
ーまたはクロマトフォーカッラング等のクロマトグラフ
ィーにより得られる溶出液の画分は後記する試験法によ
りＪＲ−８４０８活性が試験され有効画分が採取される
。イオン交換、逆相クロマトグラフィーまたはクロマト
フォーカッラングによるＪＲ−８４０８の精製操作は何
れを用いてもよく、また望ましくは、これらの操作を２
つ以上組合わせて行なってもよい。
かくして得られるＪＲ−８４０８は白色の粉末で、ニン
ヒドリン反応陽性、分子量１０，０００〜２０．０００
（ゲル濾過法）、５ＤＳ−電気泳動において単一で
ある。また酸及び熱に対して可なり安定であり、トリプ
シン及びペプシン処理により失活する。
ヒドリン反応陽性、分子量１０，０００〜２０．０００
（ゲル濾過法）、５ＤＳ−電気泳動において単一で
ある。また酸及び熱に対して可なり安定であり、トリプ
シン及びペプシン処理により失活する。
本発明により高度に精製されたＪＲ−８４０３は腫瘍患
者に対する薬物療法における画期的薬剤と成り得る可能
性をもち、また正常細胞の変性を防止する生体防御機能
を高める可能性も期待できる。
者に対する薬物療法における画期的薬剤と成り得る可能
性をもち、また正常細胞の変性を防止する生体防御機能
を高める可能性も期待できる。
つぎに本発明を実施例により詳しく説明するが、本発明
はこれにより限定されるものではない。
はこれにより限定されるものではない。
実施例１
ヒト新鮮血１８１由来の血小板について凍結、融解を２
回くり返しＩＭ−酢酸水溶液２００ ｍｌを添加後１時
間撹拌し、つぎにｔｏ 、ｏｏｏ ｘ ｙ にて４５
分間遠心分離して不溶物を除き凍結乾燥した（１．５８
Ｆ）。この乾燥粉末に２０ｍ１のＬＭ−酢酸水溶液を加
え室温でホモジナイザーにかけ凍結、融解を２回くり返
した後、１２，０００Ｘｆにて２５分間遠心分離を付な
い抽出上清を得、遠心残渣はさらに５ ｍｌのＩＭ−酢
酸水溶液を加え洗浄し遠心分離して上清を前、記の抽出
上清に合した。
回くり返しＩＭ−酢酸水溶液２００ ｍｌを添加後１時
間撹拌し、つぎにｔｏ 、ｏｏｏ ｘ ｙ にて４５
分間遠心分離して不溶物を除き凍結乾燥した（１．５８
Ｆ）。この乾燥粉末に２０ｍ１のＬＭ−酢酸水溶液を加
え室温でホモジナイザーにかけ凍結、融解を２回くり返
した後、１２，０００Ｘｆにて２５分間遠心分離を付な
い抽出上清を得、遠心残渣はさらに５ ｍｌのＩＭ−酢
酸水溶液を加え洗浄し遠心分離して上清を前、記の抽出
上清に合した。
セファデックスＧ−７５スーパーフアインをカラムに詰
め（容量８．６ａｎＸ１００４）ＩＭ−酢酸水溶液で平
衡化した後、樹脂上面に上記抽出液を載せ、下降法でＩ
Ｍ−酢酸水溶液で溶出した（流速４０ ｍｌ！／時、温
度４ ”Ｃ） 、、溶出曲線を第１図に示す。同図にお
いて、矢印を付したマーカ（１） 、 （２） 、 （
３）はいずれもファルマシア・ジャパン製である（次表
参照）。
め（容量８．６ａｎＸ１００４）ＩＭ−酢酸水溶液で平
衡化した後、樹脂上面に上記抽出液を載せ、下降法でＩ
Ｍ−酢酸水溶液で溶出した（流速４０ ｍｌ！／時、温
度４ ”Ｃ） 、、溶出曲線を第１図に示す。同図にお
いて、矢印を付したマーカ（１） 、 （２） 、 （
３）はいずれもファルマシア・ジャパン製である（次表
参照）。
ＪＲ−８４０８活性成分の溶出位置は推定分子量ｔｏ、
ｏｏｏ 〜２０，０００にあり、２７５ ｍｌの活性分
画を分取した。これを凍結乾燥に付し２６４．２ｍｆの
