JPS61225199A - 新規ヒトインタ−ロイキン２ポリペチド誘導体 - Google Patents
新規ヒトインタ−ロイキン２ポリペチド誘導体Info
- Publication number
- JPS61225199A JPS61225199A JP60065599A JP6559985A JPS61225199A JP S61225199 A JPS61225199 A JP S61225199A JP 60065599 A JP60065599 A JP 60065599A JP 6559985 A JP6559985 A JP 6559985A JP S61225199 A JPS61225199 A JP S61225199A
- Authority
- JP
- Japan
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- polypeptide derivative
- human interleukin
- polypeptide
- dna
- dna fragment
- Prior art date
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- Pending
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/55—IL-2
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S930/00—Peptide or protein sequence
- Y10S930/01—Peptide or protein sequence
- Y10S930/14—Lymphokine; related peptides
- Y10S930/141—Interleukin
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は新規なヒトインターロイキン２ポリペプチド誘
導体、該ポリペプチド誘導体をコードするＤＮＡ断片を
組み込んだ組換え体プラスミド、該プラスミドを含む微
生物および該微生物を用いるヒトインターロイキン２ポ
リペプチド誘導体の製造法に関する。
導体、該ポリペプチド誘導体をコードするＤＮＡ断片を
組み込んだ組換え体プラスミド、該プラスミドを含む微
生物および該微生物を用いるヒトインターロイキン２ポ
リペプチド誘導体の製造法に関する。
産業上の利用分野
インターロイキン２（以下Ｉ Ｌ −２と略記する）は
、Ｔ−リンパ球の生産するリンホカインである。
、Ｔ−リンパ球の生産するリンホカインである。
ＩＬ−２は、抗原刺激を受けたＴ ＩＪンパ球の増殖に
必須であるばかりでなく、細胞障害性’Ｊ” ＩＪン
パ球の増殖・分化、ナチュラルキラー細胞の活性化など
の生理作用を有することから、免疫不全症の治療や抗腫
瘍免疫療法などの臨床応用に期待が寄せられている。本
発明のヒ）ＩＬＩポリペプチド誘導体もＩＬ、−２活性
を有しており、ＩＬ−２と同様医薬としての利用が期待
される。
必須であるばかりでなく、細胞障害性’Ｊ” ＩＪン
パ球の増殖・分化、ナチュラルキラー細胞の活性化など
の生理作用を有することから、免疫不全症の治療や抗腫
瘍免疫療法などの臨床応用に期待が寄せられている。本
発明のヒ）ＩＬＩポリペプチド誘導体もＩＬ、−２活性
を有しており、ＩＬ−２と同様医薬としての利用が期待
される。
従来の技術
近年急速に発展している組換えＤＮＡ技術は高等生物の
細胞では生産量が少なく分離が因難な物質を微生物で大
量に生産することを可能にした。
細胞では生産量が少なく分離が因難な物質を微生物で大
量に生産することを可能にした。
ＩＬ−２に関しては、谷口らがヒ）Ｔ細胞性白血病細胞
株Ｊｕｒｋａｔ−１１１由来の、島田らがヒト扁桃腺細
胞由来のｃＤＮＡを大腸菌にクローン化し、その塩基配
列を決定したことが報告されている〔谷口ら：ネイチャ
ー（Ｎａｔｕｒｅ）３０２ 、３０５ （１９８３）
：島田ら：バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル
・リサーチ・コミュニケイションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ
。
株Ｊｕｒｋａｔ−１１１由来の、島田らがヒト扁桃腺細
胞由来のｃＤＮＡを大腸菌にクローン化し、その塩基配
列を決定したことが報告されている〔谷口ら：ネイチャ
ー（Ｎａｔｕｒｅ）３０２ 、３０５ （１９８３）
：島田ら：バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル
・リサーチ・コミュニケイションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ
。
Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、） １１５
、 １０４０ （１９８３）〕。
、 １０４０ （１９８３）〕。
島田らによりクローン化されたＩＬ−２ｃＤＮＡはトリ
プトファンプロモーターをもつベクターｐＫＹＰ１０
（特開昭５８−１１０６（１５））に組み込んで大腸菌
で発現させて、ＩＬ−２を大量に生産することができる
。
プトファンプロモーターをもつベクターｐＫＹＰ１０
（特開昭５８−１１０６（１５））に組み込んで大腸菌
で発現させて、ＩＬ−２を大量に生産することができる
。
島田らによってクローン化されたＩＬ−２をコードする
ｃＤＮＡは第１表に示されるとおりであＩＬ−２の誘導
体については、５８番目のアミノ酸であるシスティン（
Ｃｙｓ） をセリン（Ｓｅｒ） に置換したもの、１
０５番目のＣｙｓｆｃＳｅｒに置換したものは比活性が
１１５０〜１／１（１５）に低下し、１２５番目のＣｙ
ｓをＳｅｔに置換したものは比活性が３０％増加した例
が報告されている〔エイ・ワング（Ａ。
ｃＤＮＡは第１表に示されるとおりであＩＬ−２の誘導
体については、５８番目のアミノ酸であるシスティン（
Ｃｙｓ） をセリン（Ｓｅｒ） に置換したもの、１
０５番目のＣｙｓｆｃＳｅｒに置換したものは比活性が
１１５０〜１／１（１５）に低下し、１２５番目のＣｙ
ｓをＳｅｔに置換したものは比活性が３０％増加した例
が報告されている〔エイ・ワング（Ａ。
Ｗａｎｇ） ら；サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） ２
２４ 、 １４３１（１９８４） ）。
２４ 、 １４３１（１９８４） ）。
発明が解決しようとする問題点
本発明の目的はＩＬＩ活性の高いポリペプチドを安価に
大量に製造する手段を提供することにある。
大量に製造する手段を提供することにある。
問題点を解決するための手段
本発明者らは、第１表に示されたＩＬ−２のｃＤＮＡを
改変し、クローン化した大腸菌を培養することによって
高い■Ｌ−２活性を有するＩＬ−２の誘導体を製造でき
ることを見出し、本発明を完成するに至った。
改変し、クローン化した大腸菌を培養することによって
高い■Ｌ−２活性を有するＩＬ−２の誘導体を製造でき
ることを見出し、本発明を完成するに至った。
発明の詳細な説明
本発明によれば、新規なヒトＩＬ−２ポリペプチド誘導
体、該ポリペプチド誘導体をコードするＤＮＡを組み込
んだ組換え体プラスミド、該プラスミドを含む微生物お
よび該微生物を用いる新規なヒ）ＩＬ−２ポリペプチド
誘導体の製造法が提供される。
体、該ポリペプチド誘導体をコードするＤＮＡを組み込
んだ組換え体プラスミド、該プラスミドを含む微生物お
よび該微生物を用いる新規なヒ）ＩＬ−２ポリペプチド
誘導体の製造法が提供される。
本発明のヒトＩＬＩポリペプチド誘導体は、第１表のア
ミノ酸配列を有するヒ）ＩＬ−２ポリペプチドから一部
のアミノ酸が除去されたものである。該除去されるアミ
ノ酸はＮ末端近傍のアミノ酸であり、Ｎ末端から１〜５
個のアミノ酸のうち少なくとも１個であることが望まし
い。
ミノ酸配列を有するヒ）ＩＬ−２ポリペプチドから一部
のアミノ酸が除去されたものである。該除去されるアミ
ノ酸はＮ末端近傍のアミノ酸であり、Ｎ末端から１〜５
個のアミノ酸のうち少なくとも１個であることが望まし
い。
本発明の組換え体プラスミドは、上記ヒ）ＩＬ−２ポリ
ペプチド誘導体をコードするＤＮＡ断片がＤＮＡの発現
機能を持つ適当なプラスミドに組み込まれたものである
。
ペプチド誘導体をコードするＤＮＡ断片がＤＮＡの発現
機能を持つ適当なプラスミドに組み込まれたものである
。
本発明のヒ）ＩＬ−２ポリペプチド誘導体をコードする
ＤＮＡ断片としては、第１表に示されるヒ）ＩＬ−２を
コードするＤＮＡの塩基配列の第１〜１５番目の塩基の
うち少なくとも３個を欠失した配列を有するものが好ま
しい。
ＤＮＡ断片としては、第１表に示されるヒ）ＩＬ−２を
コードするＤＮＡの塩基配列の第１〜１５番目の塩基の
うち少なくとも３個を欠失した配列を有するものが好ま
しい。
第１表に示されるヒトＩＬ−２をコードするＤＮＡとし
ては、ＩＬ−２をコードするメツセンジャーＲＮＡから
組換えＤＮＡ技術で逆転写して得られるｃＤＮＡ （ヒ
トＩＬ−２ｃＤＮＡ）または染色体ＤＮＡから得られる
ＩＬ−２をコードするＤＮＡなどが利用できる。
