JPH04501654A - 天然型ｈｉｖ ｇｐ１６０の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＨＩＶ　ＧＰ１６０ノ’ 本明細書に記載の発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔ ｅ。

Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　５ｅｒｖｉ ｃｅｓ　Ｃｏｎｔｒａｃｔ　Ｎｏ。

Ｎ０Ｉ−ＣＰ−６７６９４の下に実施された研究の間になされたものである。

光ｊ目とＬＬ 本発明は後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の病原体であるヒト免疫不全ウィル ス（旧Ｖ）の天然型（ｎａｔｉｖｅ）ｇｐ１６０の製造に係わる。

ヒト免疫不全ウィルス（Ｉ（ＩＶ）は現在では後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ ）の病原体であることが十分に立証されている。

このウィルスはＣＤ４抗原を有する細胞に対して向性を示し、且つヘルパー−イ ンデューサー（Ｔ４）細胞に大きな細胞変性効果を及ぼす、　１（ＩＶのエンベ ロー１遺伝子産物はｇｐｉｅｏ前駆体分子として合成され、この産物は更に外側 エンベロープタンパク質ｇｐ１２０及びトランスメンブランタンパク質ｇｐ４１ となる。　ｇｐ１６０とより小さいタンパク質ｇｐ１２０及びｇｐ４１との間の 前駆体／生成物の関係は、これら３種類のタンパク質のアミノ酸配列と同様に、 現在では文献で十分に説明されている［＾１１ａｎら、５ｃｉｅｎｃｅ、２２８ ：１０９１−１０９４（１９８５）及びＶｅｒｏｎｅｓｅら、５ｃｉｅｎｃｅ、 ２２９：１４０２−１４０５（１９８５）］、外側糖タンパク質ｇｐ１２０は、 ウィルス細胞の融合及び該ウィルスによって誘起される巨細胞の形成という初期 段階で、感染し易い細胞のＣＤ４分子に結合する［Ｄａｌｇｌｅｉｓｈら、Ｎａ ｔｕｒｅ、３１２ニア６３−７６６］。

細胞表面受容体認識及び細胞融合における役割の他に、ＨＩＶのｇｐ１２０及び ｇ９４１はＩＩＩＶに感染した個体内での免疫認識の主ターゲットとなる。その ため、これらのタンパク質はウィルス中和の研究及びワクチンの開発において特 別の注目を浴びてきた０組換えＤＮＡ法によって発現したｇｐ１２０の大セグメ ント、又はＩＩＩＶ感染細胞から精製した天然型ｇｐ１２Ｇは、動物体内で主に 型特異的（ｔｙｐｅ−ｓｐｅｅｉｆ　ｉｅ）中和抗体を発生させることが判明し ている。また、バキュロウィルスベクターを保有する昆虫細胞中で発現したＨＩ Ｖエンベロープ前駆体タンパク質ｇｐ１６０は、ヤギ体内で強方な型特異的免疫 反応を引き起こした（Ｒｕｓｃｈｅら、ＰＮＡＳ　ＵＳ＾、８４：６９２４−６ ９２８（１９８７）］。

成る種の細胞系をＨＩＶに感染させて、感染した細胞を完全ウィルスを継続的に 産生ずる産生体として確立させる方法は米国特許第４，６５２，５９９号に開示 されている０本発明の細胞系感染方法及び旧Ｖ変株も既に開示されている［Ｇｅ ｔｃｈｅｌｌら、　Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　２３ニア３７−７４ ２（１９８６）］。

しかしながら、これらの事項だけでは、ＨＩＶ糖タンパク質ｇｐ１８０を天」１ 工」１５工で産生できる方法は確立されなかった。天然型ｇｐ１６０は通常、ｇ ｐｔｚｏ及びｇｐ４１に分解される。細胞培養培地又は溶解ウィルスから得られ るエンベロープタンパク質はｇｐ１２０及びｇｐ４１である。従って、ｇｐ１６ ０を天然型形態で製造できるというのは実に驚異的なことである。