乾燥粉末を得た。この活性分画１０μｇ分を後記のＪＲ
−８４０３活性試験にかけたところ、指標腫瘍細胞は対
照に比し有意に増殖抑制作用を受けた。
ｏｏｏ 〜２０，０００にあり、２７５ ｍｌの活性分
画を分取した。これを凍結乾燥に付し２６４．２ｍｆの
乾燥粉末を得た。この活性分画１０μｇ分を後記のＪＲ
−８４０３活性試験にかけたところ、指標腫瘍細胞は対
照に比し有意に増殖抑制作用を受けた。
実施例２
生新鮮血５１より得た血小板を凍結、融解操作を２回く
り返すことにより破壊し、これに０．ＩＮ−塩酸を含有
する７５％エタノール水を１００ ｍｌ加えて５ ’Ｃ
で２時間撹拌した後、ｉｏ、ｏｏｏＸｆにて４０分間遠
心分離し、上清に０．５Ｍ−酢酸緩衝液１）Ｈ５，５２
０ｍ（ｌを加えさらにｐＨを調整し最終ｐＨ５，５とす
る。５°Ｃに２時間静置後、ふたたび１０．０００ Ｘ
ｆ にて６０分間、５°Ｃで遠心分離した。この上清に
５倍容量のエーテル、エタノール等量混合液を添加して
一２０°Ｃで２昼夜靜置した。つぎに１２．０００ Ｘ
ｆにて６０分間、−２０°Ｃで遠心分離し、沈澱につ
いて実施例−１で行なったと同様にＩＭ−酢酸水溶液で
抽出し、抽出液１２、５ ｍｌを得た。セファデックス
Ｇ−７５スーパーフアインをカラムに詰め（容量２．４
１ｘｉｏ。
り返すことにより破壊し、これに０．ＩＮ−塩酸を含有
する７５％エタノール水を１００ ｍｌ加えて５ ’Ｃ
で２時間撹拌した後、ｉｏ、ｏｏｏＸｆにて４０分間遠
心分離し、上清に０．５Ｍ−酢酸緩衝液１）Ｈ５，５２
０ｍ（ｌを加えさらにｐＨを調整し最終ｐＨ５，５とす
る。５°Ｃに２時間静置後、ふたたび１０．０００ Ｘ
ｆ にて６０分間、５°Ｃで遠心分離した。この上清に
５倍容量のエーテル、エタノール等量混合液を添加して
一２０°Ｃで２昼夜靜置した。つぎに１２．０００ Ｘ
ｆにて６０分間、−２０°Ｃで遠心分離し、沈澱につ
いて実施例−１で行なったと同様にＩＭ−酢酸水溶液で
抽出し、抽出液１２、５ ｍｌを得た。セファデックス
Ｇ−７５スーパーフアインをカラムに詰め（容量２．４
１ｘｉｏ。
口）、ＩＭ−酢酸水溶液で平衡化後、樹脂上面に上記抽
出液をのせ下降法でＩＭ−酢酸水溶液で溶出した（流速
２２．５ ｍｌ１時、温度４ ’Ｃ） 、 ＪＲ−８４
０８活性成分は推定分子量１０．０００〜２０，０００
の位置に溶出され、活性分画１８０ ｍｌを得、そのｌ
Ｏμｅを後記ＪＲ−８４０８活性試験にかけたところ指
標腫瘍細胞は対照に比し有為、に増殖抑制作用を受けた
。
出液をのせ下降法でＩＭ−酢酸水溶液で溶出した（流速
２２．５ ｍｌ１時、温度４ ’Ｃ） 、 ＪＲ−８４
０８活性成分は推定分子量１０．０００〜２０，０００
の位置に溶出され、活性分画１８０ ｍｌを得、そのｌ
Ｏμｅを後記ＪＲ−８４０８活性試験にかけたところ指
標腫瘍細胞は対照に比し有為、に増殖抑制作用を受けた
。
実施例３
実施例−１で得られたＪＲ−８４０８活性分画２７５
ｍｌを分子量カット５，０００のＹＭ−５（アミコン社
製）を用いて塩交換を行ない、最終的には０．０２Ｍ−
リン酸緩衝液（ｐＨ７，５）で置換し、２４５ｍ１とし
た。ＣＭ−セファデックスＣ−２５（ファルマシア・ジ
ャパン社製）をカラム（容量３．２αＸ６０４）に詰め
、０．０２Ｍ−リン酸緩衝液（ｐＨ７，５）で平衡化し
、これに上記ＪＲ−８４０８活性成分を流し、活性成分
を吸着させ同緩衝液でよく洗浄し、ついで０．０２Ｍ〜