ては、ＩＬ−２をコードするメツセンジャーＲＮＡから
組換えＤＮＡ技術で逆転写して得られるｃＤＮＡ （ヒ
トＩＬ−２ｃＤＮＡ）または染色体ＤＮＡから得られる
ＩＬ−２をコードするＤＮＡなどが利用できる。
ヒトＩＬ−２ｃＤＮΔとしては、ヒトＩＬ−２をコード
しているものであればいかなるものも用いることができ
るが、具体的にはｐ ］−１Ｉ Ｇ ５−３を用いるこ
とができる。ｐＨｌＧ５−３は島田らにより報告されて
いるプラスミドであり、その製造法は島田ら〔バイオケ
ミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュ
ニケイションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒ
ｅｓ、 Ｃｏｍｍｕｎ、） １１５． １０４０（１９
８３） ’］に記載されている。
しているものであればいかなるものも用いることができ
るが、具体的にはｐ ］−１Ｉ Ｇ ５−３を用いるこ
とができる。ｐＨｌＧ５−３は島田らにより報告されて
いるプラスミドであり、その製造法は島田ら〔バイオケ
ミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュ
ニケイションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒ
ｅｓ、 Ｃｏｍｍｕｎ、） １１５． １０４０（１９
８３） ’］に記載されている。
ｐＨｌＧ５−３中のＩ Ｌ−２ＤＮＡはマキサム・ギル
バート法〔メソッド・イン・エンチモロジイ（Ｍｅｔｈ
、Ｂｎｚｙｍ、） ６５ ．４９９ （１９８０））
により決定された第１表に示す塩基配列を有している。
バート法〔メソッド・イン・エンチモロジイ（Ｍｅｔｈ
、Ｂｎｚｙｍ、） ６５ ．４９９ （１９８０））
により決定された第１表に示す塩基配列を有している。
ＤＮＡからの塩基の削除は、制限酵素による切断および
ヌクレアーゼＢＡＬ３１またはＤＮＡポリメラーゼ■・
クレノー断片（以下クレノー断片という）を用いる消化
によって行われる。
ヌクレアーゼＢＡＬ３１またはＤＮＡポリメラーゼ■・
クレノー断片（以下クレノー断片という）を用いる消化
によって行われる。
ＩＬ−２ポリペプチド誘導体をコードするＤＮＡを組み
込むプラスミドとしては、大腸菌で該ＤＮＡが発現でき
るものならいかなるプラスミドでも使うことができる。
込むプラスミドとしては、大腸菌で該ＤＮＡが発現でき
るものならいかなるプラスミドでも使うことができる。
好ましくは、適当なプロモーター、例えば、ｔｒｐ系、
ｌａｃ系のプロモーターの下流に外来ＤＮＡを挿入する
ことができ、しかもシャイン−ダルガノ配列（以下８Ｄ
配列と略記する）と開始コード（ＡＴＧ）の間を適当な
距離、例えば６〜１８塩基対に調節したプラスミドを用
いることができる。具体的に好的なプラスミドとしては
、本発明者らによって造成されたｐＫＹＰＩＱ。
ｌａｃ系のプロモーターの下流に外来ＤＮＡを挿入する
ことができ、しかもシャイン−ダルガノ配列（以下８Ｄ
配列と略記する）と開始コード（ＡＴＧ）の間を適当な
距離、例えば６〜１８塩基対に調節したプラスミドを用
いることができる。具体的に好的なプラスミドとしては
、本発明者らによって造成されたｐＫＹＰＩＱ。
ｒ］ＫＹＰＩＬ ｐＫＹＰ１２ （特開昭５８−１１０
６（１５））などがあげられる。ＩＬ−２ポリペプチド
誘導体をコードするＤＮＡに開始コドンを与えるために
は、プロモーターの下流に開始コドンを有し、制限酵素
で切断したときに３′末端側に開始コドンを残すような
プラスミドが用いられる。具体的に好的な例としてはｐ
ＴｒＳ３ （特開昭５９−６７２９７および特開昭５９
＝１４０８８３ ）があげられる。
６（１５））などがあげられる。ＩＬ−２ポリペプチド
誘導体をコードするＤＮＡに開始コドンを与えるために
は、プロモーターの下流に開始コドンを有し、制限酵素
で切断したときに３′末端側に開始コドンを残すような
プラスミドが用いられる。具体的に好的な例としてはｐ
ＴｒＳ３ （特開昭５９−６７２９７および特開昭５９
＝１４０８８３ ）があげられる。
ヒ１−ＩＬ−２ｃＤＮＡとしてｐＨｌ０５−３を、該Ｄ
ＮＡを組み込むためのプラスミドとしてｐＫＹＰＩＱを
、開始コドンを与えるプラスミドとしてｐＴｒ Ｓ ３
をそれぞれ用いてヒ）ＴＬ−２ポリペプチド誘導体をコ
ードするＤＮＡを組み込んだ組換え体プラスミドを造成
する例を以下に述べる。
ＮＡを組み込むためのプラスミドとしてｐＫＹＰＩＱを
、開始コドンを与えるプラスミドとしてｐＴｒ Ｓ ３
をそれぞれ用いてヒ）ＴＬ−２ポリペプチド誘導体をコ
ードするＤＮＡを組み込んだ組換え体プラスミドを造成
する例を以下に述べる。
第１図に示したようにしてｐＨｌＧ５−３ Ｃ約３．５
キロベース（以下Ｋｂと略記する）〕をＰｖｕ■で切断
したこの切断部位にＢａｍＨＩＩＪンカー（１０ベース
ベヤ−（以下ｂｐと略記する）〕を導入し、ｐＩＬＡｌ
（約３．５ ｋ ｂ ）を得る。
キロベース（以下Ｋｂと略記する）〕をＰｖｕ■で切断
したこの切断部位にＢａｍＨＩＩＪンカー（１０ベース
ベヤ−（以下ｂｐと略記する）〕を導入し、ｐＩＬＡｌ
（約３．５ ｋ ｂ ）を得る。
ついでｐＩＬＡｌをＨｇ１Δ１で切断しクレノー断片で
処理することにより平滑末端とした後、ＢａｍＨＩ切断
し、低融点アガロース電気泳動法（ＬＧＴ法）にて約７
６０ｂｐのＤＮＡ断片を精製する。次いで、第２図に示
したようにｐＫＹＰｌｏをＢａｎ■とＢａｍＨＩで切断
した後約４．３ＫｂのＤＮＡ断片を精製する。このよう
にして得た両ＤＮＡ断片と第２図に示した合成りＮＡ〔
開始コドン（ＡＴＣ）と１番目のアミノ酸であるアラニ
ン（ΔＡａ）をコードする（ＯＣＡ）を含む〕をＴ４−
ＤＮＡリガーゼにより結合しｐＩＬＪ２を得る。
処理することにより平滑末端とした後、ＢａｍＨＩ切断
し、低融点アガロース電気泳動法（ＬＧＴ法）にて約７
６０ｂｐのＤＮＡ断片を精製する。次いで、第２図に示
したようにｐＫＹＰｌｏをＢａｎ■とＢａｍＨＩで切断
した後約４．３ＫｂのＤＮＡ断片を精製する。このよう
にして得た両ＤＮＡ断片と第２図に示した合成りＮＡ〔
開始コドン（ＡＴＣ）と１番目のアミノ酸であるアラニ
ン（ΔＡａ）をコードする（ＯＣＡ）を含む〕をＴ４−
ＤＮＡリガーゼにより結合しｐＩＬＪ２を得る。
Ｎ末端の欠失したＩＬ−２ポリペプチド誘導体をコード
するＤＮＡを得るためには第３図に示したようにｐＩＬ
Ｊ２をＨｉｎｄｌｌＩ切断後Ｂａｊ２３１を短時間（１
〜３０分間）作用させてＩＬ−２のＮ末端のアミノ酸を
コードするＤＮＡを削り、続いてＰｓｔＩで切断した後
、約４、ＱＫｂのＤＮＡ断片を精製する。一方開始コト
ンを含むベクターｐＴｒＳ３をｓｐｈ Ｉ切断後クレノ
ー断片で処理し、さらにＰＳｔＩで切断した後、８８０
ｂｐのＤＮＡ断片を精製する。
するＤＮＡを得るためには第３図に示したようにｐＩＬ
Ｊ２をＨｉｎｄｌｌＩ切断後Ｂａｊ２３１を短時間（１
〜３０分間）作用させてＩＬ−２のＮ末端のアミノ酸を
コードするＤＮＡを削り、続いてＰｓｔＩで切断した後
、約４、ＱＫｂのＤＮＡ断片を精製する。一方開始コト
ンを含むベクターｐＴｒＳ３をｓｐｈ Ｉ切断後クレノ
ー断片で処理し、さらにＰＳｔＩで切断した後、８８０
ｂｐのＤＮＡ断片を精製する。
Ｔ４１Ｊガーゼで両ＤＮＡ断片を結合することにする、
ヒトＩ＞２ポリペプチド誘導体をコードするＤＮＡが組
み込まれた組換え体プラスミドが得られる。実施例で得
られるプラスミドはｐＩＬＹ４９、ｐＩＬＹ５３、ｐＩ
ＬＹ８７、ｐＩＬＹ１０６と命名した。
ヒトＩ＞２ポリペプチド誘導体をコードするＤＮＡが組
み込まれた組換え体プラスミドが得られる。実施例で得
られるプラスミドはｐＩＬＹ４９、ｐＩＬＹ５３、ｐＩ
ＬＹ８７、ｐＩＬＹ１０６と命名した。
上記組換え技法における反応の条件は、一般的に下記の
とおりである。
とおりである。
ＤＮＡの制限酵素による消化反応は通常０．１〜２０μ
ｇのＤＮＡを２〜２（１５）ｍＭ（好ましくは１０〜４
０ｍＭ）のＴｒ ｉ ５−Ｈ（１（ｐＨ６，０〜９．５
好ましくはｐ Ｈ７，０〜８．０）、０〜２（１５）ｍ
ＭのＮａＣβ、２〜２０ｍＭ（好ましくは５〜ｌＱｒｎ
Ｍ）のＭ ｇ Ｃｌ ２を含む反応液中で、制限酵素０
．１〜１（１５）単位く好ましくは１μｇのＤＮＡに対
して１〜３単位）を用い、２０〜７０℃（至適温度は用
いる制限酵素により異なる）において、１５分間〜２４
時間行う。反応の停止は、通常５５〜７５℃で、５〜３
０分間加熱することによるが、フェノールまたはジエチ
ルピロカーボネートなどの試薬により制限酵素を失活さ
せる方法も用いることができる。
ｇのＤＮＡを２〜２（１５）ｍＭ（好ましくは１０〜４
０ｍＭ）のＴｒ ｉ ５−Ｈ（１（ｐＨ６，０〜９．５
好ましくはｐ Ｈ７，０〜８．０）、０〜２（１５）ｍ
ＭのＮａＣβ、２〜２０ｍＭ（好ましくは５〜ｌＱｒｎ
Ｍ）のＭ ｇ Ｃｌ ２を含む反応液中で、制限酵素０
．１〜１（１５）単位く好ましくは１μｇのＤＮＡに対
して１〜３単位）を用い、２０〜７０℃（至適温度は用
いる制限酵素により異なる）において、１５分間〜２４
時間行う。反応の停止は、通常５５〜７５℃で、５〜３
０分間加熱することによるが、フェノールまたはジエチ
ルピロカーボネートなどの試薬により制限酵素を失活さ