糖タンパク質ｇｐ１６０はこれまで組換え法によってのみ製造されてきた。しか しながら、組換えｇｐ１６０は特にグリコジル化に関して天然型ｇｐ１６０とは 異なる。これらの相異は、特にウィルスに対する中和抗体の開発にとって欠かせ ないウィルスの向性及びハーバ−（ｈａｒｂｏｒ）エピトープがＨＩＶのエンベ ロープ糖タンパク質によって決定されるという理由から、ＨＩＶワクチンの研究 では極めて重大な意味をもつことになる。

光ｍ 本発明の目的の１つは、ＨＴＬＶ−ＩＩＩ−ｓ＋に慢性的に感染させると機能的 に完全なウィルス糖タンパク質ｇｐｔｓｏを細胞外培地中に放出する無想のＨＵ Ｔ７８細胞クローンを提供することにある。

本発明の別の目的は、細胞系がｇｐ１６０を天然型形態で培地中に放出するよう な条件で、無血清培地で増殖した無限増殖性細胞系を提供することにある。

本発明の更に別の目的は、ＨＩＶの完全ｇｐ１６０を天然型形態で提供すること にある。

これらの目的及び他の目的並びに本発明の利点は、感染細胞系８Ｄ５．３．を無 血清培地で増殖し、細胞によって培地中に放出された天然型ｇｐｉｓｏを単離す ることによって達成される。

１里ｆｆｌ 第１図（レーン１）はレンズ豆レクチンセファロースから溶離した糖タンパク質 の５ＯＳ−ＰＡにＥプロフィルを示している。

レーン２はクーマシーブルーで染色した精製ｇｐｔａｏを示している。

第２図は６０５＜ｓ＋細胞によるＩＩＩＶ特異的タンパク質の放出を示している 。パネルＡ：ＦＣＳ中で増殖した細胞からの培地；パネルＢ　：１（ＢＩＯＩ中 で増殖した細胞からの培地；レーン１：ＨＩＶ陽性ヒト血清；ｌｚ−ン２：ウサ ギ抗ＦＩＴＬＶ−ＩＩＩｓ　ｇｐ４１　；　Ｌ／−ン３：ウサギ抗１２１ペプチ ド（Ｃｅｎｔｏｃｏｒｅ）　；レーン４：ヤギ抗ＨＴＬＶ−１１１−ｇｐ１２０ 　；　レ−ン５　：　正常ｈ　）血清；レーン６＋正常ウサギ血清；レーン７： 正常ヤギ血清。

第３図はＨＴＬＶ−１１１４ｓ　＋糖タンパク質によるＨＩＶ誘導誘導シンクチ ウム形成害を示している。　ＣＥＭ細胞は後述のようにＭｏ１ｔ−３／　［ＩＴ ＬＶ−ＩＩｌ、細胞と共に培養した。細胞の写真は４８時間後に撮った７ウイル ス糖タンパク質の効果を調べるために、前記共培養に先立ってＣＥＭ細胞をタン パク質と共に予め１時間インキュベートした。パネルＡ：未処理ＣＥＭ細胞：ｔ ＜　＊　ルＢ　：ＣＥＭ［胞＋　Ｎｏｔ　ｔ−３／　ＨＴＬＶ−ＩＩＩｍ細胞； パネルＣ２非感染６Ｄ５細胞培養物からの糖タンパク質で予め処理したＣＥＮ細 胞；パネルＤ：６Ｄ５＜ｉ、＄８タンパク質で予め処理したＯＥＭ細胞。　第４ 図はＣＤ４とｇｐ、１２０及びｇｐ１６０との結合を示している。

３ＳＳ−メチオニンでａ識した６Ｄ５４５．培養物のならし培地を２０００ｘｇ の遠心分離で清澄化し、次いで０．４５ｕフイルターで沢過し、た、この培地１ ／２１を後述のように総量２１でＣＥＭｓ。