ＩＭ−塩化ナトリウム液により傾斜溶出を行なった（流
速３２ ｍｌｌ詩４゛Ｃ）。
ｍｌを分子量カット５，０００のＹＭ−５（アミコン社
製）を用いて塩交換を行ない、最終的には０．０２Ｍ−
リン酸緩衝液（ｐＨ７，５）で置換し、２４５ｍ１とし
た。ＣＭ−セファデックスＣ−２５（ファルマシア・ジ
ャパン社製）をカラム（容量３．２αＸ６０４）に詰め
、０．０２Ｍ−リン酸緩衝液（ｐＨ７，５）で平衡化し
、これに上記ＪＲ−８４０８活性成分を流し、活性成分
を吸着させ同緩衝液でよく洗浄し、ついで０．０２Ｍ〜
ＩＭ−塩化ナトリウム液により傾斜溶出を行なった（流
速３２ ｍｌｌ詩４゛Ｃ）。
溶出曲線を第２図に示す。ＪＲ−８４０８活性は０、６
〜０．９Ｍ−塩化ナトリウム溶液の位置に溶出され、Ｌ
２’ａ、５ｍｌの活性分画を捕捉することができた。こ
の分画を凍結乾燥して１４．６ ｍＷの乾燥粉末を得た
。本分画１０μｌはＪＲ−８４０８活性試験において指
標腫瘍細胞に対して有意に増殖抑制作用を与えた。
〜０．９Ｍ−塩化ナトリウム溶液の位置に溶出され、Ｌ
２’ａ、５ｍｌの活性分画を捕捉することができた。こ
の分画を凍結乾燥して１４．６ ｍＷの乾燥粉末を得た
。本分画１０μｌはＪＲ−８４０８活性試験において指
標腫瘍細胞に対して有意に増殖抑制作用を与えた。
実施例４
実施例−３で得たＪＲ−８４０３活性分画を凍結乾燥し
て得た粉末１４．６ ｍｒｌを１０ ｍｌの０．０５％
トリフルオロ酢酸水溶液を加え、室温でホモジナイザー
にかけ均一化した。これを凍結、融解し、１２．０００
Ｘｆにて３０分間遠心分離機にかけ抽出液を得た。遠心
沈澱はさらに２ ｍｌの０．０５％トリフルオロ酢酸水
溶液で洗浄し遠心分離してその上清を上記の抽出液に合
せた。アルキル基（Ｃ１３）を結合させたシリカゲル、
シンクロパックＲＰ−Ｐのカラム（１０，Ｏｍｍ×２５
０ｔｙｒｍ ） の高速液体クロマトグラフィシステ
ム（ギルソン社製）にセットし、０．０５％トリフルオ
ロ酢酸水溶液で平衡化した後、上記抽出液４ ｍｌをカ
ラムに通じ吸着させ、０．０５％トリフルオロ酢酸液で
洗浄後、０〜７５％アセトニトリル同溶液で傾斜抽出を
行なった。その溶出曲線を第３図に示す。
て得た粉末１４．６ ｍｒｌを１０ ｍｌの０．０５％
トリフルオロ酢酸水溶液を加え、室温でホモジナイザー
にかけ均一化した。これを凍結、融解し、１２．０００
Ｘｆにて３０分間遠心分離機にかけ抽出液を得た。遠心
沈澱はさらに２ ｍｌの０．０５％トリフルオロ酢酸水
溶液で洗浄し遠心分離してその上清を上記の抽出液に合
せた。アルキル基（Ｃ１３）を結合させたシリカゲル、
シンクロパックＲＰ−Ｐのカラム（１０，Ｏｍｍ×２５
０ｔｙｒｍ ） の高速液体クロマトグラフィシステ
ム（ギルソン社製）にセットし、０．０５％トリフルオ
ロ酢酸水溶液で平衡化した後、上記抽出液４ ｍｌをカ
ラムに通じ吸着させ、０．０５％トリフルオロ酢酸液で
洗浄後、０〜７５％アセトニトリル同溶液で傾斜抽出を
行なった。その溶出曲線を第３図に示す。
ＪＲ−８４０３活性成分はアセトニトリル濃度４０〜６
０％の位置に溶出された。本カラム操作を３回くり返し
抽出液Ｌ２ｍｌを処理しで得た活性分画を合せて凍結乾
燥して、１．２ ｍＷの白色乾燥粉末を得た。水晶を５
．０ｍ（！の生理食塩水に溶解し、その１００倍希釈液
１０μｌについでＪＲ−８４０１３活性試験を行なった
ところ、指標腫瘍細胞は対照に比し有意に増殖抑制作用
を受けた。