せる方法も用いることができる。
制限酵素消化によって生じたＤＮＡ断片の精製は、低融
点アガロースゲル電気泳動法（ＬＧＴ法）〔エル命つイ
スラング−（１，１Ｉｉｅｓｌａｎｄｅｒ） ：アナ
リティカル・バイオケミストリイ（八ｎａｌｙｔｉｃａ
ｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ） ９８．３０５ （１９
７９））やポリアクリルアミドゲル電気泳動法〔エイ・
エム・マキサム（Ａ９Ｍ、 Ｍａｘａｍ） ら；プロ
シーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オ
ブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、）、 ［ＩＳＡ ７４． ５６０（１
９７７） 〕などによって行う。
点アガロースゲル電気泳動法（ＬＧＴ法）〔エル命つイ
スラング−（１，１Ｉｉｅｓｌａｎｄｅｒ） ：アナ
リティカル・バイオケミストリイ（八ｎａｌｙｔｉｃａ
ｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ） ９８．３０５ （１９
７９））やポリアクリルアミドゲル電気泳動法〔エイ・
エム・マキサム（Ａ９Ｍ、 Ｍａｘａｍ） ら；プロ
シーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オ
ブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、）、 ［ＩＳＡ ７４． ５６０（１
９７７） 〕などによって行う。
ＤＮＡ断片の結合反応は、２〜２ｏＯｍＭ（好ましくは
１０〜４０ｍＭ）のＴｒｉｓ−ＨＣｐ（ｐ Ｈ６，１〜
９．５、好ましくハｐＨ７，０−８，０）、２〜２０ｍ
Ｍ（好ましくは５〜１０ｍＭ）のＭｇＣβ２．０．１．
−１０ｍＭ （好ましくは０．５〜２、０ ｍ Ｍ ）
のＡＴＰ、１〜５０ｍＭ （好ましくは５〜１０ｍＭ）
のジチオスレイトールを含む反応液中で、Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼ０．３〜１０単位を用い、１〜３７℃（好ましく
は３〜２０℃）で１５分間〜７２時間（好ましくは２〜
２０時間）行う。
１０〜４０ｍＭ）のＴｒｉｓ−ＨＣｐ（ｐ Ｈ６，１〜
９．５、好ましくハｐＨ７，０−８，０）、２〜２０ｍ
Ｍ（好ましくは５〜１０ｍＭ）のＭｇＣβ２．０．１．
−１０ｍＭ （好ましくは０．５〜２、０ ｍ Ｍ ）
のＡＴＰ、１〜５０ｍＭ （好ましくは５〜１０ｍＭ）
のジチオスレイトールを含む反応液中で、Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼ０．３〜１０単位を用い、１〜３７℃（好ましく
は３〜２０℃）で１５分間〜７２時間（好ましくは２〜
２０時間）行う。
結合反応によって生じた組換え体プラスミドＤＮＡは、
必要によりコーエンらの形質転換法〔ニス・エヌ・コー
エン（Ｓ、 Ｎ、Ｃｏｈｅｎ） ら：プロシーディン
グ・オブ・ザ・ナショナル・アヵデミイ・オブ・サイエ
ンス（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、
）。
必要によりコーエンらの形質転換法〔ニス・エヌ・コー
エン（Ｓ、 Ｎ、Ｃｏｈｅｎ） ら：プロシーディン
グ・オブ・ザ・ナショナル・アヵデミイ・オブ・サイエ
ンス（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、
）。
［ＩＳＡ ６９．２１１０ （１９７２） ）によって
、大腸菌に導入する。
、大腸菌に導入する。
組換え体プラスミドＤＮＡを持つ大腸菌から該ＤＮＡの
単離は、後に述べる実施例１に示した方法あるいはバー
ンボイムらの方法〔エイチ・シー・バーンボイム（Ｉｔ
、 Ｃ９Ｂｉｒｎｂｏｉｍ）ら：ヌクレイックーアシッ
ド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ
、）７、１５１３ （１９７９））などを用いて行う。
単離は、後に述べる実施例１に示した方法あるいはバー
ンボイムらの方法〔エイチ・シー・バーンボイム（Ｉｔ
、 Ｃ９Ｂｉｒｎｂｏｉｍ）ら：ヌクレイックーアシッ
ド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ
、）７、１５１３ （１９７９））などを用いて行う。
プラスミドＤＮＡを１〜１０種類の制限酵素で消化後ア
ガロースゲル電気泳動あるいはポリアクリルアミドゲル
電気泳動により切断部位を調べる。
ガロースゲル電気泳動あるいはポリアクリルアミドゲル
電気泳動により切断部位を調べる。
さらにＤＮＡの塩基配列を決定する必要があるときはマ
キザム・ギルバート法〔プロシーディング・オブ・ザ・
ナショナル・アヵデミイ・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ
、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）、 ７４．５６
０（１９７７） 〕によって決定する。
キザム・ギルバート法〔プロシーディング・オブ・ザ・
ナショナル・アヵデミイ・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ
、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）、 ７４．５６
０（１９７７） 〕によって決定する。
以上のような条件で組換え体プラスミドＤＮＡを製造す
ることができる。
ることができる。
本発明のＩＬ−２ポリペプチド誘導体は以下のとおりに
製造できる。
製造できる。
すなわち、プラスミド（例えばｐＩＬＹ４９）を用いて
大腸菌に−１２ＨＢ１（１１を形質転換させ、アンピシ
リン耐性（ＡｐＲ以下同じ）のコロニーの中からｐＩＬ
Ｙ４９を有する大腸菌を選びだす。ｐＩＬＹ４９を有す
る大腸菌を培地に培養することにより培養物中にＩＩ、
２ポリペプチド誘導体を生成させることができる。
大腸菌に−１２ＨＢ１（１１を形質転換させ、アンピシ
リン耐性（ＡｐＲ以下同じ）のコロニーの中からｐＩＬ
Ｙ４９を有する大腸菌を選びだす。ｐＩＬＹ４９を有す
る大腸菌を培地に培養することにより培養物中にＩＩ、
２ポリペプチド誘導体を生成させることができる。
ここで用いる培地としては大腸菌の生育ならびに丁Ｌ
−２ポリペプチド誘導体の生産に好適なものならば合成
培地、天然培地のいずれも使用できる。
−２ポリペプチド誘導体の生産に好適なものならば合成
培地、天然培地のいずれも使用できる。
炭素源としては、グルコース、フラクトース、ラクトー
ス、グリセロール、マンニトール、ソルビトールなどが
、窒素源としては、ＮＨ，Ｃβ、（Ｎ Ｈ４）２ Ｓ
０４ 、カザミノ酸、酵母エキス、ポリペプトン、肉エ
キス、バタトトリプトン、コーン・ステイープ・リカー
などが、その他の栄養源としてはに、ＨＰ○、 、ＫＨ
２Ｐ○、 、Ｎａ（１、ＭｇＳＯ４、ビタミンＢ＋ 、
ＭｇＣβ２などが使用できる。
ス、グリセロール、マンニトール、ソルビトールなどが
、窒素源としては、ＮＨ，Ｃβ、（Ｎ Ｈ４）２ Ｓ
０４ 、カザミノ酸、酵母エキス、ポリペプトン、肉エ
キス、バタトトリプトン、コーン・ステイープ・リカー
などが、その他の栄養源としてはに、ＨＰ○、 、ＫＨ
２Ｐ○、 、Ｎａ（１、ＭｇＳＯ４、ビタミンＢ＋ 、
ＭｇＣβ２などが使用できる。
培養はｐ Ｈ５，５〜８．５、温度１８〜４０℃で通気
攪拌培養により行われる。培養５〜９０時間で培養菌体
中にヒ）ＩＬ−２ポリペプチド誘導体が蓄積するので、
培養物から菌体を集菌し、菌体を超音波処理により破砕
し、遠心して得られる菌体残渣を得る。この菌体残渣か
らマーストンらの方法ＣＦ、Ａ、０．Ｍａｒｓｔｏｎ
ｅｔ ａｌ、、 ： ＢＩＯ／ＴＢＣＨＮＯＬＯＧＹ
２゜８（１５）（１９８４） ）により１１．−２ポリ
ペプチド誘導体を抽出・精製・可溶化・再生し、ギリス
らの方法〔ニス・ギリス（Ｓ、Ｇ１１ｌｉｓ）ら：ジャ
ーナル・オブ゛イムノロシイ（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、）
１２０．２０２７（１９７８）：］に従ってヒト■Ｌ
−２誘導体の定量を行う。
攪拌培養により行われる。培養５〜９０時間で培養菌体
中にヒ）ＩＬ−２ポリペプチド誘導体が蓄積するので、
培養物から菌体を集菌し、菌体を超音波処理により破砕
し、遠心して得られる菌体残渣を得る。この菌体残渣か
らマーストンらの方法ＣＦ、Ａ、０．Ｍａｒｓｔｏｎ
ｅｔ ａｌ、、 ： ＢＩＯ／ＴＢＣＨＮＯＬＯＧＹ
２゜８（１５）（１９８４） ）により１１．−２ポリ
ペプチド誘導体を抽出・精製・可溶化・再生し、ギリス
らの方法〔ニス・ギリス（Ｓ、Ｇ１１ｌｉｓ）ら：ジャ
ーナル・オブ゛イムノロシイ（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、）
１２０．２０２７（１９７８）：］に従ってヒト■Ｌ
−２誘導体の定量を行う。
以下に本発明の実施例を示す。
実施例１゜
ＩＬ−２遺伝子の下流にＢａｍＨＩ断片部位を有するプ
ラスミドｐＩＬＡ１の造成ニ ブラスミドｐＨｌＧ５−３ （３，５Ｋｂ）２μｇを２