細胞と共にインキュベートした。結合タンパク質を０ＫＴ４抗体で免疫沈降させ た。レーン１　：　０．５ｘ　１０’個の細胞；レーン２：１ｘｌＯ’個の細胞 ；レーン３：２ｘｌＯ’個の細胞；レーン４：５ｘｌＯ’個の細胞；レーン５　 ：　１０ｘ　１０’個の細胞；レーン６　：　２０ｘ　１０’個の細胞。

しい　、　の；■ １１ＵＴ７８細胞の単一の細胞クローンをヒト免疫不全ウィルス１型（旧ｖ−１ ）に感染させ、それによって感染細胞系をウィルスの継続的産生体にした。クロ ーン６Ｄ５は、Ｇｅｔｃｈｅｌｌら。

シ、Ｃ！　ｉｎ、Ｍｉｅｒｏｂｉｏｌ　、　、２３ニア３７−７４２（１９８６ ）に記載のように、１１１Ｖ−Ｈ：：慢性的ニ感染し易イ、クローン６Ｄ５をＨ ＩＶ−１、ＨＴＬＶ−１１１４、ｌの特異的株に感染させて感染細胞系６Ｄ５４ ｓｌを形成する０次いで、６Ｄ５．、、細胞をペレット化し且つ無血清培地（例 えばＤｕ　Ｐｏｎｔ社から市販されているＩＩＢＩＯＩ培地）中に再懸濁さする ことによって、前記感染細胞系を無血清培地で増殖させる０本発明の実施では、 やはりＤｕ　Ｐｏｎｔ社から市販されている無血清培地ＨＢ１０４も使用し得る 。

糖タンパク質ｇｐ１６０は、無血清培地を使用した時にだけ培地中の他のタンパ ク質から分離することができる。血清含有培地を用いた場合には、ｇｐ１６０を 他の培地成分から分離することはできない。

好ましい実施態様では、ＨＢＩＯＩ培地がトランスフェリン、インスリン及びウ シ血清アルブミンのような増殖サブルメントも含む、細胞の増殖を促進するため に、細胞の継代培養を４日置きに行った。６０５４５１細胞は２〜３世代にわた って増殖させた。培地中に放出された旧Ｖタンパク質の量は、細胞外逆転写酵素 活性による測定では、血清含有培地より無血清培地の方が４倍近く多かった。感 染細胞の培養培地中の逆転写酵素（ＲＴ）を、Ｐｏ１ｅｓｚら、ＰＮＡＳ　ＵＳ Ａ、７フ：７４１５−７４１９（１９８０）に記載のように、プライマー鋳型と して（ｄＴ）〜１５・（＾）ｎを用いて分析した。

糖タンパク質源としては細胞非含有培地を使用した。この培地を、ｐＨ７，５の リン酸ナトリウムと０．５％のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００と０．１ｍＮのフッ化 フェニルメチルスルホニルと４００ｄの塩化ナトリウムとで２０ｍＭに調整した 。室温で１時間インキュベートした後、この培地をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社市販の Ｐｅ１ｌｉｃｏｎカセツトシステムで３０倍の濃度に濃縮した。この培地サブル メントから誘導された外来タンパク質を、無血清培地の増殖サブルメント中、該 タンパク質に対するヤギ抗体を結合したセファロースを用いるイムノアフィニテ ィー吸着（−晩）によって前記濃縮物から除去した。前記ヤギ抗体に結合したタ ンパク質を除去し、非結合物質をレクチンアフィニティーカラム、好ましくはレ クチン−セファロースカラム（Ｐｈａｒ＋ｓａｃ　ｉａ）に通した。好ましくは レンズ豆レクチンカラムを使用するが、マンノースを認識する他のレクチン、例 えばコンカナバリン−＾を使用してもよい、リン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）で洗浄し た後、カラムを４００ｍＭのα−メチルマンノシドで溶離してウィルス糖タンパ ク質を取り出した。カラムの溶離にはメチルマンノシドを使用するのが好ましい が、アフィニティーカラム内のレクチンと競合する任意のマンノース、ピラノシ ド又はサツカライドを使用することもできる。第１図（レーン１）はレンズ豆レ クチンーセファロースから溶離した糖タンパク質の５ＤＳ−ＰＡＧＥプロフィル を示している。試料中の顕著な糖タンパク質は１２０及び１６０ｋＤタンパク質 であった。これらのタンパク質はまた、イムノプロット中でＨＩＶ−１抗体陽性 ヒト血清と強く反応した。　ＨＴＬＶ−１１１４５１糖タンパク質のイムノプロ ット分析は公知の方法、例えばＳａｒｎｇａｄｈａｒａｎら、５ｃｉｅｎｃｅ　 ２２４：５０６−５０８（１９８４）に記載の方法で行う、基本的には、タンパ ク質を７％５ＯＳ−ポリアクリルアミドゲルにかけ、ニトロセルロースストリッ プ（市販のもの）に移動させる０次いでこのニトロセルロースストリップを適当 な抗体で処理し、プロットをペルオキシダーゼ結合第２抗体で更に処理する。前 記ストリップをジアミノベンジジンと反応させることによってバンドを可視化す る。

