JPS6328393A - 新規なプラスミド - Google Patents
新規なプラスミドInfo
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- JPS6328393A JPS6328393A JP61169859A JP16985986A JPS6328393A JP S6328393 A JPS6328393 A JP S6328393A JP 61169859 A JP61169859 A JP 61169859A JP 16985986 A JP16985986 A JP 16985986A JP S6328393 A JPS6328393 A JP S6328393A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- plasmid
- megadaltons
- pmtp
- gene
- fragment
- Prior art date
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- Pending
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
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- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はトリプトアナーゼの生合成を司る遺伝子を含む
ＤＮＡ断片を含有する新規なプラスミドに関し、更に詳
しくは、コピー数が多く、宿主内での安定保持性に優れ
ており、細胞増殖に際して脱落することなく、親細胞か
ら娘細胞に確実１こ受は継がれる、トリプトアナーゼの
生合成を７７］る遺伝子ｔｎａ Ａとこの遺伝子を発現
させうるプロモーターとこのプロモーターを制御する調
節遺伝子をもつＤＮＡ断片とを含むＤ Ｎ Ａ断片を含
有するプラスミドに関する。
ＤＮＡ断片を含有する新規なプラスミドに関し、更に詳
しくは、コピー数が多く、宿主内での安定保持性に優れ
ており、細胞増殖に際して脱落することなく、親細胞か
ら娘細胞に確実１こ受は継がれる、トリプトアナーゼの
生合成を７７］る遺伝子ｔｎａ Ａとこの遺伝子を発現
させうるプロモーターとこのプロモーターを制御する調
節遺伝子をもつＤＮＡ断片とを含むＤ Ｎ Ａ断片を含
有するプラスミドに関する。
一般に造成プラスミドの宿主内での安定性に関して、従
来より、培養時に宿主からのプラスミドの脱落や挿入遺
伝子の欠落等種々の遺伝子的不安定性が報告されでおり
、その対応策が検討されている。
来より、培養時に宿主からのプラスミドの脱落や挿入遺
伝子の欠落等種々の遺伝子的不安定性が報告されでおり
、その対応策が検討されている。
例えば、エシェリヒア属のストレプトマイシンに依存し
ないという性質を司る染色体遺伝子ＤＮＡ断片が組み込
まれたプラスミドを、エシェリヒア属のストレプトマイ
シン依存性変異株に含有せしめて、プラスミドを含有す
る微生物の性質を安定化する方法が提案されている（特
開昭５５−１５６５９１号公報）。
ないという性質を司る染色体遺伝子ＤＮＡ断片が組み込
まれたプラスミドを、エシェリヒア属のストレプトマイ
シン依存性変異株に含有せしめて、プラスミドを含有す
る微生物の性質を安定化する方法が提案されている（特
開昭５５−１５６５９１号公報）。
しかしながら、かかる方法はに￥、済的に問題があるの
みならず、０的のプラスミドに複雑な機能を組み込む必
要がおるため、宿主の分裂増殖時にプラスミドが安定１
こ娘細胞に分配され難いことが予想され、工業的１こ応
用するにはかなりの問題がある。
みならず、０的のプラスミドに複雑な機能を組み込む必
要がおるため、宿主の分裂増殖時にプラスミドが安定１
こ娘細胞に分配され難いことが予想され、工業的１こ応
用するにはかなりの問題がある。
そこで、本発明者らは、トリプトアナーゼの生合成をｉ
ｒＪる遺伝子の宿主内安定化を図るべく、まず、親細胞
から娘細胞へと継代的に安定に分配することを可能にす
る機能をもつプラスミドについて鋭、ま研究を行ない、
Ｆ因子プラスミドの増殖制御分配系をｒｆＪる遺伝子を
含むＤＮＡＤ片がプラスミドの安定化に大きく寄与する
能力があること、そしてさらに、エシェリヒア・コリの
ＣｏｌＥｌ系プラスミドが通常細胞染色体当り数十個の
コピー数を有することに着目し、今回、Ｃｏ１Ｅｌ系プ
ラスミドの自律増殖能を司る遺伝子を含むＤＮＡ１￥Ｉ
ｉ片と、Ｆ因子プラスミドの増殖制御分配系を司る遺伝
子を含むＤＮＡ断片とを、上記のトリプトアナーゼの生
合成を司る遺伝子を含むＤ Ｎ Ａ断片とを組合せるこ
とにより、コピー数が多くしがも継代的に安定に分配可
能なプラスミドを創製することに成功し、本発明を完成
するに至った。
ｒＪる遺伝子の宿主内安定化を図るべく、まず、親細胞
から娘細胞へと継代的に安定に分配することを可能にす
る機能をもつプラスミドについて鋭、ま研究を行ない、
Ｆ因子プラスミドの増殖制御分配系をｒｆＪる遺伝子を
含むＤＮＡＤ片がプラスミドの安定化に大きく寄与する
能力があること、そしてさらに、エシェリヒア・コリの
ＣｏｌＥｌ系プラスミドが通常細胞染色体当り数十個の
コピー数を有することに着目し、今回、Ｃｏ１Ｅｌ系プ
ラスミドの自律増殖能を司る遺伝子を含むＤＮＡ１￥Ｉ
ｉ片と、Ｆ因子プラスミドの増殖制御分配系を司る遺伝
子を含むＤＮＡ断片とを、上記のトリプトアナーゼの生
合成を司る遺伝子を含むＤ Ｎ Ａ断片とを組合せるこ
とにより、コピー数が多くしがも継代的に安定に分配可
能なプラスミドを創製することに成功し、本発明を完成
するに至った。
しかして、本発明によれば、
（ａ）トリプトフアナーゼオペロン中の少なくともプロ
モーター及びこのプロモーターを制御する調節遺伝子並
びにトリプトアナーゼ構造遺伝子を含むＤ Ｎ Ａ断片
と、（ｂ） ＣｏｌＥｌ系プラスミドの自律増殖能を
司るＤ Ｎ Ａ断片と、 （ｃ） Ｆプラスミド由来の増殖制御分配系を司る遺
伝子を含むＤＮＡ断片 とから成ることを特徴とする新規なプラスミドが提供さ
れる。
モーター及びこのプロモーターを制御する調節遺伝子並
びにトリプトアナーゼ構造遺伝子を含むＤ Ｎ Ａ断片
と、（ｂ） ＣｏｌＥｌ系プラスミドの自律増殖能を
司るＤ Ｎ Ａ断片と、 （ｃ） Ｆプラスミド由来の増殖制御分配系を司る遺
伝子を含むＤＮＡ断片 とから成ることを特徴とする新規なプラスミドが提供さ
れる。
本発明のプラスミドを構成する「トリプトフアナーゼオ
ペロン中の少なくともプロモーター及びこのプロモータ
ーを制御する調節遺伝子並びにトリプトアナーゼＮＩＩ
造遺伝子を含むＤＮＡ断片」（以下「Ｔ断片」と略称す
ることがある）は、トリプトファンをインドールとピル
ビン酸とアンモニアに分解する役割をもつ＃素、すなわ
ちトリプトアナーゼの生合成を司る遺伝子を含むＤＮＡ
断片を意味し、本発明で用いるＴ断片には、殊に、トリ
プトフアナーゼオペロン中のトリプトアナーゼの生合成
を司る遺伝子であるＬｎａＡを発現させうるプロモータ
ー機能をもつＤＮＡ断片（以下［トリプト７アナーゼプ
ロモーター］というとがある）及びさらに必要に応じて
このプロモーター機能を制御しうる調節遺伝子をもつＤ
ＮＡ断片を結合したＤＮＡ断片が包含される。かかるＴ
断片としては実用的には大腸菌白米のものが好適に使用
される。
ペロン中の少なくともプロモーター及びこのプロモータ
ーを制御する調節遺伝子並びにトリプトアナーゼＮＩＩ
造遺伝子を含むＤＮＡ断片」（以下「Ｔ断片」と略称す
ることがある）は、トリプトファンをインドールとピル
ビン酸とアンモニアに分解する役割をもつ＃素、すなわ
ちトリプトアナーゼの生合成を司る遺伝子を含むＤＮＡ
断片を意味し、本発明で用いるＴ断片には、殊に、トリ
プトフアナーゼオペロン中のトリプトアナーゼの生合成
を司る遺伝子であるＬｎａＡを発現させうるプロモータ
ー機能をもつＤＮＡ断片（以下［トリプト７アナーゼプ
ロモーター］というとがある）及びさらに必要に応じて
このプロモーター機能を制御しうる調節遺伝子をもつＤ
ＮＡ断片を結合したＤＮＡ断片が包含される。かかるＴ
