JPS61257193A - 光学活性ｏ−ベンジルセリンのラセミ化法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野ン 本発明はＯ−ベンジルセリンのラセミ化法に関する。

０−ベンジルセリン全フェノール、カテコール又はレゾ
ルシノールなどの存在下でβ−チロシナーゼの作用によ
、９Ｌ−チロシン、Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニル
アラニン又はＬ　−２，４−ジヒドロキシフェニルアラ
ニンなどが生成されるので、０−ベンジルセリンは、Ｌ
−チロシン、Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニ
ン又はＬ　−２，４−ジヒドフェニルアラニン等の製造
の際の原料として重要な物質である。

（従来の技術） Ｏ−ベンジルセリンは化学合成法によ）安価に製造され
ている。この化学合成法によって得られる０−ベンジル
セリンは光学的に不活性なりＬ−０−ベンジルセリンで
ある。０−ベンジルセリンを出発原料とした光学的に活
性な物質の製造、例えば本出願人がすでに開発したβ−
チロシナーゼをＯ−ベンジルセリンとフェノール、カテ
コール又はレゾルシノールなどに作用させて、Ｌ−チロ
シン、Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン又は
Ｌ　−２，４−ジヒドロキシフェニルアラニンナトの光
学的に活性な物質ヲ農造する方法（特公昭５３−４３５
９４）がある。この方法はＬ−チロシン、Ｌ　−３，，
４−ジヒドロキシフェニルアラニン又はＬ　−２，４−
ジヒドロキシフェニルアラニンなどの光学的に活性な物
質を製造するための優れた方法である。しかし、この方
法ではβ−チロシナーゼはＬ−０−ベンジルセリンのみ
に作用し、Ｄ−０−ベンジルセリンには作用しないため
に、反応液中にＤ−０−ベンジルセリンが残存するとい
う欠点を有していた。

従来はこのＤ−０−ベンジルセリンを化学的にラセミ化
し、このラセミ化された０−ベンジルセリンをβ−チロ
シナーゼの基質として使用する方法が用りられていた。

しかし、化学的なＯ−ベンジルセリンのラセミ化法は高
温・高圧反応であり、かつ非特異的なラセミ化反応であ
るために、０−ベンジルセリンだけでなく、β−チロシ
ナーゼのニルアラニンなどもラセミ化すること、又β−
チロシナーゼが失活するという欠点があり、このために
、反応液中からＤ−０−ベンジルセリンを単離した後に
Ｄ−０−ベンジルセリンをラセミ化する必要があった。

以上の例のようＩＣ，Ｏ−ベンジルセリンを出発原料と
した光学的に活性な物質を製造する場合に作用を受けま
い０−ベンジルセリンが残存するためにとの０−ベンジ
ルセリンのみを特異的にラセミ化する方法の開発が望ま
れていた。

（本発明が解決しようとする問題点） 本発明が解決しようとする問題点は０−ベンジルセリン
のみを特異的にラセミ化する方法を確立することにある
。

（問題点を解決するための手段） 本発明者らは上述の問題点を解決する丸めに種種研究を
行った結果、アクロモバクタ−属、アシネトバクタ−属
、エアロモナス属、アグロバクテリウム属、アルカリ土
類金属、アースロノ々クター属、プレビバクテリウム属
、セルロモナス属、シトロバクター属、コリネバクテリ
ウム属、エシェリヒア属、エンテロノ々クター属、エル
ビニ７Ｊｉ、フラＭバクテリウム属、ジエンセニア属、
クレプシエラ属、クルイヘラ属、ミクロコツカス属、プ
ラノコッカス属、プロタミノバクタ−属、ゾロテｒ：）
　ｘ　属、シ為−トモナス属、ロドコッカス属、サルモ
ネラ属、ザルチナ属、ストレプトマイセス属、ビブリオ
属、ブレラ属、セファロアスカス属、デバリオマイセス
属、ジオトリカム属、ハンセヌラ属、リボマイセス属、
ピヒア属、ステリグマトマイセス属、トルロプシス属、
トリコスポロン属。

トリボノブシス属、ウインゲア属、ディポダスカス属、
リゾプス属、コリネスＩう属、クルプラリア属、エフェ
リス属、フザリウム属、グロエオセルコスポラ属、スク
レロティニア属、セグトラ属。

スタフ０ノスポラ属、スチムフィリイウム属、トリコセ
シウム属、カララ属、フミコーラ属、ウスチラゴ属、オ
ーレオバシディウム属、バイソクラミス属、ペトリエリ
ディウム属、ケトミウム属、コクリオボラス属、ノイロ
スポラ属、ムコール属、グリオクラディウム属、モニリ
エラ属、シンセファラストラム属、ヘニシリウム属、ア
スペルギシス属、ユーロチーム属、ニーペニシリウム属
、ハミゲラ属、アニキシエラ属、アラクニオタス属。