１１１Ｖ−１の［９４１タンパク質に対するモノクローナル抗体を用いるイムノ アフィニティークロマトグラフィーにより、レンズ豆レクチンセファロースカラ ムから溶離した糖タンパク質の混合物からｇｐ１６０を精製した。標準的方法で 、部分的に精製したＨＴＬＶ−Ｉ１１ｎｓ＋糖タンパク質を用いてモノク鮭 ローナル抗体を作成した。この抗体のイムノグロブリンフラクションを製造業者 （Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によって指示された方法でセファロースに結合させた。

レンズ豆レクチンセファロースカラムからの溶出液（ｅｌｕａｔｅ）を、０．５ ％のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００とＩＮの塩化カリウムと０．１ｍ１４のＰＭＳＦ とを含む２０−ＨのｐＨ８，５ノ）　！Ｊ　Ｘ−ＨＣｌ中で抗ＨＩＶ−１ｇｐ４ １セフ　ｙ　ｏ　−スを用いて４℃で平衡化した０次いでセファロースをカラム に詰め、ＰＢＳで洗浄し、結合タンパク質を１００ＭＭの重炭酸ナトリウムで溶 離した。　ＨＴＬＶ−ＩＩＩ４ｓ＋　ｐｇ１６０はほぼ均質な状態でカラムから 溶離された。第１図（レーン２）は５Ｄ５−ＰＡＧＥによって分離し且つクーマ シーブルーで染色した精製ｇＰ１６０を示している。

本発明の方法で製造した糖タンパク質ｇＰ１６０及びその誘導体は、一般的なや り方で、免疫療法及び／又は免疫診断の方法及び組成物に使用し得る。その場合 の治療方法及び使用量は当業者には明らかであり、既存の方法から選択し得る０ 例えば、本発明の方法で製造したｇｐｔｅｏはＥＬＩＳ＾アッセイで適切な診断 を行うのに有効な量で医薬的に許容し得るアジュバントと組合わせることができ る。