０ｍＭ Ｔｒ ｉ ５−ＨＣＪ！ （ｐＨ７，５）、
１０ｍＭ ＭｇＣｌ２．１０ｍＭジチオスレイトール
および５０ｍＭ ＮａＣｊ！を含む全量５（１μ＆の
溶液（以下”Ｙ−５０緩衝液″と略記する）に溶かし、
制限酵素Ｐｖｕ、［（全酒造社製、以下制限酵素につい
ては特記しない限りすべて全酒造社製）４単位を加えて
、３７℃で２時間消化反応を行った。反応物からＬＧＴ
法により約３．５ Ｋ ｂのｐＨｌＧ５−３断片１尾を
得た。このＤＮＡｌｌｉ片０．１μｇを５ピコモル（ｐ
ｍｏｌｅ）の５′−リン酸化１３ａｍＨＩリンカ−（５
′−ｐＣＣＧＧＡＴ’ＣＣＧ（、−３’；コラポレイテ
ィブ社製）の存在下２０ｍＭＴｒ ｉ’５−ＨＣｊ！
（ｐＨ７，６）、１０ｍＭＭｇＣｊ！２．１０ｍＭジチ
オスレイトールおよび１ｍＭ ＡＴＰを含む緩衝液（
以下この緩衝液を゛’Ｔ４１Ｊガーゼ緩衝液″と略記す
る）２０μＱ中２単位のＴ４１Ｊガーゼ（宝酒造社製二
以下同じ）を加え、４℃１８時間反応を行った。このよ
うにして得た組換え体プラスミドＤＮＡを用い、大腸菌
８８１（１１株〔ポリバー（Ｂｏｌｉｖｅｒ） ら；
ジー７ （Ｇｅｎｅ） ２．７５（１９７７）） ヲ
コーエンらの方法〔ニス・エヌ・コーエン（Ｓ、 Ｎ、
Ｃｏｈｅｎ） ら：プロシーディング・オブ・ザ・ナシ
ョナル・アカデミイ・オブ・ザイエンス（Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、） ＬＩ
Ｓ八、６９． ２１１０ （１９７２） ：］（以
下大腸菌の形質転換にはこの方法を用いる）により形質
転換し、ＡｐＲのコロニーを得た。この形質転換株より
プラスミド ＤＮＡを公知の方法〔エイチ・シー・バー
ンボイム（Ｉｔ、 Ｃ，Ｂｉｒｎｂｏｉｍ）ら；ヌクレ
イツク・了ジッド・リザーチ（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓ、）、７．１５１３ （１９７９）〕（以下
プラスミドＤＮＡの分離はこの方法を用いる）に従って
分離精製し、該プラスミドＤＮＡをＢａｍＨＩ等の制限
酵素で消化することによりプラスミドの構造解析を行っ
た。ｐＨｌＧ５−３のＰｖｕｎ部位にＢａｍＨＩＩＪン
カーが挿入された組換え体プラスミドが得られたことを
確認した。この組換え体プラスミドをｐＩＬＡｌとよぶ
。
ラスミドｐＩＬＡ１の造成ニ ブラスミドｐＨｌＧ５−３ （３，５Ｋｂ）２μｇを２
０ｍＭ Ｔｒ ｉ ５−ＨＣＪ！ （ｐＨ７，５）、
１０ｍＭ ＭｇＣｌ２．１０ｍＭジチオスレイトール
および５０ｍＭ ＮａＣｊ！を含む全量５（１μ＆の
溶液（以下”Ｙ−５０緩衝液″と略記する）に溶かし、
制限酵素Ｐｖｕ、［（全酒造社製、以下制限酵素につい
ては特記しない限りすべて全酒造社製）４単位を加えて
、３７℃で２時間消化反応を行った。反応物からＬＧＴ
法により約３．５ Ｋ ｂのｐＨｌＧ５−３断片１尾を
得た。このＤＮＡｌｌｉ片０．１μｇを５ピコモル（ｐ
ｍｏｌｅ）の５′−リン酸化１３ａｍＨＩリンカ−（５
′−ｐＣＣＧＧＡＴ’ＣＣＧ（、−３’；コラポレイテ
ィブ社製）の存在下２０ｍＭＴｒ ｉ’５−ＨＣｊ！
（ｐＨ７，６）、１０ｍＭＭｇＣｊ！２．１０ｍＭジチ
オスレイトールおよび１ｍＭ ＡＴＰを含む緩衝液（
以下この緩衝液を゛’Ｔ４１Ｊガーゼ緩衝液″と略記す
る）２０μＱ中２単位のＴ４１Ｊガーゼ（宝酒造社製二
以下同じ）を加え、４℃１８時間反応を行った。このよ
うにして得た組換え体プラスミドＤＮＡを用い、大腸菌
８８１（１１株〔ポリバー（Ｂｏｌｉｖｅｒ） ら；
ジー７ （Ｇｅｎｅ） ２．７５（１９７７）） ヲ
コーエンらの方法〔ニス・エヌ・コーエン（Ｓ、 Ｎ、
Ｃｏｈｅｎ） ら：プロシーディング・オブ・ザ・ナシ
ョナル・アカデミイ・オブ・ザイエンス（Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、） ＬＩ
Ｓ八、６９． ２１１０ （１９７２） ：］（以
下大腸菌の形質転換にはこの方法を用いる）により形質
転換し、ＡｐＲのコロニーを得た。この形質転換株より
プラスミド ＤＮＡを公知の方法〔エイチ・シー・バー
ンボイム（Ｉｔ、 Ｃ，Ｂｉｒｎｂｏｉｍ）ら；ヌクレ
イツク・了ジッド・リザーチ（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓ、）、７．１５１３ （１９７９）〕（以下
プラスミドＤＮＡの分離はこの方法を用いる）に従って
分離精製し、該プラスミドＤＮＡをＢａｍＨＩ等の制限
酵素で消化することによりプラスミドの構造解析を行っ
た。ｐＨｌＧ５−３のＰｖｕｎ部位にＢａｍＨＩＩＪン
カーが挿入された組換え体プラスミドが得られたことを
確認した。この組換え体プラスミドをｐＩＬＡｌとよぶ
。
実施例２゜
ＩＬ−２発現プラスミドｐｌＬＪ２の造成：実施例１に
より得られたｐＩＬＡｌをもつ大腸菌ＨＢＩＯＩ菌株を
培養し、培養菌体から常法によりｐｌＬＡＩＤＮＡを調
製した。得られたｐｉＬＡＩＤＮＡ １０μｇを２０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ Ｈ７，５）、１０ｍＭ
ＭｇＣβ２．１０ｍＭジチオスレイトールおよび１
５［］ｍＭＮａＣβを含む全量５０μｇの溶液に溶かし
、制限酵素Ｈｇ１ＡＩ［：ニュー・イングランド・バイ
オ・ラプス（Ｎｅｗ Ｂｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ
）社製〕 １０単位を加え、３７℃で４時間切断反応を
行った。フェノール抽出、クロロホルム抽出の後、エタ
ノール沈殿により、ＤＮＡ断片９μｇを回収した。この
ＤＮＡ断片を５０ｍＭ Ｔｒ ｉ ５−ＨＣＩ！ （
ｐＨ７，８＞７ｍＭ ＭｇＣＬおよび６ｍＭメルカプ
トエタノールを含む溶液に溶かし、ｄΔＴＰ、ｄＴＴＰ
、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰそれぞれ１ｍＭになるように加え
、さらに４単位のクレノー断片（宝酒造社製、以下同じ
）を加えて、室温で１時間反応させ、突出末端を削った
。フェノール抽出、クロロホルム抽出後、エタノール沈
殿により、ＤＮＡ断片８Ｊ１ｇを回収した。該ＤＮＡ断
片を全量４０μｇの２０ｍＭＴｒ ｉ ５−ＨＣｊ２
（ｐＨ７，５）、１０ｍＭＭｇＣ１２，１０ｍＭジチオ
スレイトールおよび１（１５）ｍＭ ＮａＣＪ！（以
下”Ｙ−１（１５）緩衝液″と略記する）を含む溶液に
溶かし、１０単位のＢａｍＨＩを加え、３７℃で２時間
切断反応を行った。この反応液からＬＧＴ法により、ヒ
トＩＬ−２ＤＮＡの大部分を含む約７６０ｂｐのＤＮＡ
断片（Ｈｇｉ八Ｉへクレノー断片−ＢａｍＨＩ断片）約
０．５μｇを得た。
より得られたｐＩＬＡｌをもつ大腸菌ＨＢＩＯＩ菌株を
培養し、培養菌体から常法によりｐｌＬＡＩＤＮＡを調
製した。得られたｐｉＬＡＩＤＮＡ １０μｇを２０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ Ｈ７，５）、１０ｍＭ
ＭｇＣβ２．１０ｍＭジチオスレイトールおよび１
５［］ｍＭＮａＣβを含む全量５０μｇの溶液に溶かし
、制限酵素Ｈｇ１ＡＩ［：ニュー・イングランド・バイ
オ・ラプス（Ｎｅｗ Ｂｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ
）社製〕 １０単位を加え、３７℃で４時間切断反応を
行った。フェノール抽出、クロロホルム抽出の後、エタ
ノール沈殿により、ＤＮＡ断片９μｇを回収した。この
ＤＮＡ断片を５０ｍＭ Ｔｒ ｉ ５−ＨＣＩ！ （
ｐＨ７，８＞７ｍＭ ＭｇＣＬおよび６ｍＭメルカプ
トエタノールを含む溶液に溶かし、ｄΔＴＰ、ｄＴＴＰ
、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰそれぞれ１ｍＭになるように加え
、さらに４単位のクレノー断片（宝酒造社製、以下同じ
）を加えて、室温で１時間反応させ、突出末端を削った
。フェノール抽出、クロロホルム抽出後、エタノール沈
殿により、ＤＮＡ断片８Ｊ１ｇを回収した。該ＤＮＡ断
片を全量４０μｇの２０ｍＭＴｒ ｉ ５−ＨＣｊ２
（ｐＨ７，５）、１０ｍＭＭｇＣ１２，１０ｍＭジチオ
スレイトールおよび１（１５）ｍＭ ＮａＣＪ！（以
下”Ｙ−１（１５）緩衝液″と略記する）を含む溶液に
溶かし、１０単位のＢａｍＨＩを加え、３７℃で２時間
切断反応を行った。この反応液からＬＧＴ法により、ヒ
トＩＬ−２ＤＮＡの大部分を含む約７６０ｂｐのＤＮＡ
断片（Ｈｇｉ八Ｉへクレノー断片−ＢａｍＨＩ断片）約
０．５μｇを得た。
別に、特開昭５８−１１０６（１５）公報記載の方法で
調製したｐＫＹＰｌｏの３μｇをＹ−１（１５）緩衝液
５０μｇに溶かし、制限酵素ＢａｍＨＩとＢａｎ１ｌ
（東洋紡績社製）それぞれ５単位ずつ加え、３７℃で４
時間切断反応を行った。この反応液からＬＧＴ法により
トリプトファンプロモーター（Ｐｔｒｐ）を含む約４．
３ｋＭ）ＤＮＡ断片約１．８μｇを得た。
調製したｐＫＹＰｌｏの３μｇをＹ−１（１５）緩衝液
５０μｇに溶かし、制限酵素ＢａｍＨＩとＢａｎ１ｌ
（東洋紡績社製）それぞれ５単位ずつ加え、３７℃で４
時間切断反応を行った。この反応液からＬＧＴ法により
