JPS61268630A - 血栓溶解促進剤 - Google Patents
血栓溶解促進剤Info
- Publication number
- JPS61268630A JPS61268630A JP60109256A JP10925685A JPS61268630A JP S61268630 A JPS61268630 A JP S61268630A JP 60109256 A JP60109256 A JP 60109256A JP 10925685 A JP10925685 A JP 10925685A JP S61268630 A JPS61268630 A JP S61268630A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- plasmin
- human
- inhibitor
- cells
- antibody
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
ａ、産業上の利用分野
本発明はヒトα２−プラスミンインヒビター（ａ、 −
ｐｌａｓｍｉｎ １ｎｈｉｂｉｔｏｒ ； ａ、−ａｎ
ｔｉｐｌａｓｍｉｎ ）Ｋ対するモノクローナル抗体、
特にヒトα２−プラスミンインヒビターの線維素溶解部
位（ｒｅａｃｔｉｖｅ ５ｉｔｅ ）を抗原として認識
し、その結果ヒトαオープラスミンインヒビタ−の、プ
ラスミンの線維素溶解作用に対する阻害活性を抑制し、
線溶促進させる働きを有するモノクローナル抗体を有効
成分とする、血栓症（Ｔｈｒｏｍｂｏ＠ｉｓ ） 、広
汎性血管向凝固症（Ｄ Ｉ Ｃ； Ｄｉｓｓｅｍｉｎａ
ｔｅｄ ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒｃｏａｇｕｌａｔ
ｉｏｎ ）等の如き血栓性疾患の新規治療剤として使用
される血栓溶解促進剤に関する。
ｐｌａｓｍｉｎ １ｎｈｉｂｉｔｏｒ ； ａ、−ａｎ
ｔｉｐｌａｓｍｉｎ ）Ｋ対するモノクローナル抗体、
特にヒトα２−プラスミンインヒビターの線維素溶解部
位（ｒｅａｃｔｉｖｅ ５ｉｔｅ ）を抗原として認識
し、その結果ヒトαオープラスミンインヒビタ−の、プ
ラスミンの線維素溶解作用に対する阻害活性を抑制し、
線溶促進させる働きを有するモノクローナル抗体を有効
成分とする、血栓症（Ｔｈｒｏｍｂｏ＠ｉｓ ） 、広
汎性血管向凝固症（Ｄ Ｉ Ｃ； Ｄｉｓｓｅｍｉｎａ
ｔｅｄ ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒｃｏａｇｕｌａｔ
ｉｏｎ ）等の如き血栓性疾患の新規治療剤として使用
される血栓溶解促進剤に関する。
ｂ、従来技術
ヒトの（１，−プラスミンインヒビタ−は、青水と諸井
によって液切に単離・精製され、線維素溶解＃Ｉ素のプ
ラスミン（ｐｌａａｍｉｎ ）のエステラーゼ活性を瞬
間的に阻害する強力なプラスミンインヒビタ−であり、
１１．７−の糖を含む分子量約６７，０００の１本領の
糖蛋白質であることが知られているＣ Ｍｏｒｏｉ ＆
Ａｏｋｉ ；Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＋ｚｓ
ｌ、５９５６−５９６５（１９７６）参照〕。
によって液切に単離・精製され、線維素溶解＃Ｉ素のプ
ラスミン（ｐｌａａｍｉｎ ）のエステラーゼ活性を瞬
間的に阻害する強力なプラスミンインヒビタ−であり、
１１．７−の糖を含む分子量約６７，０００の１本領の
糖蛋白質であることが知られているＣ Ｍｏｒｏｉ ＆
Ａｏｋｉ ；Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＋ｚｓ
ｌ、５９５６−５９６５（１９７６）参照〕。
−万ヒトのα、−プラスミンインヒビタ−には３植類の
活性部位があることが知られている。第１はプラスミン
の巌維累溶解作用阻害部位（以下これｆｔ’ ＩＪ ７
クテイプサイト′というと、とがあるン（Ｂ、Ｗｉｍａ
ｎ ＆ Ｄ、Ｃｏ１１ｅｎ ；Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｂ＠ｍ１ｓｔｒｙ
。
活性部位があることが知られている。第１はプラスミン
の巌維累溶解作用阻害部位（以下これｆｔ’ ＩＪ ７
クテイプサイト′というと、とがあるン（Ｂ、Ｗｉｍａ
ｎ ＆ Ｄ、Ｃｏ１１ｅｎ ；Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｂ＠ｍ１ｓｔｒｙ
。
２５４．９２９１−９２９７（１９７９）参照〕であり
、第２はカルボキシル基末端側のプラスミン結合部位（
Ｂ、Ｗｉｍａｎ ＆ Ｄ、Ｃｏ１１ｅｎ ； Ｅｕｒｏ
ｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ 、 ８４ 、５７３−５７８（１９７８）参照〕
であり、第３はアミ７基末端のフィブリン結合部位であ
る（ Ｙ、 ５ａｋａｔａｓｅｔ ａｌ、ｖ Ｔｈｒｏ
ｍｂｏｓｉａ Ｒｅ５ｅａｒｃｈｓ １６ 、２７９
−２８２（１９７９）参照〕。
、第２はカルボキシル基末端側のプラスミン結合部位（
Ｂ、Ｗｉｍａｎ ＆ Ｄ、Ｃｏ１１ｅｎ ； Ｅｕｒｏ
ｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ 、 ８４ 、５７３−５７８（１９７８）参照〕
であり、第３はアミ７基末端のフィブリン結合部位であ
る（ Ｙ、 ５ａｋａｔａｓｅｔ ａｌ、ｖ Ｔｈｒｏ
ｍｂｏｓｉａ Ｒｅ５ｅａｒｃｈｓ １６ 、２７９
−２８２（１９７９）参照〕。
ヒトα２−プラスミンインヒビターにおけるこれら３種
類の活性部位のうち、リアクティブサイトを抗原として
選択的に認識するモノクローナル抗体を提供できれば、
これを使用することによってヒトα２−プラスミンイン
ヒビターの繊維素溶解阻害作用を直接抑え、線溶を促進
することができるので非常に興味あることである。
類の活性部位のうち、リアクティブサイトを抗原として
選択的に認識するモノクローナル抗体を提供できれば、
これを使用することによってヒトα２−プラスミンイン
ヒビターの繊維素溶解阻害作用を直接抑え、線溶を促進
することができるので非常に興味あることである。
一方、血栓性疾患は血液の性状の変化、血流のうつ滞、
血管壁の変化等により、血管内で血液が凝固する病気で
あり、ＤＩＣは凝固活性因子の血管内侵入等により、全
牙の細小血管に血栓が形成された開気である。これらの
治療に於て血栓の溶解な目的として、プラスミノーゲン
を活性化させる為の酵素、例えばつａキナーゼの投与が
行われ℃いる。しかし、血中のα、−プラスミンインヒ
ビタ−によってプラスミンが速、やかに阻害されるので
効果的ではなかった。従って血中のα、−プラスミンイ
ンヒビタ−のプラスミン活性阻害作用を直接抑えるモノ
クローナル抗体を治療に用いれば血栓を速やかに消失さ
せる事ができる。
血管壁の変化等により、血管内で血液が凝固する病気で
あり、ＤＩＣは凝固活性因子の血管内侵入等により、全
牙の細小血管に血栓が形成された開気である。これらの
治療に於て血栓の溶解な目的として、プラスミノーゲン
を活性化させる為の酵素、例えばつａキナーゼの投与が
行われ℃いる。しかし、血中のα、−プラスミンインヒ
ビタ−によってプラスミンが速、やかに阻害されるので
効果的ではなかった。従って血中のα、−プラスミンイ
ンヒビタ−のプラスミン活性阻害作用を直接抑えるモノ
クローナル抗体を治療に用いれば血栓を速やかに消失さ
せる事ができる。
Ｃ９本発明の構成
本発明によれば、ヒトα２−プラスミンインヒビターに
対するモノクローナル抗体であって、ヒトα２−プラス
ミンインヒビターにおけるプラスミンの線維素溶解阻止
作用を抑制するモノクローナル抗体或いはその少なくと
もＦａｂ部分を有する断片を有効成分とする血栓溶解促
進剤が提供される。か〜る本発明の血栓溶解促進剤は、
例えば血栓が原因となっている血栓性疾患を治療するた
めに有効である。
対するモノクローナル抗体であって、ヒトα２−プラス
ミンインヒビターにおけるプラスミンの線維素溶解阻止