０％の位置に溶出された。本カラム操作を３回くり返し
抽出液Ｌ２ｍｌを処理しで得た活性分画を合せて凍結乾
燥して、１．２ ｍＷの白色乾燥粉末を得た。水晶を５
．０ｍ（！の生理食塩水に溶解し、その１００倍希釈液
１０μｌについでＪＲ−８４０１３活性試験を行なった
ところ、指標腫瘍細胞は対照に比し有意に増殖抑制作用
を受けた。
実施例５
実施例−４で得られたＪＲ−８４０８活性分画５ｍｌの
うちｔ ｍｌを用いてクロマトフォーカッラング（ファ
ルマシア社製）を実施した。Ｍｏｎｏ ＰプレパックＨ
Ｒ５／２０カラム（ファルマシア製）をＦＰＬＣ（ファ
ルマシア社製）にセットし、ＪＲ−８４０８活性成分を
吸着させ、ファルマライト８−１０．５（ファルマシア
社製）を使用し、ｐＨ８〜１０．５間でｐＨ傾斜溶出し
た。ＪＲ−８４０８活性成分はｐＨ９〜１０の位置に溶
出され活性分画３．５ｍｌを得た。本活性分画を分子量
カット８．５００の透析膜を用いて生理食塩水に対して
２昼夜透析し、凍結乾燥した。以上の操作を５回くり返
し実施し、実施例−４で得られたＪＲ−８４０８活性分
画全量５ ｍｌを処理して白色粉末０．７ ｍｆを得た
。
うちｔ ｍｌを用いてクロマトフォーカッラング（ファ
ルマシア社製）を実施した。Ｍｏｎｏ ＰプレパックＨ
Ｒ５／２０カラム（ファルマシア製）をＦＰＬＣ（ファ
ルマシア社製）にセットし、ＪＲ−８４０８活性成分を
吸着させ、ファルマライト８−１０．５（ファルマシア
社製）を使用し、ｐＨ８〜１０．５間でｐＨ傾斜溶出し
た。ＪＲ−８４０８活性成分はｐＨ９〜１０の位置に溶
出され活性分画３．５ｍｌを得た。本活性分画を分子量
カット８．５００の透析膜を用いて生理食塩水に対して
２昼夜透析し、凍結乾燥した。以上の操作を５回くり返
し実施し、実施例−４で得られたＪＲ−８４０８活性分
画全量５ ｍｌを処理して白色粉末０．７ ｍｆを得た
。
水晶は分子量ｔｏ、ｏｏｏ〜２０．０００ （第１図）
、等電点９．０〜ｉｏ、ｏｃ第４図）を示し、ニンヒド
リン反応陽性、生理食塩水中６０°Ｃ５８０分間または
１００ ’Ｃ１分間の加熱処理及び室温において０、２
Ｎ−塩酸と６０分間または７０％蟻酸と８０分間接触
させる酸処理においても、その腫瘍細胞増殖抑制活性は
失なわれなかった。なお氷晶をトリプシン（牛膵臓から
の製品、ディフコ社製）濃度ｏ、 ｉ ｍｙｙｍｇで、
８７’Ｃ２２４時間処理に付したところ、その活性はほ
とんど失われた。
、等電点９．０〜ｉｏ、ｏｃ第４図）を示し、ニンヒド
リン反応陽性、生理食塩水中６０°Ｃ５８０分間または
１００ ’Ｃ１分間の加熱処理及び室温において０、２
Ｎ−塩酸と６０分間または７０％蟻酸と８０分間接触
させる酸処理においても、その腫瘍細胞増殖抑制活性は
失なわれなかった。なお氷晶をトリプシン（牛膵臓から
の製品、ディフコ社製）濃度ｏ、 ｉ ｍｙｙｍｇで、
８７’Ｃ２２４時間処理に付したところ、その活性はほ
とんど失われた。
実施例６’ ＪＲ−８４０８の腫瘍細胞に対する作用。
腫瘍細胞であるＫＢ細胞（ヒト鼻咽腔癌）、ＨＥＰ−２
細胞（ヒト喉頭癌）、Ｈｅ１ａ細胞（ヒト子宮頚部癌）
、Ｇ−３６１細胞（ヒト悪性黒色腫）、Ｋ−５６２細胞
（ヒト白血病）、Ｌ−１２１０細胞（マウス白血病）及
びＬ−９２９（マウス結合組織癌）をあらかじめ４８時
間培養後それぞれの細胞１０４ 個を検体を添加した１
０％仔牛血清含有イーグル培地ｔ ｍｌ中で、８７ ’