トリプトファンプロモーター（Ｐｔｒｐ）を含む約４．
３ｋＭ）ＤＮＡ断片約１．８μｇを得た。
一方、成熟ヒ）ＩＬ−２ポリペプチドのＮ末端であるア
ラニン（Ｃ，ＣＡ）と、発現に必要な開始コドン（ＡＴ
Ｃ）を付与する必要があること、またＰｔｒｐの下流の
ＳＤ−配列とＡＴＣとの距離は、６〜１８ｂｐの間の適
当な長さにする必要があることなどの理由から、下記の
ＤＮＡ！Ｊンカーを合成した。
ラニン（Ｃ，ＣＡ）と、発現に必要な開始コドン（ＡＴ
Ｃ）を付与する必要があること、またＰｔｒｐの下流の
ＳＤ−配列とＡＴＣとの距離は、６〜１８ｂｐの間の適
当な長さにする必要があることなどの理由から、下記の
ＤＮＡ！Ｊンカーを合成した。
まず一本鎖Ｄ Ｎ Ａ 、 １１３−ｍａｒとｌ ４−
ｍａｒを通常のトリエステル法〔アールク・レア（Ｒ９
Ｃｒｅａ） ら：プロシーディング・オブ・ザ・ナシ
ョナル・アカデミイ・オブ・サイｘンス（Ｐｒｏｃ、Ｎ
ａｔｌ、 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）。
ｍａｒを通常のトリエステル法〔アールク・レア（Ｒ９
Ｃｒｅａ） ら：プロシーディング・オブ・ザ・ナシ
ョナル・アカデミイ・オブ・サイｘンス（Ｐｒｏｃ、Ｎ
ａｔｌ、 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）。
乃、 ５７６５（１９７８））により合成した。１５−
ｍｅｒおよび１４−ｍｅｒの各々２ｍを５０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｊ！（ｐＨ７，５）、１０ｍＭ ＭｇＣ
Ｃ，５ｍＭジチオスレイトール、Ｏ，ＬｍＭ ＥＤＴ
Ａおよび１ｍＭ ＡＴＰを含む全量４０μＱの溶液に
とかし、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ３０単位（宝酒
造社製）を加えて、３７℃で６０分間リン酸化反応を行
った。
ｍｅｒおよび１４−ｍｅｒの各々２ｍを５０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｊ！（ｐＨ７，５）、１０ｍＭ ＭｇＣ
Ｃ，５ｍＭジチオスレイトール、Ｏ，ＬｍＭ ＥＤＴ
Ａおよび１ｍＭ ＡＴＰを含む全量４０μＱの溶液に
とかし、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ３０単位（宝酒
造社製）を加えて、３７℃で６０分間リン酸化反応を行
った。
次に上記で得たｐＩＬＡ１由来のＨｇ１ＡＩ−クレノー
断片−ＢａｍＨＩ断片（約７６Ｑｂｐ）０．４Ｉｔｇと
発現ベクターｐＫＹＰ １０のＢａｎｌｎ−ＢａｍＨＩ
断片（約４．３ｋｂ）１．０ｇとをＴ４リガーゼ緩衝液
２５μＱに溶かし、この混合液に上記ＤＮＡ リンカ−
を約０，１尾加えた。この混合溶液にさらにＴ ４ Ｄ
ＮＡ ！Ｊガーゼ６単位を加え、４℃で１８時間結合反
応を行った。
断片−ＢａｍＨＩ断片（約７６Ｑｂｐ）０．４Ｉｔｇと
発現ベクターｐＫＹＰ １０のＢａｎｌｎ−ＢａｍＨＩ
断片（約４．３ｋｂ）１．０ｇとをＴ４リガーゼ緩衝液
２５μＱに溶かし、この混合液に上記ＤＮＡ リンカ−
を約０，１尾加えた。この混合溶液にさらにＴ ４ Ｄ
ＮＡ ！Ｊガーゼ６単位を加え、４℃で１８時間結合反
応を行った。
得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて大腸菌Ｈ
ＢＩＯＩ株を形質転換し、Ａｐｌのコロニーを得た。こ
のコロニーの培養菌体からプラスミドＤＮＡを回収した
。得られたプラスミドの構造はＥｃｏＲＩＳＢａｎＩ［
Ｉ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩで切断後、アガロース
ゲル電気泳動により確認した。このプラスミドをｐＩＬ
Ｊ２とよぶ。ｐＩＬＪ２のＢａｎｍ、ＨｉｎｄｌＩ付近
の塩基配列は下記のとおり であることをマキサム・ギルバートの方法［ＡｌＭ。
ＢＩＯＩ株を形質転換し、Ａｐｌのコロニーを得た。こ
のコロニーの培養菌体からプラスミドＤＮＡを回収した
。得られたプラスミドの構造はＥｃｏＲＩＳＢａｎＩ［
Ｉ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩで切断後、アガロース
ゲル電気泳動により確認した。このプラスミドをｐＩＬ
Ｊ２とよぶ。ｐＩＬＪ２のＢａｎｍ、ＨｉｎｄｌＩ付近
の塩基配列は下記のとおり であることをマキサム・ギルバートの方法［ＡｌＭ。
Ｍａｘａｍ ら ： Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、
八ｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ、、 ７４゜５６０
（１９７７））で確認した。
八ｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ、、 ７４゜５６０
（１９７７））で確認した。
実施例３゜
ヒ）ＩＬ−２の末端部分を欠失したポリペプチドをコー
ドするプラスミドｐＩＬＹ４９、ｐＩＬＹ５３、ｐＩＬ
Ｙ３７、ｐＩＬＹ１０６の造成；実施例２の方法によっ
て得たｐＩＬＪ２（約５．１ｋｂ）２５ｇをＹ−１（１
５）緩衝液４（１５）μｆｆに溶かし、５０単位の）ｌ
ｉｎｄｌｌｌを加え、３７℃で３時間反応を行った。こ
の反応液８０μＱ （ＤＮＡとして５■を含む）に１０
倍濃度のＢΔＬ３１緩衝液Ｃ１（１５）ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８，１）、３Ｍ Ｎａ（１，６０ｍ
Ｍ ＣａＣｊｌ！２．６０ｍＭ ＭｇＣｌ２２．５
ｍＭ ＥＤＴＡＩＩを２４ｕＱ。
ドするプラスミドｐＩＬＹ４９、ｐＩＬＹ５３、ｐＩＬ
Ｙ３７、ｐＩＬＹ１０６の造成；実施例２の方法によっ
て得たｐＩＬＪ２（約５．１ｋｂ）２５ｇをＹ−１（１
５）緩衝液４（１５）μｆｆに溶かし、５０単位の）ｌ
ｉｎｄｌｌｌを加え、３７℃で３時間反応を行った。こ
の反応液８０μＱ （ＤＮＡとして５■を含む）に１０
倍濃度のＢΔＬ３１緩衝液Ｃ１（１５）ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８，１）、３Ｍ Ｎａ（１，６０ｍ
Ｍ ＣａＣｊｌ！２．６０ｍＭ ＭｇＣｌ２２．５
ｍＭ ＥＤＴＡＩＩを２４ｕＱ。
水を１６μｇ加え、さらにヌクレアーゼＢＡＬ３１〔ベ
セスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（ＢＲＬ）社製〕０
．２５単位を加えて、３０℃で１分間反応を行った。ヌ
クレアーゼＢＡＬ３１はＤＮＡ分子を末端から削ってゆ
く活性（エキソヌクレアーゼ活性）を有し、上記用いた
反応条件はＨｉｎｄ■部位から約３０塩基対削れる条件
である。この反応液をフェノール抽出、クロロホルム抽
出後エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。回収した
ｐＩＬＪ２−ＨｉｎｄｌＩＩ−ＢＡＬ３１分解断片１．
０ｇｇを２０μａのＹ−１（１５）緩衝液に溶かし、２
単位のＰｓｔＩを加え、３７℃で２時間切断反応を行っ
た。この反応液からＬＧＴ法により、約４．ＯＫｂのＤ
ＮＡ断片（ｐＩＬＪ２−ＨｉｎｄＩＩＩ −ＢＡＬ３１
−ＰｓｔＩ断片）０．５絹を回収した。
セスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（ＢＲＬ）社製〕０
．２５単位を加えて、３０℃で１分間反応を行った。ヌ
クレアーゼＢＡＬ３１はＤＮＡ分子を末端から削ってゆ
く活性（エキソヌクレアーゼ活性）を有し、上記用いた
反応条件はＨｉｎｄ■部位から約３０塩基対削れる条件
である。この反応液をフェノール抽出、クロロホルム抽
出後エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。回収した
ｐＩＬＪ２−ＨｉｎｄｌＩＩ−ＢＡＬ３１分解断片１．
０ｇｇを２０μａのＹ−１（１５）緩衝液に溶かし、２
単位のＰｓｔＩを加え、３７℃で２時間切断反応を行っ
た。この反応液からＬＧＴ法により、約４．ＯＫｂのＤ
ＮＡ断片（ｐＩＬＪ２−ＨｉｎｄＩＩＩ −ＢＡＬ３１
−ＰｓｔＩ断片）０．５絹を回収した。
次に、ＡＴＧ・発現ベクターｐＴｒＳ３（３，８ｋｂ）
ｇ、０尾を８０ｇｇのＹ−５０緩衝液に溶かし、１５単
位の５ｐｈＩ （ＢＲＬ社製）を加え、３７℃で３時間
切断反応を行った。この反応液からＬＧＴ法により３．
８ Ｋ ｂのＤＮＡ断片５．０縄を精製、回収した。こ
の３．８ Ｋ ｂのＤＮＡ断片５．０ｇを５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−Ｈ（、ｊ！ （ｐＨ７，８）、７ｍＭ Ｍ
ｇＣβ２および６ｍＭメルカプトエタノールを含む溶液
に溶かし、ｄＡＴＰＸｄＴＴＰ。
ｇ、０尾を８０ｇｇのＹ−５０緩衝液に溶かし、１５単
位の５ｐｈＩ （ＢＲＬ社製）を加え、３７℃で３時間
切断反応を行った。この反応液からＬＧＴ法により３．
８ Ｋ ｂのＤＮＡ断片５．０縄を精製、回収した。こ
の３．８ Ｋ ｂのＤＮＡ断片５．０ｇを５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−Ｈ（、ｊ！ （ｐＨ７，８）、７ｍＭ Ｍ