作用を抑制するモノクローナル抗体或いはその少なくと
もＦａｂ部分を有する断片を有効成分とする血栓溶解促
進剤が提供される。か〜る本発明の血栓溶解促進剤は、
例えば血栓が原因となっている血栓性疾患を治療するた
めに有効である。
本発明のモノクローナル抗体はケーラーとミルシュタイ
ンの方法（Ｋｌｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ＋
Ｎａｔｕｒｅ ２５６，４９５〜４９７（１９７５））
として知られた手法によって産生される。すなわち、ヒ
トα２−プラスミンインヒビターでマウスを免疫した後
、このマウスの膵臓細胞をマウスミエローマ細胞と融合
させ、得られた／飄イプリドーマ細胞は、マイクロタイ
タープレート（ｍ１ｃｒｏｔｉｔａｒ ｐｌａｔｅｓ
）に固定されたヒトα２−プラスミンインヒビターと反
応する抗体に灼し系統的に検査し選択される。このよう
にしてヒトα２−プラスミンインヒビターに対する抗体
を合成し、分泌するハイプリドーマ細胞を選別する。得
られたハイプリドーマ細胞を無血清培地中で培養し、そ
の培髪上清中に分泌されたヒトα２−プラスミンインヒ
ビターに対する抗体は、フィブリンプレート（ｆｉｂｒ
ｉｎ ｐｌａｔｅａ ）上でヒトα２−プラスミンイン
ヒビターの繊維素溶解阻害作用を抑える活性について検
査な行なう。その結果、ヒトα２−プラスミンインヒビ
ターの線維素溶解阻止作用を特異的に抑える活性を有す
るモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマ細胞が
単離された。
ンの方法（Ｋｌｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ＋
Ｎａｔｕｒｅ ２５６，４９５〜４９７（１９７５））
として知られた手法によって産生される。すなわち、ヒ
トα２−プラスミンインヒビターでマウスを免疫した後
、このマウスの膵臓細胞をマウスミエローマ細胞と融合
させ、得られた／飄イプリドーマ細胞は、マイクロタイ
タープレート（ｍ１ｃｒｏｔｉｔａｒ ｐｌａｔｅｓ
）に固定されたヒトα２−プラスミンインヒビターと反
応する抗体に灼し系統的に検査し選択される。このよう
にしてヒトα２−プラスミンインヒビターに対する抗体
を合成し、分泌するハイプリドーマ細胞を選別する。得
られたハイプリドーマ細胞を無血清培地中で培養し、そ
の培髪上清中に分泌されたヒトα２−プラスミンインヒ
ビターに対する抗体は、フィブリンプレート（ｆｉｂｒ
ｉｎ ｐｌａｔｅａ ）上でヒトα２−プラスミンイン
ヒビターの繊維素溶解阻害作用を抑える活性について検
査な行なう。その結果、ヒトα２−プラスミンインヒビ
ターの線維素溶解阻止作用を特異的に抑える活性を有す
るモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマ細胞が
単離された。
本発明のモノクローナル抗体は、か〜るハイプリドーマ
細胞が産生ずる産出物から得られる。かくして得られた
モノクローナル抗体は、ヒトα２−プラスミンインヒビ
ターのリアクティブサイトに対し℃単一特異的 （ｍｏｎｏａｐｅｃｉｔｉｃ ）に作用する。
細胞が産生ずる産出物から得られる。かくして得られた
モノクローナル抗体は、ヒトα２−プラスミンインヒビ
ターのリアクティブサイトに対し℃単一特異的 （ｍｏｎｏａｐｅｃｉｔｉｃ ）に作用する。
次に本発明のハイプリドーマ細胞を産生ずる具体的方法
について詳細に説明する。
について詳細に説明する。
Ａ、抗原の単離、精製；
抗原に用いるヒトαオープラスミンインヒビタ−は前記
背水と諸井の方法によりヒト血漿中より単ｇ１１精製さ
れた。
背水と諸井の方法によりヒト血漿中より単ｇ１１精製さ
れた。
塩Ｂａ１ｂ／ｃマウスを用いるが、他の系（５ｔｒａｉ
ｎｓ ）のマウスな使用することもできる。その際、免
疫計画及びヒトαオープラスミンインヒビタ−の濃度は
十分な量の抗原刺激な受けたリンパ球が形成されるよう
選ばれるべきである。例えばマウスに少量のα、−プラ
スミンインヒビタ−で成る間隔で腹腔に数回免疫の後、
さらに数回静脈に投与した。最終免疫の数日後に融合の
為に膵臓細胞を取り出す。
ｎｓ ）のマウスな使用することもできる。その際、免
疫計画及びヒトαオープラスミンインヒビタ−の濃度は
十分な量の抗原刺激な受けたリンパ球が形成されるよう
選ばれるべきである。例えばマウスに少量のα、−プラ
スミンインヒビタ−で成る間隔で腹腔に数回免疫の後、
さらに数回静脈に投与した。最終免疫の数日後に融合の
為に膵臓細胞を取り出す。
膵臓を無菌的に取り出し、それから単細胞懸濁液なＡ製
する。それらの膵臓細胞を適当なラインからのマウス骨
髄層細胞と適当な融合促進剤の使用により細胞融合させ
る。膵臓細胞対骨髄腫細胞の好ましい比率は約２０：１
〜約２：ｌの範囲である。約１０’個の１＃臓細胞につ
いて０，５〜１．５ｄの融合媒体の使用が適当である。
する。それらの膵臓細胞を適当なラインからのマウス骨
髄層細胞と適当な融合促進剤の使用により細胞融合させ
る。膵臓細胞対骨髄腫細胞の好ましい比率は約２０：１
〜約２：ｌの範囲である。約１０’個の１＃臓細胞につ
いて０，５〜１．５ｄの融合媒体の使用が適当である。
細胞融合に用いる骨髄腫細胞は多く知られているが、本
発明ではＰ ３−Ｘ ６３−Ａｇ８−Ｕｌａｍ（以下Ｐ
３−０１ と略記ｊる）（Ｙｅｌｔｏｎ＋ Ｄ、Ｅ、
ａｔ ａｌ、 ＋ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓｉｎ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ
ｏｇｙ＋ ８１ ＋１ （１９７８）参照〕を用いた。
発明ではＰ ３−Ｘ ６３−Ａｇ８−Ｕｌａｍ（以下Ｐ
３−０１ と略記ｊる）（Ｙｅｌｔｏｎ＋ Ｄ、Ｅ、
ａｔ ａｌ、 ＋ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓｉｎ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ
ｏｇｙ＋ ８１ ＋１ （１９７８）参照〕を用いた。
これは、８−７ザグアニン耐性の細胞ラインであり、酵
素ヒボキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフ
ェラーゼ（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ −ｇｕａｎｉｎ
＊ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒ
ａｓｅ ）が欠失しており、それゆえにＨＡＴ （ヒポ
キサンチン、アミノプテリン、チミジン）培地中では生
存しない。また、この細胞ラインは、それ自体抗体を分
泌しない、いわゆる非分篩盤である。
素ヒボキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフ
ェラーゼ（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ −ｇｕａｎｉｎ
＊ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒ
ａｓｅ ）が欠失しており、それゆえにＨＡＴ （ヒポ
キサンチン、アミノプテリン、チミジン）培地中では生
存しない。また、この細胞ラインは、それ自体抗体を分
泌しない、いわゆる非分篩盤である。
好ましい融合促進剤としては例えば平均分子量が１１０
００〜４．０００のポリエチレングリコールを有利に使
用できるが、この分野で知られている他の融合促進剤を
使用することもできる。本発明の実施例では平均分子量
１，５４０のポリエチレングリコールを用いた。
００〜４．０００のポリエチレングリコールを有利に使
用できるが、この分野で知られている他の融合促進剤を
使用することもできる。本発明の実施例では平均分子量
１，５４０のポリエチレングリコールを用いた。
別の容器内（例えばマイクロタイタープレー）Ｊで未融
合の＃ｍｍ胞、未融合の骨髄腫細胞および融合した細胞