コリオケタ属、エメリセロプシス属、グラジノスポラ属
、ジムノアスカス属、メラノスポラ属、ミクロアスカス
属、ミクロセシウム属、ポドスポラ属、プルーシア属、
シェードユーロチーム属、ソルダリア属、スポロ−ルミ
ニラ属又はトキソトリクム属に属する微生物の中に、Ｏ
−ベンジルセリンをラセミ化する能力を有する微生物が
存在することを発見した。本発明はこの知見に基づいて
成されたものである。

本発明においてＯ−ベンジルセリンをラセミ化する能力
を有する微生物としては、例えばアクロモバクタ−・ビ
スコサス　　　　　　　　ＡＪ　２３８８（Ａｃｈｒｏ
ｍｏｂａｃｔｅｒ　ｖｉａｃｏｓｕｓ）　　　　　ＡＴ
Ｃｏ　１２４４８アシネトノ々クター・ルウオフイー　
　　　　　　ＡＪ　２５３９（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔ
ｓｒ　　１ｖｏｆｆｉ）　　　　　　　ＡＴＣＣ９０３
６エアロモナス・サルモ二シ／　　　　　　　　　ＡＪ
　２９２６（Ａｅｒｏｍｏｎａａ　　ｓａｌｍｏｎｉｃ
ｉｄａ）　　　　　ＡＴＣＣ１４１７４アグロノぐクテ
リウム・ツメファシェンス　　　ＡＪ　２７７９（Ａｇ
ｒｏｂａａｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｓｆａｃｉｅｎｓ）　
　ＡＴＣＣ４４５２アルカリｒネス・マーシャリイ　　
　　　　　ＡＪ　２１４７（Ａｌｃａｌｌｇｅｎｅｓ　
ｍａｒｓｈａｌｌｉｉ）　　　　　ＡＴＣＣ２１０３０
アースロハクター・シンプレツクス　　　　　ＡＪ　１
４２０（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｓｉｍｐｌｅｘ）
　　　　　　ＡＴＣＣ６９４６ブレピパクテリウム・フ
スカム　　　　　　　ＡＪ　３１２４（Ｂｒｅｖｉｂａ
ａｔｓｒｌｕｍ　ｆｕｓａｕｍ）　　　　ＦＩＲＭ−Ｐ
　ｇ／９＋セルロモナス・フラビゲナ　　　　　　　　
　　ＡＪ　１５６７（Ｃ＠ｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ　ｆｌ
ａｖｉｇｅｎａ）　　　　　ＡＴＣｏ　　４８８シトロ
バクタ−・フロインディ　　　　　　　　ＡＪ　２６１
９（Ｃ１ｔｒｏｂａｃｔｅｒ　ｆｒｅｕｎｄｉｉ）　　
　　　ＡＴＣＣ８０９０コリネバクテリウム・ミチガネ
ンス　　　　　ＡＪ　１３９０（Ｃｏｒｙｎ＠ｂａｃｔ
＠ｒｌｕｍ　ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｅ）　　ＡＴＣＣ
４９２エシエリヒア・コリ　　　　　　　　　　　　　
ＡＪ　２６１０（Ｅｓｃｈａｒｉｃｈｌａ　　ｃｏｌυ
　　　　　　　　ＡＴＣＣ１２８１４エンテロバクタ−
・クロアカニ　　　　　　　ＡＪ　２６４３（Ｅｎｔｅ
ｒｏｂａｃｔｅｒ　　ｃｌｏａｃａｅ）　　　　　　Ａ
ＴＣＣ７２５６アスペルギルス・ルーパ （Ａｓｐ＠ｒｇｉｌｌｕｇ　ｒｕｂｅｒ）　　　　　　
　　ＡＴＣｏ　　９４８１（Ｍｌｃｒｏｔｈ＠ａｉｕｍ
　ｒ＠ｔｉｓｐｏｒｕｍ）　　　　ＡＴＣＣ２２１８４
などがある。