ｇＣβ２および６ｍＭメルカプトエタノールを含む溶液
に溶かし、ｄＡＴＰＸｄＴＴＰ。
ｄＣＴＰ、ｄ、ＧＴＰそれぞれ１ｍＭになるように加え
、さらに５単位のクレノー断片を加えて、室温で１時間
反応させ、突出末端を削った。フェノール抽出、クロロ
ホルム抽出の後、エタノール沈殿により、ＤＮＡ断片３
．０尾を回収した。該ＤＮＡ断片３．０μｇを全量３０
μρのＹ−１（１５）緩衝液に溶かし、５単位のＰｓｔ
Ｉを加え、３７℃で３時間切断反応を行った。この反応
液からＬＧＴ法によりＰｔｒｐを含む約８８０ ｂ ｐ
のＤＮＡ断片（ｐＴｒＳ３−３ｐｈｌ−クレノー断片−
Ｐｓｔｌ断片）０．５μｇを回収した。
、さらに５単位のクレノー断片を加えて、室温で１時間
反応させ、突出末端を削った。フェノール抽出、クロロ
ホルム抽出の後、エタノール沈殿により、ＤＮＡ断片３
．０尾を回収した。該ＤＮＡ断片３．０μｇを全量３０
μρのＹ−１（１５）緩衝液に溶かし、５単位のＰｓｔ
Ｉを加え、３７℃で３時間切断反応を行った。この反応
液からＬＧＴ法によりＰｔｒｐを含む約８８０ ｂ ｐ
のＤＮＡ断片（ｐＴｒＳ３−３ｐｈｌ−クレノー断片−
Ｐｓｔｌ断片）０．５μｇを回収した。
次に上記で得た、ｐＩＬＪ２−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢＡＬ
３１−Ｐｓ ｔ Ｉ断片（約４． ＯＫ ｂ ） ０．
５鴻とｐＴｒＳ３−３ｐｈ Ｉ−クレノー断片−Ｐｓｔ
Ｉ断片（８８０ｂｐ） ０．５ｃ＋ｇを全量２０μｐの
Ｔ４リガーゼ緩衝液に溶かしＴ４ＤＮΔリガーゼ０，３
単位を加え、４℃で１８時間結合反応を行った。
３１−Ｐｓ ｔ Ｉ断片（約４． ＯＫ ｂ ） ０．
５鴻とｐＴｒＳ３−３ｐｈ Ｉ−クレノー断片−Ｐｓｔ
Ｉ断片（８８０ｂｐ） ０．５ｃ＋ｇを全量２０μｐの
Ｔ４リガーゼ緩衝液に溶かしＴ４ＤＮΔリガーゼ０，３
単位を加え、４℃で１８時間結合反応を行った。
得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて大腸菌Ｈ
８１（１１株を形質転換し、生じたＡｐｌのコロニーの
培養菌体からプラスミドＤＮＡを回収した。これらのプ
ラスミドを第３図に示したとおりｐＩＬＹ４９、ｐＩＬ
Ｙ５３、ｐ Ｉ ＬＹ８７、ｐＩＬＹ１０６とよぶ。こ
れらのプラスミドの構造は、Ｂａｎ■、ＢａｍＨＩ、Ｅ
ｃｏＲＩで切断後、アガロースゲル電気泳動法により確
認した。
８１（１１株を形質転換し、生じたＡｐｌのコロニーの
培養菌体からプラスミドＤＮＡを回収した。これらのプ
ラスミドを第３図に示したとおりｐＩＬＹ４９、ｐＩＬ
Ｙ５３、ｐ Ｉ ＬＹ８７、ｐＩＬＹ１０６とよぶ。こ
れらのプラスミドの構造は、Ｂａｎ■、ＢａｍＨＩ、Ｅ
ｃｏＲＩで切断後、アガロースゲル電気泳動法により確
認した。
上記プラスミド中のヒ）ＩＬｉ構造遺伝子のＮ末端付近
の配列はそれぞれ、 であることをマキサム・ギルバート法により確認した。
の配列はそれぞれ、 であることをマキサム・ギルバート法により確認した。
ｐＩＬＹ４９によりコードされるＩＬ−２ポリペプチド
誘導体〔本誘導体をＩＬ−２（△１−９）と呼ぶ〕は、
成熟型ヒ）ＩＬ−２ポリペプチドのＮ末端のＡｈａから
９番目のＬｙｓまで９個のアミノ酸が欠失し、１０番目
のＴｈｒから始まっていることが確認された。同様に、
ｐＩＬＹ５３によりコードされる■Ｌ−２ポリペプチド
誘導体〔本誘導体を■Ｌ−２（△１−５）と呼ぶ〕は、
Ｎ末端から５アミノ酸、ｐＩＬＹ８７によりコードされ
るＩＬ−２ポリペプチド誘導体〔本誘導体をＩＬＩ （
△１−８）と呼ぶ〕は、Ｎ末端から８アミノ酸、ｐＩＬ
Ｙ１０６によりコードされるＩＬ−２ポリペプチド誘導
体〔本誘導体を■Ｌ−２（△１−３）と呼ぶ〕は、Ｎ末
端から３アミノ酸が欠失していることが確言忍された。
誘導体〔本誘導体をＩＬ−２（△１−９）と呼ぶ〕は、
成熟型ヒ）ＩＬ−２ポリペプチドのＮ末端のＡｈａから
９番目のＬｙｓまで９個のアミノ酸が欠失し、１０番目
のＴｈｒから始まっていることが確認された。同様に、
ｐＩＬＹ５３によりコードされる■Ｌ−２ポリペプチド
誘導体〔本誘導体を■Ｌ−２（△１−５）と呼ぶ〕は、
Ｎ末端から５アミノ酸、ｐＩＬＹ８７によりコードされ
るＩＬ−２ポリペプチド誘導体〔本誘導体をＩＬＩ （
△１−８）と呼ぶ〕は、Ｎ末端から８アミノ酸、ｐＩＬ
Ｙ１０６によりコードされるＩＬ−２ポリペプチド誘導
体〔本誘導体を■Ｌ−２（△１−３）と呼ぶ〕は、Ｎ末
端から３アミノ酸が欠失していることが確言忍された。
実施例４゜
ｐｌＬＪ２、ｐＴＬＹ４９、ｐＩＬＹ５３、ｐＩＬＹ３
７、ｐＴＬＹ１０６を保有する大腸菌によるＩＬＩ誘導
体の生産： 実施例２および３で得た組換え体プラスミドｐｌＬＪ２
、ｐＩＬＹ４９、ｐＩＬＹ５３、ｐＩＬＹ３７およびｐ
ＴＬＹ１０６をもつ大腸菌８８１（１１株（それぞれを
ＥＩＬＪ２、ＥＩＬＹ４９、ＥＩＬＹ５３およびＥＩＬ
Ｙ１０６と呼ぶ）をＬＧ培地〔トリプトン１０ｇ、酵母
エキス５ｇ、ＮａＣ，１２５ｇ、グルコース２ｇを水１
ｐにとかしＮａＯＨにてｐＨを７．０とする。〕で３７
℃、１８時間培養し、この培養液Ｑ、５ｍｌをｌ Ｑｍ
ｌのＭＣＧ培地［Ｎａ２ＨＰＯ４０，６％、Ｋ Ｈ４Ｆ
Ｏ４０，３％、ＮａＣｊ２ ０．５％、カザミノ酸０
．５％、Ｍ ｇ Ｓ Ｏａ １ ｍ Ｍ、ビタミ７Ｂ
＋ ４μｇ／ｍｌ、ｐＨ７，２〕に接種し、３０℃で
４〜８時間培養後、トリプトファンの誘導物質である３
β−インドールアクリル酸（３β−１ｎｄｏｌｙｌａｃ
ｒｙｌｉｃ ａｃｉｄ、 以下■ΔＡと略す）を１０
鴻／ｍｌ加え、さらに２〜１２時間培養を続けた。培養
液を８，（１５）０ｒｐｍ、１０分間遠心して集菌し、
３０ｍＭ ＮａＣβ、３０ｍＭ Ｔｒ ｉ ５−Ｈ
Ｃｊ！ （Ｔ：１８７．５）緩衝液で洗浄した。洗浄菌
体を上記緩衝液３ｍｌに懸濁し、０℃で超音波破砕（Ｂ
ＲＡＮＳＯＮ ５ＯＮＩＣＰＯ畦ＲＣＯＭＰＡＮＹ社５
ＯＮＩＦＩＥＲＣＢＬＬ ＤＩＳＲＩＩＰＴＯＲ２（１
５），０ＵＴＰＵＴ Ｃ０ＮＴＲ０Ｌ ２゜１０分間処
理）した。これを１５．（１５）Ｏｒ ｐ ｍ、 ３０
分間遠心して菌体残渣を得た。この菌体残渣からマート
ンらの方法［Ｆ、Ａ、Ｏ，Ｍａｒｔｏｎ ら： ＢＩＯ
／ＴＩＥＣＨ−ＮＯ＋、口ＧＹ ２．８（１５） （１
９８４）） ニよりＩｔ、−２ポリペプチド誘導体を抽
出・精製・通常の方法で可溶化・再生し、ギリスらの方
法［：Ｓ、Ｇ１１ｌｉｓ ら： Ｊ、１ｍｍｕｎｏ］。
７、ｐＴＬＹ１０６を保有する大腸菌によるＩＬＩ誘導
体の生産： 実施例２および３で得た組換え体プラスミドｐｌＬＪ２
、ｐＩＬＹ４９、ｐＩＬＹ５３、ｐＩＬＹ３７およびｐ
ＴＬＹ１０６をもつ大腸菌８８１（１１株（それぞれを
ＥＩＬＪ２、ＥＩＬＹ４９、ＥＩＬＹ５３およびＥＩＬ
Ｙ１０６と呼ぶ）をＬＧ培地〔トリプトン１０ｇ、酵母
エキス５ｇ、ＮａＣ，１２５ｇ、グルコース２ｇを水１
ｐにとかしＮａＯＨにてｐＨを７．０とする。〕で３７
℃、１８時間培養し、この培養液Ｑ、５ｍｌをｌ Ｑｍ
ｌのＭＣＧ培地［Ｎａ２ＨＰＯ４０，６％、Ｋ Ｈ４Ｆ
Ｏ４０，３％、ＮａＣｊ２ ０．５％、カザミノ酸０
．５％、Ｍ ｇ Ｓ Ｏａ １ ｍ Ｍ、ビタミ７Ｂ
＋ ４μｇ／ｍｌ、ｐＨ７，２〕に接種し、３０℃で
４〜８時間培養後、トリプトファンの誘導物質である３
β−インドールアクリル酸（３β−１ｎｄｏｌｙｌａｃ
ｒｙｌｉｃ ａｃｉｄ、 以下■ΔＡと略す）を１０
鴻／ｍｌ加え、さらに２〜１２時間培養を続けた。培養
液を８，（１５）０ｒｐｍ、１０分間遠心して集菌し、
３０ｍＭ ＮａＣβ、３０ｍＭ Ｔｒ ｉ ５−Ｈ
Ｃｊ！ （Ｔ：１８７．５）緩衝液で洗浄した。洗浄菌
体を上記緩衝液３ｍｌに懸濁し、０℃で超音波破砕（Ｂ
ＲＡＮＳＯＮ ５ＯＮＩＣＰＯ畦ＲＣＯＭＰＡＮＹ社５
ＯＮＩＦＩＥＲＣＢＬＬ ＤＩＳＲＩＩＰＴＯＲ２（１
５），０ＵＴＰＵＴ Ｃ０ＮＴＲ０Ｌ ２゜１０分間処
理）した。これを１５．（１５）Ｏｒ ｐ ｍ、 ３０
分間遠心して菌体残渣を得た。この菌体残渣からマート
ンらの方法［Ｆ、Ａ、Ｏ，Ｍａｒｔｏｎ ら： ＢＩＯ
／ＴＩＥＣＨ−ＮＯ＋、口ＧＹ ２．８（１５） （１
９８４）） ニよりＩｔ、−２ポリペプチド誘導体を抽
出・精製・通常の方法で可溶化・再生し、ギリスらの方
法［：Ｓ、Ｇ１１ｌｉｓ ら： Ｊ、１ｍｍｕｎｏ］。
皿２０２７ （１９７８）：］に従ってヒトＴ Ｉ−−
２ポリペプチド誘導体の定量を行った。蛋白量の測定は
、日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ社プロティン・
アッセイキット（スタンダードアッセイ法）［：Ｍ、Ｍ
、Ｂｒａｄｆｏｒｄ ：Ａｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、
、 ７２．２４８（１９７６） ：］により行った。
２ポリペプチド誘導体の定量を行った。蛋白量の測定は
、日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ社プロティン・
アッセイキット（スタンダードアッセイ法）［：Ｍ、Ｍ
、Ｂｒａｄｆｏｒｄ ：Ａｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、