の混合物を、未融合の骨髄１１細胞を支持しない選択培
地で希釈し、未融合の細胞な死滅させるのに十分な時間
（約１ａ間ン培養する。培地は薬物抵抗性（例えば８−
７ザグ７ニノ抵抗性）で未融合の骨髄腫細胞を支持しな
いものく例えば前記）ＩＡＴ培地ンが使用される。
合の＃ｍｍ胞、未融合の骨髄腫細胞および融合した細胞
の混合物を、未融合の骨髄１１細胞を支持しない選択培
地で希釈し、未融合の細胞な死滅させるのに十分な時間
（約１ａ間ン培養する。培地は薬物抵抗性（例えば８−
７ザグ７ニノ抵抗性）で未融合の骨髄腫細胞を支持しな
いものく例えば前記）ＩＡＴ培地ンが使用される。
この選択培地中では未融合の骨髄腫細胞は死滅する。こ
の未融合の膵臓細胞は非腫瘍性細胞なのである一定期間
後（約１週間後）死滅する。これらに対して融合した細
胞は骨髄腫の親細胞の腫瘍性と親牌臓細胞の性質をあわ
せ持つために選択培地中で生存できる。
の未融合の膵臓細胞は非腫瘍性細胞なのである一定期間
後（約１週間後）死滅する。これらに対して融合した細
胞は骨髄腫の親細胞の腫瘍性と親牌臓細胞の性質をあわ
せ持つために選択培地中で生存できる。
かくしてハイブリドーマ細胞が検出された後、七の培養
上清を採取し、ヒトαオープラスミンインヒビタ−に対
する抗体について＃累免疫定量法（Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉ
ｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎ。
上清を採取し、ヒトαオープラスミンインヒビタ−に対
する抗体について＃累免疫定量法（Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉ
ｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎ。
５ｏｒｂｅｎｔ Ａｓ５ａｙ ）によりスクリーニング
する。
する。
ヒトα、−フラスミンインヒビターに対する抗体を産生
している・・イブリドーマ細胞を、無血清培地で培養し
て得られた、抗体を含んだ培養上澄液を濃縮し、ヒトα
、−ブラスミンイ／ヒビターと共に一定時間イ／キュベ
ートした。さらにこのヒトα鵞−プラスミンインヒビタ
ー混合液にプラスミンを加え、フィブリンプレート上に
のせ、フィブリン溶解面積を測定した。このようにして
、ヒトαオープラスミンインヒビタ−に対する活性を持
つ抗体を産生ずる／％イブリドーマ細胞を選択する。
している・・イブリドーマ細胞を、無血清培地で培養し
て得られた、抗体を含んだ培養上澄液を濃縮し、ヒトα
、−ブラスミンイ／ヒビターと共に一定時間イ／キュベ
ートした。さらにこのヒトα鵞−プラスミンインヒビタ
ー混合液にプラスミンを加え、フィブリンプレート上に
のせ、フィブリン溶解面積を測定した。このようにして
、ヒトαオープラスミンインヒビタ−に対する活性を持
つ抗体を産生ずる／％イブリドーマ細胞を選択する。
目的の抗体を産生ずる・・イブリドーマ細胞を適当な方
法（例えば限定希釈法）でりａ−ン化すると、抗体は２
つの異なった方法で産生される。その第１の方法によれ
ば・・イブリドーマ細胞を一定時間適当な培地で培養す
ることにより、その培養上清からそのハイブリドーマ細
胞の産生ずるモノクローナル抗体を得ることができる。
法（例えば限定希釈法）でりａ−ン化すると、抗体は２
つの異なった方法で産生される。その第１の方法によれ
ば・・イブリドーマ細胞を一定時間適当な培地で培養す
ることにより、その培養上清からそのハイブリドーマ細
胞の産生ずるモノクローナル抗体を得ることができる。
第２の方法によればハイブリドーマ細胞は同質遺伝子又
は半同質遺伝子を持つマウスの腹腔に注射することがで
きる。一定時間後の宿主動物の血液中及び腹水中より、
その・〜インＩＪドーマ細胞の産生するモノクローナル
抗体を得ることができる。
は半同質遺伝子を持つマウスの腹腔に注射することがで
きる。一定時間後の宿主動物の血液中及び腹水中より、
その・〜インＩＪドーマ細胞の産生するモノクローナル
抗体を得ることができる。
本発明で用いるモノクローナル抗体は、抗体全体を用い
るのはもちろんの事、抗体を、蛋白分解酵素であるパパ
インを用いてＰｏｒｔｅｒの方法（Ｒ，Ｒ，Ｐｏｒｔａ
ｒ＋ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＪｏｕｒｎａｔ ’ｙ３，
１１９〜１２６（１９５９）＃照〕により切断し、添付
図面の点線で囲まれた部分、いわゆるＦａｂ成分を含む
構造のモノクローナル抗体であればよい。
るのはもちろんの事、抗体を、蛋白分解酵素であるパパ
インを用いてＰｏｒｔｅｒの方法（Ｒ，Ｒ，Ｐｏｒｔａ
ｒ＋ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＪｏｕｒｎａｔ ’ｙ３，
１１９〜１２６（１９５９）＃照〕により切断し、添付
図面の点線で囲まれた部分、いわゆるＦａｂ成分を含む
構造のモノクローナル抗体であればよい。
このモノクローナル抗体のＦａｂの部分構造はフィブリ
ンプレート上でヒトαオープラスミンインヒビタ−の線
維素溶解阻害作用を抑える活性について調べられた。そ
の結果、上記のモノクローナル抗体のＦａｂの部分構造
のみでヒトαオープラスミンインヒビタ−の線維素溶解
阻害作用を特異的に迎える活性を有する事が確かめられ
た。
ンプレート上でヒトαオープラスミンインヒビタ−の線
維素溶解阻害作用を抑える活性について調べられた。そ
の結果、上記のモノクローナル抗体のＦａｂの部分構造
のみでヒトαオープラスミンインヒビタ−の線維素溶解
阻害作用を特異的に迎える活性を有する事が確かめられ
た。
本発明のＦ’ａｂ構造を少なくとも有するモノクー−ナ
ル抗体及び部分は、ヒトαオープラスミンインヒビタ−
のリアクティブサイトに対して単一特異的に作用する。
ル抗体及び部分は、ヒトαオープラスミンインヒビタ−
のリアクティブサイトに対して単一特異的に作用する。
本発明に使用される抗体であ、る１α！−プラスミンイ
ンヒビタ−におけるプラスミ／の線維素溶解作用の阻止
部位を特異的に認識して結合し得るモノクローナル抗体
′は、本発明者らによって初めて見出され、先に特許出
願された（昭和５９年４月１７日出願：発明の名称１モ
ノクロ一ナル抗体、・〜イプリドーマ細胞及びモノクロ
ーナル抗体の製造方法′、昭和５９年ｌθ月１２日出願
：発明の名称１モノクロ一ナル抗体′）Ｏかくして、本
発明においては前記モノクローナル抗体式いは七〇Ｆａ
ｂ部分を少くとも有する抗体の断片を有効成分と含有す
るものであれば、それを血栓に接触させることによりそ
れがヒトαオープラスミンインヒビタ−におけろプラス
ミ／のりアクティブサイトに特異的に作用し、結果的に
血栓ｆｔ浴溶解せるので血栓溶解促進剤として利用でき
る。例えば本発明の血栓溶解促進剤は、静注用製剤とし
て使用することができ、その場合、上記上／りａ−ナル
抗体或いは七〇Ｆａｂ部分を少くとも有する抗体断片は
広い範囲の含有割合でよく、またこれらは通常静注用と
して使用されている水性媒体中に溶解乃至分散して使用
することができる。
ンヒビタ−におけるプラスミ／の線維素溶解作用の阻止
部位を特異的に認識して結合し得るモノクローナル抗体
′は、本発明者らによって初めて見出され、先に特許出
願された（昭和５９年４月１７日出願：発明の名称１モ
ノクロ一ナル抗体、・〜イプリドーマ細胞及びモノクロ
ーナル抗体の製造方法′、昭和５９年ｌθ月１２日出願
：発明の名称１モノクロ一ナル抗体′）Ｏかくして、本
発明においては前記モノクローナル抗体式いは七〇Ｆａ
ｂ部分を少くとも有する抗体の断片を有効成分と含有す
るものであれば、それを血栓に接触させることによりそ
れがヒトαオープラスミンインヒビタ−におけろプラス
ミ／のりアクティブサイトに特異的に作用し、結果的に
血栓ｆｔ浴溶解せるので血栓溶解促進剤として利用でき
る。例えば本発明の血栓溶解促進剤は、静注用製剤とし
て使用することができ、その場合、上記上／りａ−ナル
抗体或いは七〇Ｆａｂ部分を少くとも有する抗体断片は