これらの微生物の菌体を得るには、通常の培地を用いて
、培養すればよい。

これらの微生物の培養のために用−られる培地は通常の
炭素源、窒素源、無機イオン等を含有する通常の培地で
ある。

ビタミン、アミノ酸等の有機微量栄養素を添加すると望
ましい結果が得られる場合が多い。

さらに、Ｏ−ベンジルセリンを培地に少量添加すると、
高論ラセミ化能を有する菌体が採取される場合が多い。

炭素源としては、グリコース、シェフロース等の炭水化
物、酢酸等の有機酸、アルコール類、その他が適宜使用
される。窒素源としては゛、アンモニアガス、アンモニ
ア水、アンモニウム塩、ソの他が用いられる。無機イオ
ンとしては、マグネシウムイオン、燐酸イオン、カリイ
オン、鉄イオン。

その他が必要に応じ適宜使用される。

培養は好気的条件下に、−４ないし８、温度２５ないし
４０℃の適当な範囲に制御しつつ工ないし１０日培養を
行えば望ましい結果が得られる。

本発明で用いる微生物の処理物とは上記のようにして得
られる培養物のうち０−ベンジルセリンをラセミ化する
活性を有する画分をいう。このような画分としては、培
養液そのもの、培養液から菌体を除いた液、分離菌体、
洗滌された分離菌体。

分離菌体の分解物又は分解物の精製物などがある。

これらの微生物の処理物はそのまま使用してもよく、凍
結乾燥、アセトン乾燥などの処理を行ってもよく、固定
化などの処理を行ってもよい。

分離菌体を分解する方法はアセトン、トルエン等の有機
溶媒による処理、界面活性剤による処理。

リゾチーム等の溶菌酵素による処理、超音波処理。

機械的な破砕処理などがある。分解物の精製方法として
は通常用いられている蛋白質の精製方法が用いられる。

水溶性媒体としては、水、バッファーおよびエタノール
等の有機溶媒を含むものが使用できる。更に必要に応じ
て、微生物の生育に必要な栄養素、抗酸化剤、界面活性
剤、補酵素、および金属イオン等を水性媒体に添加する
こともできる。

上記微生物の菌体を水溶性媒体中で培養しながら、菌体
と０−ベンジルセリンを接触せしめて作用せしめる場合
には、Ｏ−ベンジルセリンを含み。

かつ微生物の生育に必要な炭素源、窒素源、無機イオン
などの栄養素を含む水性媒体が用いられる。

更にビタミン、アミノ酸等の有機微量栄養素を添加する
と望ましい結果が得られる場合が多い。

炭素源としては、グルコース、シェフロース等の炭水化
物、酢酸等の有機酸、アルコール類、その他が適宜使用
される。窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア
水、アンモニウム塩、その他が用りられる。無機イオン
としては、マグネシウムイオン、燐酸イオン、カリイオ
ン、鉄イオン。

その他が必要に応じ適宜使用される。

培養は好気的条件下に、ｐＨ４ないし８、温度２５ない
し４０℃の適当な範囲に制御しつつ行えば望ましい結果
が得られる。

かくして１な込し１０日間も培養を行えば、〇−ベンジ
ルセリンは効率よくラセミ化される。

これに対し、上記微生物の培養液をそのまま、培養菌体
あるいは菌体処理物をＯ−ベンジルセリンと接触せしめ
て作用せしめる場合には、Ｏ−ベと ンジルセリか菌体処理物を溶解またはけん濁した水性媒
体を１０℃ないし７０℃の適当な温度に調節し、ＰＨｔ
−４ないし８に保ちつつ、暫時静置または攪拌すればよ
−。かくして５ないし１００時間も経過すれば水性媒体
中に多量の０−ベンジルセリンのラセミ化物が生成蓄積
される。

このようＫして得られた０−ベンジルセリンのラセミ化
物を培養液又は水溶液よシ採取する方法は、イオン交換
樹脂を用いる方法、等電点にて沈殿せしめる方法等、通
常の方法が採用される。生成したアミノ酸の定量はアミ
ノ酸７°ナライデーで定量し、光学異性体は、光学異性
体分離カラムを用いた高速液体クロマトで測定すること
によりＤ＃Ｌを定め九。

（効果） 本発明で使用する微生物の処理物は０−ベンジルセリン
のみを特異的にラセミ化するので、０−ベンジルセリン
をフェノール、カテコール又はレゾルシノールの存在下
で、β−チロシナーゼにょシ作用させてＬ−チロシ、Ｌ
　−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン又はＬ　−
２，４−ジヒドロキシフェニルアラニンを生成させる反
応系に１本発明で使用する微生物の処理物を共存させる
と、β−チロシナーゼの作用を受けないＤ−０−ベンジ
ルセリンは本発明で使用する微生物の処理物によシラセ
ミ化され、β−チロシナーゼの作用を受るＬ−０−ベン
ジルセリンが生成される。このため忙、Ｌ−チロシン、
Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン又はＬ　−
２，４−ジヒドロキシフェニルアラニンの生成量が増大
する。

上記の例のようにＯ−ベンジルセリンを出発原料とした
光学的に活性な物質を生成する場合に本発明の方法であ
るＯ−ベンジルセリンのラセミ化法はきわめて有用な方
法である。

以下実施例にて説明する。

（実施例１） ブイヨンスラントで３０℃、２４時間生育させたフラぎ
バクテリウム・フェルギニウムＡＴＣＣ１３５２４又は
エルビニア・へルビコーラＡＴＣＣ２１４３３を、フラ
？バクテリウムの場合には下記に示す培地（５）に、エ
ルピニアの場合には下記に示す培地（Ｂ）に培養した。

これらの培養液全量を遠心分離によシ菌体を採取した。

これらの菌体をＯ−ベンジル−ＤＬ−セリン２１１２乙
ａ。

カテコール１１／ｄｉおよびピリドキサール５′−リン
酸１０１ｎ９／ｄｔｔ−含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ８，０）（終末５！！Ｌｔ）に５１１７ｄｔになる様
に添加し、３０℃で１２時間保持反応した。なお、対照
区として、フラＲバクテリウム・フェルギニウムＡＴＣ
Ｃ１３５２４は添加せｆ　、エルビニア・ヘルピコ−５
ＡＴＣＣ２１４３３のみを反応液に添加し、同様に３０
℃。

１２時間保持反応した。生成したＬ　−３，４−ジヒド
ロキシフェニルアラニンの量をアミノ酸アナライザーで
測定し、この結果を第１表に示した。

第１表に示したようＫＯ−ベンジルセリンをラセミ化す
る能力を有するフラゼパクテリウム・フェルギニウムＡ
ＴＣＣ１３５２４の菌体処理物を共存させた時にＬ　−
３，４ジヒドロキシフエニルアラニンの生成量が増大し
た。

培地（いずれも５００ｍ肩付コルベンに５０ｍの培地を
投入） 培地（４） グルコース　　　　　０．５　１１７ｄｌ硫安　　　　
　　　０６３Ｉ ＫＨ２ＰＯ４０，１＃ に２ＨＰＯ４０，３ｇ ＭｇＳ０４・７Ｈ２００，０５１ ｐｅｓｏ４−７Ｈ２００，００１１ Ｍｎ５Ｏ・４Ｈ００，００１１ 酵母エキス　　　　０．５１ ポリペプトン　　　０．５　１ マルツエキス　　　０，５１ ぎリドキシン塩酸塩　　　１０　■／−炭酸カルシウム
　　　４　　ｙ／ｄｔ　（別殺菌ンｐｉ（：　７．０　
（ＫＯＨ） 殺菌条件：１１５℃、１５分間加圧蒸気殺菌培地（［Ｉ Ｌ−チロシン　　　　　０．２　．９力！ＫＨ２ＰＯ４
０，１１ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，０５１ グリセロール　　　　　０．６１ コハク酸　　　　　　　０．５　１ 酵母エキス　　　　　　２．０　１ 肉エキス　　　　　　　０．５　１ ピリドキシン塩酸塩　　　　　０．０１　　１Ｐ）（：
　　７．５　（ＫｏＨ） 殺菌条件：１１５℃、１５分間加圧蒸気殺菌（実施例２
） ブイヨンスラントで３０℃、２４時間生育させた第２表
に示す微生物を実施例１に示した培地（Ａ）に−白金耳
接種し、３０℃で２４時間振盪培養した。この培養液よ
シ菌体を遠心分離によシ採取し、培養液と同量の生理食
塩水で一回洗浄し、菌体を集めた。

この菌体、ｔ−Ｄ体のＯ−ベンジルセリンＩＩ、にＵお
よびピリドキサール５′−リン酸１０　ｒｖ／′ａを含
む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐｉ−１８，０）に５１！／
ｄｔになる様に添加し、３０℃に２０時間保持反応した
。

Ｄ一体の０−ベンジルセリンがラセミ化されて生成した
Ｌ一体の０−ベンジルセリンの量を光学異性体分離カラ
ムを用いる高速液体クロマトで測定し、この結果を第２
表に示した。

（実施例３） ブイヨンスラントで３０℃２４時間生育させたシュード
モナス・オパリスＡＴＣＣ３４５９ｆ：、実験例１に示
した培地（Ａ）に−白金耳接種し３０Ｃ２４時間振盪培
養した。この培養液よシ菌体を遠心分離によシ採取し、
培養液と同量の生理食塩水で１回洗浄し、菌体を集めた
。この菌体ｔ−Ｌ一体又はＤ一体の０−ベンジルセリン
１１１７ｄｉおよびピリドキサール５′−リン酸１０Ｗ
Ｉ９／ｄｔを含む０．１　Ｍリン酸緩衝液それぞれの反
応に用いた０体又はＬ体の０−ベンジルセリンはほぼ完
全にラセミ化されている事が判明した。この結果を第３
表に示した。

第３表 （実施例４） ブイヨンスラントで３０℃２４時間生育させたアクロモ
バクタ−・ビスコサスＡＴＣＣ１２４４８ｔ　実ｍ例１
に示した培地（Ａ）に−白金耳接種し、３０℃で１２時
間振盪培養したのち、１０ＪｉＦ／ｄｔのＯ−ベンジル
−Ｌ−セリン（ＫＯＨでＰＨ７，０になる様に中和）溶
液ｔ−５ＩＬｌ加えて更に１０時間培養した。０−ベン
ジル−Ｌ−セリンがラーミ化されて生成し九〇−ベンジ
ルーＤ−セリンを光学活性体分離用カラムを用いて高速
液体クロマトで測定した結果０．４３１１７ｄｌの０−
ベンジル−Ｄ−セリンが生成していた。

（実施例５） 実施例３と同様に培養し、洗浄したフラゲパクテリウム
・フェルギニウムＡＴ（’Ｃ１３５２４の菌体を生理食
塩水に２０ｇ／ｄｔになる様に懸濁した菌液５Ｈに４’
％アルプン酸ナトリウム溶液５１Ｊｔ−加え混合したの
ち、１５１１７ｄｔ塩化カルシウム溶液に、この混合液
を徐々に滴下し、ビーズ状の固定化菌体を作成した。こ
の固定化物全量を０体の０−ベンジル−セリンｌｌ１ｄ
ｉ″Ｉｋ含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ）Ｉｓ、ｏ）ｚ
ｏａ／に投入し、３０℃に５時間保持反応させた。この
結果り体のＯ−ベンジル−セリンはラセミ化され、反応
液中には０．４ｊｌ／ｄｔの０−ベンジル−Ｌ−セリン
が生成していた。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 　光学活性０−ベンジルセリンをラセミ化する能力を有
   するアクロモバクター属、アシネトバクター属、エアロ
   モナス属、アグロバクテリウム属、アルカリゲネス属、
   アースロバクター属、プレビバクテリウム属、セルロモ
   ナス属、シトロバクター属、コリネバクテリウム属、エ
   シェリヒア属、エンテロバクター属、エルビニア属、フ
   ラボバクテリウム属、ジエンセニア属、クレプシエラ属
   、クルイヘラ属、ミクロコッカス属、プラノコッカス属
   、プロタミノバクター属、プロテウス属、シュードモナ
   ス属、ロドコッカス属、サルモネラ属、ザルチナ属、ス
   トレプトマイセス属、ビブリオ属、ブレラ属、セファロ
   アスカス属、デバリオマイセス属、ジオトリカム属、ハ
   ンセヌラ属、リポマイセス属、ピヒア属、ステリグマト
   マイセス属、トルロプシス属、トリコスポロン属、トリ
   ゴノプシス属、ウインゲア属、ディポダスカス属、リゾ
   プス属、コリネスポラ属、クルプラリア属、エフェリス
   属、フザリウム属、グロエオセルコスポラ属、スクレロ
   ティニア属、セプトラ属、スタゴノスポラ属、ステムフ
   ィリィウム属、トリコセシウム属、カララ属、フミコー
   ラ属、ウスチラゴ属、オーレオバシディウム属、バイソ
   クラミス属、ペトリエリディウム属、ケトミウム属、コ
   クリオボラス属、ノイロスポラ属、ムコール属、グリオ
   クラディウム属、モニリエラ属、シンセファラストラム
   属、ペニシリウム属、アスペルギルス属、ユーロチーム
   属、ユーペニシリウム属、ハミゲラ属、アニキシエラ属
   、アラクニオタス属、コリオケタ属、エメリセロプシス
   属、ゲラシノスポラ属、ジムノアスカス属、メラノスポ
   ラ属、ミクロアスカス属、ミクロセシウム属、ポドスポ
   ラ属、プルーシア属、シュードユーロチーム属、ソルダ
   リア属、スポロールミエラ属又はトキソトリクム属に属
   する微生物の処理物を水性媒体中で光学活性０−ベンジ
   ルセリンに作用させて光学活性０−ベンジルセリンをラ
   セミ化せしめることを特徴とする光学活性０−ベンジル
   セリンのラセミ化法。