Ｃ、５％炭酸ガス気流中で５日間培養した。検体無添加
の対照群と実施例−５で得たＪＲ−８４０８を添加（２
００ｎｆ／培地ｍｅ） した試験群を同時に培養し２
４時間毎にトリパンブルーで染色されない生存細胞数を
光学顕微鏡下に計数した。その１例を第５図に示す。
細胞（ヒト喉頭癌）、Ｈｅ１ａ細胞（ヒト子宮頚部癌）
、Ｇ−３６１細胞（ヒト悪性黒色腫）、Ｋ−５６２細胞
（ヒト白血病）、Ｌ−１２１０細胞（マウス白血病）及
びＬ−９２９（マウス結合組織癌）をあらかじめ４８時
間培養後それぞれの細胞１０４ 個を検体を添加した１
０％仔牛血清含有イーグル培地ｔ ｍｌ中で、８７ ’
Ｃ、５％炭酸ガス気流中で５日間培養した。検体無添加
の対照群と実施例−５で得たＪＲ−８４０８を添加（２
００ｎｆ／培地ｍｅ） した試験群を同時に培養し２
４時間毎にトリパンブルーで染色されない生存細胞数を
光学顕微鏡下に計数した。その１例を第５図に示す。
また検体の使用量を変えて実験し用量作用曲線を作った
。その１例を第６図に示す。各種腫瘍細胞に対する５０
％増殖抑制濃度を第２表に示す。
。その１例を第６図に示す。各種腫瘍細胞に対する５０
％増殖抑制濃度を第２表に示す。
実施例７ ＪＲ−８４０８の正常細胞に対する作用。
正常細胞であるＦｌｏｗ７０００紬胞（ヒト胎児包皮）
、初代培養ラット肝臓細胞、初代培養仔牛腎細胞・、初
代培養ニワトリ全胚細胞をあらかじめ２代以上継代培養
し、それぞれの細胞１０４個をｌＯ％仔牛血清含有イー
グル培地１ ｍｌに加え、ＪＲ−８４０８無添加の対照
群、実施例−４のＪＲ−８４０８を添加した実験群及び
実施例−５のＪＲ−８４０８を添加した群の３群に分け
５日間５％炭酸ガス気流中、３７゛Ｃで培養した。１日
、３日、５日目毎にトリパンブルーで染色されない生存
細胞数を光学顕微鏡に計数した。対照群の細胞を基に検
体の細胞抑制作用を確認した。結果を第８表に示す。ま
た初代培養ラット肝臓細胞を指標細胞とし、実施例−４
で得たＪ Ｒ−８４０８（５００ｎｆ／／ｍｌ）を検体
としたものを実験群Ａに、また実施例−５のＪ Ｒ−８
４０８（’５００ ｎｌ／ｍｌ）を検体としたものを実
験群Ｂとしで得られた結果を第７図に示した。
、初代培養ラット肝臓細胞、初代培養仔牛腎細胞・、初
代培養ニワトリ全胚細胞をあらかじめ２代以上継代培養
し、それぞれの細胞１０４個をｌＯ％仔牛血清含有イー
グル培地１ ｍｌに加え、ＪＲ−８４０８無添加の対照
群、実施例−４のＪＲ−８４０８を添加した実験群及び
実施例−５のＪＲ−８４０８を添加した群の３群に分け
５日間５％炭酸ガス気流中、３７゛Ｃで培養した。１日
、３日、５日目毎にトリパンブルーで染色されない生存
細胞数を光学顕微鏡に計数した。対照群の細胞を基に検
体の細胞抑制作用を確認した。結果を第８表に示す。ま
た初代培養ラット肝臓細胞を指標細胞とし、実施例−４
で得たＪ Ｒ−８４０８（５００ｎｆ／／ｍｌ）を検体
としたものを実験群Ａに、また実施例−５のＪ Ｒ−８
４０８（’５００ ｎｌ／ｍｌ）を検体としたものを実
験群Ｂとしで得られた結果を第７図に示した。
同様に初代培養ニワトリ全胚細胞を指標細胞とし実施例
−５のＪＲ−８４０８（ＬＯＯＯｍｆ／ｍｅ）を検体と
しで得られた結果を第８図に示す。
−５のＪＲ−８４０８（ＬＯＯＯｍｆ／ｍｅ）を検体と
しで得られた結果を第８図に示す。
ＪＲ−８４０３活性試験法
指標腫瘍細胞としてはＫＢ細胞（ヒト咽腔癌）またはＨ
Ｅ、−２細胞（ヒト喉頭癌）を用いる。培地には１０％