断片としては実用的には大腸菌白米のものが好適に使用
される。
このＴ断片の供給源としては特に制限はなり・が、エシ
ェリヒア・コリＡＴＣＣ２３２８２、エシエリヒア・コ
リＡＴＣＣ２３４３７、エシェリヒア・コリＡＴＣＣ２
３４６１等が有利に使用される。
ェリヒア・コリＡＴＣＣ２３２８２、エシエリヒア・コ
リＡＴＣＣ２３４３７、エシェリヒア・コリＡＴＣＣ２
３４６１等が有利に使用される。
これら供給源微生物から本発明の目的に適うｔｎａ Ａ
断片と）リプト７アナーゼプロモーター及びこのプロモ
ーターを制御する調節遺伝子とが結合したＤＮＡ断片を
調製するための詳細な方法は後記実施例１の（Ａ）に示
すが、基本繰作としては、染色体遺伝子中にトリプトフ
アナーゼオペロンをもつ大腸菌の染色体遺伝子を抽出し
、制限酵素Ｂａｗｌ−１１、ＩＩ １ｎｄＩＩＩを用い
てトリプトフアナーゼオペロンＤＮＡ断片を切り出すと
ｔｎａ Ａ及びトリプト７アナーゼプロモーター及びこ
のプロモーターを制御する調節遺伝子を含むＤＮＡ断片
が得られる。
断片と）リプト７アナーゼプロモーター及びこのプロモ
ーターを制御する調節遺伝子とが結合したＤＮＡ断片を
調製するための詳細な方法は後記実施例１の（Ａ）に示
すが、基本繰作としては、染色体遺伝子中にトリプトフ
アナーゼオペロンをもつ大腸菌の染色体遺伝子を抽出し
、制限酵素Ｂａｗｌ−１１、ＩＩ １ｎｄＩＩＩを用い
てトリプトフアナーゼオペロンＤＮＡ断片を切り出すと
ｔｎａ Ａ及びトリプト７アナーゼプロモーター及びこ
のプロモーターを制御する調節遺伝子を含むＤＮＡ断片
が得られる。
本発明はｆｉｊ述しｔこように、上記のＴ断片を、Ｆ因
子プラスミド由来のプラスミドの増殖制御分配系を司る
遺伝子を含むＤＮＡ断片と組合わせる点に１つの特徴を
有する。Ｆ因子プラスミドは例えば［蛋白質 ４ｆ酸
１ｓＬＸＪＪ２７巻第１ｔ［１９８２）の９８頁の図１
の遺伝子地図及びＥｃｏＲＩによる物理的地図に示され
る如き構造をもつ、分子量が９４．５ｋｂ（６２Ｘ１０
’グルトン）の既知のプラスミドであり、大腸菌などの
腸内細菌中に通常細胞染色体当り１〜２個のコピー数で
存在し、このプラスミドは細胞分裂後にそれぞれの娘細
胞中に正確に伝達されるような機構を備えている（この
ように、コピー数を低いレベルに保ちつつ、正確に宿主
の増殖とベースを合わせて増やす仕組みを５Ｌｒｉｎ８
ｅｎＬな増殖の制御と呼んでいる）、Ｆ因子プラスミド
におけるこのような５ｔｒｉＢｅｎＬな増殖の制御（５
！１能が、ｗｉｎｉ−Ｆと呼ばれる分子量が９．２ｋｂ
の自律増殖できる断片に担われていることも既に究明さ
れており［”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ＆Ｇｅｎｅｒａｌ
ｇｅｎｅｔｉｅｓ”１９６．１８５−１９３（１９８４
）］、このｍ１ｎｉ−ＦがＦ因子プラスミドより制限酵
素ＥｃｏＲＩにより切り出し可能であることも知られて
いる。
子プラスミド由来のプラスミドの増殖制御分配系を司る
遺伝子を含むＤＮＡ断片と組合わせる点に１つの特徴を
有する。Ｆ因子プラスミドは例えば［蛋白質 ４ｆ酸
１ｓＬＸＪＪ２７巻第１ｔ［１９８２）の９８頁の図１
の遺伝子地図及びＥｃｏＲＩによる物理的地図に示され
る如き構造をもつ、分子量が９４．５ｋｂ（６２Ｘ１０
’グルトン）の既知のプラスミドであり、大腸菌などの
腸内細菌中に通常細胞染色体当り１〜２個のコピー数で
存在し、このプラスミドは細胞分裂後にそれぞれの娘細
胞中に正確に伝達されるような機構を備えている（この
ように、コピー数を低いレベルに保ちつつ、正確に宿主
の増殖とベースを合わせて増やす仕組みを５Ｌｒｉｎ８
ｅｎＬな増殖の制御と呼んでいる）、Ｆ因子プラスミド
におけるこのような５ｔｒｉＢｅｎＬな増殖の制御（５
！１能が、ｗｉｎｉ−Ｆと呼ばれる分子量が９．２ｋｂ
の自律増殖できる断片に担われていることも既に究明さ
れており［”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ＆Ｇｅｎｅｒａｌ
ｇｅｎｅｔｉｅｓ”１９６．１８５−１９３（１９８４
）］、このｍ１ｎｉ−ＦがＦ因子プラスミドより制限酵
素ＥｃｏＲＩにより切り出し可能であることも知られて
いる。
本発明はこのｍ１ｎｉ−Ｆに担われている増殖制御分配
系を利用するものであり、しかして「Ｆ因子プラスミド
由来の増殖制御分配系を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片」
（以下「Ｆ断片」と略称することがある）は、上述した
ようなＦ因子プラスミドを娘細胞に正確に伝達する機構
を備えた遺伝子画分を意味し、その上うなＦ断片の代表
例としては約９゜２ｋｂの分子量を有するｍ１ｎｉ−Ｆ
断片が挙げられる。
系を利用するものであり、しかして「Ｆ因子プラスミド
由来の増殖制御分配系を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片」
（以下「Ｆ断片」と略称することがある）は、上述した
ようなＦ因子プラスミドを娘細胞に正確に伝達する機構
を備えた遺伝子画分を意味し、その上うなＦ断片の代表
例としては約９゜２ｋｂの分子量を有するｍ１ｎｉ−Ｆ
断片が挙げられる。
さらに、本発明において一ヒ記Ｔ断片及びＦ断片と組合
わせて使用される「ｃｏｌＥｉ系プラスミド由来の自律
増殖を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片」（以下「Ｓ断片」
と略称することがある）は、コピー数が１細胞染色体当
り２０〜３０個であるＣｏ１Ｅｌ系プラスミドの自律増
殖を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片を意味し、その上うな
Ｓ断片の代表例としては約４ 、３ ｋｂの長さを有す
るプラスミドｐＢＲ３２２由米のＳ断片が挙げられ、そ
の他にプラスミドル８１３２５等由来のＳ断片がある。
わせて使用される「ｃｏｌＥｉ系プラスミド由来の自律
増殖を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片」（以下「Ｓ断片」
と略称することがある）は、コピー数が１細胞染色体当
り２０〜３０個であるＣｏ１Ｅｌ系プラスミドの自律増
殖を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片を意味し、その上うな
Ｓ断片の代表例としては約４ 、３ ｋｂの長さを有す
るプラスミドｐＢＲ３２２由米のＳ断片が挙げられ、そ
の他にプラスミドル８１３２５等由来のＳ断片がある。
本発明により提供されるプラスミドは、以上に述べたＴ
断片、Ｆ断片及びＳ断片の３つの必須のＤＮＡ断片を有
する限り、池の遺伝情報を担つＤＮＡ断片、例えば抗生
物質耐性マーカーであるアンビシリン耐性遺伝子を含む
ＤＮＡ断片、カナマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片
等をさらに含みうるが、典型的な具体例は、Ｔ断片、Ｆ
断片及びＳ断片の３つのＤＮＡＩＥＩＩ片から実質的に
なり、分子量が約１０．７メガダルトン（約１６．４ｋ
ｂ）のプラスミドで、本発明者らが［プラスミドｐＭ
Ｔ Ｐ −１１及び「プラスミドｐＭＴＰ−ＩＲＪと命
名した２種のプラスミドである。プラスミドｐＭＴＰ−
ＩＲ。
断片、Ｆ断片及びＳ断片の３つの必須のＤＮＡ断片を有
する限り、池の遺伝情報を担つＤＮＡ断片、例えば抗生
物質耐性マーカーであるアンビシリン耐性遺伝子を含む
ＤＮＡ断片、カナマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片
等をさらに含みうるが、典型的な具体例は、Ｔ断片、Ｆ
断片及びＳ断片の３つのＤＮＡＩＥＩＩ片から実質的に
なり、分子量が約１０．７メガダルトン（約１６．４ｋ
ｂ）のプラスミドで、本発明者らが［プラスミドｐＭ
Ｔ Ｐ −１１及び「プラスミドｐＭＴＰ−ＩＲＪと命
名した２種のプラスミドである。プラスミドｐＭＴＰ−
ＩＲ。
プラスミドｐＭＴＰｉのｍｉ旧−Ｆ断片部分が逆向きに
配位している以外はプラスミドｐＭＴＰｉと同じ構造の
ものである６ なお、本明細書において、プラスミドの分子量はアガロ
ースデル電気泳動法により測定した値である。
配位している以外はプラスミドｐＭＴＰｉと同じ構造の
ものである６ なお、本明細書において、プラスミドの分子量はアガロ
ースデル電気泳動法により測定した値である。
以下、このプラスミドｐＭＴＰ−１及びｐＭ Ｔ Ｐ
−ＩＲについてさらに詳細に説明する。
−ＩＲについてさらに詳細に説明する。
プラスミドｐＭＴＰ−１及びｐＭＴＰ−ＩＨの下記の制
限Ｈ索の感受性（認識部位の数）及び該制限酵素による
分解断片の氏さくｋｂ）は下記の表に示すとおりである
。
限Ｈ索の感受性（認識部位の数）及び該制限酵素による
分解断片の氏さくｋｂ）は下記の表に示すとおりである
。
プラスＬＬｐＭＴＰ−１
ＣｃｏＲＩ ２ ９．２．７．２Ｂ
ａｎ）ＩＩ ３
９．９、 ４．１、 ２．４Ｈｉｎｄ［Ｉ［２
８，４，８，０ Ａｖａｌ ２ ３．９．１２．
５ＰｓｔＩ ６ ４，９．４．０．３．
８．１．８．１．５．０．４ＳａｌＩ ２
１２．７．３．７ＥｃｏＲＩ ２
９．２．７．２ｎｉｇ）（Ｉ
３ １０．７、３．３、２．４Ｈｉｎｄ
ｌＩＩ ２
０．８、 １５．６ＡｖａＩ ２
３．９．１２．５Ｐｓｔｌ
６ ４．９．４．９．２．９．１．８．１．５
．０．４ＳａｌＩ ２ １２，６
．３．８また、プラスミドｐＭＴＰ−１及びｐＭＴＰ−
ＩＲの制限酵素切断地図を添付の第１図及！Ｊ第２図に
示す。
ａｎ）ＩＩ ３
９．９、 ４．１、 ２．４Ｈｉｎｄ［Ｉ［２
８，４，８，０ Ａｖａｌ ２ ３．９．１２．
５ＰｓｔＩ ６ ４，９．４．０．３．
８．１．８．１．５．０．４ＳａｌＩ ２
１２．７．３．７ＥｃｏＲＩ ２
９．２．７．２ｎｉｇ）（Ｉ
３ １０．７、３．３、２．４Ｈｉｎｄ
ｌＩＩ ２
０．８、 １５．６ＡｖａＩ ２
３．９．１２．５Ｐｓｔｌ
６ ４．９．４．９．２．９．１．８．１．５
．０．４ＳａｌＩ ２ １２，６
．３．８また、プラスミドｐＭＴＰ−１及びｐＭＴＰ−
ＩＲの制限酵素切断地図を添付の第１図及！Ｊ第２図に
示す。
以上に述べた如き特性をもつ本発明のプラスミドｐＭＴ
Ｐ−１及びｐＭＴＰ−ＩＲは、例えば次のようにして製
造することができる。
Ｐ−１及びｐＭＴＰ−ＩＲは、例えば次のようにして製
造することができる。
まず、ｌｌａ Ａ断片にトリプト７アナーゼプロモータ
ー及びこのプロモーターを制御する調節遺伝子を結合し
たＤＮＡＩ！Ｉｉ片（Ｔ断片）の調製は、例えば、染色
体遺伝子中にトリプトフアナーゼオペロンをもつ大腸菌
、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｅｏｌｉＫ−１
２（ＩＦＯ３３０１、ＡＴＣＣ１０７９８、ＡＴＣＣｅ
２３５６２）などから染色体ＤＮＡを抽出し、それから
常法［Ｅ、Ｆ、Ｆｒ１Ｌｓｅｈ、 Ｓａｍｂｒ。
ー及びこのプロモーターを制御する調節遺伝子を結合し
たＤＮＡＩ！Ｉｉ片（Ｔ断片）の調製は、例えば、染色
体遺伝子中にトリプトフアナーゼオペロンをもつ大腸菌
、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｅｏｌｉＫ−１
２（ＩＦＯ３３０１、ＡＴＣＣ１０７９８、ＡＴＣＣｅ
２３５６２）などから染色体ＤＮＡを抽出し、それから
常法［Ｅ、Ｆ、Ｆｒ１Ｌｓｅｈ、 Ｓａｍｂｒ。
ｏｋ、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ ａｔｏｎｉｎｇ″（１９
８２）ｐ、１６４〜１６５、Ｃｏｌｄ Ｓ ｐｒｉｎ
ｇＨａｒｂｏｒ Ｌ ａｂｏｒａｔ。
８２）ｐ、１６４〜１６５、Ｃｏｌｄ Ｓ ｐｒｉｎ
ｇＨａｒｂｏｒ Ｌ ａｂｏｒａｔ。
ｒｙｅ照１に従って、制限酵素ＢａＩＩＩＨＩ及１トｒ
ｉｎｄｌｌｒを用いてトリプトフアナーゼオペロンＤＮ
Ａ断片を切り出すと、約３．２ｋｂのトリプト７アナー
ゼブロモーター及びこのプロモーターを制御する調遺伝
子並びにｔｎａＡを含むＴ断片がイ；シられる。
ｉｎｄｌｌｒを用いてトリプトフアナーゼオペロンＤＮ
Ａ断片を切り出すと、約３．２ｋｂのトリプト７アナー
ゼブロモーター及びこのプロモーターを制御する調遺伝
子並びにｔｎａＡを含むＴ断片がイ；シられる。
一方、ｍ１ｎｉ−Ｆ断片の調節は、例えば、Ｆ因９プラ
スミドを保有する微生物、例えば、大腸菌（Ｅｃｏｌｉ
）Ｋ −１２株（ＡＴＣＣＩ ５１５３、ＡＴＣＣｅ２
３５８９、ＡＴＣＣｃ２３５９０）Ｗからそれ自体公知
の方法で、例えばＰ、Ｇｕｅｒｒｙ＋ ＤＬ。
スミドを保有する微生物、例えば、大腸菌（Ｅｃｏｌｉ
）Ｋ −１２株（ＡＴＣＣＩ ５１５３、ＡＴＣＣｅ２
３５８９、ＡＴＣＣｃ２３５９０）Ｗからそれ自体公知
の方法で、例えばＰ、Ｇｕｅｒｒｙ＋ ＤＬ。
１−ｅ Ｂｌａｎｃ、 Ｓ、Ｆａｌｋｏｗ；Ｊ、Ｂａ
ｃＬｏ、１１ Ｇ、。
ｃＬｏ、１１ Ｇ、。
１０６４（１９７３）等の文献に記載の方法でＦ因子プ
ラスミドを取り出し、それから制限酵素Ｅｃ。
ラスミドを取り出し、それから制限酵素Ｅｃ。
Ｒ１を用いて分子量が約９．２ｋｂの信；旧−Ｆ断片を
切り出すことにより調製することができる。
切り出すことにより調製することができる。
他方、Ｃｏ１Ｅ１プラスミドの自律増殖を司る遺伝子を
含むＤＮＡ断片の供給源としては、Ｃｏ１Ｅ１プラスミ
ドとして代表的なプラスミドｐＢＲ３２２を使用するの
が便利である。
含むＤＮＡ断片の供給源としては、Ｃｏ１Ｅ１プラスミ
ドとして代表的なプラスミドｐＢＲ３２２を使用するの
が便利である。
上記の如くして調製されたＴ断片を制限酵素ＢａｍＨＩ
及［７Ｈｉｎｄ［［で処理したプラスミドｐＢ Ｒ３２
２と一緒にし、Ｔ４’ＤＮＡす〃−ゼを作用させて、プ
ラスミドｐＢＲ３２２に上記Ｔ断片が組み込まれたプラ
スミドを作成する。次いで、このプラスミドをＥｃｏＲ
Ｉで開！ｉさせ、上記のようにして調製されたｍ１ｎｉ
−Ｆ断片と一緒にし、Ｔ４ＤＮＡす〃−ゼを作用させて
結合させることにより、目的とするプラスミドｐＭＴＰ
・１及びｐＭ Ｔ Ｐ −ＩＲを得ることができる。
及［７Ｈｉｎｄ［［で処理したプラスミドｐＢ Ｒ３２
２と一緒にし、Ｔ４’ＤＮＡす〃−ゼを作用させて、プ
ラスミドｐＢＲ３２２に上記Ｔ断片が組み込まれたプラ
スミドを作成する。次いで、このプラスミドをＥｃｏＲ
Ｉで開！ｉさせ、上記のようにして調製されたｍ１ｎｉ
−Ｆ断片と一緒にし、Ｔ４ＤＮＡす〃−ゼを作用させて
結合させることにより、目的とするプラスミドｐＭＴＰ
・１及びｐＭ Ｔ Ｐ −ＩＲを得ることができる。
なお、プラスミドｐＭ Ｔ Ｐ −１およびｐＭＴＰ−
ＩＲの呉体的調製法については後記実施例１でさらに詳
細に説明する。
ＩＲの呉体的調製法については後記実施例１でさらに詳
細に説明する。
このようにして調５！すれる本発明のプラスミドは、フ
ビー数、７５Ｃ多く、宿主の細胞分裂に際して娘細胞に
受は継がれる際に脱落することが少なく安定であるとい
う優れた特性を有する。
ビー数、７５Ｃ多く、宿主の細胞分裂に際して娘細胞に
受は継がれる際に脱落することが少なく安定であるとい
う優れた特性を有する。
従って、本発明のプラスミドはトリプトファンもしくは
トリプトファン透導体の製造において工業的に応用する
ことが大いに期待される。トリプトファンの製造に際し
ては、本発明のプラスミドで宿主が形質転換される。こ
の形質転換に利用できる宿主菌としては、大腸菌が好ま
しい。
トリプトファン透導体の製造において工業的に応用する
ことが大いに期待される。トリプトファンの製造に際し
ては、本発明のプラスミドで宿主が形質転換される。こ
の形質転換に利用できる宿主菌としては、大腸菌が好ま
しい。
また、これら宿主菌に対する本発明のプラスミドの導入
はそれ自体公知の方法、例えば、Ｍ 、 Ｍ ａｎｄｅ
ｌ、Ａ、ＨｉＨａ；Ｊ、Ｍｏｌ、 Ｂｉｏｌ、 ５３
．１５９（１９７０）等の文献に記載の方法で行うこと
ができる。
はそれ自体公知の方法、例えば、Ｍ 、 Ｍ ａｎｄｅ
ｌ、Ａ、ＨｉＨａ；Ｊ、Ｍｏｌ、 Ｂｉｏｌ、 ５３
．１５９（１９７０）等の文献に記載の方法で行うこと
ができる。
このようにして形質転換された宿主菌はそれ自体公知の
方法で培養することにより、トリプトアナーゼを菌体内
に充分に生産蓄積させることができる。
方法で培養することにより、トリプトアナーゼを菌体内
に充分に生産蓄積させることができる。
トリプトアナーゼは、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａ
ｎｄＢ ｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｂｅｍｉｓｔｒｙ
Ｖ ｏｆ ３６、Ｎ０１３、Ｐ２５２３〜２５２８（
１９７２）、特公告昭４９−４６９１７号公報などの文
献により知られているように、インドール、５ヒドロキ
シインドール、５−７ミフインドール、５−メチルイン
ドールなどのインドール類と、ピルビン酸、オキザロ酢
酸、リンゴ酸、７マール酸、グリオキシル酸、乳酸など
の有機酸の少なくとも１つと、アンモニウムイオンとか
ら；あるいは上記インドール類とシスティン、シスチン
、Ｓ−メチルシスティン、セリンなどのアミノ酸のうち
の少なくとも１つとから、Ｌ−）リブリフアンまたはＬ
−）すブト７アン誘導体を製造する際の酵素反応に利用
することができる。
ｎｄＢ ｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｂｅｍｉｓｔｒｙ
Ｖ ｏｆ ３６、Ｎ０１３、Ｐ２５２３〜２５２８（
１９７２）、特公告昭４９−４６９１７号公報などの文
献により知られているように、インドール、５ヒドロキ
シインドール、５−７ミフインドール、５−メチルイン
ドールなどのインドール類と、ピルビン酸、オキザロ酢
酸、リンゴ酸、７マール酸、グリオキシル酸、乳酸など
の有機酸の少なくとも１つと、アンモニウムイオンとか
ら；あるいは上記インドール類とシスティン、シスチン
、Ｓ−メチルシスティン、セリンなどのアミノ酸のうち
の少なくとも１つとから、Ｌ−）リブリフアンまたはＬ
−）すブト７アン誘導体を製造する際の酵素反応に利用
することができる。
しかして、培養された菌体を該酵素反応に＋１１用する
場合、該菌体はそのままで使用することができるが、該
菌体を超音波処理等で破砕した破砕物、又はその破砕物
をさらに水等で抽出した抽出物、或いは該抽出物をさら
に硫安等で処理して酸素成分を沈澱させた粗Ｎ製物の形
で使用することらでき、さらに、該菌体又はそれら処理
物は必要により固体化して用いることもできる。
場合、該菌体はそのままで使用することができるが、該
菌体を超音波処理等で破砕した破砕物、又はその破砕物
をさらに水等で抽出した抽出物、或いは該抽出物をさら
に硫安等で処理して酸素成分を沈澱させた粗Ｎ製物の形
で使用することらでき、さらに、該菌体又はそれら処理
物は必要により固体化して用いることもできる。
該菌体又はその処理物の存在下でのインドールとピルビ
ン酸またはその塩とアンモニウムイオンとの反応は、通
常の酵素反応と同様に例えば０゜１ Ｍ ’） ７酸緩
衝１ｆｆｌ（ｐＨ７，５−１０，０）あるいは水（ｐｉ
（７，５〜１０．０）等の溶媒中で、約２０〜約５０°
Ｃ１好ましくは約３０〜約４０°Ｃの温度で通常約１０
〜約７２時間で行なわれる。
ン酸またはその塩とアンモニウムイオンとの反応は、通
常の酵素反応と同様に例えば０゜１ Ｍ ’） ７酸緩
衝１ｆｆｌ（ｐＨ７，５−１０，０）あるいは水（ｐｉ
（７，５〜１０．０）等の溶媒中で、約２０〜約５０°
Ｃ１好ましくは約３０〜約４０°Ｃの温度で通常約１０
〜約７２時間で行なわれる。
インドールとピルビン酸またはその塩とアンモニウムイ
オンの反応時の使用量、酵素反応に対し阻害がない程度
の濃度であれば特に制限はないが、一般にはそれぞれを
０．１−２０％（ｗｔ／ｖｏｌ）の濃度範囲で使用する
のが適当である。まｔこ、該菌体又はその処理物の使用
量もＶｆｌこ制限されるものではないが、一般に１〜１
０％（ｗｔ／ｖｏｌ）の濃度で使用することができる。
オンの反応時の使用量、酵素反応に対し阻害がない程度
の濃度であれば特に制限はないが、一般にはそれぞれを
０．１−２０％（ｗｔ／ｖｏｌ）の濃度範囲で使用する
のが適当である。まｔこ、該菌体又はその処理物の使用
量もＶｆｌこ制限されるものではないが、一般に１〜１
０％（ｗｔ／ｖｏｌ）の濃度で使用することができる。
なお、上記形質転換された菌の培養は、宿主菌の種類に
よって異なるが、一般には、通常用いられる合成或いは
天然培地を用いて行なうことができる。しかして炭素源
としては、グルツース□、グリセロール、７ラクトース
、シュクロース、糖蜜等の種々の炭化化物が使用できる
。まｊこ、窒素源としては、トリプトン、酵母エキス、
コーン・スチープ・リカー、カゼイン加水分解物等の天
然６機窒素源が使用できる。天然有機窒素源の多くは窒
素源と共に炭素源にもなり得る。また、培地には、Ｌ−
）リプドアアン及び／又は５−メチルトリプトファン、
５−オキシトリプトファン等などのトリプトファン誘導
体を通常０．０１％（四ｔ／ｖｏｌ）以上、好ましくは
０．１％〜１．０％耐／νｏ１程度の濃度で存在させる
ことが好ましい。
よって異なるが、一般には、通常用いられる合成或いは
天然培地を用いて行なうことができる。しかして炭素源
としては、グルツース□、グリセロール、７ラクトース
、シュクロース、糖蜜等の種々の炭化化物が使用できる
。まｊこ、窒素源としては、トリプトン、酵母エキス、
コーン・スチープ・リカー、カゼイン加水分解物等の天
然６機窒素源が使用できる。天然有機窒素源の多くは窒
素源と共に炭素源にもなり得る。また、培地には、Ｌ−
）リプドアアン及び／又は５−メチルトリプトファン、
５−オキシトリプトファン等などのトリプトファン誘導
体を通常０．０１％（四ｔ／ｖｏｌ）以上、好ましくは
０．１％〜１．０％耐／νｏ１程度の濃度で存在させる
ことが好ましい。
培養は、振盪培養あるは通気攪拌深部培養などの好気的
条件下に行うことができる。培養温度は一般に２０〜ｓ
ｏ’ｃｔ’あり、培地中の培地のｐ ）−１は中性また
は微アルカリ性附近に維持することが望ましい、培養期
間は、通常１〜５日である。
条件下に行うことができる。培養温度は一般に２０〜ｓ
ｏ’ｃｔ’あり、培地中の培地のｐ ）−１は中性また
は微アルカリ性附近に維持することが望ましい、培養期
間は、通常１〜５日である。
上記のような培養方法によって得らｈだ菌体又はその処
理物を用いてインドールとピルビン酸またはその塩とア
ンモニウムイオンとを反応せしめて１）られる、反応液
中に生成したＬ−トリプトファンの分離・調製は、イオ
ン交換ム（Ｎ、活性炭等による吸着、脱着処理等の公知
の方法に上り行うことがｃきる。
理物を用いてインドールとピルビン酸またはその塩とア
ンモニウムイオンとを反応せしめて１）られる、反応液
中に生成したＬ−トリプトファンの分離・調製は、イオ
ン交換ム（Ｎ、活性炭等による吸着、脱着処理等の公知
の方法に上り行うことがｃきる。
また、本発明のプラスミドで形質転換した宿主菌はＬ−
トリプトファンの発酵法による生産にも利用することが
できる。すなわち、本発明のプラスミド″Ｃ形質転換し
た宿主をインドールを含む培地′Ｃ培養すれば、培地中
にＬ−）リプ）７アンが生産蓄積し、これを採取するこ
とによりＬ−）−リプドアアンを製造することができる
。
トリプトファンの発酵法による生産にも利用することが
できる。すなわち、本発明のプラスミド″Ｃ形質転換し
た宿主をインドールを含む培地′Ｃ培養すれば、培地中
にＬ−）リプ）７アンが生産蓄積し、これを採取するこ
とによりＬ−）−リプドアアンを製造することができる
。
犬に実施例により本発明のプラスミドの調製についてさ
らに具体的に説明する。
らに具体的に説明する。
実施例１ニブラスミド ＭＴＰ−１［７ＭＴＰ−１１立
ｘ］− Ａ）ｘ＞ｚ−ユｈＩヒニリ−（Ｅ ５ｅｈｃｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏ↓ゆＬ培地（トリプトン１０ｇ、酵母エキス
５ｇ、グルコース１ｇ、ＮａＣ１５ｇ、Ｊ’留水ＩＮ、
ｐＨ７，２）１００（至）１を容１５００曽１の三角７
ラスフに分注し、１２０°Ｃで１５分間滅菌処理した。
ｘ］− Ａ）ｘ＞ｚ−ユｈＩヒニリ−（Ｅ ５ｅｈｃｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏ↓ゆＬ培地（トリプトン１０ｇ、酵母エキス
５ｇ、グルコース１ｇ、ＮａＣ１５ｇ、Ｊ’留水ＩＮ、
ｐＨ７，２）１００（至）１を容１５００曽１の三角７
ラスフに分注し、１２０°Ｃで１５分間滅菌処理した。
この培地にエシェリヒア・コリ（Ｅｓｐｂｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌ’ｉ）Ｋ １２ＡＴＣＣ２７３２５を植菌
し、３７゛Ｃで１５時間培養を行った後、この培１！液
２鐘１を探り、新たに上記培地１００ｍ１に接種し、再
度３７°Ｃで４時開培養を行なった。
ａ ｃｏｌ’ｉ）Ｋ １２ＡＴＣＣ２７３２５を植菌
し、３７゛Ｃで１５時間培養を行った後、この培１！液
２鐘１を探り、新たに上記培地１００ｍ１に接種し、再
度３７°Ｃで４時開培養を行なった。
培養終了後、この培１！液全量を遠心分離（８０００×
８．１５分間、４°Ｃ）して集菌し、菌体を５０ｔ＊Ｍ
） リ ス援衝ａ（ｐＨ８，０）−１０ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ・２Ｎａ溶液５０＋ｅｌｌ：懸濁した。次にリゾ
ナウムを最終濃度が２ｏ＋ｇ／ｍｌになるように添加し
、５分開靜置後、１０％ドデシル硫酸ナトリウムａ液を
６−１添加し、６５°Ｃで３０分間保温した。この溶菌
液に、５Ｍ ＮａＣ１溶液１５ｍ１を添加し、０°Ｃ
で１時間冷却し、全量を遠心分離（１２０００×ｇ、６
０分間、４ ’Ｃ） Ｌ、上清画分を分取し、２倍量の
エタ／−ルを加え、混合後、遠心分離（５０００Ｘｇ、
１０分間、４°Ｃ）した、得られた沈澱物を１０ｍＭ）
リス緩衝液（ｐＨ７，５）−１＋ｓＭＥＤＴ Ａ・２Ｎ
ａ７８液で溶解させ、７エ／−ル処理（除タンパク処理
）およびＲＮＡ分解酵素による処理をイテない、最終的
にＤＮＡ１．５ｍｇを得た。
８．１５分間、４°Ｃ）して集菌し、菌体を５０ｔ＊Ｍ
） リ ス援衝ａ（ｐＨ８，０）−１０ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ・２Ｎａ溶液５０＋ｅｌｌ：懸濁した。次にリゾ
ナウムを最終濃度が２ｏ＋ｇ／ｍｌになるように添加し
、５分開靜置後、１０％ドデシル硫酸ナトリウムａ液を
６−１添加し、６５°Ｃで３０分間保温した。この溶菌
液に、５Ｍ ＮａＣ１溶液１５ｍ１を添加し、０°Ｃ
で１時間冷却し、全量を遠心分離（１２０００×ｇ、６
０分間、４ ’Ｃ） Ｌ、上清画分を分取し、２倍量の
エタ／−ルを加え、混合後、遠心分離（５０００Ｘｇ、
１０分間、４°Ｃ）した、得られた沈澱物を１０ｍＭ）
リス緩衝液（ｐＨ７，５）−１＋ｓＭＥＤＴ Ａ・２Ｎ
ａ７８液で溶解させ、７エ／−ル処理（除タンパク処理
）およびＲＮＡ分解酵素による処理をイテない、最終的
にＤＮＡ１．５ｍｇを得た。
Ｂ） ）リブト−７アナーゼをＨる゛ ｕＬ前記（Ａ
）で調製した染色体ＤＮＡ２５μｇを、制限酵Ｘ）［１
ｎｄｌｌ及びＢａｍＨＩ（各々５０ ｕｎｉｔｓ）を用
い３０°Ｃ１１時間反応、で切断し、染色体ＤＮＡのＨ
ｉｎｄｌ及びＢａ鴎ＨＴ分解物溶液を？Ａ製した。
）で調製した染色体ＤＮＡ２５μｇを、制限酵Ｘ）［１
ｎｄｌｌ及びＢａｍＨＩ（各々５０ ｕｎｉｔｓ）を用
い３０°Ｃ１１時間反応、で切断し、染色体ＤＮＡのＨ
ｉｎｄｌ及びＢａ鴎ＨＴ分解物溶液を？Ａ製した。
この分）Ｉｆ、物ン容液１こプラスミドｐＢＲ３２２１
ｇｇを制限酵２ ｆ−（ｉ ｎｄ ＩＩ！及び１３ａｍ
Ｉ４Ｉ（各１ ｕｎｉｔ）を用い３０°Ｃ１１時間反応
、で切断して得た分解物溶液をン五合し、５０翔〜１ト
リス援衝液（ｐＨ７，６＞、１０ｍＭ）千オスレイトー
ル、１懐Ｍ ＡＴＰ、１０ ｍ Ｍ ！’ｉｉ ｇ
Ｃｌ ２及びＴ４す〃−ゼ１ｕｎｉしの各成分を添加し
く各成分の濃度は最終濃度である）、１６℃で１５時開
反応させ、結合させた。
ｇｇを制限酵２ ｆ−（ｉ ｎｄ ＩＩ！及び１３ａｍ
Ｉ４Ｉ（各１ ｕｎｉｔ）を用い３０°Ｃ１１時間反応
、で切断して得た分解物溶液をン五合し、５０翔〜１ト
リス援衝液（ｐＨ７，６＞、１０ｍＭ）千オスレイトー
ル、１懐Ｍ ＡＴＰ、１０ ｍ Ｍ ！’ｉｉ ｇ
Ｃｌ ２及びＴ４す〃−ゼ１ｕｎｉしの各成分を添加し
く各成分の濃度は最終濃度である）、１６℃で１５時開
反応させ、結合させた。
この溶状を用い、常法［Ｍ−Ｍａｎｄｃｌ、Ａ）（ｉｇ
ａ； Ｊ 、 Ｍ ｏｆ、 Ｂ ｉｏｌ、 、旦、１５
９（１９７０）参照１に従って、エシエリヒア・コリ（
Ｅ ５ｃｂｃｒｉｃｈｉａＣｏｌｉ）Ｋ １２系株（ト
リプトアナーゼ欠損変異およびトリプトアナーゼ要求性
変異株）を形質転換し、選択培地（ＫｚＨＰＯ４７８、
ＫＨ，Ｐｏ。
ａ； Ｊ 、 Ｍ ｏｆ、 Ｂ ｉｏｌ、 、旦、１５
９（１９７０）参照１に従って、エシエリヒア・コリ（
Ｅ ５ｃｂｃｒｉｃｈｉａＣｏｌｉ）Ｋ １２系株（ト
リプトアナーゼ欠損変異およびトリプトアナーゼ要求性
変異株）を形質転換し、選択培地（ＫｚＨＰＯ４７８、
ＫＨ，Ｐｏ。
２ｇ、（ＮＨ＋）２ｓＯｎ１ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０
０，１ｇ、カザミノ酸、ｓＦｌ、ＤＬ−５−メチル−ト
リプトファン ５０Ｂ、グリセリン２ｇ、寒天２０ｇ、
純水１１）に塗抹した。この培地上の生「株をＬ培地に
アンピシリンを最終濃度で５０μｇ／ ＋ｎ ｌ ”７
む培地に植菌し、３７°Ｃで７時開培重した後、ｍ体を
遠心分離（８０００Ｘｇ、１０分間、４℃）により巣め
た。この菌体を用いてＹリブドア７ナーゼ活性を調べた
。
０，１ｇ、カザミノ酸、ｓＦｌ、ＤＬ−５−メチル−ト
リプトファン ５０Ｂ、グリセリン２ｇ、寒天２０ｇ、
純水１１）に塗抹した。この培地上の生「株をＬ培地に
アンピシリンを最終濃度で５０μｇ／ ＋ｎ ｌ ”７
む培地に植菌し、３７°Ｃで７時開培重した後、ｍ体を
遠心分離（８０００Ｘｇ、１０分間、４℃）により巣め
た。この菌体を用いてＹリブドア７ナーゼ活性を調べた
。
反応液（０，ＩＭリン酸緩衝液ｐ［（８，０，１０慎Ｍ
） １７ ７’ ） ７ ７ ：／ 、
０ 、１ ％ ） ’Ｊ ） ン Ｘ−１００
）１ｍｌに７ｇｍ体５０ｍｇを加え、３７°Ｃで３０分
間反応させた。生成するインドールをｐ−ノメチルベン
：！：アルデヒドを用いて呈色させたところ、赤色に呈
色した株が得られた。この株より、アルカリ−３ＤＳ
法［Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ＋Ｅ、Ｆ、Ｆｒ１ｔｓｃｈ＋
Ｊ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ；“Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ
ｅｌｏｉｅｎｇ”（１９８２）ｐ９０〜９１参照１に
よりプラスミドを抽出し、プラスミドをＢａｗＨＩ及び
Ｈｉｎｄ［［で切断し分子量を７ガロースデルを用いて
調べたところ、ｐＢＲ３２２のＨｉｎｄｌｌＩ及びＢａ
ｗＨＩ？ｆＫ位に約３．２ｋｂのＤＮＡの挿入がみられ
た。
） １７ ７’ ） ７ ７ ：／ 、
０ 、１ ％ ） ’Ｊ ） ン Ｘ−１００
）１ｍｌに７ｇｍ体５０ｍｇを加え、３７°Ｃで３０分
間反応させた。生成するインドールをｐ−ノメチルベン
：！：アルデヒドを用いて呈色させたところ、赤色に呈
色した株が得られた。この株より、アルカリ−３ＤＳ
法［Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ＋Ｅ、Ｆ、Ｆｒ１ｔｓｃｈ＋
Ｊ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ；“Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ
ｅｌｏｉｅｎｇ”（１９８２）ｐ９０〜９１参照１に
よりプラスミドを抽出し、プラスミドをＢａｗＨＩ及び
Ｈｉｎｄ［［で切断し分子量を７ガロースデルを用いて
調べたところ、ｐＢＲ３２２のＨｉｎｄｌｌＩ及びＢａ
ｗＨＩ？ｆＫ位に約３．２ｋｂのＤＮＡの挿入がみられ
た。
さらに、このプラスミド溶液を用いて、上記宿主に再形
質転換したところ、約１０ ’ｃｅｌｌｓ／μｇＤＮＡ
の頻度で選択培地に生育する株が現れた。
質転換したところ、約１０ ’ｃｅｌｌｓ／μｇＤＮＡ
の頻度で選択培地に生育する株が現れた。
Ｃ） Ｆプラスミド白米ｍ１ｎｉ−Ｆ−断りγ！λ土
し堡−り培地にエシエリヒア・コリ（Ｅ ５ｃｈｃｒｉ
ｃｈｉａＣｏｌｉ）Ｋｌ ２ ＹＫ２００４（ＦＥＲ
Ｍ−Ｐ−７８３８）を植菌し、アルカリ−６ＤＳ法によ
りプラスミドｐＭＴＹ−２を抽出した。このプラスミド
ｐＭＴＹ−２２μｇと、前記プラスミドｐＢＲ３２２−
ｔｎａＡ１／ｊＨを制限酵素Ｅ ｅｏＲＴ ５ ｕｎ
ｉｔｓを用いて３７°Ｃで１時間反応させるこにより切
断し、６５°Ｃで１０分間保温することにより、Ｅｃｏ
ＲＩを失活させｒこ後、該失活溶液中の成分が最終濃度
として各々５０協Ｍトリス緩衝液ｐＨ７，６、ｌｏｎ＋
ＭＭｇＣ＋□、１０ｕＭノチオスレイトール、１ｍＭＡ
ＴＰ及びＴ ４１Ｊ 、ｆ−ゼｌｕｎ己になるように各
成分を強化し、１６゛Ｃで１５時間保温しｔこ。この溶
液を用いてエシェリヒアやコリ（Ｅｓｃｈｃｒｉｃｌ目
ａｃｏｌｉ）Ｋ １２系株（トリプトアナーゼ欠損変異
及びトリプトファン要求性変異株）を常法に従って形質
転換させ、上記選択培地に塗床し、３７℃で２日間培養
した。生育してきた株につき、アルカリ−３ＤＳ法によ
りプラスミドを抽出し、制限酵素ＥｅｏＲ１（５ｕｎｉ
ｔｓ）およゾＨ１ｎｄｌＩＩ （５ｕｎｉｔｓ）を用い
てプラスミドを切断し、アガロースデル電気泳動を用い
て分子量を測定したところ、プラスミドｐＭＴＹ−２に
含まれているｕｉｎｉ−Ｆ断片（９，２ｋｂ）がＥｃｏ
ＲＩｅ位に組み込よｒＬだプラスミドが５つ（％）得ら
れた。さらに、これら５つのプラスミドのＨｉｎｄｌｌ
切断パターンを調べたところ、１ｉｎｉ−Ｆ断片が異な
る配位で結合したプラスミドが１つ存在することを確認
した。これらのプラスミドをｐＭＴＰ−１及びｐＭＴＰ
−ＩＲと命名し、それらの制限酵素切断地図は第１図及
び第２図に示すとおりであった。
し堡−り培地にエシエリヒア・コリ（Ｅ ５ｃｈｃｒｉ
ｃｈｉａＣｏｌｉ）Ｋｌ ２ ＹＫ２００４（ＦＥＲ
Ｍ−Ｐ−７８３８）を植菌し、アルカリ−６ＤＳ法によ
りプラスミドｐＭＴＹ−２を抽出した。このプラスミド
ｐＭＴＹ−２２μｇと、前記プラスミドｐＢＲ３２２−
ｔｎａＡ１／ｊＨを制限酵素Ｅ ｅｏＲＴ ５ ｕｎ
ｉｔｓを用いて３７°Ｃで１時間反応させるこにより切
断し、６５°Ｃで１０分間保温することにより、Ｅｃｏ
ＲＩを失活させｒこ後、該失活溶液中の成分が最終濃度
として各々５０協Ｍトリス緩衝液ｐＨ７，６、ｌｏｎ＋
ＭＭｇＣ＋□、１０ｕＭノチオスレイトール、１ｍＭＡ
ＴＰ及びＴ ４１Ｊ 、ｆ−ゼｌｕｎ己になるように各
成分を強化し、１６゛Ｃで１５時間保温しｔこ。この溶
液を用いてエシェリヒアやコリ（Ｅｓｃｈｃｒｉｃｌ目
ａｃｏｌｉ）Ｋ １２系株（トリプトアナーゼ欠損変異
及びトリプトファン要求性変異株）を常法に従って形質
転換させ、上記選択培地に塗床し、３７℃で２日間培養
した。生育してきた株につき、アルカリ−３ＤＳ法によ
りプラスミドを抽出し、制限酵素ＥｅｏＲ１（５ｕｎｉ
ｔｓ）およゾＨ１ｎｄｌＩＩ （５ｕｎｉｔｓ）を用い
てプラスミドを切断し、アガロースデル電気泳動を用い
て分子量を測定したところ、プラスミドｐＭＴＹ−２に
含まれているｕｉｎｉ−Ｆ断片（９，２ｋｂ）がＥｃｏ
ＲＩｅ位に組み込よｒＬだプラスミドが５つ（％）得ら
れた。さらに、これら５つのプラスミドのＨｉｎｄｌｌ
切断パターンを調べたところ、１ｉｎｉ−Ｆ断片が異な
る配位で結合したプラスミドが１つ存在することを確認
した。これらのプラスミドをｐＭＴＰ−１及びｐＭＴＰ
−ＩＲと命名し、それらの制限酵素切断地図は第１図及
び第２図に示すとおりであった。
Ｌ培地（トリプトン１０ｇ、酵母エキス５８、ＮａＣ１
５ｇ、グルツース１ｇ、蒸留水１１ｐ８７．２）１００
ｍｌを容量５００ＩＩ＋ｌの三角フラスコに分注し、１
２０°Ｃで１５分間滅菌処理した。この培地にエシエリ
ヒア・コリ（Ｅｓｅｈｃｒｉｃｈｉａ ｅｏｌｉ）Ｋ
１２ＡＴＣＣ２７３２５株を公知の方法［実験農芸化
学（下）ｆｊＳ３版Ｐ２２６〜２３０（３１ｊ京大学農
学部Ｓ芸化学教室編、朝倉書店、昭和５３年５月２５日
発行）参照１で処理した変異株（）リプドアアン要求、
アデニン要求）リブト７アナーゼ欠失）を稙ｍし、３７
°Ｃで１５時間培養を行なった後、この培養−ａ２ｍｌ
を探り、新たに上記培地１００ｍ１に接種し、再度３７
℃で２時間培養を行なった。培養終了後、この培養物の
３０ｍ１を無菌的に遠心分離（８０００Ｘｇ、５分間
４°Ｃ）して集菌した。
５ｇ、グルツース１ｇ、蒸留水１１ｐ８７．２）１００
ｍｌを容量５００ＩＩ＋ｌの三角フラスコに分注し、１
２０°Ｃで１５分間滅菌処理した。この培地にエシエリ
ヒア・コリ（Ｅｓｅｈｃｒｉｃｈｉａ ｅｏｌｉ）Ｋ
１２ＡＴＣＣ２７３２５株を公知の方法［実験農芸化
学（下）ｆｊＳ３版Ｐ２２６〜２３０（３１ｊ京大学農
学部Ｓ芸化学教室編、朝倉書店、昭和５３年５月２５日
発行）参照１で処理した変異株（）リプドアアン要求、
アデニン要求）リブト７アナーゼ欠失）を稙ｍし、３７
°Ｃで１５時間培養を行なった後、この培養−ａ２ｍｌ
を探り、新たに上記培地１００ｍ１に接種し、再度３７
℃で２時間培養を行なった。培養終了後、この培養物の
３０ｍ１を無菌的に遠心分離（８０００Ｘｇ、５分間
４°Ｃ）して集菌した。
滅菌処理を行なった１ ００ｍＭ ＭｇＣｌ２溶液３
０ｍ１に懸濁後、遠心分離（８０００ｘｇ５分開分開’
Ｃ）を行ない。あらかじめ０”Ｃに冷却しておいた滅菌
処理済の１００ｍＭ ＣａＣｌ２１０ａ＋Ｉに再懸濁
し、この懸濁液を水中にて、１時開冷却した。
０ｍ１に懸濁後、遠心分離（８０００ｘｇ５分開分開’
Ｃ）を行ない。あらかじめ０”Ｃに冷却しておいた滅菌
処理済の１００ｍＭ ＣａＣｌ２１０ａ＋Ｉに再懸濁
し、この懸濁液を水中にて、１時開冷却した。
冷却終了後、この懸濁ｉ（［１００μｍにプラスミドｐ
ＭＴＰ−１０，５μｇ又はｐＭＴＰ−ＩＲｏ。
ＭＴＰ−１０，５μｇ又はｐＭＴＰ−ＩＲｏ。
５μｇを添加し、水中にて３０分間冷却した。次に４２
°Ｃにて２分間加温し、選択培地（Ｋ２ＨＰＯイアｇ、
ＫＨ２ＰＯ４２ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯイ １ｇ、Ｍｇ６
０．７ＨｚＯＯ，Ｉｇ、 カザミノ酸 ５８、ＤＬ−
メチルトリプトファン５０ｍｇ、塩酸アデニン５０Ｂ、
グリセリン２ｇ１アンビンリン２０１Ｉ＋ｇ、寒天２０
ｇ、純水１２）に塗床し、３７゛Ｃにて２４時間培養し
、生ゴした菌株を得た。プラスミドｐＭ ＴＰ −１で
形質転換された株をＹＫ３００２と命名し、プラスミド
ｐＭＴＰ−１Ｒで形質転換された株をＹＫ３００３と命
名した。
°Ｃにて２分間加温し、選択培地（Ｋ２ＨＰＯイアｇ、
ＫＨ２ＰＯ４２ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯイ １ｇ、Ｍｇ６
０．７ＨｚＯＯ，Ｉｇ、 カザミノ酸 ５８、ＤＬ−
メチルトリプトファン５０ｍｇ、塩酸アデニン５０Ｂ、
グリセリン２ｇ１アンビンリン２０１Ｉ＋ｇ、寒天２０
ｇ、純水１２）に塗床し、３７゛Ｃにて２４時間培養し
、生ゴした菌株を得た。プラスミドｐＭ ＴＰ −１で
形質転換された株をＹＫ３００２と命名し、プラスミド
ｐＭＴＰ−１Ｒで形質転換された株をＹＫ３００３と命
名した。
出」ｙ−柩スｍ咀り１追Ｚ１５ぼりｔ戊Ｊ−ｐＭＴＰ−
１１０５ ｐＭ１０５ｐ Ｆ＜ １ ０’対
照区 Ｏ このプラスミドｐＭＴＰ−１を保持する形質転換株エシ
エリヒア・コリに１２ ＹＫ３００２は、茨城県筑波
部谷田部町東１丁目１番３号の工業技術院微生物工業技
術研究所に、昭和６１年７月１０日付℃受託番号：徽工
研寄第８８４４号（Ｆ Ｅ ＲＭ Ｐ−８８４４）と
して、そしてプラスミドｐＭＴＰ−ＩＲを保持する形質
転換株エシェリヒア・フ１７ Ｋ １２ Ｙ Ｋ ３
００３は、同様に昭和６１年７月１０日付で受託番号：
微工研寄ｐｔｆＪ８８４５号（ＦＥＲＭ Ｐ−８８４
５）として寄託されている。
１１０５ ｐＭ１０５ｐ Ｆ＜ １ ０’対
照区 Ｏ このプラスミドｐＭＴＰ−１を保持する形質転換株エシ
エリヒア・コリに１２ ＹＫ３００２は、茨城県筑波
部谷田部町東１丁目１番３号の工業技術院微生物工業技
術研究所に、昭和６１年７月１０日付℃受託番号：徽工
研寄第８８４４号（Ｆ Ｅ ＲＭ Ｐ−８８４４）と
して、そしてプラスミドｐＭＴＰ−ＩＲを保持する形質
転換株エシェリヒア・フ１７ Ｋ １２ Ｙ Ｋ ３
００３は、同様に昭和６１年７月１０日付で受託番号：
微工研寄ｐｔｆＪ８８４５号（ＦＥＲＭ Ｐ−８８４
５）として寄託されている。
実施例３：Ｕ−転」灸生立交疋１
前記の選択培地１００ｍ１を５００ｍ１容三角フラスコ
に分注し、１２０℃で１５分間滅菌処理したものに、実
施例２で得た形質転換株をそれぞれ植菌し、３７°Ｃに
て２４時間振盪培養を行なった後、同様にして調製した
Ｌ培地１００１を５００ｍ１容三角プラスフに分注し、
１２０ ’Ｃで１５分間滅菌したものに１０１当０５０
ｃｅｌｌｓの左１合になるように稙継し、同じく３７°
Ｃにて２４時間振盪培養を行なった６次に遠心分離数を
用いて集菌し、菌体を洗浄後、アンピシリンを５０μ８
／請１の割合で添加したし培地および無添加のＬ培地と
して調製した平板培地に一定量塗抹し、３７゛Ｃにて１
日培養後生をコロニーをカウントする。
に分注し、１２０℃で１５分間滅菌処理したものに、実
施例２で得た形質転換株をそれぞれ植菌し、３７°Ｃに
て２４時間振盪培養を行なった後、同様にして調製した
Ｌ培地１００１を５００ｍ１容三角プラスフに分注し、
１２０ ’Ｃで１５分間滅菌したものに１０１当０５０
ｃｅｌｌｓの左１合になるように稙継し、同じく３７°
Ｃにて２４時間振盪培養を行なった６次に遠心分離数を
用いて集菌し、菌体を洗浄後、アンピシリンを５０μ８
／請１の割合で添加したし培地および無添加のＬ培地と
して調製した平板培地に一定量塗抹し、３７゛Ｃにて１
日培養後生をコロニーをカウントする。
この結果、どちらの形質転換株らアンピリジン添加およ
び無添加培地に生をしたコロニーは同数であること、さ
らにＬ培地生■コロニーは全て実施例１で用いた選択培
地に生をすること、すなわち該プラスミドの高度の安定
性を確認した。
び無添加培地に生をしたコロニーは同数であること、さ
らにＬ培地生■コロニーは全て実施例１で用いた選択培
地に生をすること、すなわち該プラスミドの高度の安定
性を確認した。
実施例３ニトリブト７アナーイ遁１−Ｏ」見り培地１０
０曽１を５００＋ａｌ容三角フラスコに分注し、１２０
°Ｃで１５分間滅菌処理したらのに、実施例１で得ｔこ
形質転換株を植菌し、３７゛Ｃにて１日振盪培養後、同
様にして調製したトリプトファンを２００ｐＦｉ／ｍｌ
の濃度で含有するし培地１００儂１に０ 、２ ｍｌ接
種し、同じく３７°Ｃにて８時間振盪培養した。該培１
！液を遠心分離することにより菌体をｉ菌し、１００＋
Ｍ）リス緩ｉ液（ｐＨ８，０）５０ＩｌｌＩにて洗浄し
、再び遠心分離を行い集画後、湿漬体を２００１１ｇ採
取し、１輸Ｉの１００−Ｍトリス緩衝［（ｐＨ８、Ｏ）
に懸濁し超音波処理を行なった。処理後の菌体破砕物を
適当に１００ｍＮ・１トリス緩衝液（ｐ！４８．０）で
希釈して、１恒１中に１ ０ ０ μｍｏｌｅ）
リ スｆｆ１ｉｔｉａ（ｐＨ８，０） 、 １００ μ
ｍｏｌｅ Ｋ Ｃｌ、１０μｍｏｌｅ Ｌ−トリプ
トファン、０．０３μｍｏｌｅピリドキサールー５−リ
ン酸を含む反応液に加えて３７°Ｃ１５分間反応させた
後、常法［０，Ｈ，Ｓ＋５ｉＬｈ ａｎｄ Ｃ，Ｙ
ａｎｏｆａｓｋｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ Ｅ ｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ”、 Ａ ｃａｄｅｍｉｃ＋ Ｎ
ｅｗ Ｙ ｏｒｋ（１９６２）、ｖｏｌ ５、ｐ
７９４〜８０６１に従い生成するインドールを定量した
。
０曽１を５００＋ａｌ容三角フラスコに分注し、１２０
°Ｃで１５分間滅菌処理したらのに、実施例１で得ｔこ
形質転換株を植菌し、３７゛Ｃにて１日振盪培養後、同
様にして調製したトリプトファンを２００ｐＦｉ／ｍｌ
の濃度で含有するし培地１００儂１に０ 、２ ｍｌ接
種し、同じく３７°Ｃにて８時間振盪培養した。該培１
！液を遠心分離することにより菌体をｉ菌し、１００＋
Ｍ）リス緩ｉ液（ｐＨ８，０）５０ＩｌｌＩにて洗浄し
、再び遠心分離を行い集画後、湿漬体を２００１１ｇ採
取し、１輸Ｉの１００−Ｍトリス緩衝［（ｐＨ８、Ｏ）
に懸濁し超音波処理を行なった。処理後の菌体破砕物を
適当に１００ｍＮ・１トリス緩衝液（ｐ！４８．０）で
希釈して、１恒１中に１ ０ ０ μｍｏｌｅ）
リ スｆｆ１ｉｔｉａ（ｐＨ８，０） 、 １００ μ
ｍｏｌｅ Ｋ Ｃｌ、１０μｍｏｌｅ Ｌ−トリプ
トファン、０．０３μｍｏｌｅピリドキサールー５−リ
ン酸を含む反応液に加えて３７°Ｃ１５分間反応させた
後、常法［０，Ｈ，Ｓ＋５ｉＬｈ ａｎｄ Ｃ，Ｙ
ａｎｏｆａｓｋｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ Ｅ ｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ”、 Ａ ｃａｄｅｍｉｃ＋ Ｎ
ｅｗ Ｙ ｏｒｋ（１９６２）、ｖｏｌ ５、ｐ
７９４〜８０６１に従い生成するインドールを定量した
。
その結果、本発明のプラスミドｐＭＴＰ−１又はｐＭＴ
Ｐ−ＩＲを保持する大腸菌（ＦＥＲＭ Ｐ−８８４４
及びＦＥＲＭ Ｐ−８８４５）を用いた場合、活性は
いずれも約１５０ ｕｎｉｔｓ（１ｕｎｉｔ＝ ０ 、
１μΦｏ１ｅ生成したインドールｆｆｉ／−ｇタンパク
ｉ／２０分）であった、また、対照として、ｍ１ｎｉ−
Ｆを含まないプラスミドｐＢ Ｒ３２２−ＬｎａＡを保
持する大腸直を用いて、上記方法で活性を調べたところ
、約７０ ｕｎｉｔｓの活性値を示した。
Ｐ−ＩＲを保持する大腸菌（ＦＥＲＭ Ｐ−８８４４
及びＦＥＲＭ Ｐ−８８４５）を用いた場合、活性は
いずれも約１５０ ｕｎｉｔｓ（１ｕｎｉｔ＝ ０ 、
１μΦｏ１ｅ生成したインドールｆｆｉ／−ｇタンパク
ｉ／２０分）であった、また、対照として、ｍ１ｎｉ−
Ｆを含まないプラスミドｐＢ Ｒ３２２−ＬｎａＡを保
持する大腸直を用いて、上記方法で活性を調べたところ
、約７０ ｕｎｉｔｓの活性値を示した。
実施例４：Ｌ−）リブドアアンの１力−下記組成のし培
地５０ｍ１を５００１１１１容三角フラスコに分注し、
１２０°Ｃで１５分間滅菌処理したものに上記実施例２
で得た形質転換株エシエリヒア・コリに−１２（ＦＰＲ
Ｍ Ｐ−８８４４及ＶＦ゛ＰＲＭ Ｐ−８８４５）
を植菌し、３７゛Ｃにて１日振盪培！！後、同様にして
調製したＬ−）リブドアアンを２００ｐｇ／ｍｌの濃度
で含有するＬ培地１００ａ＋ｌに２ω１接触し、同じく
３７°Ｃにて８時間振盪培養した。
地５０ｍ１を５００１１１１容三角フラスコに分注し、
１２０°Ｃで１５分間滅菌処理したものに上記実施例２
で得た形質転換株エシエリヒア・コリに−１２（ＦＰＲ
Ｍ Ｐ−８８４４及ＶＦ゛ＰＲＭ Ｐ−８８４５）
を植菌し、３７゛Ｃにて１日振盪培！！後、同様にして
調製したＬ−）リブドアアンを２００ｐｇ／ｍｌの濃度
で含有するＬ培地１００ａ＋ｌに２ω１接触し、同じく
３７°Ｃにて８時間振盪培養した。
し慶邦の組（
トリプトン １０ｇ
酵母エキス ５ｇ
ＮａＣｌ ５ｇ
グルコース １ｇ
蒸留水 １２
ｐＨ７，２
遠心分離機を用いて菌体を回収し、これをインドール１
．５ｇ、ピルビン酸ナトリウム１．５ｇ、酢酸アンモニ
ウム１．５ｇ、ピリドキサールリン酸０゜５Ｂ及び「ト
リトンＸ−１００ｊ５ｇを含む１００ｍＭトリス緩ｉ液
（ｐＨ８、５）５０ｍｌに懸濁し、振盪しながら３７℃
で５時間反応を行なった。反応終了後、反応物を水で１
０倍に希釈したのち、遠心分離により得た上澄液につい
て高速液体クロマトグラフィーで生成したＬ−）リプド
アアンの分析を行なったところ、いずれの形質転換株を
用いた場合にも、２．１Ｂ／１１１のＬ−）リプドア７
ンの生成が認められた。
．５ｇ、ピルビン酸ナトリウム１．５ｇ、酢酸アンモニ
ウム１．５ｇ、ピリドキサールリン酸０゜５Ｂ及び「ト
リトンＸ−１００ｊ５ｇを含む１００ｍＭトリス緩ｉ液
（ｐＨ８、５）５０ｍｌに懸濁し、振盪しながら３７℃
で５時間反応を行なった。反応終了後、反応物を水で１
０倍に希釈したのち、遠心分離により得た上澄液につい
て高速液体クロマトグラフィーで生成したＬ−）リプド
アアンの分析を行なったところ、いずれの形質転換株を
用いた場合にも、２．１Ｂ／１１１のＬ−）リプドア７
ンの生成が認められた。
反応終了ｆ！５０ｍ１の１０倍希釈液５００鰺１をアン
モニア型強酸性イオン交換樹脂（ダイヤイオン５Ｋ−Ｉ
Ｂ、三菱化！！、製）のカラムを通してＬ−）リブドア
アンを吸Ｎさせたのち、アルカリ溶液で溶出後、濃縮し
Ｌ−）リブドアアンの粗結晶を析出させた。これをア七
トンで洗浄し乾燥してＬ−トリブトファンの結晶を０．
７ｇを得た。
モニア型強酸性イオン交換樹脂（ダイヤイオン５Ｋ−Ｉ
Ｂ、三菱化！！、製）のカラムを通してＬ−）リブドア
アンを吸Ｎさせたのち、アルカリ溶液で溶出後、濃縮し
Ｌ−）リブドアアンの粗結晶を析出させた。これをア七
トンで洗浄し乾燥してＬ−トリブトファンの結晶を０．
７ｇを得た。
なお、対照のためｍｉ旧−Ｆ断片を含まない、プラスミ
ドｐＢ Ｒ３２２−ｔｎａＡを含有する形質転換株を用
いて同様の毘（乍でＬ−）リブドアアンを生成させたと
ころ、Ｌ−）リブドアアンの結晶が０゜３ｇしか得られ
なかった。
ドｐＢ Ｒ３２２−ｔｎａＡを含有する形質転換株を用
いて同様の毘（乍でＬ−）リブドアアンを生成させたと
ころ、Ｌ−）リブドアアンの結晶が０゜３ｇしか得られ
なかった。
ｆｐＪ１図及び第２図はそれぞれプラスミドｐＭＴＰ−
１及びｐＭＴＰ−ＩＲの制限酵素切断地図である。
１及びｐＭＴＰ−ＩＲの制限酵素切断地図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、（ａ）トリプトアナーゼオペロン中の少なくともプ
ロモーター及びこのプロモーターを制御する調節遺伝子
並びにトリプトアナーゼ構造遺伝子を含むＤＮＡ断片と
、 （ｂ）ＣｏｌＥｌ系プラスミドの自律増殖能を司るＤＮ
Ａ断片と、 （ｃ）Ｆプラスミド由来の増殖制御分配系を司る遺伝子
を含むＤＮＡ断片 とから成ることを特徴とする新規なプラスミド。 ２、ＣｏｌＥｌ系プラスミドの自律増殖能を司るＤＮＡ
断片（ｂ）がｐＢＲ３２２由来のものである特許請求の
範囲第１項記載のプラスミド。 ３、Ｆプラスミドの増殖制御分配系を司る遺伝子（ｃ）
がｍｉｎｉＦ断片である特許請求の範囲第１項又は第２
項記載のプラスミド。 ４、トリプトアナーゼオペロンの少なくともプロモータ
ー及びこのプロモーターを制御する調節遺伝子並びにト
リプトアナーゼ構造遺伝子を含むＤＮＡ断片（ａ）が、
大脹菌Ｋ１２系株の染色体ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨ
I 及びＨｉｎｄIIIで切り出すことにより得られる分子
量が約３．２ＫｂのＤＮＡ断片である特許請求の範囲第
１〜３項のいずれかに記載のプラスミド。 ５、プラスミドｐＭＴＰ−１又はｐＭＴＰ−１Ｒである
特許請求の範囲第１〜４項のいずれかに記載のプラスミ
ド。 ６、分子量が約１０．７メガダルトンであり、制限酵素
ＢａｍＨ I 、ＨｉｎｄIII及びＥｃｏＲ I に対する切
断部位がそれぞれ３ヶ所、２ヶ所及び２ヶ所であり、且
つＥｃｏＲ I による切断断片の分子量が約６．０メガ
ダルトン及び約４．７メガダルトンであり、ＢａｍＨ
I による切断断片が約６．４メガダルトン、約２．７メ
ガダルトン及び約１．６メガダルトンであり、そしてＨ
ｉｎｄIIIによる切断断片が約５．５メガダルトン及び
約５．２メガダルトンであることを特徴とするプラスミ
ドｐＭＴＰ−１である特許請求の範囲第５項記載のプラ
スミド。 ７、分子量が約１０．７メガダルトンであり、制限酵素
ＢａｍＨ I 、ＨｉｎｄIII及びＥｃｏＲ I に対する切
断部位がそれぞれ３ヶ所、２ヶ所及び２ヶ所であり、且
つＥｃｏＲＩによる切断断片の分子量が約６．０メガダ
ルトン及び約４．７メガダルトンであり、ＢａｍＨ I
による切断断片が約７．０メガダルトン、約２．１メガ
ダルトン及び約１．６メガダルトンであり、そしてＨｉ
ｎｄIIIによる切断断片が約１０．２メガダルトン及び
約０．５メガダルトンであることを特徴とするプラスミ
ドｐＭＴＰ−１Ｒである特許請求の範囲第５項記載のプ
ラスミド。 ８、プラスミドｐＭＴＰ−１又はｐＭＴＰ−１Ｒで形質
転換されたエシエリヒア・コリＫ１２系微生物。 ９、トリプトフアナーゼオペロン中の少なくともプロモ
ーター及びこのプロモーターを制御する調節遺伝子並び
にトリプトフアナーゼ構造遺伝子を含むＤＮＡ断片とＣ
ｏｌＥ１系プラスミドの自律増殖能を司るＤＮＡ断片と
Ｆプラスミド由来の増殖制御分配系を司る遺伝子を含む
ＤＮＡ断片とから成るプラスミドで形質転換されたエシ
エリヒア・コリの培養物又はその処理物の存在下に、イ
ンドールとピルビン酸又はその塩とアンモニア又はアン
モニウムイオンとを反応させることを特徴とするＬ−ト
リプトフアンの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61169859A JPS6328393A (ja) | 1986-07-21 | 1986-07-21 | 新規なプラスミド |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61169859A JPS6328393A (ja) | 1986-07-21 | 1986-07-21 | 新規なプラスミド |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6328393A true JPS6328393A (ja) | 1988-02-06 |
Family
ID=15894262
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61169859A Pending JPS6328393A (ja) | 1986-07-21 | 1986-07-21 | 新規なプラスミド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6328393A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02255082A (ja) * | 1989-03-28 | 1990-10-15 | Toray Ind Inc | トリプトファナーゼ生産能を有する形質転換体およびｌ―トリプトファンの製造法 |
| US5279951A (en) * | 1989-05-08 | 1994-01-18 | Research Association For Utilization Of Light Oil | Cultivation of transformed microorganisms |
| US10704808B2 (en) | 2015-08-26 | 2020-07-07 | Phc Holdings Corporation | Ultra-low temperature freezer |
-
1986
- 1986-07-21 JP JP61169859A patent/JPS6328393A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02255082A (ja) * | 1989-03-28 | 1990-10-15 | Toray Ind Inc | トリプトファナーゼ生産能を有する形質転換体およびｌ―トリプトファンの製造法 |
| US5279951A (en) * | 1989-05-08 | 1994-01-18 | Research Association For Utilization Of Light Oil | Cultivation of transformed microorganisms |
| US10704808B2 (en) | 2015-08-26 | 2020-07-07 | Phc Holdings Corporation | Ultra-low temperature freezer |
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