広い範囲の含有割合でよく、またこれらは通常静注用と
して使用されている水性媒体中に溶解乃至分散して使用
することができる。
以下実施例を掲げ本発明の詳細な説明する。
実施例１
（１） Ｌトα！−プラスミンインしビターの調製前記
、青水及び諸井の方法に従い、ヒト血漿２，３６０ｍか
らヒトα、−７ラスミンインヒビター７．７ダを得た。
、青水及び諸井の方法に従い、ヒト血漿２，３６０ｍか
らヒトα、−７ラスミンインヒビター７．７ダを得た。
（２） マウスの免疫
雄のＢａ１ｂ／ｃマウスをヒトαオープラスミンインヒ
ビタ−１００μｇと完全なフロインドの７ジユバント（
Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ａｄｊｕｖａｎ
ｔ ）とのエマルンヨ：／ （ｅｍｕｔｓｔｏｎ ）で
２１日間の間隔をおいて２＠腹腔に免疫した。さらに７
日後及び８８日後にヒトα２−プラスミンインヒビター
３０μＩを一生理食塩水とともに静脈に追加投与した。
ビタ−１００μｇと完全なフロインドの７ジユバント（
Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ａｄｊｕｖａｎ
ｔ ）とのエマルンヨ：／ （ｅｍｕｔｓｔｏｎ ）で
２１日間の間隔をおいて２＠腹腔に免疫した。さらに７
日後及び８８日後にヒトα２−プラスミンインヒビター
３０μＩを一生理食塩水とともに静脈に追加投与した。
最終免疫の４日後にその膵臓細胞を細胞融合のために用
いた。
いた。
膵臓を無菌的に取り出し、ステンレス製メツシュを通過
させることにより単細胞懸濁液が得られた。細胞なＬ−
グルタミン０．３９１１／ｌ 、硫酸カナマイシン０，
２ｆｉ／ｌ及びＮａＨＣｏ、 ２．０１ ／ ｌを補充
したＲＰＭＩ−１６４０培地（ＧＩＢＣＯ裏）に移した
。増殖した１ａＩａをＲＰＭＩ−１６４０で３回洗浄し
ＲＰＭＩ−１６４０培地に再懸濁させた。
させることにより単細胞懸濁液が得られた。細胞なＬ−
グルタミン０．３９１１／ｌ 、硫酸カナマイシン０，
２ｆｉ／ｌ及びＮａＨＣｏ、 ２．０１ ／ ｌを補充
したＲＰＭＩ−１６４０培地（ＧＩＢＣＯ裏）に移した
。増殖した１ａＩａをＲＰＭＩ−１６４０で３回洗浄し
ＲＰＭＩ−１６４０培地に再懸濁させた。
（４） 骨髄腫細胞の調製
マウス骨髄種細胞Ｐ３−Ｕｌは、Ｌ−グｌレタミン０，
３９１１／１１ 、硫酸カナマイシン０．２１／ｌ 、
ＮａＨＣｏ、 ２．０１／ｌ及び１０％のウシ胎児
血清で補充されたＲＰＭＩ−１６４０培地（１０チＦＣ
８−ＲＰＭＩ−１６４０と略記する）中で培養した。骨
髄腫細胞は細胞融合の時点に細胞分裂の対数期にあった
。
３９１１／１１ 、硫酸カナマイシン０．２１／ｌ 、
ＮａＨＣｏ、 ２．０１／ｌ及び１０％のウシ胎児
血清で補充されたＲＰＭＩ−１６４０培地（１０チＦＣ
８−ＲＰＭＩ−１６４０と略記する）中で培養した。骨
髄腫細胞は細胞融合の時点に細胞分裂の対数期にあった
。
（５）細胞融合
膵臓細胞と骨髄腫細胞と１ｋｌＯ：１の比率で無血清Ｒ
）’ＭＩ−１６４０培地中に懸濁し、５分間約２００１
で遠心分離した。上澄液培地を除去した後、沈降物な平
均分子量１．５４０の５０％ポリエチレングリコール溶
ｇ（ｐＨ８，２） １１１１７と共に２分間３７℃でイ
ンキュベーションした。次いで無血清ＲＰＭＩ−１６４
０培地９ｄ１に’加え、細胞を５分間注意深く再懸濁し
た。次いでこの懸濁液を５分間約２０（）ｌｅ遠心分離
Ｌ、ソノ後８ Ｘ １０’＃ａ／ａ（の濃度が得られる
ように１０ ％ Ｆ’Ｃ８−ＲＰＭＩ −１６４０培地
に再懸濁し、次いで９６マイクａウエルプレート上に分
配した（ウェル１個につき約１００μｌ）。この融合細
胞は３７℃において５ ％ ＣＯ，を使用して培養した
。
）’ＭＩ−１６４０培地中に懸濁し、５分間約２００１
で遠心分離した。上澄液培地を除去した後、沈降物な平
均分子量１．５４０の５０％ポリエチレングリコール溶
ｇ（ｐＨ８，２） １１１１７と共に２分間３７℃でイ
ンキュベーションした。次いで無血清ＲＰＭＩ−１６４
０培地９ｄ１に’加え、細胞を５分間注意深く再懸濁し
た。次いでこの懸濁液を５分間約２０（）ｌｅ遠心分離
Ｌ、ソノ後８ Ｘ １０’＃ａ／ａ（の濃度が得られる
ように１０ ％ Ｆ’Ｃ８−ＲＰＭＩ −１６４０培地
に再懸濁し、次いで９６マイクａウエルプレート上に分
配した（ウェル１個につき約１００μｌ）。この融合細
胞は３７℃において５ ％ ＣＯ，を使用して培養した
。
（６） ヒトα、−プラスミンイ／ヒビターに対する
細胞融合の１８後ＫＨＡＴ培地なウェル１個につぎ１０
０μｊ加えた。以後２日間隔で半分量の培地を新たなＨ
ＡＴ培地と交換して培４Ｍした。８日後、・〜イプリド
ーマ細胞の培養上澄液中のヒトα２−プラスミンインヒ
ビターに対する抗体について酵素免疫定量法によりスク
リーニングをおこなった。スクリーニングに用いられた
抗原はしトα、−プラスミンインヒビター１第２抗体は
アルカリ７オスフアターゼ（ａｌｋａｌｉ ｐｈｏｓｐ
ｈａｔａｓ＊ ）標識付のウサギ抗マウス抗体であった
。
細胞融合の１８後ＫＨＡＴ培地なウェル１個につぎ１０
０μｊ加えた。以後２日間隔で半分量の培地を新たなＨ
ＡＴ培地と交換して培４Ｍした。８日後、・〜イプリド
ーマ細胞の培養上澄液中のヒトα２−プラスミンインヒ
ビターに対する抗体について酵素免疫定量法によりスク
リーニングをおこなった。スクリーニングに用いられた
抗原はしトα、−プラスミンインヒビター１第２抗体は
アルカリ７オスフアターゼ（ａｌｋａｌｉ ｐｈｏｓｐ
ｈａｔａｓ＊ ）標識付のウサギ抗マウス抗体であった
。
総数３４９個のつ、エルの全てが酵素免疫定量法により
陽性であり、α、−プラスミンインヒビタ−に対する抗
体を産生じているという結果が得られた。
陽性であり、α、−プラスミンインヒビタ−に対する抗
体を産生じているという結果が得られた。
細胞の増殖が活発になったと観察されたとき、ＨＴ培地
を加えた。１日間隔で計４−ＨＴ培地を用いて培地交換
をおこない、七の後は通常のｌＯ％ＦＣ８−ＲＰＭＩ−
１６４０培地を用いて培養した。
を加えた。１日間隔で計４−ＨＴ培地を用いて培地交換
をおこない、七の後は通常のｌＯ％ＦＣ８−ＲＰＭＩ−
１６４０培地を用いて培養した。
実施例２ （ヒトα！−プラスミンイ／ヒビターに対す
る抗体を産生ずるハイグリドーマ 細胞の選択） 上記ヒトα、−プラスミ／インヒビターに対する抗体を
産生じているハイブリドーマ細胞中からヒトα２−プラ
スミンインヒビターの線維未溶解阻害活性を抑える働き
を持った抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞を次の方法
でスクリーニングした。
る抗体を産生ずるハイグリドーマ 細胞の選択） 上記ヒトα、−プラスミ／インヒビターに対する抗体を
産生じているハイブリドーマ細胞中からヒトα２−プラ
スミンインヒビターの線維未溶解阻害活性を抑える働き
を持った抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞を次の方法
でスクリーニングした。
各ウェルのハイブリドーマｔｔＩＯ％ Ｆｅ２−ＲＰＭ
Ｉ−１６４０培地中で培養し、細胞数を約２×１０７個
とした。この細胞を５分間約２００１ｉで遠心分離し、
培養上澄液を除去した後、細胞な無血清ＰＲＭＩ−１６
４０培地１（）ゴで洗浄した。
Ｉ−１６４０培地中で培養し、細胞数を約２×１０７個
とした。この細胞を５分間約２００１ｉで遠心分離し、
培養上澄液を除去した後、細胞な無血清ＰＲＭＩ−１６
４０培地１（）ゴで洗浄した。
さらに５分間約２００．９で遠心分離し、上澄液を除去
し、細胞を２−メルカフトエタノール５、Ｏｄ／ ｌ
、 イア シュリｙ ７．５ ａｄ／ ｌ 、 ｈラ
ンスフニリン５゜Ｏｙｔ／７４．エタノールアミン５．
０ｄｌｌ、 ナトリウムセレナイト５．０１１Ｌｔ／
ｌ 、 Ｌ−グルタミｙ Ｏ１３９１／ｌ 、 ｆＣ
酸カナマイシン０．２ ＆ ／ ｌ 、 Ｈｅｐｅｓ
２．３８ ＆ ／ ｌ及びＮａＨＣｏ。
し、細胞を２−メルカフトエタノール５、Ｏｄ／ ｌ