以上、本発明の好ましい実施態様を説明してきたが、本発明はこれには限定され ない。

本発明がより良く理解されるように、以下に実施例を挙げる。但し、これらの実 施例は非限定的なものであり本発明の範囲を規定するものではないと理解された い。

えＩＬＬ ！ＪＬＬＬ ２千万個の６０５＜ｓ＋細胞を、５％の標準量のメチオニンと１−Ｃ１の３ｓＳ −メチオニンと５％の透析した■１０１サプルメントとを含む１０−ＩのＨＢＩ ＯＩ無血清培地中で１５時間処理して標識した。細胞非含有の上澄みを０．４５ ミクロンフィルターでヂ過し、濃縮し、０．５％のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００， ５００ｍＭの塩化ナトリウム及び１論Ｈのフッ化フェニルメチルスルホニルで処 理した。室温で１時間放置した後、可溶化した前記培地を、０．５％のＴｒｉｔ ｏｎ　Ｘ−１００と１％のデオキシコレートと０．１％のドデシル硫酸ナトリウ トムとを含む等容量のＰＢＳ（ＰＢＳ−ＴＤＳ）と混合しり、コノ混合物１ｍｌ を１０１Ｊｌノ抗ＨＩＶ血清及び１５ｈ＋ノ１０％プロティンー＾セファロース と共に一晩インキユベートした。セファロースをベレット化し、ＰＢＳ−ＴＤＳ で４回洗浄し、１％ＳＯＳ、１％β−メルカプトエタノール及び１２５ＭＭ　） リス−ＨＣｌ＜ｐＨ６，８）と共に２分間沸騰させた。この可溶化した標識タン パク質を７．５％ＳＯＳポリアクリルアミドゲルで分離し、Ｖｅｒｏｎｅｓｅら 、５ｃｉｅｎｃｅ　２２９：１４０２−１４０５（１９８５）に記載の方法でオ ートラジオグラフィーにかけた。第２図は培養培地中の別個の免疫反応タンパク 質生成物としてのｇｐ１８０を示している。

犬１ｊＬＬ 無血清培地で増殖させた６０５４５１細胞の細胞外培地中のウィルスタンパク質 を、前述のごと＜３５Ｓ−メチオニンで代謝標識することによって分析した。放 出された放射性タンパク質を、ＨＩＶ−１血清学的陽性ヒト血清か又はＨＴＬＶ −ＩＩＩ。

ｇｐ１２０もしくはｇｐ４１に特異的な抗体のいずれかで免疫沈降させた。主要 コアタンパク質（ｐ２４）と約１２０ｋＤ及び１６０ｋＤの２種類のタンパク質 の他に、ＨＩＶ−１陽性ヒト血清が沈降した。

ＨＴＬＶ−１１１−ｇｐ１２０Ｇ：：対するヤギ抗体は１２０ｋＤ及び１６０ｋ Ｄタンパク質の両方を沈降させた。これは、これらのタンパク質がｇｐ１２０の 免疫反応領域を含むことを示唆する。一方、ウサギ抗ｇｐ４ｔは１６０ｋＤタン パク質だけしか免疫沈降させなかった。これらの結果は、１６０ｋＤタンパク質 がＨＩＶのｇｐｌＺｏ領域及びｇｐ４１領域の両方を有するのに対し、１２０ｋ Ｄタンパク質はＨＩＶのｇｐ１２０エピトープしか含まないことを意味する。

火１１工 本発明の方法で製造した天然型１２０及び１６０ｋＤ糖タンパク質の特性を、更 に、ＨＴＬＶ−１１１ｓ　ｇｐ１２０及びｇｐ４１ニ特異的な抗体に対する反応 によって分析した。そのために、タンパク質を５ＯＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニト ロセルロースストリップに移動させ、ＨＴＬＶ−ＩＩＩｓ　ｇｐ１２０及びｇｐ ４１に特異的な抗体で処理した。　１２０ｋＤタンパク質及び１６０ｋＤタンパ ク質は両方とも［ＩＩＶ−１陽性血清及びヤギ抗ｇｐ１２０ト反応した。ＨＴＬ Ｖ−１１１，ｇｐ４１に対する抗体と反応したのは８９１６０ｋＤタンパク質だ けであった。使用した２つのｇｐ１２０に対するモノクローナル抗体のうち前記 タンパク質の両方と反応したのは１つだけであった。これは、前記モノクローナ ル抗体がＨＩＶの異なる単離物と型特異的に反応することを意味する。

えＵ先 ＨＩＶ−１感染の主ターゲットはＣＤ４細胞表面マーカーを有するＴリンパ球の ヘルパー／インデューサーサブセットであるが、ウィルスが感染し易いターゲッ ト細胞に感染する実際のメカニズムはまだ解明の緒についたばかりである。

