JPH0513631B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

（産業上の利用分野） 本発明はＯ−ベンジルセリンのラセミ化法に関
する。 Ｏ−ベンジルセリンをフエノール、カテコール
又はレゾルシノールなどの存在下でβ−チロシナ
ーゼの作用によりＬ−チロシン、Ｌ−３，４−ジ
ヒドロキシフエニルアラニン又は、Ｌ−２，４−
ジヒドロキシフエニルアラニンなどが生成される
ので、Ｏ−ベンジルセリンは、Ｌ−チロシン、Ｌ
−３，４−ジヒドロキシフエニルアラニン又はＬ
−２，４−ジヒドフエニルアラニン等の製造の際
の原料として重要な物質である。 （従来の技術） Ｏ−ベンジルセリンは化学合成法により安価に
製造されている。この化学合成法によつて得られ
るＯ−ベンジルセリンは光学的に不活性なDL−
Ｏ−ベンジルセリンである。Ｏ−ベンジルセリン
を出発原料とした光学的に活性な物質の製造、例
えば本出願人がすでに開発したβ−チロシナーゼ
をＯ−ベンジルセリンとフエノール、カテコール
又はレゾルシノールなどに作用させて、Ｌ−チロ
シン、Ｌ−３，４−ジヒドロキシフエニルアラニ
ン又はＬ−２，４−ジヒドロキシフエニルアラニ
ンなどの光学的に活性な物質を製造する方法（特
公昭53−43594）がある。この方法はＬ−チロシ
ン、Ｌ−３，４−ジヒドロキシフエニルアラニン
又はＬ−２，４−ジヒドロキシフエニルアラニン
などの光学的に活性な物質を製造するための優れ
た方法である。しかし、この方法ではβ−チロシ
ナーゼはＬ−Ｏ−ベンジルセリンのみに作用し、
Ｄ−Ｏ−ベンジルセリンには作用しないために、
反応液中にＤ−Ｏ−ベンジルセリンが残存すると
いう欠点を有していた。 従来はこのＤ−Ｏ−ベンジルセリンを化学的に
ラセミ化し、このラセミ化されたＯ−ベンジルセ
リンをβ−チロシナーゼの基質として使用する方
法が用いられていた。しかし、化学的なＯ−ベン
ジルセリンのラセミ化法は高温・高圧反応であ
り、かつ非特異的なラセミ化反応であるために、
Ｏ−ベンジルセリンだけでなく、β−チロシナー
ゼの作用により生成したＬ−チロシン、Ｌ−３，
４−ジヒドロキシフエニルアラニン又はＬ−２，
４−ジヒドロキシフエニルアラニンなどもラセミ
化すること、又β−チロシナーゼが失活するとい
う欠点があり、このために、反応液中からＤ−Ｏ
−ベンジルセリンを単離した後にＤ−Ｏ−ベンジ
ルセリンをラセミ化する必要があつた。以上の例
のように、Ｏ−ベンジルセリンを出発原料とした
光学的に活性な物質を製造する場合に作用を受け
ないＯ−ベンジルセリンが残存するためにこのＯ
−ベンジルセリンのみを特異的にラセミ化する方
法の開発が望まれていた。 （本発明が解決しようとする問題点） 本発明が解決しようとする問題点はＯ−ベンジ
ルセリンのみを特異的にラセミ化する方法を確立
することにある。 （問題点を解決するための手段） 本発明者らは上述の問題点を解決するために種
種研究を行つた結果、アクロモバクター属、アシ
ネトバクター属、エアロモナス属、アグロバクテ
リウム属、アルカリゲネス属、アースロバクター
属、ブレビバクテリウム属、セルロモナス属、シ
トロバクター属、コリネバクテリウム属、エシエ
リヒア属、エンテロバクター属、エルビニア属、
フラボバクテリウム属、ジエンセニア属、クレブ
シエラ属、クルイヘラ属、ミクロコツカス属、プ
ラノコツカス属、プロタミノバクター属、プロテ
ウス属、シユードモナス属、ロドコツカス属、サ
ルモネラ属、ザルチナ属、ストレプトマイセス
属、ビブリオ属、ブレラ属、セフアロアスカス
属、ジオトリカム属、ハンセヌラ属、リポマイセ
ス属、ピヒア属、ステリグマトマイセス属、トル
ロプシス属、トリコスポロン属、トリゴノプシス
属、ウインゲア属、デイポダスカス属、リゾプス
属、コリネスポラ属、クルブラリア属、エフエリ
ス属、フザリウム属、グロエオセルコスポラ属、
スクレロテイニア属、セプトラ属、スタゴノスポ
ラ属、ステムフイリイウム属、トリコセシウム
属、カララ属、フミコーラ属、ウスチラゴ属、オ
ーレオバシデイウム属、バイソクラミス属、ペト
リエリデイウム属、ケトミウム属、コクリオボラ
ス属、ノイロスポラ属、ムコール属、グリオクラ
デイウム属、モニリエラ属、シンセフアラストラ
ム属、ペニシリウム属、アスペルギルス属、ユー
ロチーム属、ユーペニシリウム属、ハミゲラ属、
アニキシエラ属、アラクニオタス属、コニオケタ
属、エメリセロプシス属、ゲラシノスポラ属、ジ
ムノアスカス属、メラノスポラ属、ミクロアスカ
ス属、ミクロセシウム属、ポドスポラ属、プルー
シア属、シユードユーロチーム属、ソルダリア
属、スポロールミエラ属又はトキソトリクム属に
属する微生物の中に、光学活性Ｏ−ベンジルセリ
ンをラセミ化する能力を有する微生物が存在する
ことを発見した。本発明はこの知見に基づいて成
されたものである。 本発明において光学活性Ｏ−ベンジルセリンを
ラセミ化する能力を有する微生物としては、例え
ば

【表】

【表】

【表】

【表】 などがある。 これらの微生物の菌体を得るには、通常の培地
を用いて、培養すればよい。 これらの微生物の培養のために用いられる培地
は通常の炭素源、窒素源、無機イオン等を含有す
る通常の培地である。 ビタミン、アミノ酸等の有機微量栄養素を添加
すると望ましい結果が得られる場合が多い。 さらに、Ｏ−ベンジルセリンを培地に少量添加
すると、高いラセミ化能を有する菌体が採取され
る場合が多い。 炭素源としては、グルコース、シユクロース等
の炭水化物、酢酸等の有機酸、アルコール類、そ
の他が適宜使用される。窒素源としては、アンモ
ニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩、その
他が用いられる。無機イオンとしては、マグネシ
ウムイオン、燐酸イオン、カリイオン、鉄イオ
ン、その他が必要に応じ適宜使用される。 培養は好気的条件下に、PH４ないし８、温度25
ないし40℃の適当な範囲に制御しつつ１ないし10
日培養を行えば望ましい結果が得られる。 本発明で用いる微生物の処理物とは上記のよう
にして得られる培養物のうちＯ−ベンジルセリン
をラセミ化する活性を有する画分をいう。このよ
うな画分としては、培養液そのもの、培養液から
菌体を除いた液、分離菌体、洗滌された分離菌
体、分離菌体の分解物又は分解物の精製物などが
ある。これらの微生物の処理物はそのまま使用し
てもよく、凍結乾燥、アセトン乾燥などの処理を
行つてもよく、固定化などの処理を行つてもよ
い。 分離菌体を分解する方法はアセトン、トルエン
等の有機溶媒による処理、界面活性剤による処
理、リゾチーム等の溶菌酵素による処理、超音波
処理、機械的な破砕処理などがある。分解物の精
製方法としては通常用いられている蛋白質の精製
方法が用いられる。水性媒体としては、水、バツ
フアーおよびエタノール等の有機溶媒を含むもの
が使用できる。更に必要に応じて、微生物の生育
に必要な栄養素、抗酸化剤、界面活性剤、補酵