、 イア シュリｙ ７．５ ａｄ／ ｌ 、 ｈラ
ンスフニリン５゜Ｏｙｔ／７４．エタノールアミン５．
０ｄｌｌ、 ナトリウムセレナイト５．０１１Ｌｔ／
ｌ 、 Ｌ−グルタミｙ Ｏ１３９１／ｌ 、 ｆＣ
酸カナマイシン０．２ ＆ ／ ｌ 、 Ｈｅｐｅｓ
２．３８ ＆ ／ ｌ及びＮａＨＣｏ。
１．５ｆ／／ｌで補充されたＲＰＭＩ−１６４０二Ｄｕ
ｌｂｅｃｃｏ’５ＭｇＭ 二 Ｈａｍ’５Ｆ−１２（
２：１ ： １ ）の混合無血清培地（以下これ
ｆｔ’ＭＩＴｇＳ培地′と略記する）１０ｍ／に懸濁し
、３日間培養した。
ｌｂｅｃｃｏ’５ＭｇＭ 二 Ｈａｍ’５Ｆ−１２（
２：１ ： １ ）の混合無血清培地（以下これ
ｆｔ’ＭＩＴｇＳ培地′と略記する）１０ｍ／に懸濁し
、３日間培養した。
培養上澄液を回収し、これを２５倍に濃縮した。この６
１８Ｍ２５μｌにヒトα２−プラスミンインヒビター０
，４μ９を加え、３７℃で３０分間インキュベーション
した。次いでプラスミノーゲ７０．０２５ユニツト及び
ウロキナーゼ０．Ｕ ３１ユニツトを加え液量ｙｘ ４
０μｌとした。このうち１０μｌ’ｔフイブリンプレー
トにのせた。フィブリ／プレートは、３７℃、湿度９５
％以上の東件下で１８時間靜装し溶解した面積を測定し
た。
１８Ｍ２５μｌにヒトα２−プラスミンインヒビター０
，４μ９を加え、３７℃で３０分間インキュベーション
した。次いでプラスミノーゲ７０．０２５ユニツト及び
ウロキナーゼ０．Ｕ ３１ユニツトを加え液量ｙｘ ４
０μｌとした。このうち１０μｌ’ｔフイブリンプレー
トにのせた。フィブリ／プレートは、３７℃、湿度９５
％以上の東件下で１８時間靜装し溶解した面積を測定し
た。
その結果、ＩＤｌ０ハイプリドーマ細胞の産生する抗体
く加えたヒトα、−プラスミンイ／ヒビターの線維素＃
ＪＷ＃阻害活性を完全に抑える働きが見出された。
く加えたヒトα、−プラスミンイ／ヒビターの線維素＃
ＪＷ＃阻害活性を完全に抑える働きが見出された。
実施例３
ヒトα２−プラスミンインヒビタ−に対する抗体の活性
試験において陽性の結果を示したノーイブリドーマ細胞
（１１）１０ ）を次の方法でりＯ−ノ化した。
試験において陽性の結果を示したノーイブリドーマ細胞
（１１）１０ ）を次の方法でりＯ−ノ化した。
１０１０細胞な９６ワエルマイクロタイタープレートの
ｌウェルあたり０，９ ｄ胞となるよう希釈し、Ｂａ１
ｂ／ｅマタス胸腺細胞をフィーダー細胞として加えプレ
ートに分配し１０９６１０９６ＦＣ８−ＲＰ ６４０培
地で培養した。顕微鏡下で観察し、確実にシングルセル
コミニーであることを認めた。・・イブリドーマ細胞の
培養上澄液中のヒトα２−プラスミンインヒビターに対
する抗体につき酵素免疫定量法によりスクリーニングな
おこなった。
ｌウェルあたり０，９ ｄ胞となるよう希釈し、Ｂａ１
ｂ／ｅマタス胸腺細胞をフィーダー細胞として加えプレ
ートに分配し１０９６１０９６ＦＣ８−ＲＰ ６４０培
地で培養した。顕微鏡下で観察し、確実にシングルセル
コミニーであることを認めた。・・イブリドーマ細胞の
培養上澄液中のヒトα２−プラスミンインヒビターに対
する抗体につき酵素免疫定量法によりスクリーニングな
おこなった。
総数２６個のウェルが酵素免疫定量法により陽性であり
ヒトα２−プラスミンインヒビターに対するモノクロー
ナル抗体を産生じていた。
ヒトα２−プラスミンインヒビターに対するモノクロー
ナル抗体を産生じていた。
モノクローナル抗体のｎ裂；
大量のヒトα２−プラスミンインヒビターに対するモノ
クローナル抗体を産生させるために、約１０’Ｊｌ！の
ハイグリトーマ細胞をプリスタンで前処理したＢａ１ｂ
／ｃマウスに腹腔内注射した。
クローナル抗体を産生させるために、約１０’Ｊｌ！の
ハイグリトーマ細胞をプリスタンで前処理したＢａ１ｂ
／ｃマウスに腹腔内注射した。
約１週間抜採取された腹水液よりＥａｒらの方法ＣＰ、
Ｌ、Ｅｙ ＋ Ｓ、 Ｊ、 Ｐｒｏｗｓｅ ａｎｄ Ｃ
，Ｒ，Ｊｅｎｋｉｎ 。
Ｌ、Ｅｙ ＋ Ｓ、 Ｊ、 Ｐｒｏｗｓｅ ａｎｄ Ｃ
，Ｒ，Ｊｅｎｋｉｎ 。
ＩｍｍｕｎＯ（！ｈ（１ｍ１８ｔｒｙ＋ １５ 、４２
９ ４３６（１９７８）参照〕に従いプａティンＡ−セ
ファａ−ス４Ｂ（ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ −５ｅｐｈａｒ
ｏｓｅ ４ Ｂ ）カラムを用いて抗体を精製した。腹
水液２．５ｄよりヒトα２−プラスミンインヒビターに
対するモノクローナル抗体２０〜を得た。
９ ４３６（１９７８）参照〕に従いプａティンＡ−セ
ファａ−ス４Ｂ（ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ −５ｅｐｈａｒ
ｏｓｅ ４ Ｂ ）カラムを用いて抗体を精製した。腹
水液２．５ｄよりヒトα２−プラスミンインヒビターに
対するモノクローナル抗体２０〜を得た。
精製したモノクローナル抗体の特定のクラスを、クラス
特異性抗マウス抗血清を使用し℃オクタａニー？ル拡散
試験で決定した。その結果を下記表１に示した。ヒトα
２−プラスミンインヒビターに対する抗体は、その多く
がＨ鎖ｒ、。
特異性抗マウス抗血清を使用し℃オクタａニー？ル拡散
試験で決定した。その結果を下記表１に示した。ヒトα
２−プラスミンインヒビターに対する抗体は、その多く
がＨ鎖ｒ、。
Ｌ鎖にであった。
表１
実施例４
抑制
ヒトα２−プラスミンインヒビター１μｌ と各モノク
ローナル抗体５μｇを０．０５Ｍリン！！緩衝生理食塩
水（以下ＰＢＳと略す）５０μＥに溶解させ、３７℃で
３０分間インキュベーションした。次いでプラスミノー
ゲンＱ、０２５ユニツト及びウロキナーゼ０．０３１ユ
ニツトを加え液量な６０μｊとした。このうち１０μノ
をフィブリンプレートにのせた。フィブリンプレートは
３７℃、湿度９５％以上の条件下で１８時間靜重し、溶
解したｍ積を測定した。その結果を下記表２に示した。
ローナル抗体５μｇを０．０５Ｍリン！！緩衝生理食塩
水（以下ＰＢＳと略す）５０μＥに溶解させ、３７℃で
３０分間インキュベーションした。次いでプラスミノー
ゲンＱ、０２５ユニツト及びウロキナーゼ０．０３１ユ
ニツトを加え液量な６０μｊとした。このうち１０μノ
をフィブリンプレートにのせた。フィブリンプレートは
３７℃、湿度９５％以上の条件下で１８時間靜重し、溶
解したｍ積を測定した。その結果を下記表２に示した。
なお、プラスミノーゲン０，０２５ユニツトとつａキナ
ーゼ０．０３１ユニツトとによる溶解面積を１００４と
した。
ーゼ０．０３１ユニツトとによる溶解面積を１００４と
した。
表２
実施例５
１１１１ ＠識したヒトαオープラスミンインヒビタ−
ｏ、ｏ ｉμＭとα、−プラスミンインヒビタ−に対す
るモノクローナル抗体Ｕ、０５μＭ＆２％十皿清フルプ
４＝７−０．０５Ｍ）リス緩衝Ｑ （ｐＨ７，４）−０
，１５Ｍ ＮａＣＡ！ ’ｋ ｍえて、３７℃で３０分
間インキュベーショ／後、４℃で一晩放置した。
ｏ、ｏ ｉμＭとα、−プラスミンインヒビタ−に対す
るモノクローナル抗体Ｕ、０５μＭ＆２％十皿清フルプ
４＝７−０．０５Ｍ）リス緩衝Ｑ （ｐＨ７，４）−０
，１５Ｍ ＮａＣＡ！ ’ｋ ｍえて、３７℃で３０分
間インキュベーショ／後、４℃で一晩放置した。
この抗原−抗体反応混液に、２．５ ｍＭ ＣａＣ４＋
７μＭ フィブリノーゲンｉｆ分、 ２ユニ７）／Ｗ
Ｌｌトａンビンを加え、全量で１００μｌとし３７℃で
３０分間インキュペ７ショ／した。凝固物（フィブリン
塊）の形成が認められた。３０分後に２００ ｍＭ Ｅ
ＤＴＡを１００ ｐｌ加え、カルシ９ムイオンを除いた
後、竹串でこの凝固物を巻き取った。竹串に巻き取った
凝固物は５分間。
７μＭ フィブリノーゲンｉｆ分、 ２ユニ７）／Ｗ
Ｌｌトａンビンを加え、全量で１００μｌとし３７℃で
３０分間インキュペ７ショ／した。凝固物（フィブリン
塊）の形成が認められた。３０分後に２００ ｍＭ Ｅ
ＤＴＡを１００ ｐｌ加え、カルシ９ムイオンを除いた
後、竹串でこの凝固物を巻き取った。竹串に巻き取った
凝固物は５分間。
３回洗浄液〔２％ＢＳＡ、０．０５Ｍトリス緩衝液（ｐ
Ｈ７，４） 、 ０．１５ ＭＮＪＬＣＪ 、 ２