仔牛血清を添加したイーグル培地（０，１％非不可欠ア
ミノ酸添加、大日本製薬社製）を用いる。培地をマルチ
ディシュトレイ（ヌンク社製、デンマーク国）に入れ指
標細胞１０４個を懇濁液として加え、検体を生理食塩水
の溶液としで添加する。対照群には同容量の生理食塩水
のみ添加し、開放系にて５％炭酸ガス気流中、３７゛Ｃ
１１ＯＯ％湿度下に培養する。培養日数３〜４日、経時
的に観察を行ない、対照群の細胞が充分増殖した時点で
トリプシン処理、トリパンブルー染色を行ない染色され
ない生存細胞数を光学顕微鏡下に計数する。対照群に対
する検体添加群の生存細胞数を計算しその比から５０％
増殖抑制値を算出する。
Ｅ、−２細胞（ヒト喉頭癌）を用いる。培地には１０％
仔牛血清を添加したイーグル培地（０，１％非不可欠ア
ミノ酸添加、大日本製薬社製）を用いる。培地をマルチ
ディシュトレイ（ヌンク社製、デンマーク国）に入れ指
標細胞１０４個を懇濁液として加え、検体を生理食塩水
の溶液としで添加する。対照群には同容量の生理食塩水
のみ添加し、開放系にて５％炭酸ガス気流中、３７゛Ｃ
１１ＯＯ％湿度下に培養する。培養日数３〜４日、経時
的に観察を行ない、対照群の細胞が充分増殖した時点で
トリプシン処理、トリパンブルー染色を行ない染色され
ない生存細胞数を光学顕微鏡下に計数する。対照群に対
する検体添加群の生存細胞数を計算しその比から５０％
増殖抑制値を算出する。
第２表
第３表
第１図は実施例１のセファデックスＧ７５スーパーフア
インを用いるゲル・クロマトグラフィー（１Ｍ酢酸水溶
液）の溶出曲線、第２図は実施例８におけるＣＭ−セフ
ァデックＣ−２５を担体とする０、０２Ｍ〜ＩＭ塩化ナ
トリウム水溶液による傾斜溶出クロマトグラフィーの溶
出曲線、第８図は実施例４のアルキル基（Ｃ１Ｂ）を結
合させたシリカゲル・シリカゲルシンクロパックＲＰ−
Ｐを用いる高゛速液体クロマトグラフィーにおける０〜
７５％アセトニトリル（０，０５％トリフルオロ酢酸水
溶液中）による傾斜溶出の溶出曲線、第４図は実施例５
におけるファルマライト８−１０．５を用いるｐＨ８−
１０，５の傾斜溶出の溶出曲線、第５図は実施例６に示
される、実施例５で得た本発明の因子（２００ｎｇ／培
地ｍｐ ）の活性試験（指標細胞：ＫＢ）の結果、第６
図は実施例６に示される同因子の使用量を変化させて得
た活性用量作用曲線（指標細胞： Ｈｅ１ａ ）、第７
図は実施例７に示される実験群Ａ［実施例４で得た本発
明の因子（５００ｎｆ／ｍ））、実験群Ｂ〔実施例５で
得た本発明の因子（５００ｎｆ／ｍ（１） ］ の正常
細胞に対する活性試験（指標細胞：初代培養ラット肝臓
細胞）の結果、第８図は実施例７に示される、実施例５
で得た本発明の因子（１０００ｍｌ／ｍｌ ）を用いる
正常細胞に対する活性試験（指標細胞：初代培養ニワト
リ胎児細胞）の結果を示す。 特許出願人 日本ケミカルリサーチ株式会社代理人
弁理士 竹 内 卓″ ・□；上愉植坤
剃帝（’／、） （ｘ２０） ｏｇＬ央ｊｒ ２８０ｎｍ（ｘｌＯ）
ｏｒＬ光崖２８０ｎｍ 唖％攪２２０ｎｍ ０［Ｌ’Ｍと１２２０ｎｍ
インを用いるゲル・クロマトグラフィー（１Ｍ酢酸水溶
液）の溶出曲線、第２図は実施例８におけるＣＭ−セフ
ァデックＣ−２５を担体とする０、０２Ｍ〜ＩＭ塩化ナ
トリウム水溶液による傾斜溶出クロマトグラフィーの溶
出曲線、第８図は実施例４のアルキル基（Ｃ１Ｂ）を結
合させたシリカゲル・シリカゲルシンクロパックＲＰ−
Ｐを用いる高゛速液体クロマトグラフィーにおける０〜
７５％アセトニトリル（０，０５％トリフルオロ酢酸水
溶液中）による傾斜溶出の溶出曲線、第４図は実施例５
におけるファルマライト８−１０．５を用いるｐＨ８−
１０，５の傾斜溶出の溶出曲線、第５図は実施例６に示
される、実施例５で得た本発明の因子（２００ｎｇ／培
地ｍｐ ）の活性試験（指標細胞：ＫＢ）の結果、第６
図は実施例６に示される同因子の使用量を変化させて得
た活性用量作用曲線（指標細胞： Ｈｅ１ａ ）、第７
図は実施例７に示される実験群Ａ［実施例４で得た本発
明の因子（５００ｎｆ／ｍ））、実験群Ｂ〔実施例５で
得た本発明の因子（５００ｎｆ／ｍ（１） ］ の正常
細胞に対する活性試験（指標細胞：初代培養ラット肝臓
細胞）の結果、第８図は実施例７に示される、実施例５
で得た本発明の因子（１０００ｍｌ／ｍｌ ）を用いる
正常細胞に対する活性試験（指標細胞：初代培養ニワト
リ胎児細胞）の結果を示す。 特許出願人 日本ケミカルリサーチ株式会社代理人
弁理士 竹 内 卓″ ・□；上愉植坤
剃帝（’／、） （ｘ２０） ｏｇＬ央ｊｒ ２８０ｎｍ（ｘｌＯ）
ｏｒＬ光崖２８０ｎｍ 唖％攪２２０ｎｍ ０［Ｌ’Ｍと１２２０ｎｍ
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）血小板を破壊したのち酸性の水溶液もしくは水−有
機溶媒混合溶媒溶液で抽出し、所望によりゲルクロマト
グラフィーにより推定分子量１０，０００ないし２０，
０００の腫瘍細胞増殖抑制作用を有する分画を採取し、
次いで、クロマトグラフィーにより分子量１０，０００
〜２０，０００、等電点９．０〜１０．０、ニンヒドリ
ン反応陽性、トリプシンで失活するが生理食塩水中６０
℃３０分間の加熱および０．２Ｎ塩酸と６０分間または
７０％ギ酸と３０分間室温下の接触により失活しない腫
瘍細胞増殖抑制作用を有する分画を採取することを特徴
とする腫瘍細胞増殖抑制および殺腫瘍細胞因子の製造法
。 ２）ゲルクロマトグラフィーを酸性ないし中性条件下で
行う特許請求の範囲第１項記載の製造法。 ３）クロマトグラフィーが（１）陽イオン交換体に活性
成分を吸着させ、次いで中性塩の濃度勾配水溶液を用い
て傾斜溶出を行うイオン交換クロマトグラフィー、（２
）疎水性基を有する担体に活性成分を吸着させ、次いで
親水性中性有機溶媒を用いて傾斜溶出を行う逆相クロマ
トグラフィー、および（３）陽イオン交換体に活性成分
を吸着させ、次いでｐＨ傾斜溶出液により等電点順位で
順次溶出するクロマトフォーカシングのいずれか一つで
あるか、望ましくは二以上を組合せである特許請求の範
囲第１項記載の製造法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60058789A JPH0699479B2 (ja) | 1985-03-22 | 1985-03-22 | 腫瘍細胞増殖抑制剤および殺腫瘍細胞因子の製造法 |
| EP86302081A EP0195681B1 (en) | 1985-03-22 | 1986-03-20 | Tumor cytostatic-cytocidal factor and method of obtaining same |
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