ＣＤ４抗原の成る種のエピトープに対するモノクローナル抗体はウィルス感染を 阻止し且つＣＤ４及びｇｐｔｚｏの複合体を免疫沈降させ得ることが判明した。

これは、ｇｐｔｚｏとＣＤ４との間の主要な相互作用がＨＩＶ−１の感染プロセ スを開始させることを示唆するものと考えられる。ウィルス感染の結果の１つは 、細胞融合によって生じる多核巨細胞の形成である。

ＣＥＭ細胞のクローンは、ＨＩＶ−１感染細胞系と混合するとシンジチアの迅速 且つ定量的な形成を示すことが判明した［Ｍａｔｈｅｗｓら、ＰＮＡＳ、ＵＳ人 ８４：５４２４−５４２８（１９８７）］、この種のシンジチア形成はしばしば 、ウィルス感染時のｇｐｔｚｏ−ＣＤ４相互作用の尺度として使用される。　Ｈ ＴＬＶ−ＩＩｌ、、糖タンパク質がＣＥＭ細胞の［１ＴＬＶ−ＩＩ１１誘導融合 を妨害する能力を測定すべく、ターゲットＣＥＭ細胞を、Ｍｏ１ｔ−３／ＨＴＬ Ｖ−ＩＩＩ−細胞と混合する前に、部分的に精製した糖タンパク質調製物と共に ３６時間インキュベートした。　ＣＥＭ細胞を非感染６Ｄ５細胞からの糖タンパ ク質調製物と共に予めインキュベートしてもシンジチア形成には影響なかった（ 第３Ｃ図）、これに対し、ＣＥＭ細胞をＨＴＬＶ−Ｉ１１４ｓ＋糖タンパク質調 製物で予め処理すると、■ＴＬＹ−ＩＩＩｓ／Ｍｏ１ｔ−３細胞によって誘起さ れるシンジチア形成が完全に阻止された（第３Ｄ図）、これは、ウィルス糖タン パク質がターゲットＩＩＩ胞上のＣＤ４抗原と選択的に結合し得、その結果旧Ｖ −１感染細胞による感染を阻止することを示唆するものである。

ヒト血清で免疫沈降させると、ならし培地の高速遠心分離後に、ウィルス糖タン パク質の９０％以上が可溶性状態で見出された。　ＨＴＬＶ−Ｉ１１＝ｓ＋糖タ ンパク質とＣＤ４分子との相互作用を更に、ＣＥＭ細胞への標識ｇｐ１２０及び ｇｐ１６０の特異的結合によって調べた。そのために、３ＳＳ−メチオニン標識 ６０５４５１からの細胞非含有上澄みを、細胞数を増やしながら、ＣＥＭ細胞と 共にインキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄した後、細胞上の結合１１１Ｖ糖 タンパク質−Ｃ［１４複合体を前述のごとき界面活性剤だけで可溶化した。可溶 化した抽出物をＣＤ４分子に対する２つのモノクローナル抗体で免疫沈降させた 。これらのＨＩＶ糖タンパク質は両方共０ＫＴ４によって沈降した。但し、興味 深いことに、受容体密度を制限するとｇｐｔｚｏが優勢種となって細胞に結合し た。細胞の密度を高くＦＩＧ、　３Ａ　ＦＩｏ、　３Ｂ ＦＩＧ、　４ 補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の７第１項）平成２年４月１ ６日 特許庁長官　吉　１）文　毅　殿　闇 １、特許出願の表示　ＰＣＴ／ＵＳ　８９１０３４２８２、発明の名称　天然型 層Ｖ　ＧＰ１６［１の製造方法３、特許出願人 住　所　オランダ国、６８ＧＯ・エル・ニス・アーネム、ペー・オー・ボックス ・１８６、フエルペルウエヒ・７Ｇ名　称　アクゾ・エヌ・ヴエー ４、代　理　人　東京都新宿区新宿１丁目１番１４号　山田ビル５、補正書の提 出年月日　１９８９年１２月１１日６、添附書類の目録 請求の範囲の補正 ［１９８９年１２月１１日（１１，１２，８９）、国際事務局によって受理。

元の請求の範囲１〜７を補正し、請求の範囲８〜１０を追加した。］ １、（補正）天然型ヒト免疫不全ウィルスｇｐ１６０の製造方法であって、 ＨＵＴ７８Ｔ細胞系からの細胞をＩＩＴＬＶ−１１１，，４：ｌ：ｆｆｉ染ササ サセル、 天然型ｇｐ１６０を産生する感染ＨＵＴ７８細胞を選択すること、前記ｇｐ１６ ０産生細胞系を、細胞増殖を促進する条件下で、無血清培地中でインキュベート すること、及び前記培地から天然型ｇｐ１６０を単離することを含む方法。

２、（補正）Ｔ細胞系を前記ウィルスに感染させ、細胞増殖を促進する条件で培 地中でインキュベートして前記培地中に糖タンパク質を分泌させることからなる ヒト免疫不全ウィルスからのエンベロープタンパク質の製造方法において、 天然型ｇｐ１６０を産生する６Ｄ５．Ｓ□感染Ｔ細胞系からの細胞を無血清培地 中でインキュベートすること、及び天然型ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質ｇ９ １６０に対応する１６０ｋＤタンパク質を前記培地から単離することを含むよう に改良された方法。

３、（補正）天然型ｇｐｉｓｏ産生細胞。

４、（補正）請求項３に記載の６０５．ｓ、細胞によって産生された天然型ヒト 免疫不全ウィルス糖タンパク質ｇｐｔｅｏ。

５、（補正）請求項１に記載の方法で精製した天然型ｇｐ１６０゜６、（補正） 請求項２に記載の方法で精製した天然型ｇｐ１６０゜７、（補正）請求項１に記 載の方法で製造した。ｐ１６０を含み、且つイムノアッセイでｇｐ１６０、ｇｐ １２０又はｇｐ４１に対する抗体と反応させることによって診断薬として有効で ある試薬組成物。

８、（追加）免疫反応を起こすのに有効な量の請求項４に記載の天然型ヒト免疫 不全ウィルス糖タンパク質ｇｐ１６０と、医薬的に許容し得るキャリヤーとを含 むワクチン組成物。

９、（追加）無血清培地中の請求項４に記載の天然型ヒト免疫不全ウィルス糖タ ンパク質ｇｐ１６０゜１０、（追加）無血清培地中の請求項３に記載の天然型ｇ ｐ１６０産生細胞。

国際調査報告 ＰＣＴ１０５８９１０３４２Ｂ

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. １．天然型ヒト免疫不全ウイルスｇｐ１６０を製造するための方法であって、 ＨＵＴ７８細胞系からの細胞をＨＴＬＶ−ＩＩＩ４５１に感染させて６Ｄ５４５ １細胞系を作製すること、 前記６Ｄ５４５１細胞系を、細胞増殖を促進する条件下で、無血清培地中でイン キュベートすること、及び前記培地から天然型ｇｐ１６０を単離することを包含 する方法。
2. ２．Ｔ細胞系を前記ウイルスに感染させ、細胞増殖を促進する条件で培地中でイ ンキュベートして前記培地中に糖タンパク質を分泌させることからなる、ヒト免 疫不全ウイルスからエンベロープタンパク質を製造する方法において、６Ｄ５４ ５１感染Ｔ細胞系からの細胞を無血清培地中でインキュベートすること、及び 天然型ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質ｇｐ１６０に対応する１６０ｋＤタンパ ク質を前記培地から単離することを包含する改良方法。
3. ３．無血清培地中の６Ｄ５４５１細胞。
4. ４．無血清培地中のヒト免疫不全ウイルス糖タンパク質ｇｐ１６０。
5. ５．請求項１に記載の方法で精製したｇｐ１６０。
6. ６．請求項２に記載の方法で精製したｇｐ１６０。
7. ７．請求項１に記載の方法で製造したｇｐ１６０を含む、診断用薬剤として効果 的な医薬組成物。