ｍＭ ＥＤＴＡ）で洗った。最後に凝固物を竹串から
試験管に回収し、凝固物の放射活性（ｃｐｍＪｖ測定し
た。元の反応混液中の放射活性に対する凝固物の放射活
性の割合２表３に示す。
Ｈ７，４） 、 ０．１５ ＭＮＪＬＣＪ 、 ２
ｍＭ ＥＤＴＡ）で洗った。最後に凝固物を竹串から
試験管に回収し、凝固物の放射活性（ｃｐｍＪｖ測定し
た。元の反応混液中の放射活性に対する凝固物の放射活
性の割合２表３に示す。
なお表３中に通常の市販のマウス■ｇＧを比較抗体とし
て使用した結果を併せて示した。
て使用した結果を併せて示した。
表 ３
この結果から各ヒトαオープラスミンインヒビタ−に対
するモノクローナル抗体はヒトα２−ブラスミンイ／ヒ
ビターのフィブリン結合部位を認識していないモノクロ
ーナル抗体であることがわかる。
するモノクローナル抗体はヒトα２−ブラスミンイ／ヒ
ビターのフィブリン結合部位を認識していないモノクロ
ーナル抗体であることがわかる。
実施例６ （ヒトα、−フラスミンインヒビターのりア
クティブサイトをＭｔＷ＆するモノクローナル抗体の検
索） 本実施例はヒトα、−フラスミンインヒビターによるプ
ラスミンの不活性化に及ぼすα、−プラスミンインヒビ
タ−に対するモノクローナル抗体の効果ｆｔｖＩ４べた
ものである。
クティブサイトをＭｔＷ＆するモノクローナル抗体の検
索） 本実施例はヒトα、−フラスミンインヒビターによるプ
ラスミンの不活性化に及ぼすα、−プラスミンインヒビ
タ−に対するモノクローナル抗体の効果ｆｔｖＩ４べた
ものである。
α！−プラスミンインヒビター０．１５μＭとα、−プ
ラスミンインヒビタ−に対するモノクローナル抗体０．
７５μＭを２チ牛血清フルブミ／溶液０．０５ Ｍ ）
リス緩衝液（ｐＨ７，４）、 ０．１５ＭＮａＣ１）
中で３７℃、３０分間インキュベーションし、４℃で一
晩放置した。
ラスミンインヒビタ−に対するモノクローナル抗体０．
７５μＭを２チ牛血清フルブミ／溶液０．０５ Ｍ ）
リス緩衝液（ｐＨ７，４）、 ０．１５ＭＮａＣ１）
中で３７℃、３０分間インキュベーションし、４℃で一
晩放置した。
この反応混液６０μｌとプラスミン溶液（０，４７μＭ
）２０μｌを混ぜ、０．０５ Ｍ ）リス緩衝液（ｐＨ
７，４） 、 （１，１５Ｍ ＮａＣ６を加えて全量
ｔ５００μｌとしたものを谷サンプルについ１２本ずつ
用意し、３７℃で２分又は２０分間インキュベーション
した。次に３．５ｍＭ合成基質Ｓ−２２５１（Ｈ−Ｄ−
バリル−し−口イシル−Ｌ−リジル−ｐ−ニトロアニリ
ド・二塩酸塩）を２００ ａｌ加え、分光光置針（Ｂｅ
ｃｋｍａｎ 、 ＤＵ−８）によって単位時間当りの４
０５ｎｍの波長における吸光度の変化なｍ定した。対照
としてブラスミ／のみを反応させた試料とモノクローナ
ル抗体を加えずにヒトαオープラスミンインヒビタ−と
プラスミンを反応させた試料についても同様に吸光度の
変化を調べた。その結果を下記表４に示した。
）２０μｌを混ぜ、０．０５ Ｍ ）リス緩衝液（ｐＨ
７，４） 、 （１，１５Ｍ ＮａＣ６を加えて全量
ｔ５００μｌとしたものを谷サンプルについ１２本ずつ
用意し、３７℃で２分又は２０分間インキュベーション
した。次に３．５ｍＭ合成基質Ｓ−２２５１（Ｈ−Ｄ−
バリル−し−口イシル−Ｌ−リジル−ｐ−ニトロアニリ
ド・二塩酸塩）を２００ ａｌ加え、分光光置針（Ｂｅ
ｃｋｍａｎ 、 ＤＵ−８）によって単位時間当りの４
０５ｎｍの波長における吸光度の変化なｍ定した。対照
としてブラスミ／のみを反応させた試料とモノクローナ
ル抗体を加えずにヒトαオープラスミンインヒビタ−と
プラスミンを反応させた試料についても同様に吸光度の
変化を調べた。その結果を下記表４に示した。
表４
以上実施例５及び６の結果から本発明のモノクローナル
抗体はヒトαオープラスミンインヒビタ−のりアクティ
ブサイトを特異的Ｋｇ識し、プラスミン結合部位及びフ
ィブリン結合部位のいずれをもｇｌｌしていないことが
わかった。
抗体はヒトαオープラスミンインヒビタ−のりアクティ
ブサイトを特異的Ｋｇ識し、プラスミン結合部位及びフ
ィブリン結合部位のいずれをもｇｌｌしていないことが
わかった。
実施例７
ヒトαｔ−グラスミ／インヒビターのりアクティブサイ
トを特異的に認識する上記実施例記載のモノクローナル
抗体ＩＤ１０Ｃ１ｌＩｎ９を溶解液Ｃ２ｍＭ ＥＤＴＡ
、 １２．５ ｍＭシスティ／、５θ−トリス緩衝液
（ｐＨ７，４）、 ０．１５ＭＮａＣＪ ）３００μノ
に溶解し、１ダ／ｄ濃度のパパイン溶液１００μｌ’を
加え、３７℃で１８時間反応させた。
トを特異的に認識する上記実施例記載のモノクローナル
抗体ＩＤ１０Ｃ１ｌＩｎ９を溶解液Ｃ２ｍＭ ＥＤＴＡ
、 １２．５ ｍＭシスティ／、５θ−トリス緩衝液
（ｐＨ７，４）、 ０．１５ＭＮａＣＪ ）３００μノ
に溶解し、１ダ／ｄ濃度のパパイン溶液１００μｌ’を
加え、３７℃で１８時間反応させた。
この反応液を液体りａマドグラフィーにかけ、Ｆａｂ成
分を分取した。これを５ＤＳ−ボリア５クリル７ミドゲ
ル電気泳動により、還元条件及び非還元条件下で分子量
を測定したところ、抗体のＨ鎖（Ｈｅａｖｙ ｃｈａｉ
ｎ ）の７ミノ基末端より分子量約２３，０００の断片
と分子量約２３．０００のＬ鎖全体から成るＦａｂ成分
であることが確認された。
分を分取した。これを５ＤＳ−ボリア５クリル７ミドゲ
ル電気泳動により、還元条件及び非還元条件下で分子量
を測定したところ、抗体のＨ鎖（Ｈｅａｖｙ ｃｈａｉ
ｎ ）の７ミノ基末端より分子量約２３，０００の断片
と分子量約２３．０００のＬ鎖全体から成るＦａｂ成分
であることが確認された。
実施例８
ヒトαオープラスミンインヒビタ−１μ９と、各モノク
ローナル抗体３μｇを（＋、（＋ ５ Ｍ ＰＢＳ５
０μｌに溶解させ３７℃で３０分間インキュベーション
した。次いでプラスミノーゲン０，０２５ ユニット及
びつａキナーゼ０．０３ に二７トヲ加え液量な６０μ
ｌとした。このうち１０μｌをフィブリンプレートにの
せた。フィブリンプレートは３７℃湿度９５チ以上の条
件で１８時間靜直上、溶解した面積を測定した。その結
果を下記表５に示した。なお下記表の値は、プラスミノ
ーゲン０，０２５ユニツトとりａキナーゼ０．０３１ユ
ニツトとによる溶解面積を１００％とした時の相対値で
ある。
ローナル抗体３μｇを（＋、（＋ ５ Ｍ ＰＢＳ５
０μｌに溶解させ３７℃で３０分間インキュベーション
した。次いでプラスミノーゲン０，０２５ ユニット及
びつａキナーゼ０．０３ に二７トヲ加え液量な６０μ
ｌとした。このうち１０μｌをフィブリンプレートにの
せた。フィブリンプレートは３７℃湿度９５チ以上の条
件で１８時間靜直上、溶解した面積を測定した。その結
果を下記表５に示した。なお下記表の値は、プラスミノ
ーゲン０，０２５ユニツトとりａキナーゼ０．０３１ユ
ニツトとによる溶解面積を１００％とした時の相対値で
ある。
表５
また、実施例６と同様の方法でこのモノクローナル抗体
のＦａｂ成分によるヒトα２−プラスミンインヒビター
活性の抑制の検討をおこなった。
のＦａｂ成分によるヒトα２−プラスミンインヒビター
活性の抑制の検討をおこなった。
α、−プラスミンインヒビター０．６μ、ｐ（９ｐｍｏ
Ｊ）とα、−プラスミ／インヒビターに対する七ツク。
Ｊ）とα、−プラスミ／インヒビターに対する七ツク。
ａ−ナル抗体４０ｐｍｏＪＹ２％牛血清アルズミン溶液
（０，０５Ｍ トリス緩衝ｇ＜ｐＨ７，４）。
（０，０５Ｍ トリス緩衝ｇ＜ｐＨ７，４）。
０．１５ ＭＮａ＋Ｊ ） ６０ ｔｔｌに溶解し、３
７℃。
７℃。
３０分間インキユベーショノし、４℃チー 晩装置した
。
。
この反応混液とプラスミン溶液（０，４７μＭ）２０μ
Ｊｆｔ混ぜ、（１，０５Ｍ トリス緩衝液（ｐＨ７，４
）０、１５ Ｍ ＮｈＣｌな加えて全量を５００μノと
した。
Ｊｆｔ混ぜ、（１，０５Ｍ トリス緩衝液（ｐＨ７，４
）０、１５ Ｍ ＮｈＣｌな加えて全量を５００μノと
した。
次に３．５ ｍＭ合成基質Ｓ−２２５１水溶液を２００
μｌ加え、分光光度針（日立１００−５０）によって４
０５ｎｍの波長における単位時間当りの吸光度の変化を