、 ７２．２４８（１９７６） ：］により行った。
結果を第１表に示す。
蛋白の回収方法
第１表
ＩＬ、Ｊ２ ｐｌＬＪ２ １Ｌ−２１（１５）ＩＬＹ
１０６ ｐＩＬＹ１０６ １Ｌ−２（△１−３）
１２５ＩＬＹ５３ ｐＩＬＹ５３ １Ｌ−２（△１−
５） １３（１１１、Ｙ８７ ｐ＋ＬＹ８７ Ｉ
Ｌ−２（△１−８） ６７ＩＬＹ４９
ｐＩＬＹ４９ １Ｌ−２（△１−９）
’ ４８＊ＩＬ−２インタクトの比活性を１
（１５）とし、相対比活性比を示した。
１０６ ｐＩＬＹ１０６ １Ｌ−２（△１−３）
１２５ＩＬＹ５３ ｐＩＬＹ５３ １Ｌ−２（△１−
５） １３（１１１、Ｙ８７ ｐ＋ＬＹ８７ Ｉ
Ｌ−２（△１−８） ６７ＩＬＹ４９
ｐＩＬＹ４９ １Ｌ−２（△１−９）
’ ４８＊ＩＬ−２インタクトの比活性を１
（１５）とし、相対比活性比を示した。
ＩＬＹ５３およびＩＬＹ１０６を含有する大腸菌菌株は
Ｂｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｅ Ｉ Ｌ Ｙ
５３ （ＦＥＲＭＢＰ−７４８）およびＥ Ｉ Ｌ Ｙ
１０６ （ＦＥＲＭ ＢＰ−７４７） として、それ
ぞれ工業技術院微生物工業技術研究所に昭和６０年３月
２６日付で寄託しである。
Ｂｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｅ Ｉ Ｌ Ｙ
５３ （ＦＥＲＭＢＰ−７４８）およびＥ Ｉ Ｌ Ｙ
１０６ （ＦＥＲＭ ＢＰ−７４７） として、それ
ぞれ工業技術院微生物工業技術研究所に昭和６０年３月
２６日付で寄託しである。
発明の効果
本発明によれば、天然のＩＬ−２よりもＩＬ−２活性の
高いポリペプチド誘導体を安価に大量に微生物により製
造することができる。
高いポリペプチド誘導体を安価に大量に微生物により製
造することができる。
第１図は、プラスミドｐＩＬＡ１の造成工程を示すフロ
ーシートである。 第２図は、プラスミドｐＩＬＪ２の造成工程を示すフロ
ーシートである。 第３図は、プラスミドｐＩＬＹ４９、ｐＩＬＹ５３、ｐ
ＩＬＹ８７およびｐＩＬＹ１０６の造成工程を示すフロ
ーシートである。 特許出願人（１０２）協和醗酵工業株式会社σｘ０ 寸 七 ト ｃ い− Ｎ 一 第３図 手続補正書 （自発） 昭和６０年５り／６日 昭和６０年特許願第６５５９９号 ２、発明の名称 新規ヒトインターロイキン２ポリペチド誘導体３、補正
をする者 事件との関係 特許出願人 郵便番号 １（１５） 住 所 東京都千代田区大手町−丁目６番１号名称
（１０２）協和醗酵工業株式会社（２）明細書第１５頁
１８行 ＩＰ、Ａ、Ｏ，Ｍａｒｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ、、 ：
ＢＩＤ／ＴＥＣＨＮ［］ＬＯＧＹ２、Ｊをｒエフ・ニー
・オー・マーストン（Ｆ、Ａ、 Ｏ。 ＭａｒＳｔＯｎ）ら：バイオ／チクノロシイ（ＢＩ［］
／ＴＢＣＨ−ＮＯＬＯＧＹ） ２． Ｊに訂正する。 （３）同書第１７頁２１行 ｒＨＢ１（１１菌株」をｒＨＢｌ−（１１株」に訂正す
る。 （４）同書第１９頁下から５行 「アールク・レア」を「アール・フレア」に訂正する。 （５）同書第２１頁下から１０行 「１（１５）倍濃」を「５倍濃度」に訂正する。 （６）同書第２６頁３〜４行 ［マートンらの方法［Ｆ、Ａ、Ｏ，Ｍａｒｔｏｎ ら：
ＢＩＯ／ＴＢＣＨＮＯＬＯＧＹ ２．８頭」を「マース
トンらの方法〔エフ・ニー・オー・マーストン（Ｆ、
Ａ、 Ｏ，Ｍａｒｓｔｏｎ）ら：バイオ／チクノロシイ
（ＢＩＤ／ＴＢＣＨＮＯＬＯＧＹ）２．８（１５）ｊに
訂正する。 （７）同書第２６頁５行 「抽出・精製・通常の方法で可溶化・再生」を「通常の
方法で抽出・精製・可溶化・再生」に訂正する。 （８）同書第２６頁６行 「Ｓ、Ｇ１１ｌｉｓら： Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、ｊを
「ニス・ギリス（Ｓ、 Ｇ１１ｌｉｓ） ら：ジャー
ナル・オブ・イムノロシイ（Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、）
Ｊに訂正する。 （９）同書第２６頁１１行 ｒＭ、Ｍ、 Ｂｒａｄｆｏｒｄ ： Ａｎａｌ、Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ、、 Ｊを「エム・エム・プラトフォード（Ｍ
、Ｍ、 Ｂｒａｄｆｏｒｄ） ：アナリティカル・バイ
オケミストシイ （八ｎａｌ。 Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、 」に訂正する。 σ■ 同書第２６頁１３行および第１表中「第１表」を
「第２表」に訂正する。 ０υ 同書第２６頁第１表中 ｒＩ ＬＪ ２ＪをｒＥＩＬＪ２Ｊに、ｒＩＬＹ１０６
」をｒＥＩＬＹ１０６Ｊに、ｒ Ｉ Ｌ’Ｙ５３」をｒ
Ｅ Ｉ ＬＹ５３Ｊに、ｒＩＬＹ８７ＪをｒＥＩＬＹ８
７Ｊに、ｒＩＬＹ４９ＪをｒＥＩＬＹ４９ｊにそれぞれ
訂正する。
ーシートである。 第２図は、プラスミドｐＩＬＪ２の造成工程を示すフロ
ーシートである。 第３図は、プラスミドｐＩＬＹ４９、ｐＩＬＹ５３、ｐ
ＩＬＹ８７およびｐＩＬＹ１０６の造成工程を示すフロ
ーシートである。 特許出願人（１０２）協和醗酵工業株式会社σｘ０ 寸 七 ト ｃ い− Ｎ 一 第３図 手続補正書 （自発） 昭和６０年５り／６日 昭和６０年特許願第６５５９９号 ２、発明の名称 新規ヒトインターロイキン２ポリペチド誘導体３、補正
をする者 事件との関係 特許出願人 郵便番号 １（１５） 住 所 東京都千代田区大手町−丁目６番１号名称
（１０２）協和醗酵工業株式会社（２）明細書第１５頁
１８行 ＩＰ、Ａ、Ｏ，Ｍａｒｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ、、 ：
ＢＩＤ／ＴＥＣＨＮ［］ＬＯＧＹ２、Ｊをｒエフ・ニー
・オー・マーストン（Ｆ、Ａ、 Ｏ。 ＭａｒＳｔＯｎ）ら：バイオ／チクノロシイ（ＢＩ［］
／ＴＢＣＨ−ＮＯＬＯＧＹ） ２． Ｊに訂正する。 （３）同書第１７頁２１行 ｒＨＢ１（１１菌株」をｒＨＢｌ−（１１株」に訂正す
る。 （４）同書第１９頁下から５行 「アールク・レア」を「アール・フレア」に訂正する。 （５）同書第２１頁下から１０行 「１（１５）倍濃」を「５倍濃度」に訂正する。 （６）同書第２６頁３〜４行 ［マートンらの方法［Ｆ、Ａ、Ｏ，Ｍａｒｔｏｎ ら：
ＢＩＯ／ＴＢＣＨＮＯＬＯＧＹ ２．８頭」を「マース
トンらの方法〔エフ・ニー・オー・マーストン（Ｆ、
Ａ、 Ｏ，Ｍａｒｓｔｏｎ）ら：バイオ／チクノロシイ
（ＢＩＤ／ＴＢＣＨＮＯＬＯＧＹ）２．８（１５）ｊに
訂正する。 （７）同書第２６頁５行 「抽出・精製・通常の方法で可溶化・再生」を「通常の
方法で抽出・精製・可溶化・再生」に訂正する。 （８）同書第２６頁６行 「Ｓ、Ｇ１１ｌｉｓら： Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、ｊを
「ニス・ギリス（Ｓ、 Ｇ１１ｌｉｓ） ら：ジャー
ナル・オブ・イムノロシイ（Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、）
Ｊに訂正する。 （９）同書第２６頁１１行 ｒＭ、Ｍ、 Ｂｒａｄｆｏｒｄ ： Ａｎａｌ、Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ、、 Ｊを「エム・エム・プラトフォード（Ｍ
、Ｍ、 Ｂｒａｄｆｏｒｄ） ：アナリティカル・バイ
オケミストシイ （八ｎａｌ。 Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、 」に訂正する。 σ■ 同書第２６頁１３行および第１表中「第１表」を
「第２表」に訂正する。 ０υ 同書第２６頁第１表中 ｒＩ ＬＪ ２ＪをｒＥＩＬＪ２Ｊに、ｒＩＬＹ１０６
」をｒＥＩＬＹ１０６Ｊに、ｒ Ｉ Ｌ’Ｙ５３」をｒ
Ｅ Ｉ ＬＹ５３Ｊに、ｒＩＬＹ８７ＪをｒＥＩＬＹ８
７Ｊに、ｒＩＬＹ４９ＪをｒＥＩＬＹ４９ｊにそれぞれ
訂正する。
Claims (18)
- （１）ヒトインターロイキン２ポリペプチド誘導体。
- （２）第１表のアミノ酸配列を有するヒトインターロイ
キン２ポリペプチドから一部のアミノ酸が除去された特
許請求の範囲第１項記載のポリペプチド誘導体。 - （３）ヒトインターロイキン２ポリペプチドから一部の
アミノ酸の除去がＮ末端からのアミノ酸の除去であるこ
とを特徴とする特許請求の範囲第２項記載のポリペプチ
ド誘導体。 - （４）Ｎ末端から除去されるアミノ酸が、第１表に示し
たアミノ酸配列の第１〜５番目のアミノ酸のうち少なく
とも１個のアミノ酸であることを特徴とする特許請求の
範囲第３項記載のポリペプチド誘導体。 - （５）ヒトインターロイキン２ポリペプチド誘導体をコ
ードするＤＮＡ断片が組み込まれた組換え体プラスミド
。 - （６）該ＤＮＡ断片がトリプトファンプロモーターの下
流に組み込まれたことを特徴とする特許請求の範囲第５
項記載の組換え体プラスミド。 - （７）該ＤＮＡ断片が第１表の塩基配列の第１〜１５番
目の塩基のうち少なくとも３個を欠失した配列を有する
ことを特徴とする特許請求の範囲第５または６項記載の
組換え体プラスミド。 - （８）ｐＩＬＹ４９、ｐＩＬＹ５３、ｐＩＬＹ８７およ
びｐＩＬＹ１０６と称する特許請求の範囲第５、６また
は７項記載の組換え体プラスミド。 - （９）ヒトインターロイキン２ポリペプチドの誘導体を
コードするＤＮＡ断片が組み込まれた組換え体プラスミ
ドを用い形質転換した微生物を培地に培養し、培養物中
にヒトインターロイキン２ポリペプチド誘導体を生成蓄
積せしめ、該培養物からヒトインターロイキン２ポリペ
プチド誘導体を採取することを特徴とするヒトインター
ロイキン２ポリペプチド誘導体の製造法。 - （１０）該ＤＮＡ断片がトリプトファンプロモーターの
下流に組み込まれたことを特徴とする特許請求の範囲第
９項記載の製造法。 - （１１）該微生物が大腸菌に属することを特徴とする特
許請求の範囲９または１０項記載の製造法。 - （１２）ヒトインターロイキン２ポリペプチド誘導体が
第１表に示したアミノ酸配列のＮ末端の１〜５番目のア
ミノ酸のうち少なくとも１個を欠失した配列を有するこ
とを特徴とする特許請求の範囲９、１０または１１項記
載の製造法。 - （１３）ヒトインターロイキン２ポリペプチド誘導体を
コードするＤＮＡ断片が組み込まれた組換え体プラスミ
ドを含む微生物。 - （１４）該ＤＮＡ断片がトリプトファンプーモーターの
下流に組み込まれたことを特徴とする特許請求の範囲第
１３項記載の微生物。 - （１５）該微生物が大腸菌に属することを特徴とする特
許請求の範囲１３または１４項記載の微生物。 - （１６）該ＤＮＡ断片が第１表に示した塩基配列の第１
〜１５番目の塩基のうち少なくとも３個を欠失した配列
を有することを特徴とする特許請求の範囲１３、１４ま
たは１５項記載の微生物。 - （１７）￥Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ￥ ￥ｃｏｌｉ￥
ＥＩＬＹ５３ - （１８）￥Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ￥ ￥ｃｏｌｉ￥
ＥＩＬＹ１０６
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60065599A JPS61225199A (ja) | 1985-03-29 | 1985-03-29 | 新規ヒトインタ−ロイキン２ポリペチド誘導体 |
| US06/911,811 US4851512A (en) | 1985-03-29 | 1986-09-26 | Novel human interleukin-2 polypeptide derivative |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60065599A JPS61225199A (ja) | 1985-03-29 | 1985-03-29 | 新規ヒトインタ−ロイキン２ポリペチド誘導体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61225199A true JPS61225199A (ja) | 1986-10-06 |
Family
ID=13291642
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60065599A Pending JPS61225199A (ja) | 1985-03-29 | 1985-03-29 | 新規ヒトインタ−ロイキン２ポリペチド誘導体 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4851512A (ja) |
| JP (1) | JPS61225199A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1987004714A1 (fr) * | 1986-02-10 | 1987-08-13 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | Polypeptide presentant une activite equivalente a celle de l'interleukine-2 |
| JP2020529977A (ja) * | 2017-08-03 | 2020-10-15 | シンソークス，インク． | 増殖性疾患及び感染症の処置のためのサイトカイン抱合体 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3072522B1 (en) | 2005-01-06 | 2019-04-24 | Novo Nordisk A/S | Anti-kir combination treatments and methods |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3377363D1 (en) * | 1982-03-31 | 1988-08-18 | Ajinomoto Kk | Gene coding for interleukin-2 polypeptide, recombinant dna carrying said gene, cell lines possessing the recombinant dna,and method for producing interleukin-2 using said cells |
| WO1985000817A1 (en) * | 1983-08-10 | 1985-02-28 | Amgen | Microbial expression of interleukin ii |
| US4636463A (en) * | 1984-04-05 | 1987-01-13 | Scripps Clinic And Research Foundation | Antibodies to human interleukin-2 induced by synthetic polypeptides |
-
1985
- 1985-03-29 JP JP60065599A patent/JPS61225199A/ja active Pending
-
1986
- 1986-09-26 US US06/911,811 patent/US4851512A/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1987004714A1 (fr) * | 1986-02-10 | 1987-08-13 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | Polypeptide presentant une activite equivalente a celle de l'interleukine-2 |
| GB2195641A (en) * | 1986-02-10 | 1988-04-13 | Otsuka Pharma Co Ltd | Polypeptide with interleukin-2 activity |
| GB2195641B (en) * | 1986-02-10 | 1990-08-15 | Otsuka Pharma Co Ltd | Polypeptide with interleukin-2 activity |
| JP2020529977A (ja) * | 2017-08-03 | 2020-10-15 | シンソークス，インク． | 増殖性疾患及び感染症の処置のためのサイトカイン抱合体 |
| JP2020529976A (ja) * | 2017-08-03 | 2020-10-15 | シンソークス，インク． | 自己免疫疾患の処置のためのサイトカイン抱合体 |
| JP2022169649A (ja) * | 2017-08-03 | 2022-11-09 | シンソークス， インコーポレイテッド | 増殖性疾患及び感染症の処置のためのサイトカイン抱合体 |
| US11701407B2 (en) | 2017-08-03 | 2023-07-18 | Synthorx, Inc. | Cytokine conjugates for the treatment of proliferative and infectious diseases |
| US12318431B2 (en) | 2017-08-03 | 2025-06-03 | Synthorx, Inc. | Cytokine conjugates for the treatment of proliferative and infectious diseases |
| US12377131B2 (en) | 2017-08-03 | 2025-08-05 | Synthorx, Inc. | Cytokine conjugates for the treatment of autoimmune diseases |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US4851512A (en) | 1989-07-25 |
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