素、および金属イオン等を水性媒体に添加するこ
ともできる。 上記微生物の菌体を水性媒体中で培養しなが
ら、菌体とＯ−ベンジルセリンを接触せしめて作
用せしめる場合には、Ｏ−ベンジルセリンを含
み、かつ微生物の生育に必要な炭素源、窒素源、
無機イオンなどの栄養素を含む水性媒体が用いら
れる。更にビタミン、アミノ酸等の有機微量栄養
素を添加すると望ましい結果が得られる場合が多
い。 炭素源としては、グルコース、シユクロース等
の炭水化物、酢酸等の有機酸、アルコール類、そ
の他が適宜使用される。窒素源としては、アンモ
ニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩、その
他が用いられる。無機イオンとしては、マグネシ
ウムイオン、燐酸イオン、カリイオン、鉄イオ
ン、その他が必要に応じ適宜使用される。 培養は好気的条件下に、PH４ないし８、温度25
ないし40℃の適当な範囲に制御しつつ行えば望ま
しい結果が得られる。 かくして１ないし10日間も培養を行えば、Ｏ−
ベンジルセリンは効率よくラセミ化される。 これに対し、上記微生物の培養液をそのまま、
培養菌体あるいは菌体処理物をＯ−ベンジルセリ
ンと接触せしめて作用せしめる場合には、Ｏ−ベ
ンジルセリンと培養液、培養菌体あるいは菌体処
理物を溶解またはけん濁した水性媒体を10℃ない
し70℃の適当な温度に調節し、PHを４ないし８に
保ちつつ、暫時静置または撹拌すればよい。かく
して５ないし100時間も経過すれば水性媒体中に
多量のＯ−ベンジルセリンのラセミ化物が生成蓄
積される。 このようにして得られたＯ−ベンジルセリンの
ラセミ化物を培養液又は水溶液より採取する方法
は、イオン交換樹脂を用いる方法、等電点にて沈
殿せしめる方法等、通常の方法が採用される。生
成したアミノ酸の定量はアミノ酸アナライザーで
定量し、光学異性体は、光学異性体分離カラムを
用いた高速液体クロマトで測定することにより
Ｄ，Ｌを定めた。 （効果） 本発明で使用する微生物の処理物はＯ−ベンジ
ルセリンのみを特異的にラセミ化するので、Ｏ−
ベンジルセリンをフエノール、カテコール又はレ
ゾルシノールの存在下で、β−チロシナーゼによ
り作用させてＬ−チロシン、Ｌ−３，４−ジヒド
ロキシフエニルアラニン又はＬ−２，４−ジヒド
ロキシフエニルアラニンを生成させる反応系に、
本発明で使用する微生物の処理物を共存させる
と、β−チロシナーゼの作用を受けないＤ−Ｏ−
ベンジルセリンは本発明で使用する微生物の処理
物によりラセミ化され、β−チロシナーゼの作用
を受るＬ−Ｏ−ベンジルセリンが生成される。こ
のために、Ｌ−チロシン、Ｌ−３，４−ジヒドロ
キシフエニルアラニン又はＬ−２，４−ジヒドロ
キシフエニルアラニンの生成量が増大する。 上記の例のようにＯ−ベンジルセリンを出発原
料とした光学的に活性な物質を生成する場合に本
発明の方法であるＯ−ベンジルセリンのラセミ化
法はきわめて有用な方法である。 以下実施例にて説明する。 実施例 １ ブイヨンスラントで30℃、24時間生育させたフ
ラボバクテリウム・フエルギニウムATCC13524
又はエルビニア・ヘルビコーラATCC21433を、
フラボバクテリウムの場合には下記に示す培地(A)
に、エルビニアの場合には下記に示す培地(B)に培
養した。これらの培養液全量を遠心分離により菌
体を採取した。 これらの菌体をＯ−ベンジル−DL−セリン
2g／dl、カテコール1g／dlおよびピリドキサー
ル5′−リン酸10mg／dlを含む0.1Mリン酸緩衝液
（PH8.0）（終末５ml）に5g／dlになる様に添加し、
30℃で12時間保持反応した。なお、対照区とし
て、フラボバクテリウム・フエルギニウム
ATCC13524は添加せず、エルビニア・ヘルビコ
ーラATCC21433のみを反応液に添加し、同様に
30℃、12時間保持反応した。生成したＬ−３，４
−ジヒドロキシフエニルアラニンの量をアミノ酸
アナライザーで測定し、この結果を第１表に示し
た。

【表】 第１表に示したようにＯ−ベンジルセリンをラ
セミ化する能力を有するフラボバクテリウム・フ
エルギニウムATCC13524の菌体処理物を共存さ
せた時にＬ−３，４ジヒドロキシフエニルアラニ
ンの生成量が増大した。 培地（いずれも500ml肩付コルベンに50mlの培
地を投入） 培地(B) グルコース 0.5ｇ／dl 硫 安 0.3ｇ／dl KH₂PO₄ 0.1ｇ／dl K₂HPO₄ 0.3ｇ／dl MgSO₄・7H₂O 0.05ｇ／dl FeSO₄・7H₂O 0.001ｇ／dl MnSO₄・4H₂O 0.001ｇ／dl 酵母エキス 0.5ｇ／dl ポリペプトン 0.5ｇ／dl マルツエキス 0.5ｇ／dl ピリドキシン塩酸塩 10mg／dl 炭酸カルシウム ４ｇ／dl（別殺菌） PH：7.0（KOH） 殺菌条件：115℃、15分間加圧蒸気殺菌 培地(B) Ｌ−チロシン 0.2ｇ／dl KH₂PO₄ 0.1ｇ／dl MgSO₄・7H₂O 0.05ｇ／dl グリセロール 0.6ｇ／dl コハク酸 0.5ｇ／dl 酵母エキス 2.0ｇ／dl 肉エキス 0.5ｇ／dl ピリドキシン塩酸塩 0.01ｇ／dl PH：7.5（KOH） 殺菌条件：115℃、15分間加圧蒸気殺菌 実施例 ２ ブイヨンスラントで30℃、24時間生育させた第
２表に示す微生物を実施例１に示した培地(A)に一
白金耳接種し、30℃で24時間振盪培養した。この
培養液より菌体を遠心分離により採取し、培養液
と同量の生理食塩水で一回洗浄し、菌体を集め
た。 この菌体をＤ−体もしくはＬ−体のＯ−ベンジ
ルセリン1g／dlおよびピリドキサール5′−リン酸
10mg／dlを含む0.1Mリン酸緩衝液（PH8.0）に
5g／dlになる様に添加し、30℃に20時間保持反
応した。 Ｄ−体のＯ−ベンジルセリンがラセミ化されて
生成したＬ一体のＯ−ベンジルセリンまたはＬ一
体のＯ−ベンジルセリンがラセミ化されて生成し
たＤ一体のＯ−ベンジルセリンの量を光学異性体
分離カラムを用いる高速液体クロマトで測定し、
この結果を第２表に示した。

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】 実施例 ３ ブイヨンスラントで30℃24時間生育させたシユ
ードモナス・オバリスATCC3459を、実験例１に
示した培地(A)に一白金耳接種し30℃24時間振盪培
養した。この培養液より菌体を遠心分離により採
取し、培養液と同量の生理食塩水で１回洗浄し、
菌体を集めた。この菌体をＬ−体又はＤ−体のＯ
−ベンジルセリン1g／dlおよびピリドキサール
5′−リン酸10mg／dlを含む0.1Mリン酸緩衝液
（PH8.0）に5g／dlになる様に添加し30℃で３時間
保持反応した。この結果を第３表に示したが、そ
れぞれの反応に用いたＤ体又はＬ体のＯ−ベンジ
ルセリンはほぼ完全にラセミ化されている事が判
明した。この結果を第３表に示した。

【表】 実施例 ４ ブイヨンスラントで30℃24時間生育させたアク
ロモバクター・ビスコサスATCC12448を実施例
１に示した培地(A)に一白金耳接種し、30℃で12時
間振盪培養したのち、10g／dlのＯ−ベンジル−
Ｌ−セリン（KOHでPH7.0になる様に中和）溶液
を５ml加えて更に10時間培養した。Ｏ−ベンジル
−Ｌ−セリンがラセミ化されて生成したＯ−ベン
ジル−Ｄ−セリンを光学活性体分離用カラムを用
いて高速液体クロマトで測定した結果0.43g／dl
のＯ−ベンジル−Ｄ−セリンが生成していた。 実施例 ５ 実施例３と同様に培養し、洗浄したフラボバク
テリウム・フエルギニウムATCC13524の菌体を
生理食塩水に20g／dlになる様に懸濁した菌液５
mlに４％アルギン酸ナトリウム溶液５mlを加え混
合したのち、15g／dl塩化カルシウム溶液に、こ
の混合液を徐々に滴下し、ビーズ状の固体化菌体
を作成した。この固定化物全量をＤ体のＯ−ベン
ジルセリン1g／dlを含む0.1Mリン酸緩衝液（PH
8.0）20mlに投入し、30℃に５時間保持反応させ
た。この結果Ｄ体のＯ−ベンジルセリンはラセミ
化され、反応液中には0.4g／dlのＯ−ベンジル−
Ｌ−セリンが生成していた。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 光活学性Ｏ−ベンジルセリンをラセミ化する
   能力を有するアクロモバクター属、アシネトバク
   ター属、エアロモナス属、アグロバクテリウム
   属、アルカリゲネス属、アースロバクター属、ブ
   レビバクテリウム属、セルロモナス属、シトロバ
   クター属、コリネバクテリウム属、エシエリヒア
   属、エンテロバクター属、エルビニア属、フラボ
   バクテリウム属、ジエンセニア属、クレブシエラ
   属、クルイヘラ属、ミクロコツカス属、プラノコ
   ツカス属、プロタミノバクター属、プロテウス
   属、シユードモナス属、ロドコツカス属、サルモ
   ネラ属、ザルチナ属、ストレプトマイセス属、ビ
   ブリオ属、ブレラ属、セフアロアスカス属、ジオ
   トリカム属、ハンセヌラ属、リポマイセス属、ピ
   ヒア属、ステリグマトマイセス属、トルロプシス
   属、トリコスポロン属、トリゴノプシス属、ウイ
   ンゲア属、デイポダスカス属、リゾプス属、コリ
   ネスポラ属、クルブラリア属、エフエリス属、フ
   ザリウム属、グロエオセルコスポラ属、スクレロ
   テイニア属、セプトラ属、スタゴノスポラ属、ス
   テムフイリイウム属、トリコセシウム属、カララ
   属、フミコーラ属、ウスチラゴ属、オーレオバシ
   デイウム属、バイソクラミス属、ペトリエリデイ
   ウム属、ケトミウム属、コクリオボラス属、ノイ
   ロスポラ属、ムコール属、グリオクラデイウム
   属、モニリエラ属、シンセフアラストラム属、ペ
   ニシリウム属、アスペルギルス属、ユーロチーム
   属、ユーペニシリウム属、ハミゲラ属、アニキシ
   エラ属、アラクニオタス属、コニオケタ属、エメ
   リセロプシス属、ゲラシノスポラ属、ジムノアス
   カス属、メラノスポラ属、ミクロアスカス属、ミ
   クロセシウム属、ポドスポラ属、プルーシア属、
   シユードユーロチーム属、ソルダリア属、スポロ
   ールミエラ属又はトキソトリクム属に属する微生
   物の処理物を水性媒体中で光学活性Ｏ−ベンジル
   セリンに作用させて光学活性Ｏ−ベンジルセリン
   をラセミ化せしめることを特徴とする光学活性Ｏ
   −ベンジルセリンのラセミ化法。