測定した。対照と０℃プラスミンのみな反応させた試料
とモノクローナル抗体を加えずにヒトα、−プラスミン
イ／ヒビターとプラスミンを反応させた試料についても
同様に吸光度の変化を調べた。その結果を下記表６に示
した。
μｌ加え、分光光度針（日立１００−５０）によって４
０５ｎｍの波長における単位時間当りの吸光度の変化を
測定した。対照と０℃プラスミンのみな反応させた試料
とモノクローナル抗体を加えずにヒトα、−プラスミン
イ／ヒビターとプラスミンを反応させた試料についても
同様に吸光度の変化を調べた。その結果を下記表６に示
した。
表６
以上実施例８の結果から、本発明のＦａｂを有するモノ
クａ−ナル抗体はヒトα、−フラスミンインヒビターの
りアクティブサイトを特異的に認識し、ヒトαオープラ
スミンインヒビタ−の紛維素溶解阻止作用を抑制するこ
とがわかった。
クａ−ナル抗体はヒトα、−フラスミンインヒビターの
りアクティブサイトを特異的に認識し、ヒトαオープラ
スミンインヒビタ−の紛維素溶解阻止作用を抑制するこ
とがわかった。
実施例９
正常人血漿１５０μｌにトロンビン溶液（２００ユニツ
ト／ｄ ）６０μｇを加え、３７℃で２分間加温して血
漿を凝固させ凝固塊を得た。一方、正常人血漿２９０μ
ｌに、α、−プラスミンイ／ヒビターに対するモノクロ
ーナル抗体溶液（ＩＤｌ０ＣＩ ； ３，３９＋Ｉ９／
ａｔｊ）を２７μｌ加え、３７℃で３０分間加温した。
ト／ｄ ）６０μｇを加え、３７℃で２分間加温して血
漿を凝固させ凝固塊を得た。一方、正常人血漿２９０μ
ｌに、α、−プラスミンイ／ヒビターに対するモノクロ
ーナル抗体溶液（ＩＤｌ０ＣＩ ； ３，３９＋Ｉ９／
ａｔｊ）を２７μｌ加え、３７℃で３０分間加温した。
これにプラスミン溶液（１，０００ユニット／ｍ）１０
０μｌを加え同時に凝固塊を浸し、３７℃で加温した。
０μｌを加え同時に凝固塊を浸し、３７℃で加温した。
比較対照としてモノクローナル抗体溶液の代わりにリン
酸緩衝生理食塩水で置換えたものと、凝固塊溶解時間を
比較した。その結果、α、−プラスミンインヒビタ−に
対するモノクローナル抗体を用いた場合、凝固塊は約２
時間で完全に溶解したのに比べ、モノクローナル抗体を
用いない場合には１０時間以上を１！シた。
酸緩衝生理食塩水で置換えたものと、凝固塊溶解時間を
比較した。その結果、α、−プラスミンインヒビタ−に
対するモノクローナル抗体を用いた場合、凝固塊は約２
時間で完全に溶解したのに比べ、モノクローナル抗体を
用いない場合には１０時間以上を１！シた。
実施例１０
ヒト血液を用いた血栓溶解試験
正常人血液ｔＳＯμｌにトロンビン溶［（２００ユニツ
ト／Ｉ／り６０μｌを加え、３７℃で２分間加温し℃血
液を凝固させ、凝固塊な得た。−万、正常人血液３００
μｌに、α、−プラスミ／インヒビターに対するモノク
ローナル抗体溶液（ＩＤｌ０ＣＩ ； ３．３９ダ／＃
＋をンを２７μ！加え、３７℃で３０分間加温した。こ
れにプラスミン溶液（１，０００ユニツト／μ）、１０
０μｌを加え、同時にＩｔｋ固塊を浸し３７°Ｃで加温
した。比較対照としてモノクローナル抗体溶液の代わり
にリン＃緩衝生理食塩水で置換えたものと、凝固塊溶解
時間を比較した。その結果、α、−プラスミンインヒビ
タ−に対するモノクローナル抗体を用いた場合、凝固塊
は約２時間で完全に溶解したのに比べ、モノクローナル
抗体を用いない場合には１０時間以上を要した。
ト／Ｉ／り６０μｌを加え、３７℃で２分間加温し℃血
液を凝固させ、凝固塊な得た。−万、正常人血液３００
μｌに、α、−プラスミ／インヒビターに対するモノク
ローナル抗体溶液（ＩＤｌ０ＣＩ ； ３．３９ダ／＃
＋をンを２７μ！加え、３７℃で３０分間加温した。こ
れにプラスミン溶液（１，０００ユニツト／μ）、１０
０μｌを加え、同時にＩｔｋ固塊を浸し３７°Ｃで加温
した。比較対照としてモノクローナル抗体溶液の代わり
にリン＃緩衝生理食塩水で置換えたものと、凝固塊溶解
時間を比較した。その結果、α、−プラスミンインヒビ
タ−に対するモノクローナル抗体を用いた場合、凝固塊
は約２時間で完全に溶解したのに比べ、モノクローナル
抗体を用いない場合には１０時間以上を要した。
添付図面は、本発明における七ツクａ−ナル抗体を、パ
パイン？用いて分解したときの抗体のＦａｂの部分構造
を示す図である。図中Ｖは可変領域、Ｃは定常領域な示
す。 （：″
パイン？用いて分解したときの抗体のＦａｂの部分構造
を示す図である。図中Ｖは可変領域、Ｃは定常領域な示
す。 （：″
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、ヒトα＿２−プラスミンインヒビターに対するモノ
クローナル抗体であつて、ヒトα＿２−プラスミンイン
ヒビターにおけるプラスミンの線維素溶解阻止作用を抑
制するモノクローナル抗体を有効成分とする血栓溶解促
進剤。 ２、ヒトα＿２−プラスミンインヒビターに対するモノ
クローナル抗体であつて、ヒトα＿２−プラスミンイン
ヒビターにおけるプラスミンの線維素溶解阻止作用を抑
制する少なくともＦａｂ部分を有するモノクローナル抗
体を有効成分とする血栓溶解促進剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60109256A JPH0735340B2 (ja) | 1985-05-23 | 1985-05-23 | 血栓溶解促進剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60109256A JPH0735340B2 (ja) | 1985-05-23 | 1985-05-23 | 血栓溶解促進剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61268630A true JPS61268630A (ja) | 1986-11-28 |
| JPH0735340B2 JPH0735340B2 (ja) | 1995-04-19 |
Family
ID=14505564
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60109256A Expired - Fee Related JPH0735340B2 (ja) | 1985-05-23 | 1985-05-23 | 血栓溶解促進剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0735340B2 (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02268694A (ja) * | 1989-04-07 | 1990-11-02 | Teijin Ltd | 血栓溶解剤 |
| JPH03504717A (ja) * | 1988-04-04 | 1991-10-17 | ザ、ゼネラル、ホスピタル、コーポレーション | 血餅溶解の促進のための組成物及び方法 |
| US5372812A (en) * | 1988-04-04 | 1994-12-13 | The General Hospital Corporation | Composition and method for acceleration of clot lysis |
| US5582862A (en) * | 1988-04-04 | 1996-12-10 | General Hospital Corporation | Antibodies that bind to α2-antiplasmin crosslinked to fibrin which do not inhibit plasma α2-antiplasmin |
| US6114506A (en) * | 1996-09-20 | 2000-09-05 | General Hospital Corporation | Composition and method for enhancing fibrinolysis |
-
1985
- 1985-05-23 JP JP60109256A patent/JPH0735340B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH03504717A (ja) * | 1988-04-04 | 1991-10-17 | ザ、ゼネラル、ホスピタル、コーポレーション | 血餅溶解の促進のための組成物及び方法 |
| US5372812A (en) * | 1988-04-04 | 1994-12-13 | The General Hospital Corporation | Composition and method for acceleration of clot lysis |
| US5582862A (en) * | 1988-04-04 | 1996-12-10 | General Hospital Corporation | Antibodies that bind to α2-antiplasmin crosslinked to fibrin which do not inhibit plasma α2-antiplasmin |
| US5831031A (en) * | 1988-04-04 | 1998-11-03 | The General Hospital Corporation | Antibodies that bind to α2-antiplasmin crosslinked to fibrin which do not inhibit plasma α2-antiplasmin |
| US6280730B1 (en) | 1988-04-04 | 2001-08-28 | The General Hospital Corporation | Antibodies that bind to α2-antiplasmin crosslinked to fibrin which do not inhibit plasma α2-antiplasmin |
| US6576431B2 (en) | 1988-04-04 | 2003-06-10 | The General Hospital Corporation | Antibodies that bind to α2-antiplasmin crosslinked to fibrin which do not inhibit plasma α2-antiplasmin |
| JPH02268694A (ja) * | 1989-04-07 | 1990-11-02 | Teijin Ltd | 血栓溶解剤 |
| US6114506A (en) * | 1996-09-20 | 2000-09-05 | General Hospital Corporation | Composition and method for enhancing fibrinolysis |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0735340B2 (ja) | 1995-04-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Xie et al. | Fibronectin-mediated cell adhesion is required for induction of 92-kDa type IV collagenase/gelatinase (MMP-9) gene expression during macrophage differentiation: the signaling role of protein kinase C-β | |
| US4902614A (en) | Monoclonal antibody to human protein C | |
| AU654311B2 (en) | Blood coagulation protein antagonists and uses therefor | |
| Carney et al. | Double-signal hypothesis for thrombin initiation of cell proliferation | |
| AU678987B2 (en) | Antibodies specific for a haemostatic protein, their use for isolating intact protein, haemostatic compositions devoid of proteolytic cleavage products of the protein | |
| JPH04505765A (ja) | 第Ｘａ因子含有抗凝固剤組成物 | |
| UA116531C2 (uk) | Виділена молекула антитіла, яка специфічно зв'язується з ділянкою екзосайта 1 тромбіну, та її застосування | |
| EP0678524B1 (en) | Anti-human soluble fibrin antibodies, hybridoma producing them, and immunoassaying method | |
| JPH10506925A (ja) | フィブリン溶解マトリックス金属プロテイナーゼによるフィブリン（フィブリノーゲン）分解及び凝塊溶解 | |
| US5219994A (en) | Inhibitor of tissue factor activity | |
| JPS61268630A (ja) | 血栓溶解促進剤 | |
| US5486361A (en) | Hybridomas and monoclonal antibodies that speifically bind to GPIB on platelets and inhibit the binding of thrombin to platelets | |
| EP0159025B1 (en) | Monoclonal antibody specific to human alpha2-plasmin | |
| US5811265A (en) | Hybrid immunoglobulin-thrombolytic enzyme molecules which specifically bind a thrombus, and methods of their production and use | |
| EP0478366A2 (en) | Recombinant hybrid immunoglobulin molecules and method of use | |
| RU2158135C2 (ru) | Тромбоцитспецифичный химерный иммуноглобулин и методы его использования | |
| JPH06505496A (ja) | 活性因子ｘ１１１の活性化を阻害するための組成物と方法 | |
| EP0205046B1 (en) | Monoclonal antibody to human protein c | |
| JPH04228088A (ja) | 血小板因子４の生物学的作用を阻害するモノクローナル抗体 | |
| JPH0344760B2 (ja) | ||
| JPH02268694A (ja) | 血栓溶解剤 | |
| WO1996017622A1 (en) | Antibodies which inhibit the binding of thrombin to platelets | |
| JPH052310B2 (ja) | ||
| JPH03200066A (ja) | 活性化ヒトプロテインｃの測定方法 | |
| US20060241039A1 (en) | Amino acid-substituted coagulation factor V |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |